（植物学专业论文）拟南芥hpa1基因功能研究.pdf

摘要 组氨酸是生物体蛋白质合成的必需氨基酸，其生物合成途径已得到广泛的鉴 定。但是对于组氨酸在植物生长发育中的调控作用知之甚少。这是由于从试验手 段上很难区分组氨酸的代谓 功能和调控功能以及缺乏组氨酸合成缺陷的非致死 突变体。本论文中我们鉴定了一个新的组氨酸合成减少造成主根分生组织特异性 缺陷的拟南芥突变体h p a l 。通过对h p a l 突变体和a t h p a l 基因的研究我们得出 了以下结论： 1 h p m 突变体在根分生组织维持上表现出特异缺陷因而抑制主根生长。 2 h p a l 突变体的点突变发生在编码磷酸组氨醇氨基转移酶基因( h p a ) 上。外源 添加组氨酸或者转入删超表达基因均可以回复h p a l 突变表型。 3 用a t h p a i 可以回复ec o l ih p a 缺陷突变菌株，说明a t h p a l 可以执行h p a 功能。从a t h p a l 基因敲除的e m b 2 1 9 6 看a t h p a l 在组氨酸合成中发挥着必 须的作用，它的敲除导致胚致死。表明幼口，点突变并未造成h p a 功能全部 丧失，其所残存的活性足以保持胚或植株的生活。 4 生化分析显示此突变体体内游离组氨酸的含量降低了约3 0 ，但水解组氨酸 的含量正常。 p a l 并没有显示出已知的的组氨酸饥饿特征。 根据以上试验结果，我们认为根尖分生组织对于组氨酸动态平衡的改变敏感， 组氨酸可能在植物发育过程中起到重要的调控作用。 关键词：h p a l 拟南芥组氨酸根分生组织维持 v a b s t r a c t h i s t i d i n ei so n eo ft h ee s s e n t i a la m i n oa c i d sf o rp r o t e i ns y n t h e s i sa n di sr e q u i r e d b ya l ll i v i n go r g a n i s m s i t sb i o s y n t h e t i cp a t h w a yh a sb e e ne x t e n s i v e l yc h a r a c t e r i z e d i th a sb e e nw e l le s t a b l i s h e dt h a th i s t i d i n eb i o s y n t h e s i si sv i t a lf o rt h es u r v i v a lo f p l a n t s h o w e v e r , v e r yl i t t l e i sk n o w na b o u tw h e t h e rh o m e o s t a s i so fh i s t i d i n ep l a y s a n ys p e c i f i cr o l ei np l a n tg r o w t ha n dd e v e l o p m e n t t h i si sd u et ot h ed i f f i c u l t yi n e x p e r i m e n t a l l ys e p a r a t i n gt h em e t a b o l i ca n dr e g u l a t o r yf u n c t i o n so ft h i se s s e n t i a l a m i n oa c i da n dt h el a c ko fn o n - l e t h a l ( h i s t i d i n e ) d e f i c i e n c ym u t a n t s h e r ew e c h a r a c t e r i z ean o v e la r a b i d o p s i sm u t a n t ，h p a l ，i nt h eh i s t i d i n eb i o s y n t h e t i cp a t h w a y b yi n v e s t i g a t i o no fh p a lm u t a n ta n da t h p a1g e n e ，w ec o n c l u d ea sf o l l o w i n g ： 1 t h eh p a lm u t a n td i s p l a y e das p e c i f i c d e v e l o p m e n t a ld e f e c ti nr o o tm e r i s t e m m a i n t e n a n c ea n dw a su n a b l et os u s t a i np r i m a r yr o o tg r o w t h 2 t h e 幼a l m u t a n tc a r r i e sa p o i n t m u t a t i o ni n ah i s t i d i n o l p h o s p h a t e a m i n o t r a n s f e r a s e ( h p a ) g e n e t h eh p a lm u t a n tp h e n o t y p e sc a nb er e s c u e db y e i t h e rc o n s t i t u t i v e e x p r e s s i o n o ft h ew ta t h p a1 o r e x o g e n o u sh i s t i d i n e s u p p l e m e n t a t i o n 3 a t h p a1e n c o d e saf u n c t i o n a lh p a p r o t e i n t h ec o m p l e t ek n o c k o u to fa t h p a1i s e m b r y ol e t h a l ，i n d e c a t i n gt h a ta t h p a 1m a k e sav i t a lc o n t r i b u t i o nt oh p a a c t i v i t y a n dh i s t i d i n eb i o s y n t h e s i si na r a b i d o p s i sa n dt h em u t a t e dh p a p r o t e i ni n 细a li s n o tc o m p l e t e l yf u n c t i o n a l l yi n a c t i v e t h er e s i d u a lh p aa c t i v i t i e sm a yb es u f f i c i e n t t om a i n t a i nt h ev i t a l i t yo ft h e 幼a le m b r y o p l a n t s 4 b i o c h e m i c a la n a l y s i ss h o w st h a tt h em u t a t i o ni nh p a lr e s u l t e di na3 0 r e d u c t i o n i nf r e eh i s t i d i n ec o n t e n ta n dh a dn os i g n i f i c a n ti m p a c to dt h et o t a lh i s t i d i n e c o n t e n t i td i dn o tc a u s ea n yk n o w ns y m p t o m so fh i s t i d i n es t a r v a t i o n o u rr e s u l t st h e r e f o r er e v e a la ni m p o r t a n tr o l eo fh i s t i d i n eh o m e o s t a s i si np l a n tr o o t d e v e l o p m e n t k e yw o r d s ：h p a l ，a r a b i d o p s i s ，h i s t i d i n e ，r o o tm e r i s t e mm a i n t e n a n c e v i 缩写词 a p c c a p s 缩略语表 英文全称中文名称 a n a p h a s e - p r o m o t i n gc o m p l e x 末期启动复合体 c l e a v e da m p l i f i e dp o l y m o r p h i c 切割扩增多态 s e q u e n c e e m s e t h y l m e t h a n es u l f o n a t e 乙基甲烷磺酸盐 g f p g s h g r e e nf l u e n r e c e n c ep r o t e i n 绿色荧光蛋白 g l u t a t h i o n e 谷胱苷肽 h p ah i s t i d i n o lp h o s p h a t ea m i n o t r a n s f e r a s e 磷酸组胺醇转氨酶 h y g p i p l t q c r ，r - p c r s c r s s l p h y g r o m y c i n p r o p i d i u mi o d i d e p l e t h o r a q u i e s c e n tc e n t e r r e v e r s et r a n s c r i p t i o n p o l y m e r a s e c h a i nr e a c t i o n 潮霉素 碘化丙啶 p l e t h o r a 静止中心 逆转录一聚合酶链式反应 s c a r e c r o ws c a r e c r o w s i m p l es e q u e n c el e n g t h 简单序列长度多态性 p o l y m o r p h i s m i v 致谢 本研究是在导师吴平教授与英国利兹大学张汉马博士联合指导下完成的，研 究倾注着两位导师无数的心血。