（动物学专业论文）浙江几种常见刺胞动物的18s+rrna和cyt+b基因序列测定和分析.pdf

致谢 美丽的华家池畔、秀丽的西溪校园、绿荫浓郁的玉泉校区和亲切的浙江教育学院， 一处处都留下了我两年来奔波的足迹。在论文即将完成之际，我对培养我的母校、导师， 关心支持者我的工作单位浙江教育学院：以及所有支持、关，山和帮助我的人表示诚 挚的谢意。 感谢导师姜乃澄先生，他严谨细致、一丝不苟的作风一直是我工作、学习中的榜样； 他循循善诱的教导和不拘一格的思路给予我无尽的启迪。本论文从实验方案的设计到修 改成文，每个环节无不凝聚了导师大量的心血，论文能最后顺利完成更离不s i 导师的辛 勤耕耘和悉心指点。 感谢动物传染病实验室沈琴芳硕士在实验方法以及操作上的涮心指导和无私帮助： 感谢师兄胡义波在实验设计上给于宝贵的建议和关心：感谢动物疾病预防研究所陈雪燕 博士和核农业研究所林军博士在数据分析和处理上给于的指导；感谢动科院动物营养专 业吴慧慧博士、特种经济动物专业黄凌霞博士、原子核农业研究所吴媛媛博士，她们不 但在实验上的重要帮助，也在生活上给予了无微不至地照顾；同时，也感谢分析测试中 心李红亮博士、动物预防研究所高翔硕士、农学院陈斌硕士，他们在实验的整个过程中 发挥了重要的作用。 在这里，我还要感谢卢建平副教授在实验过程中给予悉心指导，并帮我采集部分标 本，感蹴刘季科教授、杨万喜副教授对我的关心及论文修改上的帮助和指导，感谢胡建 云实验师为我提供淡水水螅标本，也感谢浙江教育学院的领导和同事给我的鼓励和支持。 无私的奉献、默默的关怀，谢谢远在家乡的父母及其他亲人给我的无穷精神力量。 路走来，因为有了你们的帮助、你们的支持、你们的关爱，才。使得我有克服困难、 不断向前迈进的勇气和可能。 衷心地谢谢! 郑聪霞 于浙江大学西溪 2 0 0 6 年5 月 浙江大学硕士掌位论文 中文摘要 刺胞动物门( c n i d a r i a ) 虽然仅两胚层，组织分化尚处于原始阶段，但在 动物演化上具有十分重要意义。随着刺胞动物在医学领域研究的深入和其广阔 的应用前景，刺胞动物日益受到重视。动物资源的利用，离不开分类学这一基 础学科，同时，应用研究也对分类学提出了更高的要求。因此，刺胞动物分类 学研究越来越受到关注，已成为无脊椎动物分类学新的研究热点之一。 刺胞动物纲( c l a s s ) 的分类，依据群落形态、触手类型和数量、骨骼结构、 消化腔内隔膜的数量、分隔状态以及生活史，把其分为水螅纲( h y d r o z o a ) 、 钵水母纲( s c y p h o z o a ) 和珊瑚纲( 舳t h o z o a ) 。然而，纲以下目( o r d e r ) 、科( f a m i l y ) 的分类，不同学者之间有较大分歧，现有的形态分类系统很难反映不同科及物 种之问的进化关系，但分子生物学技术为刺胞动物自然分类系统的确立，提供 了至关重要的技术保障。本文选择小核糖体r n a ( 1 8 sr r n a ) 和线粒体细胞 色素b ( c y t6 ) 基因为分子标记，对浙江常见刺胞动物进行了序列测定和分析， 并用k i m u r a2 - p a r a m e t e r 算法建立了n j 和m p 模型分子系统树，在分子水平上 确定了它们的分类定位。主要结论如下： ( 1 ) 平洋银币水母( p o r p i t ap o r p i t a ) 的1 8 sr r n a 基因序列与g e n e b a n k 已 登陆的一未定种银币水母( p o r p i t as p 1a f 3 5 8 0 8 6 ) 的序列相似度高达 9 98 ；以n j 和m p 法建立的分子系统树显示出两种银币水母既不属管 水母目( s i p h o n o p h o r a ) ，也不属漂浮水母目( c h o n d r o p h o r a ) ，研究结果 支持将银币水母列在花水母目( a n t h o m e d u s a e ) 的观点。 ( 2 ) 产于象山和宁海的纵条矶海葵( h a l i p l a n e l l al u c i a e ) 1 8 sr r n a 基因序列 与g e n e b a n k 登录的纵条矶海葵( a j l 3 3 5 5 4 ) 序列相似性达9 9 。n j 法和 m p 法建立的分子系统树表明，纵条矶海葵的分类地位与传统分类学相 致。 ( 3 ) 红海葵( a c t i n i i d a ea c t i n i ae q u i n a ) 、黄侧花海葵( a n t h o p l e u r a x a n t h o g r a m m i c a ) 及绿疣海葵( a n t h o p l e u r am i d o r i ) 的c y tb 基因部分序 列( 1 k b 左右) 经比对，3 种海葵与已知的海葵科物种羽毛状海葵 ( m e t r i d i u ms e n i l e ，a f 0 0 0 0 2 3 ) 膨c y tb 基因序列相似性分别达均为8 8 浙江大掌硕士学位论文 、8 7 6 年t l8 6 9 。