（植物学专业论文）水稻bel基因异源表达特性分析及基因打靶载体构建.pdf

l ， 学位论文独创性声明 学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得 的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包 含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得直昌太堂或其他 教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的 任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名( 手写) ： 签字日期：年 月日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解直邑太堂有关保留、使用学位论文的规定，有权 保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权直昌太堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编本学位论文。同时授 权中国科学技术信息研究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库， 并通过网络向社会公众提供信息服务。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) i f ri p ， 学位论文作者签名( 手写) ：导师签名( 手写) 多t ! ”。 fi 签字日期：年月 日签字日期：年月 摘要 摘要 水稻b e l 基因编码的细胞色素p 4 5 0 单加氧酶c y p 8 1 a 6 对除草剂苯达松具 有抗性作用，对该p 4 5 0 基因进一步深入地研究为将其应用于提高农作物的抗除 草剂性能奠定了基础。同时采用基因打靶技术对水稻b e l 基因进行定点敲除， 能有效地获得苯达松敏感致死株。本研究将水稻b e l 基因转入烟草和番茄基因 组中进行表达，对不同抗性的转基因植株从表型和r n a 水平进行分析，同时构 建了对b e l 基因进行打靶的载体p l n a l 3 4 p h p t 。主要结果如下： 1 将实验室己有的b e l 基因表达载体p k y l 7 1 b e l 转化入烟草和番茄基因组并 进行表达。对7 0 株k a n 抗性转基因烟草进行p c r 扩增，5 4 株检测为阳性， 转化效率为7 7 ；对5 0 株k a n 抗性转基因番茄d n a 进行p c r 扩增，3 7 株检测为阳性，转化效率为7 4 。 2 对转基因烟草和番茄进行苯达松叶盘筛选和成株检测，编号为1 号和1 3 号 的转基因烟草对浓度为0 2 5 苯达松具有抗性。编号为3 号、2 3 号和2 9 号 的转基因番茄对浓度为0 0 5 苯达松具有抗性。 3 以f l - a c t i n 为内参，利用半定量r t - p c r 技术对其表达特性进行了研究，结 果表明不同苯达松抗性的转基因植株在m r n a 表达水平上也存在相应表达 量的变化。 4 对水稻品种c 4 1 8 愈伤诱导及外植体分化的培养基进行优化。结果表明当 2 , 4 - d 为3m g l ，酵母粉为6g l ，水解酪蛋白为0 6g i 时c 4 1 8 的综合培 养能力系数最高。其中，2 , 4 d 对水稻愈伤培养性状影响显著( p 0 0 5 ) ，水 解酪蛋白和酵母粉对水稻愈伤培养性状影响不显著。 5 构建水稻b e l 基因打靶表达载体p l n a l 3 4 一p h p t ，与b e l 区域同源的左右臂长 度分别为8 9 1 b p 和6 9 5 b p ，载体上含有潮霉素正向选择标记和白喉毒素负向 选择标记。 