（植物学专业论文）拟南芥cpr5基因通过aba和lox两条平行途径调节种子萌发及幼苗发育.pdf

s o u t hc h i n an o r m a l u n i v e r s i t y t h ed i s s e r t a t i o nf o r m a s t e r sd e g r e e l u l ll lii i i ii i ll lll liil y 1 7 6 8 2 5 5 a r a b i d o p s i sc p r 5 i n d e p e n d e n t l y r e g u l a t e ss e e dg e r m i n a t i o na n d s e e d l i n gd e v e l o p m e n t t h r o u g hp a r a l l e l l o x p a t h w a ya n da b a s i g n a l i n g s u p e r v i s o r ：p r o f c h e n g w e iy a n g m a j o r ： c o l l e g e ： b o t a n y c o l l e g eo fl i f es c i e n c e s u b m i t t e dd a t e ： m a y2 8 ，2 0 1 0 摘要 拟南芥c p r 5 基因通过a b a 和l o x 两条平行途径调节种子萌 发和幼苗发育 摘要 专业：植物学姓名：高桂兰导师：阳成伟教授 a b a 在植物发育和环境胁迫中起重要的调节作用，脂氧合酶l o x 在种子萌 发和幼苗生长发育上有重要作用，c p r 5 是最初在筛选抗病突变体中鉴定的基 因，越来越多的研究发现c p r 5 与其它的信号途径间存在复杂的相互作用，但是 c p r 5 在l o x 途径及a b a 途径中的具体作用还不清楚。本研究主要介绍c p r 5 在l o x 途径及a b a 途径中的生物学功能，取得的主要结果如下： l 、r t - p c r 检测c p r 5 基因在拟南芥不同组织和器官中表达水平，结果表明 该基因在拟南芥的根、茎、叶、花、角果等组织中均有表达，且叶片中表达最 高。这与利用c p r 5 基因的启动子驱动g u s 报告基因的研究结果相一致； c p r 5 一g f p 转化植物后，共聚焦显微镜观察发现c p r 5 定位于细胞质和细胞膜上； 利用r t - p c r 分析了野生型拟南芥在不同胁迫条件下c p r 5 的基因表达水平，结 果显示，在a b a ，n d g a 和干旱下c p r 5 的表达是下调的。 2 、构建c p r 5 的表达载体，分别转化拟南芥野生型和c p r 5 突变体，得到超 表达和互补的转基因植株，通过p c r 鉴定，证明已得到相应的转基因植株；表 型分析发现，在正常培养条件下，突变体c p r 5 与野生型无差异，土培一段时间 后，突变体c p r 5 比野生型株系矮小。 3 、进一步的研究发现，突变体c p r 5 在种子萌发，子叶变绿，主根伸长阶段 对a b a 超敏感，而超表达c p r 5 的转基因株系对a b a 不敏感，a b a ( 1 0 0 1 - l m ) 处理后，a b a 相关的标记基因在野生型，突变体c p r 5 和超表达株系之间并无明 显差异。此外，与突变体c p r 5 一样，双突变体c p r 5a b i l 对a b a 也是超敏感的。 另一方面，土培干旱处理和离体叶片失水都显示突变体c p r 5 具明显的抗旱性， 光刺激的气孔开放和a b a 诱导的气孔关闭条件下，c p r 5 的气孔开度均处于最 小的状态。 摘要 4 、突变体c p r 5 在种子萌发，子叶变绿，主根伸长阶段对n d g a 和茶多酚 超敏感。n d g a 能加重a b a 对突变体c p r 5 的抑制程度。n d g a ( 1 0 0 1 t m ) 处理， 与野生型相比，突变体c p r 5 中l o x 4 基因的表达的受n d g a 的上调幅度比较大， 而l o x 途径相关的其他标记基因在野生型，突变体c p r 5 和超表达株系之间无明 显差异。 5 、实验结果还表明c p r 5 的跨膜区是其功能所必需的。 6 、本研究结果表明c p r 5 是一种新型的调控因子，c p r 5 通过a b a 和l o x 两条平行途径共同调节种子萌发和幼苗发育。 