n j 法和m p 法建立的分子系统树显示，3 种海葵 也与海葵科物种首先聚支，属于同一分类单元。此与传统分类学一致。 ( 4 ) 星虫状海葵( e d w a r d s i as i p u n c u l o i d e s ) 现有分类地位，属于爱氏海葵科， 但基于1 8 sr r n a 和c y tb 基因序列分析上建立的分子系统树( n j 和 m p ) 上均显示，该物种与海葵科物种首先聚支。因此，星虫状海葵不 应再置于爱氏海葵科之中。 ( 5 ) 刺胞动物是粘多糖含量较多的物种，提取其d n a 时，采用c t a b 法效 果较为理想，p c r 体系选择较高镁离子浓度( 25 m m ) 为：自：。 综上所述，1 8 sr r n a 和c y tb 两种基因能用于分类鉴定，其中c y tb 基因 能更好的验证较低分类单元的种属关系。通过浙江常见几种刺胞动物的1 8 s r r n a 和c y tb 基因序列测定和分析，太平洋银币水母应调整到花水母目，星虫 状海葵应调整到海葵科。 关键词：刺胞动物；分类学；分子系统学：1 8 sr r n a ；细胞色素b ；总d n a 邻接法( 卜j ) ；最大简约法( m p ) 浙江大掌硕士学位c - g - 文 a b s t r a c t h y d r a s ，s e aa n e m o n e s ，c o r a l s ，a n dj e l l y f i s hb e l o n gt ot h ep h y l u mc n i d a r i a ( f o r m e r l yc a l l e dc o e l e n t e r a t a ) c n i d a r i ah a sav e r ys i m p l eb o d yo r g a n i z a t i o n ，w h i c h h a v et w ob o d yl a y e r s c n i d a r i ap l a y sa i m p o r t a n tr o l ed u r i n ga n i m a le v o l u t i o n a r y p r o c e s s t a x o n o m i cr e l a t i o n s h i p sw i t h i nt h ep h y l u l nc n i d a r i aa r en o m a l l yp u r s u e d b a s e du p o nf e wm o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r s ，s u c ha ss p e c i e sm o r p h o l o g y ，l i f eh i s t o r y ， t e n t a c l es h a p ea n dn u m b e r ，t h en u m b e ra n da r r a n g e m e n to fd i v i s i o n sw i t h i nt h e g a s t r o v a s c u l a rc a v i t y ( t e r m e dm e s e n t e r i e so rs e p t a ) ，t h en e m a t o c y s ts t r u c t u r e ，a n d s k e l e t a ls t r u c t u r e t h es i g n i f i c a n c eo f a n yg i v e nc h a r a c t e ri sc o n t r o v e r s i a lav a r i e t y o f t a x o n o m i cc l a s s i f i c a t i o ns y s t e m sh a v ea r i s e nw i t hd i f f e r i n gi n t e r p r e t a t i o n so f t h e s i g n i f i c a n c eo f t h e s ec h a r a c t e r s i t si m p o r t a n tt of i n dap r a c t i c a lm e t h o df o r t a x o n o m yi ni n v e r t e b r a t e t h e18 sr r n ag e n eh a se n o u g hp h y l o g e n e t i ci n f o r m a t i o n st od i s t i n g u i s ha m o n g t h em a j o rg r o u p i n g sw i t h i nt h ec l a s sa n t h o z o a c y t o c h r o m ebg e n es e q u e n c e sa r e o f t e nu s e da sp o p u l a t i o n l e v e lg e n e t i cm a r k