（微生物学专业论文）深黄被孢霉发酵生产γ亚麻酸及其分子遗传学的研究.pdf

南开大学博士研究生毕业论文中文摘要 中文摘要 f 深黄被孢霉( m o r t i e r e l l a i s a b e l l i n a ) 是毛霉目中具有重要经济价值的丝状真菌， i 碣其产生y 一亚麻酸( y l i n 0 1 e 1 3 i ca c i d ，g l a ) ，而y 一亚麻酸作为人体必需 的不饱和脂肪酸，对人体的激素调节及脂肪酸代谢发挥着重要的生理作用，尤其 它在心血管疾病、糖尿病以及癌症等方面的医疗价值而成为学术界研究的热点。 本文对深黄被孢霉生产y 一亚麻酸的发酵工艺，深黄被孢霉染色体的数目和基因 组大小，及其y 一亚麻酸合成中的关键酶6 _ 脂肪酸脱氢酶基因的克隆和序列 分析进行了研究。 本实验室通过筛选、育种、小试工作已选育出一株产y 一亚麻酸的菌株深黄被 孢霉批。，为了提高该菌株的产量性状，本文利用原生质体紫外线诱变的方法， 对m 。菌株进行了诱变筛选，从中筛选出了删。、m h ，。和删。三株诱变株，在菌体 二重、出油率和y 一亚麻酸含量上都优于出发菌株。对高产y 一亚麻酸菌株m h 2 3 进行了中试发酵，分别采用一级发酵、二级发酵和一级发酵中问补糖三种方式进 行了三批次5 0 0 立升罐体的发酵试验，结果三种发酵方式每升发酵液获得的y 一 哑麻酸含量分别为1 1 9 4 m g 、1 0 5 5 m g 和8 6 3 m g ；利用2 5 吨罐进行了两批次扩大发 酵试验，y 一亚麻酸含量分别达到1 1 7 4 m g l ，1 2 0 2 m g l 。并对y 一亚麻酸的提取 和分离纯化工艺进行了研究，将实验室中用正己烷和乙醇分步抽提的工艺改为用 6 溶剂一步抽提技术，从而简化了生产工艺，降低了生产成本：采用脲素包合法， 以甲醇作为溶剂，温度控制在7 5 8 0 。c ，包合时间为3 h ，对中试发酵所提取的菌 油进行了浓缩，y 一亚麻酸两次包合后，g l a 含量达到8 4 2 5 ，比原浓度浓缩了 近十二倍。本实验结果达到了国内同类研究的领先水平，为今后进一步工业化生 产奠定了基础。卜o 卫 ( 国内外对深黄被孢霉的研究主要集中在其实际应用方面，而对其遗传学和基 阎水平上的研究报道较少 本文剂用脉冲凝胶电泳c h e f 系统首次确定了被孢霉属 中产g l a 的深黄被孢霉a s 3 3 41 0 ( m o r t i e r e l l ai s a b e l l i n aa s 33 4 1 0 ) 及其诱变株也_ 2 2 、 i h 2 3 以及不产g l a 的拉曼被孢霉a s 3 3 4 1 3 ( m o r t i e r e l l ar a m a n n i a n aa s 33 4 1 3 ) 和 葡酒色被孢霉a s 3 3 4 1 4 ( m o r t i e r e l l av i n a c e aa s 33 4 1 4 ) 的染色体数目及基因组大 小。料每被孢霉菌丝体在2 溶壁酶和4 蜗牛酶溶液中，3 0 处理4 h ，收集原生质体， 调整原生质体浓度在2 1 0 8 个m l 左右，经低熔点琼脂糖包埋后，于含2 m g m l 蛋 白酶k 的n d s 溶液中酶解4 8 h ，制备成适于电泳的样品块。在脉冲电泳条件：o8 胶浓，缓冲液0s t b e ，脉冲间隔时间1 2 0 s ，电压5 3 v c m ，电泳时间1 2 h ，然后 脉冲间隔时间1 8 0 s ，电压5 3 v c m ，电泳时间1 2 h 。深黄被孢霉a s 3 3 4 i 0 及其诱 变株具有相同的染色体d n a 分子数目和大小，分离出1 5 条染色体带，以啤酒酵母 y n n 2 9 5 染色体d n a 分子量为标准，估计其大小约为( k b ) ：2 6 6 0 、2 4 0 0 、2 2 5 0 、1 9 9 0 、 南开大学博士研究生毕业论文中文摘要 】8 2 0 、1 7 6 0 、1 6 3 0 、i 4 2 0 、1 3 4 0 、1 1 6 0 、8 6 0 、7 6 0 、6 8 0 、5 2 0 、3 9 0 ；拉曼被孢霉 a s 3 3 4 1 3 分离出1 0 条染色体带，大小约为2 4 3 0 、2 2 8 0 、1 9 1 0 、1 7 0 0 、1 6 0 0 、1 4 2 0 、 l2 8 0 、11 0 0 、9 3 0 、3 9 0 ；葡酒色被孢霉a s 3 3 4 1 4 分离出11 条染色体带，大小约 为2 6 6 0 、2 4 1 0 、2 1 6 0 、2 0 8 0 、1 9 2 0 、1 6 8 0 、1 6 2 0 、1 5 0 0 、1 4 4 0 、1 1 2 0 、1 0 8 0 。三 种被孢霉基因组大小分别约为2 1 6 4 0 k b 、1 5 0 4 0 k b 、1 9 6 7 0 k b 。通过比较三种被孢霉 的电泳核型，显示出染色体种间的特异性带型，提供了被孢霉基因组结构的基本 信息，经联网检索，国内外未见相同或相似的报道。l 一。 本文在研究深黄被孢霉基因组结构的基础上，进一步对y 一亚麻酸代谢过程 中的关键酶6 一脂肪酸脱氢酶在基因水平上进行了研究。