关键词：拟南芥c p r 5 a b an d g a 幼苗发育 a b s t r a c t a r a bid o p sis6 掰in d e p e n d e n t l yr e g u l a t e s s e e dg e r min a tl0 na n ds e e d lin gd e v e l o p m e n t t h r o u g hp a r a l l e ll o xp a t h w a ya n da b a sig n a lin g m a j o r b o t a n y n a m e ：o u i l a ng a o s u p e r v i s o r ：p r o f c h e n g w e i y a n g a b s t r a c t 3 h ep h y t o h o r m o n ea b s e i s i ea c i d ( a b a ) i sw e l lk n o w nf o ri t sr e g u l a t o r yr o l e si n i n t e g r a t i n ge n v i r o n m e n t a lc o n s t r a i n t sw i t ht h ed e v e l o p m e n t a lp r o g r a m so fp l a n t s l o x sp l a yi m p o r t a n tr o l e si ns e e dg e r m i n a t i o na n ds e e d l i n gg r o w t ha n dd e v e l o p m e n t c p r 5g e n ew a si n i t i a l l yi d e n t i f i e di ns c r e e n sf o rm u t a n t sw i t he n h a n c e dd i s e a s e r e s i s t a n c e a c c u m u l a t i n ge v i d e n c es u g g e s t e dt h a tc p r 5k a sc l o s ea n dc o m p l e x i n t e r a c t i o n sw i t ho t h e rs i g n a l l i n gn e t w o r k s , b u tt h ep r e c i s er o l eo fc p r 5i nl o x p a t h w a y a n da b as i g n a l l i n gr e m a i n se l u s i v e t h e b i o l o g i c a l f u n c t i o no ft h e a x a b i d o p s i sc p r 5g e n ei nl o xp a t h w a ya n da b as i g n a l i n gi sp r o v i d e dh e r e t h e m a i nr e s u l t sw e r ea sf o l l o w s ： 1 t h et e m p o r a la n ds p a t i a l e x p r e s s i o np a t t e r n s o fc p r 5i na r a d i d o p s i sw e r e d e t e c t e db yr t - p c ra n dg u ss t a i n i n g t h er e s u l t ss u g g e s t e dc p r 5e x p r e s s e di n a l lt i s s u e si n c l u d i n g r o o t ，l e a f , s i l i q u ea n ds e e d l i n g ，a n di te x p r e s s e dm o s ti n r o s e t t e t h ec o n f o c a ll a s e rs c a n n i n ga n a l y s i so fr o o t so ft r a n s g e n i cs e e d l i n g s e x p r e s s i n gc p r 5 一g f pf u s i o np r o t e i ns h o w e dt h a tc p r 5w a sl o c a t e di nc y t o p i a s m a n de e l lm e m b r a n e 2 c p r 5g e n ee x p r e s s i o nv e c t o rw a sc o n s t r u c t e da n dt r a n s f o r m e di n t ow i l dt y p ea n d c p r 5 r t - p c ra n a l y s i ss h o w e dt h a tc p r 5g e n ew a si n t e g r a t e di na r a d