e r sa n dh a v ea l s ob e e nu s e dt oe s t i m a t e a b s o l u t ed i v e r g e n c et i m e sb e t w e e nt a x aw h i c hh a v ec l o s er e l a t i o n s h f p w ed e t e r m i n e d t h et a x o n o m i cs t a t u so f s o m es p e c i e si nc n i d a r i af r o mz h e f i a n gb ys e q u e n c i n ga n d a n a l y z i n gt h et w og e n e t i cm a r k e r a l la n a l y s i sw e r ep e r f o r m e du s i n gm e g a 3 s o f t w a r e a ni n i t i a ld i s t a n c ea n a l y s i so f t h ee n t i r ed a t aw a sp e r f o r m e du s i n gak i m u r a t w o 。p a r a m e t e rm o d e l t h ep h y l o g e n e t i ct r e e sc o n s t r u c t e db yt w om e t h o df n ja n dm p ) b a s e do np r e v i o u sb o o t s t r a pa n a l y s e s t h em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： 1 a c c o r d i n gt os e q u e n c ea l i g n m e n t ，t h e18 sr r n ag e n es e q u e n c e so fp o r p i t a p o r p i t ao fz h e n g j i a n ga r et h em o s ts i m i l a rt ot h a to fo n ep o r p i t as p ( a f 3 5 8 0 8 6 ) a n d t h es i m i l a r i t yp e r c e n ti s9 9 8 i ti n d i c a t e dt h a tp o r p i t ap o r p i t ao fz h e n g j i a n g b e l o n g sn e i t h e rt ot h eo r d e rs i p h o n o p h o r an o rt ot h eo r d e rc h o n d r o p h o r a ，b u tb e l o n g s t ot h eo r d e ra n t h o m e d u s a e ，b a s e du p o nb o t ho ft h en ja n dm pt r e e ，w i t hb o o t s t r a p v a l u e1 0 0 w e s u g g e s t e d t h a t p o r p i t ap o r p i t ao fz h e j i a n g i sas p e c i e so f a n t h o m e d u s a e 2t h e18 sr r n ag e n es e q u e n c e so fh a t i p l a n e l l al u c i a eo f x i a n g s h a na n d n i n g h a ia r eb o t hm o s ts i m i l a rt ot h a to fh a l i p l a n e l t al u c i a e ( a j l 3 3 5 5 4 ) i n g e n e b a n ka n dt h es i m i l a r i t yp e r c e n ta r e9 9 t h et o p o l o g yo fn ja n dm pt r e e 3 浙江大掌硕士学位论文 s u p p o r tt h a t t h et w oh a l i p l a n e l l al u c i a ea r e s p e c i e so fd i a d u m e n i d a e t h e c o n c l u s i o n sa r ec o n s i s t e n tw i t ht h er e s u l to f m o r p h o l o g i c a lt a x o n o m y 3 a c c o r d i n gt ot h er e s u l t so fs e q u e n c ea l i g n m e n t ，t h ep