关键词：b e l ( b e i ) 基因；异源表达；半定量r t - p c r ；基因打靶 i i a b s t r a c t c y p 8 1 a6t h ec ”o c u o m ep 4 5 0w h i c hw a sc o d e db yt h er i c e g e n eb p ，h a s r e s i s t a n c et oh e r b i c i d eb e n t a z o n ，t h ef u r t h e rr e s e a r c ht ot h i sp 4 5 0g e n e c a l ls e t t l et h e f o u n d a t i o no fu s i n gi tt oe n h a n c i n gt h ee c o n o m i cc r o pr e s i s t a n tt oh e r b i c i d e f u n h e r m o r e ，k n o c ko u tt h eg e n eb e lu s i n gt h eg e n et a r g e t i n gi nr i c ec a no b t a i nt h eb e n 住眩o n s u s c e p t i v er i c e t h i sp a p e rt r a n st h eg e n eb e lt ot o b a c c oa n dt o m a t o 舶m 也e p h e n o t y p ea n dr n a l e v e lt oa n a l y z et h ee x p r e s s i o no fd i f f e r e n t 角s t t l e s st r a n s 2 e n e p l a n t o t h e r w i s e ，c o n s t r u c tt h ev e c t o rp l n a l3 4 一p h p tc a nb eu s e di n g e n eb g ， t a r g e t i n g t h em a i n l yr e s u l ta sf o l l o w s ： 1 t r a n st h ee x p r e s s i o nv e c t o rp k y l 7 1 b e lh a sb e e nc o n s t r u c t e di no u rl a bt o t o b a c c oa n dt o m a t og e n o m i c a m o n g7 0p u t a t i v eb e l t r a n s f o t r u a n t so ft o b a c c o 5 4w e r ep c r - p o s i t i v e ，t r a n g e n ee f f i c i e n t u p t o 7 7 a m o n g5 0p u t a t i v e b e l - t r a n s f o r m a n t so ft o m a t o37w e r ep c r - p o s i t i v e t r a n g e n ee f f i c i e n t u pt o 7 4 2 w i t ht h eb e n t a z o nl e a ft e s t i n ga n di n d i v i d u a l t e s t i n g ，s e r i a ln u m b e r1a n d13 t r a n s e g e n et o b a c c oh a sr e s i s t a n c et ob e n t a z o nc o n c e n t r a t i o no f0 2 5 ，s e r i a l n u m b e r3 、2 3a n d2 9t r a n s e g e n et o m a t oh a sr e s i s t a n c et ob e n t a z o nc o n c e n t r a t i o n o f o 0 5 3 w i t hr t - p c ra m p l i f i c a t i o nt o s t u d yt h ee x p r e s s i o no fg e n eb e li nt r a n s g e l l e p l a n tw i t hf l - a c t i na ss t a n d a r d ，t h er e s u l ts h o w st h a tt r a n s f o r m a n t sw i 也d i 腕r e n t r e s i s t a n tt