i d o p s i s t h em u t a n tc p r 5a n dt r a n s g e n i cs e e d l i n g so v e r - e x p r e s s i o no fc p r 5w e r eu s e df o r a l lf u r t h e rs t u d i e s u n d e rn o r m a lc u l t u r ee o n d i t i o n , 1 1 0o b v i o u sd i f f e r e n c e sw e r e o b s e r v e di na l lt h et h r e eg e n o t y p i es e e d l i n g sa ts e e d l i n gg r o w t hs t a g e so np l a t e s , i i i a b s t r a c t w h i l et h em u t a n tc p r 5e x h i b i t e ds m a l l e ra e r i a lp a r t st h a nw i l d t y p eo ns o i l - g r o w n p l a n t s 3 t h em u t a n tc p r 5w e r eh y p e r s e n s i t i v et oa b at h a nw i l dt y p e d u r i n gs e e d g e r m i n a t i o n , c o t y l e d o ng r e e n i n ga n dp r i m a r yr o o tg r o w t h , w h e r e a st r a n s g e n i c p l a n t so v e r - e x p r e s s i n gc p r 5w e r eh y p o s e n s i t i v e t h et r a n s c r i p t i o nl e v e lo ft h e a b a - i n d u c e dm a r k e rg e n e sw a sa n a l y z e db ys e m i - q u a n t i t i v er t - p c ri n10 0 1 x l v a b a t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h et r a n s c r i p t i o nl e v e lo fa b l l ，a b l 2 , a b l 5 ， a t p p 2 c , a b f 3 ，a b f 4 ，r d 2 9 a ，r d 2 9 b ，r d 2 2a n dr a b l 8w a ss i m i l a ri na l lt h e t h r e eg e n o t y p i cs e e d l i n g s f u r t h e r m o r e ，d o u b l e - m u t a n ta n a l y s e so fc p r 5w i t h a b a - i n s e n s i t i v em u t a n ta b i li n d i c a t i n gt h a t ，f i t st h ec p r 5m u t a t i o n , t h ed o u b l e m u t a n tc p r 5a b i lw a sa l s oh y p e r s e n s i t i v et oa b a o nt h eo t h e rh a n d ，t h ec p r 5 m u t a t i o ns h o w e dad r o u g h t - r e s i s t a n tp h e n o t y p e ，s t o m s t a la p e r t u r eo fc p r 5w a st h e s m a l l e s tb o t hi n l i g h t - i n d u c e d s t o m a t a l o p e n i n ga n d a b ai n h i b i t i o no f l i g h t - i n d u c e ds t o m a t a lo p e n i n g 4 t h em u t a n tc p r 5w e r ea l s oh y p e r s e n s i t i v et on d g aa n dt e ap o l y p h e n o l s r e s p o n s e si ns e e dg e r m i n a t