6 _ 脂肪酸脱氢酶 是以亚油酸( c 1 8 ：2 “”) 为底物，在c 6 和q 位之问脱氢形成y 一亚麻酸( c 1 8 ：3 a “) ，克隆到该基因对提高g l a 产量，进行基因工程菌的构建和转基因植物具有 重大意义。本论文将已发表的高等植物、动物、蓝细菌、真菌的5 - 脂肪酸脱氢酶 序列进行同源性比较，发现6 一脂肪酸脱氢酶具有三个组氨酸保守区，但与其它位 点的脂肪酸脱氢酶不同的是，a 6 一脂肪酸脱氢酶在n 端特有细胞色素b ；( c y t b ；) 区，因此，我们根据c y t b ；区的h p g g 和组氨酸保守区i i iq i e h h l f p 的氨基酸序列设 汁引物，提取深黄被孢霉的总r n a ，进行r t - p c r 扩增，将扩增出的d n a 片段进行 连接、转化，最后对重组质粒进行酶切鉴定和测序。f 结果表明深黄被孢霉l 脂肪 酸脱氢酶h p g g 区与i i i 区之间的c d n a 片段长度为1 0 7 1 个核苷酸，编码3 5 7 个氨基 酸，与己报道的高山被孢霉6 一脂肪酸脱氢酶基因具有9 4 9 6 的同源性，而与其它物 种如蓝细菌、玻璃苣、小鼠、线虫的6 _ 脂肪酸脱氢酶同源性很低，氨基酸序列的 最大同源性在3 0 左右，核苷酸序列的最大同源性在5 0 左右。在此基础上，又对 吐脂肪酸脱氢酶结构基因进行了克隆和序列分析，得到了全长为1 3 7 卑b p 核苷酸 序列，编码4 5 7 个氨基酸，这是国际上对深黄被孢霉6 _ 脂肪酸脱氢酶基因的首次 报道卫“ 螺王两童菽，本j 垒文在研究深黄被孢霉生产g l a 的发酵工艺基础上，对该菌株 进行了电泳核型分析，首次报道了其染色体数目和基因组大小，并对产y 亚麻 酸的关键酶一一5 _ 脂肪酸脱氢酶基因进行了克隆和序列分析，为更深入细致地研 究被孢霉中脂肪酸脱氢酶系统的分子遗传学，揭示产生g l a 的调控机制打下了坚 实的摹础。附今后基因工程菌株的构建和转基因植物的研究具有重 和实际的应用价值0 一“；足一， 一 够 关键词： 深黄被孢霉，y 一亚麻酸，发耐，蘧蚕珥囊霾是国，电 体d n a ，6 _ 脂肪酸脱氢酶基因，反转录聚合酶链式反应， 析瘪遣傅蟮， 要的理论意义 泳核型，染色 克隆，序列分 南开大学博士研究生毕业论文英文摘要 a b s t r a c t t h ef i l a m e n t o u sf u n g u s ，m o r t i e r e l l ai s a b e l l i n a ，b e l o n g i n gt ot h em u c o r a l e s ，i so f g r e a tv a l u e i n e c o n o m ya s i t p r o d u c e s y l i n o l e n i ca c i d ( g l a lg l ai so n eo ft h e e s s e n t i a lu n s a t u r a t e df a t t ya c i df o rh u m a nb o d ya n dp l a y si m p o r t a n tp b y s i o l o g i c a lr o l e si n b o t ht h eh o r m o n a lr e g u l a t i o na n df a t t ya c i dm e t a b o l i s ma n de s p e c i a l l yi nt h et r e a t m e n to f c a r d i o v a s c u l a rd i s o r d e r s ，d i a b e t e s ，c a n c e ra n ds oo nt h e r e f o r e ，t h i sf u n g u sh a ss of a r b e c o m et h e p r i n c i p a l f o c u so fr e s e a r c h e si nt h ea c a d e m i cc i r c l e s t h i st h e s i s m a i n l y i n d i c a t e st h es t u d yo nt h ef e r m e n t a t i o np r o c e s so fm i s a b e l l i n ap r o d u c i n gy l i n o l e n i c a c i d ，t h en u m b e ro ft h ec h r o m o s o m e sa n dt h es i z eo fg e n o m eo fm i s a b e l l i n a ，a n dt h e c l o n i n ga n ds e q u e n c ea n a l y s i so f t h ek e ye n z y m e 6 一f a t t ya c i dd e s a t u r a s eg e n ei n g l a s y n t h e s i s o n es t r a i no