ob e n t a z o nc o r r e s p o n dt ot h e e x p r e s s i o ni nm r n a 4 o p t i m i z i n gt h ec u l t u r em e d i u mo fr i c ec 418i n d u c e m e n to fe m b r v oc a l l u sa n d e x p l a n td i f f e r e n t i a t i o n w h e n2 , 4 - d3 m g l ，y e a s tp o w d e r6g l ，c a s e i n h y d r o l y s a t e0 6g l ，t h ec 418i n t e g r a t ec u l t i v a t en u m b e ri st h eh i g h e s t ，2 , 4 dh a s t h es i n i f i c a n te f f e c tt or i c ec a l l u s ( p 0 0 5 ) ，c a s e i nh y d r o l y s a t ea n dy e a s tp o w d e r h a v en on o t a b l ee f f e c tt or i c ec a l l u s 5 c o n s t r u c t e dt h er i c e h o m o l o g yl e n g t ho f g e n eb e lt a r g e t i n gv e c t o rp l n a l 3 4 一p h p tw i t ht h el e f tb e l 8 91b pa n dr i g h tb e lh o m o l o g yl e n g t ho f6 9 5 b p ，i ta l s o i i i c o n t a i n st h eh p ，a n dd t - aa sp o s i t i v ea n d n e g a t i v es e l e c t i o nm a r k e r k e yw o r d s ：b e l ( b e l ) g e n e ；h e t e r o g e n e o u se x p r e s s i o n ；s e m i q u a n t i t a t i v er t - p c r ； g e n et a r g e t i n g i v 目录 目录 摘要。i i a b s t r a c t i v 第1 章引言1 1 1 水稻苯达松敏感致死突变材料及其突变基因定位l 1 1 1 水稻苯达松敏感致死突变材料研究进展1 1 1 2n o r i n8 m 中b s l 基因定位的研究2 1 1 38 0 7 7 s 中b e l 基因定位的研究2 1 1 4c y p 8 1 a 6 基因的图位克隆和功能鉴定3 1 2 细胞色素p 4 5 0 3 1 2 1 细胞色素p 4 5 0 的一般特征4 1 2 2 植物中与除草剂代谢相关p 4 5 0 酶系研究进展4 1 2 3 植物中p 4 5 0 对除草剂的代谢机理5 1 2 4p 4 5 0 酶系的应用6 1 3 基因打靶8 1 3 1 基因打靶研究概述8 1 3 2 基因打靶机制9 1 3 3 基因打靶过程1 0 1 3 4 基因打靶的应用1 1 1 4 选题依据13 第2 章b e l 基因转烟草和番茄表达分析1 4 2 1 材料与方法15 2 1 1 材料15 2 1 2 方法l6 2 1 2 1 b e l 基因对番茄的遗传转化及转基因植株再生1 6 2 1 2 2 转基因烟草和番茄的p c r 检测17 2 1 2 3 转基因烟草和番茄的叶盘筛选1 8 v 目录 2 1 2 4 转基因烟草和番茄的苯达松抗性的成株检测1 9 2 1 2 5 转b e l 基因烟草和番茄的半定量r t - p c r 分析1 9 2 2 结果与分析2 2 2 2 1 转基因烟草和番茄植株的获得2 2 2 2 2 转基因烟草和番茄p c r 检测2 3 2 2 3 转基因烟草和番茄的叶盘筛选2 4 2 2 4 转基因烟草和番茄成株检测2 5 2 2 5 转b e l 烟草和番茄半定量r t - p c r 2 7 2 3 