i o n , c o t y l e d o ng r e e n m ga n dr o o tg r o w t h i n t e r e s t i n g l y , i tw a sf o u n dt h a tn d g at r e a t m e n ta g g r a v a t e dt h ea b ai n h i b i t e dg r o w t h i n a d d i t i o n , t h et r a n s c r i p t i o no fl o x 4g e n ew a sm u c hm o r eu p r e g u l a t e di nc p r 5 m u t a t i o nt h a nt h a to fw i l dt y p ei nr e s p o n s et on d g a , a n dt h e r ew e r en oo b v i o u s d i f f e r e n c e si nl o x l ，l q 磁，l o x 3 ，l o x , l o x 6 , a o s la n dh p l l 5 i tw a sa l s os h o w nt h a tt h ep o t e n t i a lt r a n s m e m b r a n er e g i o n sa tt h ec a r b o x y t e r m i n u so fc p r 5w e r ei m p o r t a n t 6 a l lt h o s er e s u l t s s u g g e s tt h a t c p r 5r e p r e s e n t san e wr e g u l a t o rw h i c h i n d e p e n d e n t l yr e g u l a t e ss e e dg e r m i n a t i o na n de a r l ys e e d l i n gd e v e m p m e mt h r o u g h p a r a l l e ll o xp a t h w a ya n da b as i g n a l i n g k e yw o r d s ：a r a b i d o p s i st h a l i a n ac p r 5a b an d g as e e d l i n gd e v e l o p m e n t i v 缩略词表 缩写名 3 u t r 5 u t r a b a a m p b p c d n a d d h 2 0 d e p c d n t p d t t g g f p g u s h k a n l o x m e j a m g m m m l m m m s n c e d n d g a o d p c r 砒f i 州蹴 缩略词表 英文名 3 - u n t r a n s l a t e dr e g i o n 5 - u n t r a n s l a t e dr e g i o n a b s c i s i ca c i d a m p i c i l i n b a s ep a i r c o m p l e m e n t a r yd n a d o u b l ed i s t i l l e dw a t e r d i e t h y p y r o c a r b o n a t e d e o x y c y t i d i n et r i p h o s p h a t e 1 , 4 一d i t h i o e r y t h r i t o l g r a m g r e e nf l u o r e s c e n tp r o t e i n i b - g l u c u r o n i d a s e h o u r k a n a m y c i n l i p o x y g e n a s e s m e t h y lj a s m o n a t e m i l l i g r a m m i n u t e m i l l i t e r m i l l i m o l e m u r a s h i g ea n ds k o o gm e d i u m n i n e - c i c e p o x y c a r o t e n o i dd i o x y g e n a s e n o r d i h y d r o g u a i a r e t i ea c i d o p t i c a ld e n s i t y p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n r i f a m p i c i n r i b o n u c l e 雠 v 中译名 3 末端非翻译区 5 末端非翻译区 脱落酸 氨苄青霉素 碱基对 互补d n a 双蒸水 焦碳酸二乙酯 脱氧核糖核苷酸 二硫苏糖醇 。 