四年来，导师对治学的严谨求实、对事业的执着 追求，对科研前沿的高瞻远瞩，时刻激励着我。导师不仅在学业上给我以精心的 指导，在生活上也给我许多关心和帮助，这些将使我铭记终生。在此我谨向导师 表示最诚挚的谢意! 本课题的合作者朱晴羽、李静、李想在此论文的完成中作了很大的贡献在此 对他们表示深深的谢意。 在攻读博士学位论文期间，得到李靖老师、易可可老师、毛传藻老师、吴忠 长老师、李燕老师、寿惠霞老师、王首锋老师、陈汉民老师、黄方亮老师、刘洪 家老师、李美飞老师、吴运荣老师、姜华武博士后、段可博士后的多方帮助和指 导，在此对他们表示深深的谓 意。 感谢博士期间党磊、焦芳婵、侯兴亮、周洁、齐晓朋、储俊、张麝龙、杜黎 明、余小波、丁沃娜、张波涛、于洁、秦诚、王学敏、何小薇、李小汀、孟一君、 王文锋等同学在我实验过程中给予的热忱帮助，在此致以诚挚的感谢。 感谢实验室其他所有师兄弟姐妹们对我的帮助。 感谢我的爱人和家人对我的理解和支持! 莫肖蓉 2 0 0 6 7 博士学位论文 引言 第一章文献综述 第一部分植物主根分生组织维持的研究进展 植物根系有两个主要的功能：从土壤中吸收养分水分和固定植物。植物在长 期进化过程中形成了受环境调节的根系发生发育机制。根系的这种适应性生长是 胚后发育( p o s t e m b r y o n i cd e v e l o p m e n t ) 分子生物学机理的研究模型。 1 植物主根的形态结构和发生发育过程简介 i i 主根的形态结构 植物根系的大致可以分为两大类，大多数双子叶植物所具有的直根系和大多 数单子叶植物所具有的须根系。拟南芥根的纵向分布从其尖端向后依次可分为根 冠( r o o tc a p ) 、分生区( m e r i s t e m a t i cz o n e ) j 伸长区( e l o n g a t i o nz o n e ) 和根毛区( r o o t h a i rz o n eo 根冠( r o o tc a p ) 由薄壁细胞构成的圆锥帽状结构，套在生长锥的 外面，起保护作用，是根部感觉重力的部位。在根冠与分生组织之间有4 个有丝 分裂不活跃的细胞构成静止中一l , ( q u i e s c e n tc e n t e r ) 。静止中心往后的细胞能不断分 裂形成新的细胞，属于分生区( m e r i s t e m a t i cz o n e ) ，长约i m m 。在分生区的后 部，细胞沿根的纵轴方向伸长以增加根的长度，叫做伸长区( e l o n g a t i o nz o n e ) 。 处于伸长区后部的是成熟( 根毛) 区( m a t u r a t i o nz o n e ) ，该处细胞停止生长， 分化成各种成熟组织，表皮细胞形成根毛，是吸收水分和养分最重要的部位。从 根的横截面观察，成熟的根由表皮( e p i d e r m i s ) 、皮层( c o r t e x ) 、内皮层( e n d o d e r m i s ) 、 中柱鞘( p e r i c y c l e ) 及由中柱鞘包围的维管组织( v a s c u l a rt i s s u e ) 组成。这些成 熟的组织来源于4 种干细胞( 或称起始细胞) ：顶端根冠起始细胞( c o l u m e l l ar o o t 博：l 学位论文 c a pi n i t i a l ) ；中柱鞘和维管束起始细胞( p e r i c y c l ea n dv a s c u l a rt i s s u ei n i t i a l ) ；表皮 和侧生根冠起始j j 包( e p i d e r m i sa n dl a t e r a lr o o tc a pi n i t i a l ) 以及皮层和内皮层起始 细胞。这4 种类型的起始细胞包围着静止中，i 二, ( d o l a n 等，1 9 9 3 ) 。 1 2 主根的发生发育方式 拟南芥主根顶端围绕静止中心的上述4 种起始细胞( 干细胞) 通过各种方式 的分裂，分化和可调节的细胞膨胀最终产生各种类型的根细胞组织。由于根的生 长是不间断的，所以这些过程是连续的。因此在整个发育时期内，各个发育阶段 都是存在的。具体来说，起始细胞或者只进行垂周分裂产生单行细胞，或者首先 进行一次垂周分裂然后再进行平周分裂产生两层或更多层细胞。顶端根冠起始细 胞通常只进行垂周分裂，它们分裂产生的细胞进行迅速的膨胀和细胞分化，最终 形成富含淀粉粒并可感受重力的顶端根冠细胞。其它三种类型的起始细胞通常进 行垂周和平周两种方式的分裂，产生不同特性的细胞。例如皮层内皮层起始细 胞首先进行一次垂周分裂，重新产生一个起始细胞和一个子细胞。这个子细胞进 行一次平周分裂产生第一个皮层细胞和第一个内皮层细胞( 图1 b ) 。这些细胞在 分化完成之前还要进行几次垂周的方向分裂。随后，它们将进行迅速的极性细胞 膨胀。总之，通过四种类型的起始细胞的不断分裂、分化和膨胀，最终形成完整 的根结构( s c h e r e s 等，2 0 0 2 ) 。 