a r t i a lc y tbg e n e s e q u e n c e o fa c t i n i i d a ea c t i n i a e q u i n e ，a n t h o p l e u r ax a n t h o g r a m m i c a a n d a n t h o p l e u r am i d o r ia r es i m i l a rt om e t r i d i u mj p 月池( a f 0 0 0 0 2 3 ) o fa c t i n i i d a ea n d s i m i l a r i t yp e r c e n ta r e8 8 ，8 7 6 a n d8 69 一a n da l lo ft h e ma r ei nt h es a m ec l a d e o n p h y l o g e n e t i ct r e e s ( n ja n dm p ) i tj u s t a st h er e s u l to fm o r p h o l o g i c a l t a x o n o m y , a l lo f t h e ma r es p e c i e so f a c t i n i i d a e 4 e d w a r d s i as i p u n c u l o i d e si s b e l o n gt ot h eo r d e re d w a r d s i d a ei nb e i n g ， h o w e v e r , i tf i r s ta s s e m b l ew i t hs p e c i e so fa c t i n i i d a ei nt h es a m ec l a d eo nt h e p h y l o g e n e t i ct r e e s e q ja n dm p ) ，a n dn o tw i t ht h es p e c i e so fe d w a r d s i d a e w e s u g g e s t e dt or e n a m et h ee d w a r d s i as i p u n c u l o i d e sa sa c t i n i i d a es i p u n c u l o i d e s 5w ec o n s i d e r e dt h a tt h e18 sr r n aa n dc y tb g e n e a r es u f f i c i e n t p h y l o g e n e t i cs i g n a lf o rd e t e r m i n i n gt a x o n o m i cr e l a t i o n s h i pi nc n i d a r i a ，a l t h o u g ht h e t a x o n o m yb a s e do ns e q u e n c ea n a l y s i so f18 sr r n aa n dc y tbg e n eo fs o m es p e c i e s o fc n d a r i af r o mz h e j i a n ga r en o te n t i r e l yc o n s i s t e n tw i t ht h er e s u l to f m o r p h o l o g i c a l t a x o n o m y ，a n dt h ec y tbg e n ei sm o r ee f f i c i e n c yt oe s t i m a t e a b s o l u t ed i v e r g e n c e t i m e sb e t w e e n c l o s e l yr e l a t e dt a x a 6 2 x c t a be x t r a c t i o n b u f f e rw h i c hi s p a r t i c u l a r l ye f f e c t i v ea tr e m o v i n g p o l y s a c c h a r i d e st h a ta r ea b u n d a n ti nc n i d a r i aa r eg o o df o rd n a e x t r a c t i o n h i g h c o n c e n t r a t i o no f m g “( 2 5 m m ) i se f f i c i e n ti nd n a a m p l i f i c a t i o n so f t h e1 8 sr r n a a n d c y tbg e n e k e yw o r d s ：c n i d a r i a , t a x o n o m y , p h y l o g e n y , 18 sr r n a ，c y t6 ，d n as e q u e n c e 4 浙江大掌硕士掌位论文 图表目录 圈l 