fy l i n o l e n i ca c i d p r o d u c i n gm i s a b e l f i n ai v l 6 2 2h a sb e e no b t a i n e di n o u rl a b o r a t o r yv i as c r e e n i n g ，b r e e d i n ga n das m a l l - s c a l et e s ti no r d e rt oi m p r o v et h ey i e l d c h a r a c t e ro ft h i ss t r a i n ，p r o t o p l a s t - - u l t r a v i o l e tr a ym u t a g e n e s i sm e t h o dw a sa d o p t e dt o m a k emi s a b e l l i n am 6 2 2p r o d u c ed e r i v a t i v em u t a n t s w eo b t a i n e dt h r e em u t a n ts t r a i n s ： m h 2 3 ，m h l 8a n dm i - 1 2 6 ，w h i c hw e r e f a rb e t t e rt h a nm 6 2 2i nt h ed r yc e l lw e i g h t ，r a t eo f l i p i d p r o d u c t i o na n dc o n t e n to fg l ai n am e d i u m s c a l et e s t ，m i s a b e l l i n am h 2 3 ，am u t a n to f h i g hy i e l d i n go fg l a ，w a sm a d e t of e r m e n tr e s p e c t i v e l yu s i n gt h ef i r s ts t e pf e m e n t a t i o n ， t h es e c o n ds t e pf e r m e n t a t i o na n dt h ef i r s ts t e pf e r m e n t a t i o nd u r i n gw h i c hs u g a rw a sa d d e d i n5 0 0l i t e rf e r m e n t e r t h er e s u l tw a st h a tt h ec o n t e n t so fg l ao b t a i n e di nt h et h r e ew a y s i ne a c hl i t r eo ft h ef e r m e n t e db r o t hw e r e11 9 4 m g ，1 0 5 5 m ga n d 8 6 3 m g ，r e s p e c t i v e l y ； a n o t h e re n l a r g e df e r m e n t a t i o nt e s tw a sm a d ei nt w ob a t c h e si na2 5 - t o nf e r m e n t e kt h e r e s u l to fw h i c hw a st h a tt h ec o n t e n t so fg l ac a m et oi17 4 m g la n d 12 0 2 m g l ， r e s p e c t i v e l y i na d d i t i o n ，af u r t h e rs t u d yw a sm a d eo ft h et e c h n i q u eo fe x t r a c t i o n , i s o l a t i o n a n dp u r i f i c a t i o no fg l at h ef a c t i o n a le x t r a c t i o nu s e di nt h el a b o r a t o r yw i t hn h e x a n ea n d e t h a n o lw a sc h a n g e di n t ot h ew h o l ee x t r a c t i o no f6 “s o l v e n t ，w h i c hs i m p l i f i e dp r o d u c t i o n t e c h n i q u ea n dr e d u c e dc o s to fp r o d u c t i o n t h e f u n g a ll i p i de x t r a c t e df r o m t h ef e r m e n t a t i o n i nt h em e d i u m s c a l et e s tw a sc o n c e n t r a t e db yt h eu r e aa d d u c t i n gm e t