克 绿色荧光蛋白 葡糖醛酸酶基因 小时 卡那霉素 脂氧合酶 茉莉酸甲酯 毫克 分钟 毫升 毫摩尔 m s 基本培养基 9 - j 颐环氧类胡萝卜素双加氧酶 去甲二氢愈创木酸 光密度 聚合酶链式反应 利福平 核糖核酸酶 缩略词表 r o t a t i o n sp e rm i n u t e r e v e r s et r a n s c r i p t i o n - p c r s e c o n d s i l w e t t h e r m u s aq u a t i c u sd n ap o l y m e r a s e t r a n s f e rd n a m e l t i n gt e m p e r a t u r e t r i h y d r o x y m e t h y l a m i n o m e t h a n e m i c r o g r a m m i c r o l i t r e m i c r o m o l e c o l u m b i aw i d e t y p e v l 每m i n 转速 反转录p c r 秒钟 表面活性剂 嗜热水生菌d n a 聚合酶 转移d n a 解链温度 三( 羟甲基) 氨基甲烷 微克 微升 微摩尔 野生型 娘 a 呻m s洲删璺恤呈p m 蝴盯 目录 目录 摘要i a b s t r a c t i i i 缩略词表v 第1 章引言1 1 1a b a 途径一l 1 1 1a b a 的合成一l 1 1 2a b a 参与的生理过程3 1 2l o x 途径。3 1 2 1l o x 途径中的酶3 1 2 2l o x 参与的生理过程4 1 2 3l o x 途径的抑制剂n d g a 5 1 3c 尸r 5 6 1 3 1c p r 5 的结构，突变位点及突变表型6 1 3 2c p r 5 参与植物的发育及形态建成一7 1 3 3c 脉5 与生物和非生物胁迫7 1 4 本研究的目的和意义一8 第2 章材料与方法9 2 1 实验材料9 2 1 1 植物材料9 2 1 2 菌株及质粒9 2 1 3 工具酶、试剂及试剂盒9 2 1 4 常用培养基和溶液的配制9 2 1 5 本论文中采用的引物对1 0 2 2 实验方法1 1 2 2 1 载体的构建及鉴定l l 2 2 2 载体的构建图谱1 5 2 2 3 拟南芥的培养及转化1 7 2 2 4 各项生理指标的测定1 7 2 2 5 基因表达分析1 9 2 2 6g u s 组织化学定位分析2 0 2 2 7 共聚焦显微实验2 0 第3 章结果与分析2 l l 目录 3 1c p r 5 基因的c d n a 和其基因的结构特点2 l 3 2c 尸雕基因的表达模式2 2 3 3 不同胁迫处理下c 袱5 基因的表达变化。2 3 3 4c p r 5 蛋白的细胞定位研究2 3 3 5 过表达c p r 5 及其突变体的分子鉴定及表型分析2 4 3 6 突变体c p r 5 及3 5 s - c p r 5 对a b a 的响应。2 5 3 7 突变体c p r 5 及3 5 s - c p r 5 对干旱的响应2 6 3 8a b a 对突变体c p r 5 及3 5 s - c p r 5 中胁迫应答基因的影响2 7 3 9c p r 5 与a b l l 的遗传关系2 8 3 1 0 突变体c p r 5 及3 5 s - c p r 5 对n d g a 、a b a 叠加的响应2 8 3 1 1 突变体c p r 5 及3 5 s - c p r 5 对n d g a 的响应3 0 3 1 2 突变体c p r 5 及3 5 s - c p r 5 对茶多酚的响应3 1 3 1 3 突变体c p r 5 及3 5 s - c p r 5 对m e j a 的响应3 l 3 1 4 n d g a 处理，突变体c p r 5 及3 5 s - c p r 5 中l o x 途径相关基因的表达变 化：；：1 3 1 5c p r 5 蛋白的细胞膜关联性研究3 3 第4 章讨论一3 5 4 1a 啮5 在a b a 途径中的作用3 5 4 2c p r 5 介导a b a 和l o x 两条平行途径3 6 4 3c p r 5 在l o x 途径中的作用3 6 4 4c p r 5 在a b a 信号和l o x 途径中的作用模型3 7 参考文献。3 9 致谢4 4 附录一4 5 u 第1 章引言 第1 章引言 植物由于其固着生长的生物学特性，其生长发育过程及代谢调控与内外环境 有着密切的相互联系，并且在生长过程中不可避免地受环境信号的调控并遭遇到 各种逆境胁迫，如盐碱、贫瘠、干旱的土地，寒冷、冰冻的气候，各种病原微生 物的侵害等；植物对逆境的响应和适应不仅通过生理生化过程，还需要通过分子 细胞水平的调控。