儿种水母和海葵的总d n a 2 5 圈2 2 x c t a b 与u n i q 1 0 柱式动物基因组d n a 抽提试剂盒抽提总d n a 的比较2 5 圈3 1 8 sr r n a 基因p c r 扩增 2 6 图4 太平洋银币水母l8 sr r n a 基因核苷酸序列 2 7 图5 星虫状海葵1 8 sr r n a 基因核苷酸序列2 8 图6 采自象山的纵条矶海葵( 象山) 1 8 sr r n a 基因核营酸序列2 9 图7 采白宁海纵条矶海葵1 8 sr r n a 基因核苷酸序列 2 9 图8 采自象山纵条矶海葵、宁海纵条矶海葵与已知纵条矶海葵18 sr r n a 基因的比对 ： 1 图9 基于1 8 sr n a 基因片段的邻接法( n j ) 建立的刺胞动物物种分子系统树3 7 图1 0 基于18 sr n a 基因片段的最大简约法( m p ) 建立的刺胞动物物种分子系统树 幽 图 蚓 i 刳 图15 图1 6 幽1 7 表1 表2 表3 表4 表5 表6 表7 表8 四种海葵线粒体c y tb 基因p c r 扩增结果 ， 红海葵线粒体c y tb 基因核苷酸序列 黄侧花海葵线粒体c y tb 基因核营酸序列 绿疣海葵线粒体c y tb 基因核苷酸序列 星虫状海葵线粒体c y tb 基因核苷酸序列 基于c y tb 基因片段的邻接法( n j ) 建立的刺胞动物物种分子系统树 基于c y tb 基因片段的晶大简约法( m p ) 建立的刺胞动物物种分子系统树 水母乖j 海葵的1 8 sr n a 基因核苷酸及序列睦度 分子系统数中所用样本数据 刺胞动物及外类群1 8 sr r n a 基因序列间的相似度及差异率 刺胞动物及外类群1 8 sr r n a 基因序列相对遗传距离 海葵及其他刺胞动物物种c y tb 基因序列长度和核菅酸含量 分子系统树所j = | j 样本数据 珊瑚纲物种及外类群c y tb 基因序列间的相似度及差异率 珊瑚纲物种及外类群c y tb 基因序列相对遗传距离 强 帖 钉 卯 驱 铝 ” 弘 ” 弘 的 如 引 跎 浙江大学硕士学位论文 1 刺胞动物分子生物学研究概况 刺胞动物( c n i d a r i a ) 门为辐射对称、具两胚层、具原始组织分化的低等后 生动物( m e t a z o a ) ，在动物演化上具有重要的地位。刺胞动物具有两种基本的 结构类型，即水螅型( p o l y p ) 和水母型( m e d u s a ) ，通常具有世代交替现象。 水螅纲绝大多数种类既有水螅型，也有水母型；珊瑚纲全部种类为水螅型；钵水 母纲的大多数种类水母世代特别发达。 刺胞动物全部营水生活，绝大多数种类栖息于海洋，淡水刺胞动物种类很 少，一般认为淡水种类也起源于海洋。但淡水种类都属广温性种类，分布较为广 泛。而海洋刺胞动物大部分却是狭温种类，绝大多数珊瑚就是典型的热带动物， 分布只局限于热带和亚热带海洋。 目前，在中国海域记录到各种海洋刺胞动物，约计1 0 1 0 种。上面表述一般 依掘群落形态、触手类型和数量、刺细胞的结构、骨骼结构、消化腔内隔膜的数 量和分隔状态，以及生活史等把刺胞动物分为水螅纲( h y d r o z o a ) 、钵水母纲 ( s c y p h o z o a ) 和珊瑚纲( a n t h o z o a ) 等三个纲。水螅纲，典型代表动物是水母和数枝 螅，中国海已记录4 5 6 种。钵水母纲，典型代表动物是海蜇，中国海域已记录 3 9 种。珊瑚纲，典型代表动物是珊瑚和海葵，中国海己记录5 1 5 种。 据统计，浙江省常见的刺胞动物目前共涉及2 3 个科3 2 个种，淡水常见的有 索氏桃花水母和多种水螅，浙江沿海最常见的刺胞动物是各种海葵。 国内对刺胞动物的的研究，无沧是系统分类，还是应用研究，均开展不多， 相关文献资料十分匮乏，现将国内外相关研究概况综述如下。 1 1 刺胞动物的研究进展 刺胞动物的种类繁多，近期发现陔动物有较高的药用价值，以及遗传进化方 面的研究价值，国内外学者对刺胞动物的展开了多项研究。在国外，对刺胞动物 的研究较为系统和全面，涉及分类、生理生化、发育生物学、形态学、遗传和进 化、免疫组织化学、生物活性物质、生态学( s c h m i c h 等，1 9 9 8 ；p l i c h e r ta n ds c h n e i d e r ， 2 0 0 4 ；j a r m s 等，2 0 0 2 ；r o d i m o v ，2 0 0 5 ；m a l a k h o v , 2 0 0 4 ；g a l l i o t 等，1 9 9 9 ；h e r r i n ga n d 8 浙江大学硕士掌位论文 w i d d e r ，2 0 0 2 ；p 6 r e z 等，2 0 0 5 ；m a d e l e i n e 等，2 0 0 2 ) 等多方面的研究，并取得了很大的 成果。 从2 0 世纪6 0 年代末期，科学家就开始注意对细胞毒素的生物化学、药物学、 毒物学方面进行了研究，提取其活性物质，找出了对人类有益的成分，作为新的 药物来源或其他生物医学化合物( 窦昌贵，1 9 8 3 ；许实波等，1 9 9 0 ；q ：镇辛和吕安宁 1 9 9 8 ；p a s c o e 等，2 0 0 2 ；a n a r o j a s ，2 0 0 2 ) 。