h o dw i t hm e t h a n o la s s o l v e n t ，a t7 5 - 8 0 c f o r3h o u r sa f t e rg l ah a db e e na d d u c t e dt w i c e ，t h ec o n t e n to f g l a c a m eu pt o8 42 5 ，a r o u n dat w e l f t ha sm u c ha st h eo r i g i n a lc o n c e n t r a t i o nt h er e s u l t s o b t a i n e di no u r l a b o r a t o r yh a v ec o m eu pt ot h ea d v a n c e dl e v e l si nt h es a m e a r e ai nc h i n a 南开大学博士研究生毕业论文英文摘要 a n dl a i dt h ef o u n d a t i o nf o rt h el i n d u s t r i a l i z e dp r o d u c t i o n p r e v i o u s l y , r e s e a r c h e so fm o r t e 舢a i s a b e l l i n a a r e m a i n l yc o n c e n t r a t i n g o ni t s p r a c t i c a la p p l i c a t i o n , b u tl i t t l eh a sb e e nr e p o r t e do n t h es t u d yo fi t sg e n e t i c sa n d g e n e l e v e l w eh a v ef o rt h ef i r s tt i m ee m p l o y e dt h ec h e fs y s t e m ( c o u t o u r c l a m p e dh o m o g e n e o u s e l e c t r i cf i e l dg e le l e c t r o p h o r e s i s ) t oi d e n t i f yt ot h en u m b e ro f t h ec h r o m o s o m e sa n dt h es i z e o fg e n o m eo fm o r t i e r e l l ai s a b e l l i n aa s33 4 1 0a n di t sm u t a n t sm 6 2 2a n dm h 2 3w h i c h p r o d u c eg l aa s w e l la sm o r t i e r e l l ar a m a n n i a n aa s 3 3 4 1 3a n dm o r t i e r e l l av i n a c e a a s 33 4 1 4w h i c hd o n t p r o d u c e g l at h e s a m p l ep i e c e sa p p l i c a b l e t ot h ec h e f e l e c t r o p h o r e s i sw e r em a d eb yh a n d l i n gm o r t i e r e l l am y c e l i ai n2 l y w a l l z y m ea n d4 s n a i l a s ea t3 0 cf o r4h o u r s ，g a t h e r i n gt h ep r o t o p l a s t sa n da d j u s t i n gt h e i rc o n c e n t r a t i o nt o 2 10 5 m lo rs oa n de m b e d d i n gt h e p r o t o p l a s t s i nt h el o wm e l t i n gp o i n t a g a r o s ea n d e n z y m a t i c a l l yt r e a t i n g t h ea g a r o s e - e m b e d d e d p r o t o p l a s t s w i t hn d sc o n t a i n i n g2 m g m l p r o t e n a s ek f o r4 8 hw e c a r r yo u tc h e fe l e c t r o p h o r e s i so f m o r t i e r e l l au n d e rc o n d i t i o n so f o8 a g a r o s eg e li no5 t b e ，53 w c m ，ap u l s es w i t c h i n gi n t e r v a l o f1 2 0 sf o r 1 2 h ， f o l l o w e db y53v c m ，1 8 0 sf o r1 2 ha t1 4 。