2 胚后主根分生组织维持的分子机制研究进展 2 1 生长素在主根发生发育和根分生组织区域维持中的作用 根尖分生组织( r o o ta p i c a lm e r i s t e mr a m ) 的活性直接决定了整个主根及 根系的发育( d o l a ne ta 1 ，1 9 9 3 ：s c h e r e se ta 1 ，1 9 9 4 ) 。主根分生组织在胚 胎发生期形成( j u r g e n s ，1 9 9 5 ：s c h e r e se ta 1 ，1 9 9 4 ) 。在胚后发育阶段，分生 组织细胞的分裂和分化受到高度的调控。随着根的生长，分生组织一直维持着其 特定的细胞构成。 博= l 学位论文 许多生理学、遗传学试验已经证明生长素参与胚根的形成过程，例如一些与 生长素相关的基因突变会影响胚根的发育。拟南芥m o n o p t e r o s 阳突变体缺少胚 根( b e r l e t ha n dj u r g e n s ，1 9 9 3 ) 。m p 基因编码一个生长素响应因子蛋白，它能调节 对生长素的迅速转录响应( h a r d t k ee ta 1 ，1 9 9 8 ) 。b o d e n l o s 伯刚突变体和生长素抗 性突变体a u x i nr e s i s t a n t 6 ( a x r 6 ) 有相似的早期胚根表型和严重的主根缺陷 ( h a r n a n ne ta 1 ，1 9 9 9 ；h o b b i e e ta 1 ，2 0 0 0 ) 。这些突变体对外源的生长素表现出增加 的抗性，并且6 讲突变体和聊p 突变体在遗传上可以互作。因此，至少这三个基因 的突变说明生长素参与胚根的形成过程。 与m p , b d l 和a x r 6 类似，拟南芥h b t ( h o b b i t ) 突变的缺陷最早可在胚胎发生中 检测到，在将来成为末端根细胞类型的起源细胞中发生细胞分裂平面的错误定 向。发育成苗后，其根末端缺少静止中心，根冠柱细胞，侧根冠，缺乏具有有丝 分裂活性的分生组织( w i l l e m s e ne ta 1 ，1 9 9 8 ) 。h b t 基因编码细胞分裂后期启动复 合物a n a p h a s e - p r o m o t i n gc o m p l e x ( a p c ) 的一个亚基类似物( b l i l o ue ta 1 ，2 0 0 2 ) ，该 基因可以部分回复酵母a p c 蛋白亚基缺陷的c d c 2 7 突变体。a p c 蛋白是一种多亚 基的泛素连接酶复合体，用以启动c y c l i n 蛋白在c d k ( c y c l i nd e p e n d e n tk i n a s e ) 酶低 活性期的降解。h b t 突变体的末端生长素积累显著下降，对外源生长素敏感性下 降，与之相应的是突变体中生长素响应的转录抑制子a u x l 7 f i a a l 7 在蛋白水平上 的积累。还不清楚a u x i a a 蛋白的降解是否直接由h b t 参与，但h b t 将生长素与 细胞周期有关的细胞分裂分化进程联系起来。 生长素在胚后分生组织维持中起重要作用的证据是来自于对生长素运输体 突变体的研究。生长素的运输机制很受关注，因为运输受到干扰会影响几乎所有 生长素有关的发育过程。通过对生长素i n f l u x ( a u x l 家族) 矛d e f f l u x 载体( p i n 家族) 的候选蛋白的鉴定，有大量证据表明它们在生长素极性运输中起作用( f r i m l ， 2 0 0 3 ；v o g l e re ta 1 ，2 0 0 3 ) 。在拟南芥中的研究表明，p i n 蛋白的定位在根尖 分生组织是特异性的，并且是有所重叠的。p i n l 主要位于原生韧皮部细胞的下侧， 但在表皮和皮层中也有微弱的信号可以检测到( f r i m le ta 1 ，2 0 0 2 a ； b 1 i l o u e ta 1 ，2 0 0 5 ) 。a u x l 蛋白不对称地分布于根原生韧皮部细胞与p i n l n 反一侧 ( s w a m pe ta 1 ，2 0 0 1 ) 。原生韧皮部细胞中a u x i 与p i n l 负责中柱细胞中生长素的 向根尖方向下行( a c r o p e t a lt r a n s p o r t ) 。p i n 4 在静止中心及包围静止中心的细 博：i ：学位论文 胞中检测到，在原形成层的细胞中位于细胞下侧( b 1 i l o ue ta 1 ，2 0 0 5 ) 。p i n 4 负责根分生组织静止中心下方产生一个生长素积累的库，这对于根中生长素梯度 的维持是必需的( f r i m le ta 1 ，2 0 0 2 a ) 。p i n 3 位于2 3 层根冠柱细胞 ( c o l u m e l l a ) 中，在此处的分布没有明显的极性分布特征。在伸长区中p i n 3 位 于微管束细胞的下侧以及中柱鞘细胞的侧向一侧( b i i l o u ，2 0 0 5 ) 。位于根冠柱 细胞中的p i n 3 在改变重力方向刺激的2 分钟内，可以重新朝新的细胞底部分布， 表明重力感受和生长素再分配之间通过p i n 3 耦合。a u x i 与p i n 3 也在相同的根冠柱 细胞中发挥功能( f r i m l ，2 0 0 3 ：f r i m le ta 1 ，2 0 0 2 b ) 。