研究植物在逆境条件下的生长发育特性，是培育能在逆境条件 下正常生长发育的植物的重要基础；尤其在分子水平揭示这种特性，更是利用现 代生物技术改良植物获得抗逆性强的植物的先决条件。 1 1a b a 途径 脱落酸( a b a ) 作为一种植物激素，几乎存在于所有高等植物中。a b a 参与 了多个植物生长发育过程，越来越多的研究表明：a b a 在生物体内最主要的功 能是作为胁迫激素参与了植物对外界胁迫条件的适应。对于a b a 合成、代谢和 信号途径的研究都表明a b a 调节了植物逆境胁迫信号传导和生长发育过程 ( v e r s l u e sa n dz h u , 2 0 0 5 ) 1 1 1a b a 的合成 通过鉴定a b a 生物合成缺陷突变体，人们已经揭示出许多脱落酸生物合成 一 过程中的关键因子。在高等植物中a b a 并不是主要由直接途径合成的，而是通 过裂解c 4 0 的类胡萝卜素产生的，这是a b a 合成途径的起始步骤( z e e v a a r ta n d c r e e l m a n , 1 9 8 8 ) 。玉米黄质环氧酶( 烟草中命名为a b a 2 、拟南芥中为a b a b 催化 玉米黄质的环氧化作用和环氧黄质为紫黄质( m a r i n e ta 1 ，1 9 9 6 ) 。该基因突变( a b a l ) 限制了脱落酸和叶黄素的生物合成以及玉米黄素环氧酶的活性，是a b a 合成的 第一步。a b a 2 主要参与了a b a 合成过程中由黄素到a b a 醛的转换。该过程称 为a b a 合成中第二步。a b a 3 ( 又被称为l o s s ) 编码硫酸化酶，其激活的钼协同 因子使a b a 醛氧化酶催化完成a b a 合成的最后一步( x i o n ge ta 1 。2 0 0 1 ) 另外，生化研究表明9 顺式环氧类萝卜素双加氧酶( n c e d ) 是a b a 合成的关 键酶。n c e d 催化9 顺式叶黄素的裂解，形成黄质醛( 第一个c 1 5 中间产物) ，该 反应是a b a 生物合成的限速步骤( 图1 1 ) ( t a n e ta 1 ，1 9 9 7 ；c h e m y sa n dz e e v a a r t ， 2 0 0 0 ；s e oa n dk o s h i b a , 2 0 0 2 ) 。研究表明拟南芥基因a t n c e d 6 ，a t n c e d 9 在种子 发育过程的胚乳和胚中表达，n c e d 参与合成的a b a 控制了种子的休眠抑制了 萌发( l e f e b v r ee ta 1 ，2 0 0 6 ) 。n c e d 是水分胁迫下引起a b a 含量增高的关键酶 华南师范大学学位论文 ( r e ne ta 1 2 0 0 7 on d g a 可能是n c e d 的抑制剂，研究发现n d g a 可以抑制胁 迫条件下a b a ( s t r e s sa b a ) 的合成，并且这种抑制作用是剂量依赖性的，2 0 p m 的n d g a 就可明显抑制a b a 的合成，l o o p m 时，基本上可以阻滞a b a 的合 成( p e n e t a l ，2 0 0 7 b ) 。 a i 删啉d o p s i s ：a t a b a l n p q 2 1 t o s 8 m p l u m b a g i n i f o l i s ：n l b a 2 r i ：o s a l l 第1 章引言 1 1 2a b a 参与的生理过程 一方面a b a 作为植物发育的重要调节物质，参与调控植物发育的诸多重要 过程：如参与植物种子贮藏蛋白和脂类的合成、抑制种子萌发、耐受种子脱水和 促进休眠、抑制胚胎萌发及抑制生长时期转变、促进叶片衰老脱落等( l e u n ga n d g i r a u d a t ，1 9 9 8 ；r o c k ，2 0 0 0 ) 。有文献报道为使种子能在适宜的条件下萌发，逆境 条件下，a b a 常使种子保持在休眠状态；种子萌发后，在非适宜环境下a b a 也 可能抑制幼苗的形态建成及发育，通过减慢幼苗的生长速度等待适宜环境的到 来。因此这种抑制作用可以说是植物早期生长发育的检测点( l o p e z - m o l i n ae t a l 。 2 0 01 ；f i n k e l s t e i ne ta 1 ，2 0 0 2 ；n a m b a r aa n dm a r i o n - p o l l ，2 0 0 3 ) 。 另一方面，a b a 作为触发植物对逆境胁迫应答反应的传递体，参与调控植物 对逆境胁迫，如干旱、高盐、低温等产生的应答。