ct h er e s u l t sr e v e a l e dm i s a b e l l i n aa s 33 4 1 0 a n dr 。sm u t a n t sa r ei d e n t i c a li nt h en u m b e ra n ds i z eo ft h ec h r o m o s o m a ld n am o l e c u l e s t h e i rc h r o m o s o m a ld n a sh a v eb e e nr e s o l v e di n t ol5b a n d s a n dc h r o m o s o m a ld n a s f r o ms a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a ey n n 2 9 5a r eu s e da st h em o l e c u l a rs i z er e f e r e n c em a r k e r s ， t h e i rs i z e sa r ee s t i m a t e dt ob ea p p r o x i m a t e l y ( k b ) ：2 6 6 0 ，2 4 0 0 ，2 2 5 0 ，1 9 9 0 ，1 8 2 0 ，1 7 6 0 ， 16 3 0 ，1 4 2 0 ，1 3 4 0 ，11 6 0 ，8 6 0 ，7 6 0 ，_ 6 8 0 ，5 2 0a n d 3 9 0 ；1 0c h r o m o s o m a lb a n d sf r o m m o r t i e r e l l ar a m a n n i a n aa s 33 4 1 3a r ea p p r o 撕m a t e l y ( k b ) ：2 4 3 0 ，2 2 8 0 ，1 9 1 0 ，1 7 0 0 ，1 6 0 0 ， 1 4 2 0 ，1 2 8 0 ，1 1 0 0 ，9 3 0a n d3 9 0 ；llc h r o m o s o m a lb a n d sf r o mm o r t i e r e l l av i n c l c e aa s 33 4 1 4 a r ea p p r o x i m a t e l y ( k b ) ：2 6 6 0 ，2 4 1 0 ，2 1 6 0 ，2 0 8 0 ，1 9 2 0 ，1 6 8 0 ，1 6 2 0 ，1 5 0 0 ，1 4 4 0 ，1 1 2 0a n d 1 0 8 0t h e g e n o m es i z e so f t h et h r e e m o r t i e r e l l aa r ea p p r o x i m a t e l y2 1 6 4 0k b ，1 5 0 4 0 k ba n d i 9 6 7 0 k b ，r e s p e c t i v e l ye l e t r o p h o r e t i ck a r y o t y p e o ft h r e em o r t i e r e l l a s p e c i e s s h o w e d s p e c i e s - s p e c i f i cc h r o m o s o m eb a n d i n gp a t t e r n s t h i ss t u d yp r o v i d e dt h eb a s i ci n f o r m a t i o n a b o u tt h ec o n s t i t u t i o no f t h en u c l e a r g e n o m e o f m o r t i e r e l l a r e t r i e v i n gi ni n t e r n e t ，w eh a v e n e v e rf o u n d a n yo f t h es a m e o rs i m i l a rr e p o r t so nt h i sm a t t e ri i nt h ew o r l d b a s e do nt h er e s e a r c ho ft h eg e n o m es t r u c t u r eo f m i s a b e l l i n a ，af u i r t h e rs t u d yh a s b e e nm a d eo f t h e k e ye n z y m e 6f a t t ya c i dd e s a t u r a s ei nt h em e t a b , l o l i cp r o c e s so f g l a a ti t s g e n el e v e l ，y l i n o l e n i ca c i d ( c 1 8 ：3 a6 ，9 ，1 2 ) i ss y n t h e s i z e db y 6 - f a t t ya c i d d e s