早在2 0l 廿纪5 0 年代，海洋生物学家就开 始进行了生态学方面的研究，对成礁珊瑚群落生态、刺胞动物与共生生物之削的 关系等进行了大量研究( j u a n 等，2 0 0 4 ；g r a h a m ，2 0 0 1 ；w e i r - b r u s h ，2 0 0 4 ) 。在刺胞动 物的形态结构特别是刺细胞结构进行了细致的研究，对刺细胞的形态结构和作用 机理进行了描述，如s t e f a n 等( 2 0 0 5 ) 剥刺细胞的形成和作用进行了详细的阐述， 为研究提供了大量数据。关于刺胞动物的生理生化研究的工作也进行了不少， o i a n t e r 等( 2 0 0 4 ) 对刺胞动物神经肽与趋光效应进行了研究。在形态学分类的基 础上，近年来，许多科学家开始从分子生物学水平对刺胞动物进行分类并建立系 统进化关系树，b e r n t s o n 等( 1 9 9 9 ，2 0 0 1 ) 通过对小核糖1 8 sr r n a 序列分析， 分别建立了珊瑚纲里的六放亚纲和八方亚纲内物种的系统发生关系，并对些有 争议的物种进行了重新分类；f o r s m a n 等( 2 0 0 5 ) 通过对i t s 部位的分析对珊 瑚动物s i d e r a s t r e a 的进化史进行了研究；h i r o n o b u 等( 2 0 0 5 ) 对石珊瑚目 ( s c l e r a c t i n i a ) 的三个物种的线粒体全序列进行了分析比较。关于生存捕食行为 方面也有不少的研究，也有学者进行了刺胞动物体内g l w a m i d e s 等免疫活性物质 进行了相关研究( y t m g e n ，1 9 9 8 ) 。 国内剥刺胞动物的研究，目前主要集中新种的形态学和分类定位，刺胞动物 的分布调查、生态学意义以及遗传进化等；应用性研究主要集中在水母毒素等生 物活性物质的提取和分析等领域；分子生物学水平的研究也初步开展。胡义波等 ( 2 0 0 6 ) 对浙江萧山和绍兴的桃花水母在系统形态学研究的基础上，并结合核糖 体小亚基r r n a 基因序列分析最终确认是索氏桃花水母。范学铭等( 2 0 0 5 ) 应用 r a p d 技术对大庆水螅、北京水螅、强壮水螅、漠河水螅、绿水螅等5 种水螅的 基因组d n a 进行多态性研究，从分子水平探讨它们的分类地位和亲缘关系，为完 善系统分类方法提供分子水平证据。但总体而言，相对于国外研究，国内更多的 停留在调查研究和形态学鉴别水平上，分子生物学研究相对比较薄弱。 浙江大学硕士掌位论文 因此，如何借助较为稳定的分子标记列物种进行分类和遗传进化比较可以成 为当前国内研究的重点之一。 1 _ 2 分子系统学的分子标记 121 分子系统学的形成 几个世纪以来，博物学家和生物学家一直都在对生物多样性进化描述和解 释。这种工程及其结果便是生物系统学( s y s t e m a t i c s ) 。生物系统学是研究生物多 样性以及它们中i n 的任何一个类群和其他类群的各种关系的科学。系统学的研究 建立在分类学基础之上，而对生物进行分类是人类认识生物世界的第一步。1 8 世纪林奈( l i n n a e u s ，1 7 5 8 ) 双名法的建立为对生物多样性描述和分类奠定了基 础。1 8 6 0 年，海克尔( h a e c k l ) 提出了系统发生( p h y l o g e n y ) ：i 塞_ - - 概念。研究系统 发生的主要任务是探讨物种之间的历史渊源以及物种之f 司的亲缘关系。但早期建 立起来的生物系统发生史很少有客观标准。直到本世纪上半叶人们关注的焦点仍 然是物种、物种形成和地理变异而不是生物发生。1 9 4 2 年，贺胥利( j h u x l e y ) 在进化论的现代综合中仍未出现系统发生这个词。后来德国植物学家齐默尔 曼( z i m m e r m a n n ) 建立了项枝学说( t e l o m e t h e o r y ) 和德国昆虫学家亨尼希 ( w h e r m i g ) 创建了分支系统学说( c l a d i s i i c s y s t e m a t i c s ) 。他们都是基于现存生物 和生物化石的共同特征来概括提炼出一些客观标准来重新构建生物进化史。2 0 世纪6 0 年代开始，新的系统发生数据逐渐积累，计算机硬件和软件的建立，使系统 发生学取得了长足的进步，同时蛋白质和核酸分子结构检测方法得到迅猛发展， 并且这些方法很快被进化学家所接受的采用，这样就产生了一门新的学科分 子系统学。分子系统学是用分子生物学的技术和方法来研究生物多样性，以及它 们之间相互关系的科学。它主要包括两大领域，即种群遗传学( p o p u l “o n g e n e t i c s ) 和系统发生学( p h y l o g e n e t i c s ) ，前者主要研究种内分化，后者主要研究物种多样性 及种问系统发生。 