在较高级的发育阶段，a b a 主 要通过调节气孔的运动响应各种非生物胁迫( f i n k e l s t e i ne ta 1 ，2 0 0 2 ；a s s m a n n 2 0 0 3 ；c h r i s t m a n ne ta 1 ，2 0 0 6 ；y a m a g u c h i s h i n o z a k ia n ds h i n o z a k i 。2 0 0 6 ) 。通过鉴定 响应胁迫信号的特定组分或基因，己初步构画出从逆境胁迫信号的猝发到逆境 基因表达整个信号转导途径的框架。在a b a 调控胁迫相关基因表达的信号转导 途径中，a b a 对其下游响应基因的调控主要是转录水平的调控，与之相关的信 号转导组分成员主要包括a b i 家族的多个成员，其中么删( l e u n ge ta 1 ，1 9 9 4 ) 和a b l 2 ( r o d r i g u e ze ta 1 ，1 9 9 8 ) 基因编码的蛋白均与蛋白丝氨酸苏氨酸磷酸酶 2 c ( p p 2 c ) 有8 0 同源性，结构非常相似，通过减少蛋白磷酸化负调控a b a 反应。 它们的磷酸化调节目标是一类具有基本的亮氨酸锌指结构b z i p 转录因子的激 活，包括a b a 响应元件( p 0 3 r e ) 结合因子a b f 3 ，a b f 4 ，a b l 5 。这些活化的转 录因子再与a b a 响应基因( a b a r e s p o n s eg e n e s ) 启动子区存在的a b a 响应元件 ( a b a r e s p o n s ee l e m e n t s ，a b r e ) 结合，从而激活或抑制着下游基因的表达。 1 2l o x 途径 1 2 1l o x 途径中的酶 脂氧合酶( l i p o x y g e n a s e sl o x s ；e c1 1 3 1 1 1 2 ) 是含有非血红素离子的双加氧 酶，在动植物和微生物中普遍存在( b r a s h , 19 9 9 ；f e u s s n e ra n dw a s t e r n a c k , 2 0 0 2 ) 。 己经发现拟南芥有6 个l o x 基因，马铃薯有1 4 个l o x 基因，番茄有5 个l o x 基因，大豆有9 个l o x 基因( c h e nc ta 1 ，2 0 0 4 ；l i a v o n c h a n k aa n df e u s s n e r , 2 0 0 6 ) 。 l o x 是多功能酶，至少催化3 种不同的反应类型：1 ) 脂质的双加氧化反应 ( 过氧化物酶反应) ；2 ) 氢过氧化脂质的次级转化( 氢过氧化物酶反应) ( k l m ne ta 1 ， 3 华南师范大学学位论文 1 9 9 1 ) ；3 ) 环氧白三烯的形成( 白三烯合成反应) ( s h i m i z ue la 1 ，1 9 8 4 ) 。在生理条件 下，植物中的双加氧化反应是最普遍的l o x 催化含( z ，z ) 1 ，4 戊二烯结构单元 的不饱和脂肪酸的加氧反应，产生不饱和脂肪酸的过氧化物。 脂肪酸过氧化物是脂氧合酶作用的初产物，它们是高反应活性的分子，能被 迅速转化为具有生理活性的物质，即氧f l 旨( o x y l i p i n s ) 。目前发现脂肪酸过氧化物 在酶的作用下至少可以通过六条途径转化( g r e c h k i n ，1 9 9 8 ) ，参与代谢的酶包括 过氧化氢裂解酶( h y d r o p e r o x i d el y a s e ，h p l ) 、氧化丙二烯合酶( a l l e n eo x i d e s y n t h a s e ， a o s ) 、联乙烯醚合酶( d i v i n y le t h e rs y n t h a s e ，d e s ) 、过氧酶( p e r o x y g e n a s e ，p o x ) 、 脂氧化酶( l i p o x y g e n a s e ，l o x ) 等( 图1 2 ) 。植物氧脂是有效的生物调节剂，在 信号转导、植物的生长发育、衰老、器官的形成、体内平衡的保持等方面都具有 重要的作用。 f a t t y 厂a c i d s 9 4 1 3 l i p o x y g e n a s e 图1 2 氧酯合成的分支结构( v e l l o s i l l o 等，2 0 0 7 ) f i g u r e1 - 2t h es c h e m eo f b r a n c h e sl e a d i n gt ot h es y n t h e s i s o f a c t i v eo x y l i p i n s ( v e l l o s i i l oe la 1 ，2 0 0 7 ) 1 2 2l o x 参与的生理过程 植物l o x 参与植物生长发育、成熟及衰老的各个阶段( s i e d o w , 1 9 9 1 ) 。