a t u r a s eu s i n gl i n o l e i c a c i d ( c 1 8 ：2 a 9 1 2 1 a s as u b s t r a t eb yd e h y d r o g e n a t i o nb e t w e e n 南开大学博士研究生毕业论文 英文摘要 c a r b o n6a n d7 i fi ti sc l o n e dt ot h eg e n e ，t h a ti so fg r e a ts i g n i f i c a n c et oc o n s t r u c t i o n g e n e t i c a l l ye n g i n e e r e ds t r a i na n dt r a n s g e n i cp l a n t sc o m p a r i s o no f t h ed e d u c e da m i n o a c i ds e q u e n c e so ft h ep u b l i s h e d 6 f a t t ya c i dd e s a t u r a s ef r o mh i g h e rp l a n t s ，m a m m a l s ， c y a n o b a c t e f i aa n df u n g ir e v e a l e dt h a t 6 - f a t t y a c i dd e s a t u r a s ec a r r i e st h r e eh i s t i d i n e h i g h l yc o n s e r v a t i o nr e g i o n s ，b u tt h ed i f f e r e n c ef r o mt h ef a t t ya c i dd e s a t u r a s e so nt h eo t h e r p o s i t i o ni s t h a t a 6 - f a t t ya c i dd e s a t u r a s ec o n t a i n san - t e r m i n a lc y t o c h r o m eb 5d o m a i n t h e r e f o r e ，w ed e s i g n e dp r i m e r sb a s eo nt h es e q u e n c e so ft h eh p g g i n c y t b 5a n dt h e h i s t i d i n ec o n s e r v a t i o n r e g i o n i i i q i e h h l f p t h e p r i m e r s w e r eu s e df o rp c r a m p l i f i c a t i o no fc d n a r e v e r s et r a n s c r i b e df r o mt o t a lr n ao fm i s a b e l l i n a t h ep c r a m p l i f i e dd n af r a g m e n t sw e r ep u r i f i e d ，l i g a t e di n t op g e m - tv e c t o r , a n dt r a n s f o r m e di n t o e c o l ij m l 0 9c e l l f i n a l l y , t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw e r ei d e n t i f i e da n ds e q u e n c e d t h e r e s u l ts h o w e dt h a tt h ee d n a f r a g m e n to f m i s a b i l l i n a 6 - f a t t ya c i dd e s a t u r a s eb e t w e e n t h eh p g ga n di i i q i e h h l f pw a s1 0 7 1 b pe n c o d i n g3 5 7 a ai nl e n g t h ，a n dm i s a b e l l i n a s h o w e d9 4 i d e n t i t yw i t hm a l p i n a 6 - f a t t ya c i dd e s a t u r a s e w h e r e a si t e x h i b i t e dl o w e r i d e n t i t yw i t ht h e x 6 f a t t ya c i dd e s a t u r a s eo ft h eo t h e ro r g a n i s m ss u c ha ss y n e c h o c y s t i s ， b o r a g eo f f i c i n a l i s , r a ta n dc a e n o r