讨论3 0 2 3 1b e l 基因的利用价值3 0 2 3 2 b e l 基因在转基因烟草和番茄中表达量的探讨3 0 2 3 3 半定量r t - p c r 扩增3 2 第3 章水稻培养基条件的优化3 3 3 1 材料与方法3 4 3 1 1 实验材料3 4 3 1 2 方法3 4 3 1 2 1 愈伤组织的诱导3 4 3 1 2 2 愈伤组织分化培养3 4 3 1 2 3 培养性状的定义3 5 3 2 结果分析与讨论3 5 3 2 1 胚性愈伤组织的诱导3 5 3 2 2 愈伤组织的分化培养3 6 3 2 3 各培养性状的遗传3 6 第4 章水稻b e l 基因打靶载体的构建 4 1 实验材料与方法3 9 4 1 1 材料3 9 4 1 2 方法3 9 4 1 2 1 潮霉素基因( h p 0 与p m d l 8 一t o p 4 5 0 载体的连接3 9 4 1 2 2 b e l - h p t 片段与p l n a l 3 4 表达载体的连接4 5 v i 目录 4 2 结果与分析4 6 4 2 1 h p t 基因与p m d l 8 一t - p 4 5 0 载体的连接及转化4 6 4 2 2 p m d l 8 - t - p h p t 载体的不完全酶切4 7 4 2 3 b e l - h p t 片段与p i n a l 3 4 表达载体的连接及转化4 8 4 3 讨论4 9 基因打靶载体构建的思考4 9 第5 章结论5 2 j 变谢5 3 参考文献5 4 攻读学位期间的研究成果。5 9 v u 第l 章引言 第1 章引言 1 1 水稻苯达松敏感致死突变材料及其突变基因定位 1 1 1 水稻苯达松敏感致死突变材料研究进展 除草剂苯达松为苯并噻二唑类( b e n z o t h i a d i a z o l e ) 选择性化学除草剂，被 用于水稻、花生等作物田间防除杂草，主要防治对象为双子叶杂草及莎草科植 物，对水稻田的单子叶杂草的防治也有一定效果。普通水稻品种具有对苯达松 的抗性，0 5 苯达松溶液喷施于水稻苗期，仍表现安全无害【l 】。 m o r i 等【2 j 通过 r 射线照射n o r i n8 获得了对苯达松敏感致死的n o r i n8 m ( 农 林8 m ) 。在3 5 - - - 4 叶期，用0 5m g l - - 5 0 0m g l 苯达松溶液处理n o r i n8 m ，会 造成n o r i n8 m 叶尖卷曲、叶色枯黄、叶片下垂甚至植株死亡。陈忠明等【3 】采用 苯达松对浸种期、分蘖期、孕穗期和灌浆期的突变株n o r i n8 m 和正常株进行喷 洒，发现在浸种时苯达松浓度超过0 1 会导致普通水稻品种发芽率严重下降， 在灌浆期喷洒0 0 5 的苯达松溶液则n o r i n8 m 出现灼烧症状，分蘖期孕穗期 均正常。当浓度为0 1 时，n o r i n8 m 全部死亡。 随后张集文等1 4 则用3 5 0g y 6 0 c o 吖射线辐射诱变水稻光温敏雄性不育系 w 6 1 5 4 s 获得水稻苯达松敏感的化学致死突变体8 0 7 7 s 。对8 0 7 7 s 的3 叶l 心秧苗 进行喷洒，苯达松浓度大于3 0 0m e t , 时，可以在2 7 d 内完全杀死8 0 7 7s 自交苗。 而属于磺酰脲类的除草剂农得时、草克星、威农等则抑$ t j 8 0 7 7 s 秧苗的心叶长出， 导致叶色发黄，秧苗生长停止或矮缩，对照及f1 代均无明显影响。涂巨民等【5 】 研究发现8 0 7 7 s 比n o r i n8 m 对同一浓度的苯达松抗性稍强，在同一浓度致死效果 不同。 m o i l 2 】和张集文等【4 】分别分析了突变体n o r i n8 m 和8 0 7 7 s 与普通水稻品种 的杂交或回交后代的遗传分离比，两种材料均显示出杂交1 ：3 和回交1 ：1 的比 例，表现出典型的孟德尔隐性遗传的特性。结果表明两种突变体对苯达松敏感 致死性均由细胞核中的隐性单基因控制。我国学者陈忠明等【3 】亦验证这一结果。 m o i l 2 】将n o r i n8 m 对苯达松敏感致死这种突变性状的单隐性基因命名为如f 基 第1 章引言 因，控制8 0 7 7s 对苯达松敏感致死的基因命名为b e l 基因【4 1 。 