p i n 7 在分生组织区与伸 长区的原形成层细胞中位于侧面和下侧，在根冠柱细胞中与p i n 3 的定位重叠，根 据p i n 3 与p i n 7 的定位推测其还负责将根尖末梢柱细胞中积累的高浓度生长素侧 向分配( f r i m le ta 1 ，2 0 0 2 b ； b 1 i l o ue ta 1 ，2 0 0 5 ) 。p i n 2 在表皮和侧根冠 定位于细胞的上侧，在皮层细胞中主要定位于下侧( b 1 i l o ue ta 1 ，2 0 0 5 ) 。a u x i 蛋白也分布在同一个细胞的p i n 2 $ j 反的一侧，a u x i 与p i n 2 是表皮中生长素向根基 部方向回流( b a s i p e t a lt r a n s p o r t ) 的主要负责者( f r i m l ，2 0 0 3 ) 。 p i n 基因控制根分生组织细胞分裂区的大小。在拟南芥p j 做陷的突变体中， 可以检测到其它p i n 蛋白的异位表达，因l 上k p i n 单突变体的缺陷可以通过其它p i n 蛋白的异位表达而得到掩盖( b 1 i l o ue ta 1 ，2 0 0 5 ) 。p 拍1 和p 门弹突变体显示 出根长度及分生组织区域的轻微缩小。p i n 3 , p i n 4 年 j p i n t - 单突变体仅在静止中心 和根冠柱细胞处显示精细的分裂缺陷。但是一系列含有p i n 2 1 j 4 j 双突变，三突变， 四突变显示出更加缩短的根长和根分生组织区。由于p i n 2 是介导生长素向根基部 方向运输的主要成分，这表明生长素向向根基部方向运入处于分生组织区域的细 胞对于调节分生组织区域大小是很重要的。与分生组织区域各处细胞均需得到生 长素供应的概念相吻合的是外源施力h a u x i n 可以回复p i n p n 2 年h p i n 2 p i n 3 p i n 釉 分生组织区域到野生型状态。位于原形成层维管细胞侧面的p i n 3 ，p i n 7 将生长素 侧向再分配和由p i n 2 负责的生长素向根基部方向运输构成了一个生长素流环线， 这样一个环线系统可以重新部署生长素的分配，该环线所介导的生长素流通容量 调节着分生组织区域的大小( b l i l o ue ta 1 ，2 0 0 5 ) 。 博= b 学位论文 2 2 静止中心在胚后分生组织维持中的分子机制研究 拟南芥根尖分生组织的细胞构成包含了四个中心细胞，即静止中心 ( q u i e s c e n tc e n t e rq c ) ，在其周围的是干细胞( i n i t i a lc e l1 ) ( d o l a ne ta 1 ， 1 9 9 3 ) 。q c 不具有分裂活性，干细胞具有很强的分裂能力。在胚后发育阶段，每 个贴近q c 的干细胞会进行一次平周分裂( d o l a ne ta 1 ，1 9 9 3 ) ，这是一次非对称 分裂，产生两个姐妹子细胞，其中贴近q c 的保持原先干细胞活性；另一个离q c 较远的子细胞则根据所处的位置分化成各种具体的细胞( v a nd e nb e r ge ta 1 ， 1 9 9 5 ) 。当q c 被激光消融，紧贴的干细胞便失去其特有的分裂能力，同姐妹细胞 一样的方式进行分化( v a nd e nb e r ge ta 1 ，1 9 9 7 ) 。这就表明q c 对于维持周围 干细胞身份，阻止干细胞进入分化是很重要的；q c 及其与之相邻的干细胞构成的 这个干细胞小生境对于维持根尖分生组织活性又是极其重要的。 s c r ( s c a r e c r o w ) 和s h r ( s h o r t r o o t ) 突变体都具有短根的表型，其皮层和 内皮层起始细胞的不对称分裂不能进行，在根的径向结构中缺少一层细胞 ( s c h e r e se ta 1 ，1 9 9 5 ) 。用组织特异性的标记分析发现突变细胞层的特性在两个突 变体中是不同的。在s c r 突变体中，突变层具有皮层和内皮层的双重特性，表明 s c r 基因是起始细胞平周分裂所必须的，但不参与细胞分化( d il a u r e n z i oe t a 1 ，1 9 9 6 ) 。在s h r 突变体中，突变层只具有皮层细胞的特性，表明s h r 基因不但参 与原始细胞的平周分裂分裂，而且还参与内皮层细胞的分化( d il a u r e n z i oe ta 1 ， 1 9 9 6 ) 。这两个基因都属于转录调节子g r a s 家族。s c r 基因在皮层和内皮层起 始细胞，其子细胞，内皮层细胞和静止中心( q c ) 细胞表达( d il a u r e n z i oe ta 1 ， 1 9 9 6 ) 。由于在s h r 突变体中，s c r 基因的表达降低，说明s h r 基因参与了。s 锄 基因的转录激活( h e l a r i u t t ae ta 1 ，2 0 0 0 ) 。然而，s h r 基因只特异地在中柱细胞进 行转录，融合绿色荧光蛋白的s h r 的免疫定位试验表明s h r 可能从中柱细胞移动 到邻近的细胞层。