h a b d i t i se l e g a n s ，a n d3 0 o r s oi d e n t i t yw i t ht h ea m i n o a c i ds e q u e n c e sa n d5 0 o r s oi d e n t i t yw i t ht h en u c l e o t i d es e q u e n c eo nt h i sb a s i s ，w e f u r t h e rc l o n e dt h e x 6 - f a t t ya c i dd e s a t u r a s es t r u c t u r a lg e n eo f m i s a b e l l i n aa n do b t a i n e d t h ef u l l - l e n g t h ，1 3 7 i b p ，o ft h en u c l e o t i d es e q u e n c ee n c o d i n g4 5 7a m i n oa c i d st h i si st h e f i r s tr e p o r tt h a t 6 f a t t ya c i dd e s a t u r a s eg e n ef r o m m i s a b e l l i n aw a sc l o n e di nt h ew o r l d t os u mu p ，b a s e do t lt h ef e r m e n t a t i o np r o c e s so fm i s a b e l l i n ap r o d u c i n gg l a ，w e h a v es u c c e e d e di ne l e c t r o p h o r e t i ck a r y o t y p ea n a l y s i so ft h i ss t r a i n ，a n dh a v er e p o r t e dt h e n u m b e ro fi t sc h r o m o s o m ea n dt h es i z eo fi t sg e n o m em o r e o v e lw eh a v ea c h i e v e ds u c c e s s i nt h ec l o n i n ga n ds e q u e n c ea n a l y s i so ft h ek e ye n z y m e 一6 - f a t t ya c i dd e s a t u r a s eg e n e o ft h e p r o d u c t i o n o fg l aa l lr e s u l t sm e n t i o na b o v eh a v el a i dt h ef o u n d a t i o no ft h e t h o r o u g hg o i n gr e s e a r c ho f t h em o l e c u l a rg e n e t i c so ft h ef a t t ya c i dd e s a t u r a s es y s t e mi n m o r t i e r e l l aa n dr e v e a l i n gt h er e g u l a t o r ym e c h a n i s mo ft h ep r o d u c t i o no fg l aa n da r eo f g r e a tt h e o r e t i c a ls i g n i f i c a n c ea n dg r e a ta p p l i e dv a l u et ot h ef u r t h e rs t u d yo fg e n e t i c a l l y e n g i n e e r e ds t r a i na n dt r a n s g e n i cp l a n t s k e y w o r d s ：m o r t i e r e l l ai s a b e l l i n a ，y l i n o l e n i ca c i d ，f e r m e n t a t i o n ，p u l s e d f i e l d g e l 旦翌兰生望生竺堕堑竺兰些兰苎一 叁奎塑墨 e l e c t o p h o r e s i s ，e l e c t r o p h o r e t i ck a r y o t y p e c h r o m o s o m a ld n a , a 6 _ f a t t ya c i d d e s a t u r a s e g e n e ，r e v e r s et r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n ( r t 。