1 1 2n o r i n8 m 中b s l 基因定位的研究 刘秋华等【6 】利用s s r 标记技术将n o r i n8 m 苯达松敏感致死基因( 命名为 b s l ) 定位于水稻第3 染色体上，并获得了与b s l 基因连锁的2 个s s r 标记r m l 3 5 0 和r m 3 8 5 6 ，遗传距离分别为1 5 0 c m 和1 4 1 c m 。涂巨民等【5 j 研究发现n o r i n8 m 苯达松敏感致死突变株在c y p 8 1 a 6 基因第1 个外显子的第1 6 9 b p 处存在单碱基 c 的缺失，而正常株则表现正常。对该突变位点区域设计引物进行扩增，引物 上引入n a s e i 酶切位点，n a s e i 酶切位点的识别区域覆盖碱基突变点。n o r i n8 扩增片段切出5 0 b p 和1 5 l b p 两条带，而n o r i n8 m 酶切后不变，仍为2 0 0 b p 片 段大小。从而进一步说明在n o r i n8 m 上存在单碱基c 的缺失。通过生物信息学 分析表明c y p 8 1 a 6 基因单碱基c 的缺失提前终止了氨基酸的翻译，使肽链缩短 至3 3 8 个氨基酸，造成如e r r 三价基因等保守区域移动，这些与血红素的组 装，i 螺旋区的氧化激活，血红素结合区域的改变相关，造成解毒功能的丧失。 1 1 38 0 7 7 s 中b e l 基因定位的研究 z h a n g 等【7 】以水稻光( 温) 敏雄性不育系w 6 1 5 4 s 和其突变体8 0 7 7 s 为近等基 因系对b e l 基因进行s s r 标记定位，把b e l 基因定位于水稻第3 染色体，与最 紧密连锁的s s r 标记r m l 6 8 相距7 1 c m 的位置。朱必凤等【8 】从2 1 0 对随机引物 中筛选出$ 2 0 4 2 0 和s 3 1 6 6 0 0 引物在8 0 7 7 s 敏感株系和正常株系间存在差异， $ 2 0 4 2 0 和s 31 6 - 6 0 0 与b e l 基因之间的遗传连锁距离分别为1 0 6 6 c m 和7 0 4 c m 。 朱磊等【9 】在张集文己将b e l 基因定位于第3 染色体上且与r m l 6 8 相距7 i c m 的基础上对b e l 基因进一步进行定位，采用3 0 对s s r 标记对8 0 7 7 s x 培矮“的 f 2 代1 8 2 株隐性纯合群体进行扩增，筛选出的5 对s s r 引物将b e l 基因初步定 位于r m 5 4 7 5 和r m 6 7 5 两个s s r 标记之间，且与这两个标记的遗传距离分别 为4 3 c m 和5 2 c m 。同时朱等用这3 0 个s s r 标记对3 5 6 株表现为苯达松敏感致 死性的培矮6 4 s x 9 3 1 1 的f 2 代隐性纯合群体进行扩增，将b e l 基因定位于r m 4 1 6 和r m 3 8 5 7 之间约1 9 c m ( 约5 0 0 k b ) 范围内。在这5 0 0 k b 范围内，采用s n p 第三 代分子标记技术将b e l 基因定位于s n p l 5 8 和s n p l 3 8 之间约0 2 e r a ( 物理距离约 8 7 k b ) ，与四个s n p 分子标记共分离。s n p l 5 1 所扩增的序列位于预测的细胞色 2 第1 章引言 素p 4 5 0 羟化酶基因c y p 8 1 a 6 的外显子区，该区域单个碱基c 的缺失使所编码 的蛋白质序列从6 3 0 位以后发生根本的改变，致使终止密码止提前出现。且 s n p l 5 1 缺失位点位于高度保守的血红素结合区域，该位点的缺失引起p 4 5 0 催 化中心的高级结构的改变进而影响其解毒等功能【l0 1 。采用b g l i 酶切位点对单碱 基突变位点的序列进行r f l p p c r 分析，8 0 7 7 s 的扩增产物采用b g l i 酶切出2 4 b p 和2 2 6 b p 两条带，而w 6 1 5 4 s 则为扩增的2 5 1 b p ，进一步说明在8 0 7 7 s 的6 p ， 基因区域确实存在单碱基c 的缺失【5 1 。 1 1 4 c y p 8 1 a 6 基因的图位克隆和功能鉴定 生物信息学分析表明c y p 8 1 a 6 基因含有两个外显子和一个内含子【l l 】， n c b i 上c y p 8 1 a 6 基因的编码序列为2 1 9 9 b p ，共编码7 3 2 个氨基酸，c y p 8 1 a 6 基因总长度大于3 9 5 3 b p 。