1 0 浙江大学硕士掌位论文 122 分子系统学的研究方法及应用 1221 分子系统学的研究方法 在分子系统学的研究中，首先是通过现代分子生物学技术，获得物种特定遗 传标记的大量数据。然后，把这些数据进行相关的数学分析并剥研究结果进行解 释和说明。常用的核酸分析方法有d n a 杂交、串联重复序列数目变异、单链构 象多态性、变性梯度凝胶电泳、限制性片段长度多态性、随机扩增多态 生d n a 、 测序和克隆。蛋白质分析技术中常用的方法有：免疫学技术，同工酶电泳、蛋白 质电泳及氨基酸分析等。染色体分析中常用的方法有：核型分析、带型分析、荧 光原位杂交、染色体原位隐藏杂交、引物原位标记、多( 探针) 引物原位标记等 在上述方法中，主要以核酸分析为主。特别是测序技术的，自动测序技术及序列 分析技术越来越多的地被采用。数据分析中常用的方法有：1 ) 简约法，这种方法 旨在确定最短的系统树，对该树核苷酸或氨基酸的替代总数应取最小值。该方法 中影响较大的是最大简约法，加权简约法和进化简约法；2 ) 距离矩阵法，此处的 距离指相对替代率、遗传距离或进化距离。常见的方法有：不加权成对群算术平 均法、f i t c hm a r g o l i a s h 法、转化距离法、邻接法等；3 ) 最大似然法，以各种假殴 的进化数学模型对观测结果进行检验，选出具有最大似然函数的模型构树。常见 的方法有l a n g l e y 平h f i t c h 法、f e l s e n s t e i n 法等，由于分子数据由抽样获得，所以在 用某种方法获得系统树后，还要用重抽样法来检验校正，常见的有折刀法和自助 法。总之，在数据处理时最好用多种方法进行比较，以期获得一致的结果，提高 结果的可靠性。 12 22 分子系统学的应用 分子系统学主要应用于分类学，构建分子树或生物进化树。b e c e r r a 等( 1 9 9 7 ) 应用分子系统学的方法，还成功地解释了昆虫和宿主植物之间的协同进化关系。 此外，分予系统学还用于中草药的鉴定和分离、流行病、病原体、基因和基因组 进化、行为学、生态学、生物地理学、发育生理学甚至犯罪学等领域的研究。 分子系统学研究一个重要的内容就是构建分子进化树。进化树( e v o l u t i o n a r y t r e e ) 又名系统树( p h y l o g e n e t i ct r e e ) ，是包括进化论、遗传学、分类学、分子生物 浙江大学硕士学位论文 学、生物化学、生态学及概率论、图论、计算机科学和群沦交叉形成的边缘领域。 以不同物种的分子数据( 如d n a ) 为依据构建的进化树称为分子进化树。通过 d n a 序列分析研究生物的进化过程，确立物种间的进化关系具有许多优越性。 d n a 仅仅由4 种碱基基本结构单位组成，其序列的异同明确无误，因而，易于分 j i ；d n a 序列含有丰富的进化信息，如某些物种含有1 0 1 1 个碱基对；d n a 序列 相对易于获得，特别是随着p c r 技术的应用，以及人类基因组计划的实施，d n a 序列正以爆炸性的速度积累起来。因此，基于d n a 序列的分子进化树的构建已成 为生物系统研究中最重要的工具之一。 1 3c y tb 在分子系统学研究中的应用 1 3 1 细胞色素6 基因 1 3 1 1 细胞色素b 基因的结构 在m t d n a 的1 3 个蛋白质编码基因中，细胞色素b 基因的结构是被了解得 最为清楚的。它的期望分子量为4 2 7 k d ( a n d e r s o n 等、1 9 8 1 ，w a l l a c e 等，1 9 9 4 ) ， 含有大约1 1 4 0 b p , 只能编码一条含有3 9 7 个氨基酸的多肽链，该基因的m r n a 以一个含有4 对核苷酸、5 - p r i m e r 的非编码区为开头，紧接着是启动子a u g ， 末端是终止子u a a 的u 碱基，侧面与t r n a g l u 和t r n a t h r 相接。这些t r n a 在转录过程中可被解除掉( a n d e r s o n 等，1 9 8 1 ：o j a l a 等1 9 8 l ：a t t a r d i 等1 9 8 2 ) 。 1312 细胞色素b 基因的进化特点 细胞色素b 基因一般不发生缺失和( 或) 插入，碱基置换多数是沉默的，很 大程度上倾向于转换( t r a n s i t i o n ) 或颠换( t r a n s e r s i o n ) ，且编码蛋白质的密码子位点 进化速度不恒定，在沉默位点进化速度较快，密码子第三位点进化最快，而在非 同义替换位点进化缓慢，如密码子第二位点最保守( i r w i n 等，1 9 9 1 ) ；而且，密 码子的使用存在偏倚性( b i a s ) ，首先，密码子的第三位碱基为a 和c 的比例明 显高于g 和t ，其中a 的比例最高，在3 3 4 4 2 0 之间，g 最低，在3 8 8 9 之删。其次，密码子的第二位碱基为嘧啶的比例( ( t + c ) = 6 8 o o3 ) 明显高于 嘌呤；同时，相应的基因组内保守区与可变区共存( m e y e r 和w i l s o n 1 9 9 0 ；i r w i n 等，1 9 9 1 ：n o r m a r k 等，1 9 9 1 ) 。