p c r ) ， c l o n i n g ，s e q u e n c ea n a l y s i s 南开大学博士研究生毕业论文第一章 第一章y 一亚麻酸中试发酵的研究 一、前言 ( 一) y 一亚麻酸的发现历史及代谢路线 1 9 1 9 年，由l u f t 和h e i d u s h k a l l l 等从月见草的种子油中发现了一种新的脂肪酸， 即q 一亚麻酸( a - l i n o l e l i ca c i d ) 的同分异构体，命名为y 一亚麻酸( y l i n o l e l l i c i d ，g l a ) ，1 9 2 7 年，利用臭氧化降解反应测定其结构为6 ，9 ，1 2 一十八碳三烯酸”1 ， 直到1 9 4 9 年，正式确认y 一亚麻酸为全顺式6 ，9 ，1 2 一十八碳三烯酸( a 1 1e i s6 ，9 ，1 2 一 o c t a d e c a t r i e n o i ca c i d ) 1 3 1 ，分子式为c 1 8 h 3 0 0 2 ，结构式为： y 一亚麻酸是人体一种必需脂肪酸( e s s e n t i a lf a t t ya c i d ，e f a s ) ，必需脂肪酸就 如同维生素一样，是一种营养元素，由于它不能由人体自身宣接合成，只能从食 物中获得，所以国外的许多临床研究称y 一亚麻酸为维生素f 。y 一亚麻酸对人体而 言具有双重功能，既是人体的必需营养元素，同时又是治疗疾病的重要药物，其 代谢路线如图1 1 所示。 多烯不饱和脂肪酸( p 0 1 y u n s a t u r a t e df a t t ya c id ，p u f a ) 是指含有两个或 两个以上双键且碳原子数为1 6 至2 2 的直链脂肪酸，从碳链的甲基端原子开始， 根据第个双键在分子中所在的位置将p u f a 分为两类，即n 一6 ( 或u 一6 ) 和n 3 ( 或u 一3 ) “1 ，亚油酸是u 一6 及u 一3 两类的母体，在生物体中经一系列脱氢酶催 化和碳链延长而衍生成其它的p u f a 。由于人体缺乏在脂肪酸的第九位碳原子以上 位置引入不饱和双键的脱氢酶，所以人体自身不能合成亚油酸( l i n o l e i ca c i d ， l a ) 和y 一亚麻酸( y - l i n o l e l l i ca c i d ，g l a ) ，需从食物中获取，因此，l a 、g l a 和a a ( 花生四烯酸，a r a c h i d o n i ca c l d ) ，被称为必需脂肪酸( e f a s ) 。机体内所有 膜的流动性和柔韧性都受到e f a s 组成的影响，而e f a s 在膜内的浓度和分子内的 双键数决定了膜的流动性。然而，有同样双键的n 一3e f a s 却不能逆转n - 6e f a s 造成的缺陷，因此，双键的构型必定是重要的“1 ，另外，e f a s 也影响到膜内许多 蛋白如离子通道、受体、a t p a s e 等的结构和功能”】。 必需脂肪酸至少有四个作用：( 1 ) 具有调节细胞膜结构的作用；( 2 ) 是生物活 性物质如前列腺素、自三烯、过氧羟基脂肪酸的前体；( 3 ) 控制皮肤水分的不渗 透性及胃肠道和血脑屏障细胞膜的渗透性；( 4 ) 调节胆固醇的运输和合成。 堕堑查兰苎圭堕塑竺兰些堡茎丝二兰 ( 1 1 6e f a s ) 6 脱 c 1 8 ：0 硬脂酸 ( s t e a r i ca c i d ) h 。脱氢酶( 2 h ) 9 - c 1 8 ：1 油酸 ( o l e i ca c i d ) 0a 1 2 脱氢酶( 一2 h ) a9 ，1 2 一c 1 8 ：2 亚油酸 ( l i n o l e i ca c i d l a ) 氢酶( 删) 矿 a6 ，9 ，1 2 一c 1 8 ：3y 一亚麻酸 ( y l i n 0 1 e n i ca c i d g l a ) 延长+ 2 c p g - 类+ a5 ，8 ，1 1 - c 2 0 ：3 二高y 亚麻酸 ( d i h o m o i 环氧酶、i p g 2 一 f 弋 p g d 2p g f ：p g j ： y l i n o l e n i ca c i d d 6 l a ) a5 脱氢酶( 一2 h ) a5 ，8 ，1 1 ，1 4 一c 2 0 ：4 花生四烯酸 ( a r a c h i d o n i ca c i d 从) 目l 氧i + 2 c 酶i ( n 一3e f a s ) 脱氢酶( 一2 h ) a 9 ，1 2 ，1 5 - c 1 8 ：3q 亚麻酸 ( o l i n o l e n i ca c i d ) 6 脱氢酶( 一2 h ) a6 9 1 2 1 5 一c 1 8 ：4 + 2 c a 8 ，1 1 ，1 4 ，1 7 - c 2 0 ：4 i a t 脱氢酶( 2 h ) a 5 ，8 ，1 1 ，1 4 ，1 7 - c 2 0 ：5 ( e i c o s a p e n t a e n o i c ，e p a ) 0 + 2 c ，a 5 _ 脱氢酶( 一2 h ) a47 1 0 1 3 1 6 1 9 一c 2 2 ：6 ( d o c o s a h e x e n o i ca c i d d h a ) l ta 7 ，1 0 ，1 3 ，1 6 一c