s h r 不但出现在中柱细胞中，而且出现在邻近的细胞层，包括 皮层内皮层起始细胞，它的子细胞，内皮层细胞和静止中心( q c ) 细胞( n a k a j i m a e t a l ，2 0 0 1 ) 。这些结果表明s h r 蛋白改变了位置，即从中柱细胞到邻近的细胞层。 这种移动似乎被严格调控，尽管详尽的机制还没有被阐明。此外，在中柱细胞， s h r 蛋白定位在细胞核和细胞质，但是一旦s h r 蛋白转移到内皮层，它就只出现 在细胞核中( n a k a j i m a e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。这些结果表明s h r 不但作为细胞分裂的激活 博：卜学位论文 子和细胞分化的诱导子，还是一个位置信号。 那么分生组织皮层内皮层起始细胞的1 次平周分裂受到阻断后，这种分生组 织区的细胞排列方式改变是否会影响后序垂周分裂活性，造成短根表型呢? s a b a t i n i 等( 2 0 0 3 ) 的研究表明，短根表型并不是由于这1 次平周分裂受阻造成的。 其问题的实质还是在静止中心上。s c f ，突变体的q c 细胞性状不正常。用代表静 止中心身份的报告株系检测发现在突变体e o q c 4 6 ，q c 2 5 的身份丧失，q c l 8 4 身 份仍存在，表明静止中心身份部分消失。用淀粉粒染色的结果显示s c f 一，突变体根 冠柱细胞起始细胞已分化，表明根冠柱细胞起始细胞功能已丧失。利用在静止中 心特异表达的g a l 4 g f pe n h a n c e rt r a pl i n e 与u a s ( 受g a l 4 n i ；j 应的上游激活序 列) 启动子接s c r 转基因株系之间杂交，使得在s c f ，突变体的静止中心特异表达 s c r ，结果表明足以回复s c f j 突变体的静止中心身份，并且突变体的主根长度也 随之回复到野生型状态。这说明q c 的身份直接需求q c 部位的s c r 活性，而皮层 内皮层部位的s c r 活性与q c 并无直接关系，表明s c f 突变体分生组织不能维持 正常分裂活性并不是皮层内皮层起始细胞平周分裂缺陷造成的，而是q c n 份的 部分丧失所致。 q c 及其与之相邻的干细胞构成的这个干细胞小生境对于维持根尖分生组织 活性是极其重要的。a i d a 等( 2 0 0 4 ) 鉴定了2 个含有a p 2d o m a i n 的转录因子p l t l ( p l e t h o r a1 ) 和p l t 2 ( p l e t h o r a 2 ) ，两者功能冗余，是胚胎发生过程中 胚根部位干细胞小生境确立所必需的，也是胚后根分生组织干细胞小生境维持所 必需的。在胚后根分生组织中忍砌表达部位是在q c 及其与之相邻的干细胞中， p l t j p t 2 9 t 突变体根冠柱细胞层数增加，q c 身份缺失，干细胞缺失，分生组织不 能维持，在发芽6 8 天后根尖细胞已全部处于分化状态。尼哟转录受生长素所 诱导，尼啪表达部位也是生长素积累的部位：尼7 基因与5 幽硌饼对于静止中心 与干细胞的确立均是必需的，但两者不是同一路径中的上下游关系而是平行的， 它们共同决定着q c 的身份。 2 3 氧化还原剂在胚后分生组织维持中的机制研究 q c ! i n 何形成并不知道，但被认为可能是生长素极性运输的后果( k e r ka n d f e l d m a n ，1 9 9 5 ；k e r ke ta 1 ，2 0 0 0 ) 。一系列生长素信号受到干扰的突变体例如，印， 博：i j 学位论文 e t t ，a u x l 和p i n l ，均表明生长素对于根分生组织的确立、维持和组织起着中心作用 ( s a b a t i n ie ta 1 ，1 9 9 9 ) 。生长素输出载# f p i n 4 突变体不能在静止中心以及下方的根 冠柱细胞中形成生长素积累库，p i n 4 突变体q c 及其周围干细胞的身份已混乱， f r i m l 等( 2 0 0 2 ) 通过对a t p i n 4 的鉴定，提出了q c 确立是由于生长素库积累造成 的。根据这一模型q c 形成可以被看作是生长素梯度积累的后果，但是生长素如 何确立q c 的机制并不清楚，氧化还原剂可能作为联系生长素矛i q c 形成的一种中 间媒介( k e r k 和f e l d m a n ，1 9 9 5 ) 。 许多研究结果支持维生素c 和谷胱甘j k ( g l u t a t h i o ng s h ) 在根分生组织确立 中所起的作用。与周围分裂活跃的分生组织相比，玉米q c 处维生素c 含量较低 ( k e r ka n df e l d m a n ，19 9 5 ) ，拟南芥q c 处谷胱甘肽g s h 水平较4 k 乇( f r i c k e re ta 1 ，2 0 0 0 ； s m a c h e z - f e m h n d e ze ta 1 ，1 9 9 7 ) 。c h e n g 等( 1 9 9 5 ) 分离n 2 个基因r m l l ，r m l 2 缺陷的突变体，这些突变体能产生正常的胚根，但缺少根尖的分生组织，在萌发 后不再进行或只进行有限次数的细胞分裂，导致主根极短。