涂等【5 j 从启动子1 5 1 6 处扩增至终止子5 1 8 b p 处，将扩 增的4 3 1 l b p 片段连入p c a m b i a l 3 0 1 中，构建正向c y p 8 1 a 6 基因表达载体 p c 4 5 0 2 。同时将c y p 8 1 a 6 基因扩增片段反向连入p c a m b i a l 3 0 1 表达载体中， 构建反义表达载体p a a n t 。用质粒p c 4 5 0 2 对8 0 7 7 s 进行转化，转化植株喷 洒1 2 5 0 m g l 苯达松仍存活，而对照8 0 7 7 s 表现为致死，将反义表达载体p a a n t l 对w 6 1 5 4 s 进行转化，含c y p 8 1 a 6 基因的w 6 1 5 4 s 植株转化后表现出对苯达松 的敏感性。将c y p 8 1 a 6 基因转入敏感植株中恢复敏感株对苯达松的抗性，转入 反义c y 尸8 朋6 基因表达体系抑制b e l 基因进一步说明b e l 基因位于c 冲8 以6 基因内。然而b e l 基因在异源植物中的表达尚未报道，其在异源植物中的表达 情况则有待进一步研究。 以上实验证明b e l 和b s l 基因均位于水稻第三染色体上的c y p 8 1 a 6 基因内， 通过蛋白序列比对发现c y p 8 1 a 6 与菊芋中的绿麦隆羟化酶c y p 8 1 8 1 有6 3 的 相似性和4 5 的同源性，与烟草中的c y p 8 1 8 2 有5 9 的相似性和4 4 的同源 性。这表明c y p 8 1 a 6 可参与内源基因的次生代谢和羟化酶水化作用。进一步比 对发现c y p 8 1 a 6 的蛋白序列与p 4 5 0 家族p f a m 0 0 0 6 7 的绝大多数成员都具有高 相似性，与一般的模式p 4 5 0 序列相似性达9 4 4 ，c y p 8 1 a 6 基因为预测的细胞 p 4 5 0 基因p j 。 1 2 细胞色素p 4 5 0 第1 章引言 1 2 1 细胞色素p 4 5 0 的一般特征 p 4 5 0 广泛存在于细菌、植物、动物中。细菌p 4 5 0 的种类相对于动植物而言 少很多。有研究认为，细菌p 4 5 0 是细菌必需的与其抵抗逆境胁迫和消除有毒物 质的危害有关系。动物中，p 4 5 0 酶系参与激素合成、外源物质降解、前致癌物 质活话等。而在植物中p 4 5 0 不仅参与植物体的基础代谢，更重要的是它还参与 了植物的次生代谢，主要表现在次生代谢物质的合成及降解外源化学药物毒性 两方面【1 2 】。如今己从1 1 1 种植物中获得了1 0 5 2 个p 4 5 0 基因，部分p 4 5 0 功能已得到 鉴定【1 3 】。 细胞色素p 4 5 0 是一种末端单加氧酶，从n a d ( p ) h 获得电子后，催化单 加氧反应，细胞色素p 4 5 0 的末端氧化功能使其在碳同化、激素合成、外源物质 降解等方面起着重要作用。在原核生物中，细胞色素p 4 5 0 游离于胞质中，为一 种可溶性蛋白；真核生物中，p 4 5 0 作为一种膜结合蛋白，主要分布在内质网和 线粒体内膜上。迄今为止，p 4 5 0 超家族已有4 8 0 多个成员，分属7 4 个家族， 而且不断有新家族、新成员被发现【1 4 1 。通过生物信息学分析发现拟南芥有2 4 6 个p 4 5 0 基因或假基因【l5 | ，而在水稻中则发现了3 5 6 个p 4 5 0 基因以及9 9 个相 关的假基因。 p 4 5 0 酶系大多为5 0 6 0 k d a ，大约只有1 6 的氨基酸相似性，三维结构极 具保守性。一个靠近碳末端的基序p h e xxg x a r g xcx g 是p 4 5 0 蛋白中最 为保守的序列，其中半胱氨酸残基提供血红素铁的第五配体，也是c o 结合蛋 白在4 5 0 n m 处有特征吸收峰的原因，对细胞色素生物学功能的发挥起着至关重 要的作用，因此，该基序又通常被称为血红素结合域( h e m e b i n d i n gd o m a i n ) 。在 该功能域的上游约1 5 0 a a 处存在另一保守的i 螺旋( i h e l i x ) ，共有的序列为 a g gxd e t - t s ，其功能是负责距离血红素远侧氧原子的活化，并在i 螺旋 上形成一个活化槽【1 6 】。