l o x 参与的生理过程涉及损伤、病原攻击、种子萌芽、果实熟化、植物衰老、脱落酸 ( a b s c i s i ca c i d ，a b a ) 和茉莉酸( j a s m o n i ca c i d ，j h ) 合成，l o x 也在正常的植物生 长和生殖生长过程中作为营养储藏蛋i 兰t ( v e g e t a t i v ea o r a g ep r o t e i n , v s p ) ，参与脂 类迁移，以及调节“源”与“库 的分配，响应营养胁迫( k a u s c ha n dh a n d a , 1 9 9 7 ； 4 第1 章引言 f i s c h e re ta l ，1 9 9 9 ；f e u s s n e re ta 1 ，2 0 0 i ) o 花生的成熟种子中，黄曲霉( a s p e r g i l l u ss p p ) 可诱导脱o x l 基因表达， p n l o x l 的催化产物可抑制真菌毒素合成，说明种子中的l o x 可作为储藏蛋白 和参与防御( b u r o we ta 1 ，2 0 0 0 ) ；l o x 在幼苗中参与储藏脂肪动员，如萌发的黄 瓜种子中，与脂肪体结合的特异l o x 能加氧到酯化脂肪酸，氧化的脂肪酸很容 易从脂肪体解离而释放到胞液中( f e u s s n e re ta 1 2 0 0 1 ) ；l o x 参与植物的营养生 长，在马铃薯块茎的形成过程中，l o x 可能起动调节细胞生长的氧化油脂的合成， 控制块茎生长和发育( k o l o m i e t se t 以，2 0 0 1 ) ；l o x 参与果实风味物质的形成， 番茄的l o x 家族中，t o m l o x c 参与番茄风味物质己醛和己烯醛的形成( c h e ne t a 1 ，2 0 0 4 ) ；l o x 可以作为营养储藏蛋白，库限制时，大豆叶中至少5 种营养l o x 蛋白( v l x a 、v l x b 、v l x c 、v l x d 和v l x e ) 的含量增高( f i s c h e re ta l ，1 9 9 9 ) ； l o x 在植物防御中的作用，l o x 催化产生的j a 和在植物生长中也有重要的生 理作用，缺乏合成或感知j a 的拟南芥植物对损伤和昆虫的侵害反应迟钝 ( m c c o n ne ta l ，1 9 9 7 ；x i ee ta 1 ，1 9 9 8 ) ：l o x 催化产物如己醛等对植物病原物有 不利影响，氢过氧化物和己醛有驱除害虫的作用( m o h r ie ta 1 ，1 9 9 0 ) ：大豆在受损 伤、干旱和热胁迫等逆境中，l o x 的含量及活性成倍增加( m e l a n e ta 1 ，1 9 9 4 ；p a r k e ta l ，1 9 9 4 ；p o r t ae ta 1 ，1 9 9 9 ) ，说明l o x 参与了大豆的抗逆生理反应。 1 2 3k o x 途径的抑制剂n d g a 去甲二氢愈创木酸( n o r d i h y d r o g u a i a r e t i ea c i d ：n d g a ) 是从常青灌木 ( l a r r e a d i v a r i c a t a ) 和石炭酸灌木( g u a i a c u mo m c i n a l e ) 中提取的一种天然成分，生 长于西南美洲和墨西哥北部，曾采用这种植物的茎和叶制成的草药来治疗外伤、 解痉、消炎止痛和驱除寄生虫。n d g a 也可以人工合成，作为一种强抗氧化剂 用于食品防腐。n d g a 作为一种强脂氧化酶的抑制剂，具有抗炎症、抗病毒、 抗肿瘤、抗血管生成等多种生物学效应，广泛应用于传统医学和研究等方面。国 外学者对n d g a 进行了多年研究，发现其具有多种生物学活性，其中最具代表 性的是抑制脂氧化酶的活性，n d g a 是花生四烯酸代谢过程中脂氧化酶的强抑 制剂。作为l o x 的经典抑制剂，n d g a 兼有抗氧化剂和自由基的还原剂作用，能 明显地抑制l o x 介导d m a 的脱甲基化及代谢活性产物甲醛的生成( h o v e ra n d k u l k a r n i , 2 0 0 0 ) ，也呈剂量依赖地抑制l o x 对联苯胺愈创木酚等外源化学物在亚 麻酸参与下的协同氧化酶活性。另外，n d g a 还能阻滞大豆脂氧合酶介导的对氨 基苯酚与谷胱甘肽共轭化合物的生成，降低对氨基苯酚的肾毒性( y a n ga n d k u l k a m i ，2 0 0 0 ) 。 5 华南师范人学学位论文 1 3 历明万 1 3 1c p r 5 的结构，突变位点及突变表型 c p r 5 ( o n s t i t u t i v ee x p r e s s e ro