v e m o o u x 等( 2 0 0 0 ) 克隆了尺尬j 基因，发现它编码谷胱甘肽g s h 生物合成的第一个酶：谷氨酰半胱氨 酸合成酶( y g l u t a m y l c y s t e i n es y n t h e t a s e ) 。外源添 3 i g s h f i 邑恢复突变体的根长， 说明根尖分生组织的维持依赖于g s h 。 j a n g 等( 2 0 0 3 ) 报道玉米q c 细胞与周围分生组织相比处于高度氧化状态。 在q c 细胞中，还原状态的维生素c 很低而其氧化产物脱氢抗坏血酸 d e h y d r o a s c o r b a t e ( d h a ) 贝i j 较高，类似地还原状态的g s h 含量很低而氧化状态的谷 光甘肽o x i d i z e dg l u t a t h i o n e ( g s s g ) 贝j j 较高。当根尖生长素积累的分布受n p a 干扰 后，q c 处的氧化状态下降，然后q c 细胞离开g 1 期进入有丝分裂。j a n g 等( 2 0 0 3 ) 的结果支持了氧化还原剂可能作为联系生长素和q c 形成的一种中间媒介的看 法。 2 4 其它因素在胚后分生组织维持中的机制研究 冠部干细胞产生的分泌蛋i 自c l v 3 ( c l v a t a 3 ) ，激活c l v l 一c l v 2 受体复合 体，负向调控冠部分生组织区域( t r o t o c h a u de ta 1 ，1 9 9 9 ；r o j oe ta 1 ，2 0 0 2 ；b r a n de t a 1 , 2 0 0 0 ) 。最近发现i 塞_ - - c l v 3 信号途径也存在于根的分生组织调控中 ( c a s a m i t j a n a m a r t i n e ze ta 1 ，2 0 0 3 ；h o b ee ta 1 ，2 0 0 3f i e f se ta 1 ，2 0 0 5 ) 。根分生组织 博：l 学位论文 不能维持有2 种原因，一种是由于q c 的活性或特异性丧失而造成干细胞不能维 持，另一种是干细胞的子细胞丧失分裂能力或迅速进入分化状态。在根分生组织 中超表达c l e l 9 ( c l v 3 同源物) 可以使分生组织区域逐渐缩小，但最初出现分生组 织区域缩d , i , - j q c 特异性和干细胞维持还没有改变，表明c l v 3 信号途径是直接参 与分生组织细胞分裂的调控( c a s a m i t j a n a m a r t i n e ze ta 1 ) 。 目前拟南芥中已经鉴定了不少胚后分生组织维持缺陷的突变体。h l r ( h a l t e d r o o t ) 突变体的胚后冠部分生组织与根分生组织均不能正常维持，发芽后根分生组 织的q c 身份丧失。h l r 基因编码负责蛋白降解的2 6 s 蛋白酶体的一个小亚基， h l r 基因在根分生组织和冠部分生组织中均有表达，包括q c 和o c ( o r g a n i z i n g c e n t e r ) 处。办扣突变体的蛋白酶体活性下降，表明冠部、根部分生组织的维持是 依赖于该蛋白酶体介导的程序性降解的( u e d ae ta 1 ，2 0 0 4 ) 。 第二部分组氨酸的生物合成 组氨酸合成过程简介 氨基酸是蛋白质合成的基本组分。不同生物合成氨基酸的种类和能力不同。 对人类来说，组氨酸作为一种必需氨基酸来自我们的日常食物摄入。与人类不同 的是，高等植物能够合成自己所需的全部2 0 种氨基酸，微生物合成氨基酸的能 力有很大差异，例如大肠杆菌( e s c h e r i c i ac o l i ) 可合成全部所需氨基酸，而 乳酸菌却需从外界获取某些氨基酸。 组氨酸的生物合成以p r p p ( 5 一磷酸核糖一17 一焦磷酸) 和a t p 为原料，p r p p 为组氨酸生成提供5 个c 原子，a t p 的腺嘌呤为组氨酸咪唑环生成提供n 和c 各 一原子。咪唑环的另一n 原子来自谷氨酰胺侧链( 见图1 1a ，b ) 。经过复杂 的生化过程，经历1 1 个步骤，共有1 0 种酶参与。组氨酸的合成耗费了对细胞来 说大量的能量。这一过程与核苷酸的代谢息息相关。因此组氨酸的合成途径也可 以认为是嘌呤核苷酸代谢的一个分枝。 合成第1 步是a t p 的嘌呤环n l 与p r p p 的核糖基c 1 缩合形成p r a t p ( 57 一磷 酸核糖- a t p ) ，负责催化的酶是a t pp r t ( a t pp h o s p h o r i b o s y lt r a n s f e r a s e ) 。 博= 卜学位论文 第2 步在p r a p h ( p h o s p h o r i b o s y l a t pp y r o p h o s p h o h y d r o l a s e ) 的催化下，p r a t p 的 a t p 水解去掉一个焦磷酸分子形成p r a m p 。