位于n 末端的富含脯氨酸的绞合部和位于血红素结合功 能域和i 螺旋之间的并可能对前者起重要作用的弯曲子则为该区域欠保守基序。 这些基序或保守序列特别是血红素结合功能域中的半胱氨酸残基一旦发生了突 变将严重影响细胞色素的生物学功能。 1 2 2 植物中与除草剂代谢相关p 4 5 0 酶系研究进展 对植物中抗除草剂p 4 5 0 基因的克隆和异源转化的研究仍较少，限制了植 4 第1 章引言 物本身的p 4 5 0 基因在培育抗除草剂新材料中的应用。己进行克隆和表型分析的 植物p 4 5 0 除草剂代谢基因有烟草中的c y p 7 1 a l l 和c y 尸8 i b 2 、t h l a s p ia r v e n s a e 的c y p 7 1 8 1 、菊芋中的的c y p 7 6 8 1 和c y p 8 1 8 1 、大豆的c y p 7 1 a i o 、向日葵 ( h e l i a n t h u st u b e r o s u s ) c y p 7 3 a l 、c y p 7 6 8 1 、小麦的c y p 7 1 c 6 v l 、c y p 71 c v l 和水稻c y p 8 1 a 6 。c y p 7 3 a 1 是第一个从植物中得到的具有除草剂抗性的p 4 5 0 基因，它来源于向日葵中。对其进行酵母的异源表达显示它具有催化绿麦隆的 环甲基羟基化作用。但在活体( nv i v o ) 情况下，其代谢的主要产物是脱甲基 绿麦隆。这说明在植物体内c y p 7 3 a 1 对绿麦隆的代谢过程发挥了很小的作用 1 7 l 。从向日葵中分离的c y p 7 6 8 1 基因由m n z + 及一些药物诱导产生，能够催化 和促进苯基脲类除草剂的快速氧化脱烷基作用而对其解毒，c y p 7 6 8 1 的酵母表 达蛋白与拟南芥p 4 5 0 还原酶一起催化一些如氯吡苯脲等外来物的脱烷基作用 时i l 引，将c y p 7 6 8 1 和p 4 5 0 还原酶的融合蛋白进行转基因的结果表明，融合蛋 白对除草剂的代谢能力比单独的c y p 7 6 8 1 转基因低很多【1 9 】。至今为止己报道的 被克隆的p 4 5 0 基因都只对绿麦隆之类的氯吡苯脲具有代谢作用，且具有严格的 底物专一性，一般很少会对几类除草剂表现出交叉抗性，但相对于催化底物的 专一性来说，代谢效率可能得到提高。研究表明c y p 8 1 a 6 的p 4 5 0 基因对苯达 松及多种绿麦隆除草剂均有抗性1 5 j 。 1 2 3 植物中p 4 5 0 对除草剂的代谢机理 p 4 5 0 在植物中对害虫、真菌、细菌、病毒的防御体系中起重要作用【2 0 】。p 4 5 0 可将植物体内一些无毒性物质催化生成有毒物，以抵抗病原微生物及昆虫的危 害。它还可以将外界有毒物如杀虫剂、除草剂等转化为非毒性化合物【2 1 1 。植物 p 4 5 0 如棉花幼苗的微粒体制备液可把m o n u r o n 脱去两个甲基而成为尿素。杀虫 剂m e t d a c h l o r 可被高粱中p 4 5 0 脱乙基化。p 4 5 0 酶系催化的底物范围很广，如 多环芳烃( p a h s ) 、多氯联苯、有机氯等环境毒物、药物、有机染料、植物次 生物质等。 对于大多数外来物质的代谢植物p 4 5 0 酶系通过提高其溶解度从而解除其 对植物体的毒害作用【2 2 】。在植物体内p 4 5 0 对外源物质进行修饰，常见的方式 有两种：一种是对外源毒素进行氮位和氧位脱烷基作用i l4 1 ，例如多数种类的除 草剂被代谢为羟基化的烷烃、苯环或- 、d 化的脱烷基产物以及它们的糖 5 第1 章引言 缀合物。c a b a n n e 等【2 3 】报道，小麦细胞色素p 4 5 0 催化除草剂绿麦隆和异丙隆 ( i s o p r o t u r o n ) 在小麦植株体内代谢成- 脱烷基产物；另一种是对外源毒素进 行双链氧化，通常为环羟化。环甲基羟基化作用是位于苯环上的甲基基团被氧 化生成相应的醇。i n u i 等【2 4 】对人c y p 2 c 9 基因的研究表明转基因水稻通过芳环 的羟基化作用将绿磺隆和唑吡嘧磺隆代谢产生羟基化绿磺隆和羟基化唑吡嘧磺 隆，然后与葡萄糖形成轭合物，从而降低这2 种除草剂对水稻的毒性。从大豆 中分离到的另一种p 4 5 0 基因c y p 7 1 a i o 可使除草剂绿麦隆生成单氮脱甲基产 物，也可使其苯环上的甲基羟基化，从而解除绿麦隆毒性。 