由于功能限制，它的一部分基因较其他基因更加保 1 ， 浙江大掌硕士学位论文 守，因此，承受着较强的功能抑制；而大多数可变基因似乎都位于编码胯膜区或 氨基和羧基末端的编码区( i r w i n 等，1 9 9 1 ) 。 1 3 1 3 细胞色素b 基因作为分子标记的优点及不足 整个细胞色素b 基因进化速率适中，其变异程度足以阐明种间的系统发育关 系，有一定保守性可进行种上阶元水平的研究。与其它分子系统比较，细胞色素 b 基因蛋白质产物的生化机理更易与其基因的进化动力学相联系；在一定的进化 尺度内不受饱和效应的严重影响，一般线粒体蛋白质编码基因是在1 5 0 0 万年前 分化的，其种间序列差异小于2 ，当大于2 5 0 0 万年时碱基因罱换达到饱和时， 使其基因与单拷贝的核基因在变化率上趋于一致，不包括碱基平行突变( 如g a g ) 和回复突变( a g a ) 等诸种引起岐义的可能因素。绝大多数脊椎动 物转换与颠换的发生率也一致，所以，它提供的系统发育信息和遗传分化水平非 常适于分析种间或属间差异：c y t _ b 基因作为蛋白质编码基因较线粒体r d n a 和 非编码区的基因更易于排序，加之能用一些通用引物扩增，因而细胞色素b 基因 作为最常用的分子标记而被广泛地应用于系统发育分析。 然而c y tb 基因分子标记也存在缺点，如相邻碱基组成的偏倚性( b i a s ) ，世 系间基因的进化速率变异及密码子的第三位点饱和度，种内水平上密码子第三位 点信息量偏少等问题( i r w i n 等，1 9 9 l ；m o r i t z 等，1 9 9 2 ；n u n n 和s t a n l e y ，1 9 9 8 ) 。 132c y tb 基因的应用 尽管，线粒体d n a 细胞色素b ( c y t o c h r o m eb ) 基因存在上述不足，但由于 其序列测定容易进行、含有高分辨率的系统发育信息及在生物类群中存在范围极 广等特点，而被认为是探讨近缘物种间遗传分化的良好标记，对系统进化和分类 研究有较强的适用性( i r w i n 等，1 9 9 1 ) ，已在多种动物类群的分子进化和系统发 育研究中得到了有效应用( s m i t h 等，1 9 9 1 ) 。 王江等( 2 0 0 5 ) 及曹丽荣等( 2 0 0 4 ) 通过测定细胞色素b 全序列，分别分 析了几个羚羊亚种间的发生关系和岩羊、山羊、绵羊等几个物种见的系统发生关 系。张明海等( 2 0 0 5 ) 分析了中国东北狍和西伯利亚狍、欧洲狍之问的系统进化 关系，对中国东北狍的分类地位进行了鉴定，并提出了几个种间的进化分歧时问。 在鸟类科学研究中，c y tb 基因也得到了广泛的应用。文陇英( 2 0 0 5 ) 则对通过 浙江大掌硕士掌位论文 c y tb 探讨了斑翅山鹑的分类地位，认为其与雉类更接近，而与传统意义上真正 的鹑亲缘关系更远。王加连等( 2 0 0 3 ) 通过分析中国水域真海豚的c ”b 部分序 列( 3 3 6 b p ) 初步鉴定了真海豚的分类地位，为保护海豚的物种多样性提供了科 学的依据。c y tb 基因也广泛应用于无脊椎动物的科学研究当中。代金霞等( 2 0 0 5 ) 以c v tb 基因作为分子标记，对蝽科蝽亚科的1 1 种昆虫的进行了序列测定和分 析，确定了它们之间的系统发育关系；m a d e l e i n e 等基于c y tb 基因刺石珊瑚目 鹿角珊瑚a c r o p o r a 各物种间的序列差异进行了分析，认为这些物种的c y tb 区的 进化要比其他线粒体基因慢1 0 2 0 倍；h i r o n o b u 等( 2 0 0 5 ) 对珊瑚纲内的蜂巢珊 瑚科和褶叶珊瑚科的部分物种进行了c ”b 基因序列分析，发现序列分析结果与 传统的基于形态学的分类有很大的分歧，如大西洋的蜂巢珊瑚科的助v 地和褶i 十 珊瑚科的& o 枷缸互相比较接近，而与他们原来所归属的同类分歧较远，同日j 也认为c y tb 的分子进化速度相对于线粒体其他基因来既是比较慢的。 有研究认为，基于线粒体c y tb 基因建立的系统发生关系，能更多的反应种 属间的地域差异。g u r y e v 等( 2 0 0 2 ) 利用基因组基因( 曲2 b ) 和线粒体( c y tb ) 基因全序列对h u m u s 的8 个物种进行系统发生关系的分析，发现基于基因组基 因的系统发育树反应了种类从属关系，而c y tb 基因更多的反应地域差异。他们 推测，这可能是由于线粒体c y tb 基因因不完全繁殖隔离而在同地域种内发生基 因漂移。 1 418 sr r n a 分子标记在分子系统学研究中应用 近年来，利用1 8 sr r n a 序列变化探讨生物种问和种内的亲缘关系、系统进 化，以及鉴定未知的种属等，已经成为一种趋势，其中的主要原因在于1 8 sr r n a 在进化上的保守性。 1 411 8 sr i w a 的结构特点 一股认为，r r n a 为r n a 的二级结构。真核生物的r r n a 是由2 8 s 、5 8 s 、 5 s 和1 8 s 组成。而原核生物r r n a 由2 3 s 、5 8 s