第3 步在p r a m p 解环酶( p r a c h ， p h o s p h o r i b o s y l a m pc y c l o h y d r o l a s e ) 的作用下p r a m p 的嘌呤环被打开，形成b b m i i ( n 7 一 ( 57 一p h o s p h o r i b o s y l ) - f o r m i m i n o - 5 - a m i n o i m i d a z o l e - 4 - c a r b o x a m i d e r i b o n u c l e o t i d e ) ( n7 - ( 57 一磷酸核糖) 一亚氨甲基 - 5 - 氨基咪唑- 4 - 羧胺核苷 酸) 。第4 步在b b m i i 异构酶的作用下将b b m i i 转换为b b m i i i ，即第3 步产物中 的核糖基团转变为核酮糖基团。第5 步和第6 步紧密相连，分别由谷胺酰胺酰胺 基转移酶和环化酶( g l u t a m i n ea m i d o t r a n s f e r a s e c y c l a s e ) 催化形成咪唑甘油 磷酸和5 一氨基咪唑一4 一羧酰氨核苷酸，后者是嘌呤核苷酸生物合成的中间产 物，继续参加组氨酸合成的是咪唑甘油磷酸i g p ( i m i d a z o l e g l y c e r 0 1 p h o s p h a t e ) 。第7 步由咪唑甘油磷酸脱水酶i g p d ( i m i d a z o l e 9 1 y c e r 0 1 p h o s p h a t ed e h y d r a t a s e ) 催化i g p 通过脱水反应生成咪唑 丙酮醇磷酸i a p ，第8 步由磷酸组胺醇氨基转移酶( h i s t i d i n o lp h o s p h a t e a m i n o t r a n s f e r a s e ) 即h p a 催化，将谷氨酸上的氨基基团转移到咪唑丙酮醇磷酸 i a p 上形成磷酸组氨醇。第9 步磷酸组氨醇磷酸酶将上述膦酸酯水解生成组氨醇。 第1 0 步和第1 1 步都是由需n a d 的组氨醇脱氢酶将组氨醇连续脱氢，第一次脱氢 形成组氨醛，第二次则生成终产物组氨酸( 图1 1a ，b ) ( 沈同等，1 9 9 1 ) 。 卜i 司 i a c 前a 铀n l i _ j n h o ho h o h o h h o o o h h n c ， h 2 p - o o h o h 0 h o h 图1 1 一a ：组氨酸合成早期途径 h p 一0 一c h z ”- t - , , c h z n 心 l - h i s t i d m o lp h o s p h a t e 医互四 7 r h 。c h h o c h 2 h i i l i c h 2 n 心 l - k i s t i d i r 屺 图1 1 - - b ：组氨酸合成后期途径 l - k i s 1 i d m o l n 面面习 c a t a b o l i s m 博：i j 学位论文 2 微生物及植物中组氨酸合成酶基因的鉴定 细菌和一些低等真核生物中组氨酸的合成最先得到鉴定( w in k l e r1 9 8 7 ) 。 在大肠杆菌( e s c f l e r i c i ac o l i ) 中，负责组氨酸生物合成途径1 1 步所需的1 0 个 酶由8 个基因所编码，这是由于其中的h i s b s b h i s c 是多功能酶。h i s b 在大多数的 真细菌中包含两种酶活性：i m i d a z o l eg l y c e r o lp h o s p h a t ed e h y d r a t a s e ( i g p d ) 和h i s t i d i n o lp h o s p h a t ep h o s p h a t a s e ( c a r l o m a g n oe ta 1 1 9 8 8 ) 。h i s c 也包 含两种酶活性：a t pp h o s p h o r i b o s y lt r a n s f e r a s e 和h p a ( h i s t i d i n o lp h o s p h a t e a m i n o t r a n s f e r a s e ) 。在大肠杆菌中这8 个基因被整合在一个单独的操纵子中 ( c a r lo m a g n oe ta 1 19 8 8 ) 。而在酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r ev i s i a e ) 中，组氨 酸生物合成1 l 步所需的1 0 个酶由分散在各个染色体中的7 个基因所控制 ( m o r t i m e re ta 1 1 9 9 4 ，a 1 i f a n oe ta 1 1 9 9 6 ) 。酵母中也存在着2 个多功能酶 ( h i s 4 矛u h i s 7 ) 。h i s 4 蛋白可以分成3 个亚结构域，h i s 4 a ，h i s 4 b 和h i s 4 c ，各自 分别地与大肠杆菌的h i s i ，e 和h i s d 相对应( d o n a h u ee t