然而，在活体或体外，p 4 5 0 酶系代谢某种除草剂基团也许并不能产生对这 种除草剂的抗性。例如，c y p 7 1 a l o 酶系，在烟草中具有伏草隆n 脱甲基性质， 然而它对除草性不具有抗性，反应产物伏草隆n 脱甲基代谢物仍具有除草剂性 质1 25 。在使用广灭灵时，p 4 5 0 酶系仅催化植物分子转化为与植物毒性物质代谢 相关的活跃分子【2 6 】。此外，有些p 4 5 0 酶系仅催化部分除草剂初步解毒作用， 然后再在体内进一步进行修饰，如通过葡糖基化或谷胱甘肽转移酶的催化从而 完全解毒【2 7 1 。p 4 5 0 介导的咪草烟脱羟基化在玉米和大豆中都有发生，但与玉米 中不同，大豆中是通过谷胱甘肽结转移酶对除草剂进行代谢，完全避免除草剂 的伤害。除草剂代谢能力高低还与活体的代谢速率相关，如果活体的代谢速率 较低则p 4 5 0 酶系介导除草剂代谢功能也较低，植物仍会受到除草剂的伤害。如 玉米微粒体中p 4 5 0 具有催化绿麦隆的脱羟基化作用然而玉米却未对任何一种 除草剂表现出完全抗性。 1 2 4p 4 5 0 酶系的应用 细胞色素p 4 5 0 在植物初级代谢和次级代谢中发挥着重要作用。利用基因工 程技术对细胞色素p 4 5 0 进行分离克隆，通过转基因可以对植物代谢及性状进行 改良。 1 2 4 1 抗除草剂作物品种的培育 现今p 4 5 0 研究表明，p 4 5 0 具有抗除草剂的功能，如何将p 4 5 0 基因进行转 化，培育出抗除草剂的作物品种不仅在经济作物育种中有重要作用，在防止环 境污染方面也有重要意义。 6 第1 章引言 除了植物中多种p 4 5 0 酶系表现出对除草剂的代谢活性外，细菌和哺乳动物 等一些细胞色素p 4 5 0 也能十分快速的促进除草剂代谢而解毒或改变除草剂的代 谢途径【2 8 】。i n u i 等【2 4 】报道了表达人c 印埘珀勺转基因土豆表现出对绿麦隆、莠去 津、嘧草醚、甲基苯噻隆和达草灭的代谢活性，从而表现出对这五种除草剂的 交叉耐受性。转有c y p i a c c y p i a2 ) 酵母p 4 5 0 还原酶融合酶基因的烟草，对绿 麦隆和莠去津表现出明显的耐性【2 9 1 。y a m a d a 等【3 0 】研究发现转入鼠c 印删基因的 土豆经苯并噻二唑处理后，对取代脲类除草剂绿麦隆和甲基苯噻隆的耐受性大 大提高。i n u i 等1 2 4 j 研究发现转人c 印2 c 9 基因水稻对绿磺隆和唑吡嘧磺隆代谢速 度加快。同时发现转人c y p 2 c 1 9 基因的水稻在萌发试验中表现出对苯噻草胺、 异丙甲草胺、达草灭和稗草畏的交叉耐受性。将哺乳动物细胞色素p 4 5 0 基因导 入植物可以培育对多种除草剂有交叉抗性经济作物【9 】。利用生物工程技术获得抗 除草剂作物新品种，这将成为除草剂生物科学和作物育种领域研究的热点之一。 l 242 改良植物的抗逆性 植物中某些p 4 5 0 基因能抵抗非生物胁迫因子的影响，保证植物的正常生长 发育，将这类p 4 5 0 基因导入植物中可以培育出较高抗逆性的植物品种。高粱植 株体内具有独特的含氰苷生物合成途径，所产生的含氰苷对害虫有毒性。催化 这一代谢途径的关键酶是两个具有多种功能的p 4 5 0 基因，现已从高粱基因组中 分离克隆到这两个基因c y p 7 9 a 和c y p 7 1 e 1 。分别表达c y p 7 9 a 和c y p 7 1 e 1 以及这两个基因共同表达的转基因拟南芥植株，其体内积累了较多的含氰苷， 其他性状未改变，而且生长发育正常。这一代谢途径也在烟草植株中异源表达 成功【3 l 】。 1 2 4 3 培育雄性不育系 p 4 5 0 酶系对除草剂的解毒作用是导致除草剂选择性与植物耐受性、抗药性 的重要机制。耐受性或抗性植株能迅速将除草剂降解为低毒或无毒代谢物，而 敏感植株则不能或是解毒代谢速度远低于抗性植株。 水稻中由b e l 基因编码的细胞色素p 4 5 0 单加氧酶c y p 8 1 a 6 表现为对苯达松这 种除草剂的抗性，而在其突变株w 6 1 5 4 s 中表现为对苯达松的敏感致死性。如果 将水稻的不育系中将b e l 基因转变为b e l 基因，则可以通过喷洒苯达松而有效地对 7 第1 章引言 杂交种中的杂交进行筛选【32 。从土壤杆菌s t r e o t o m y c e sg r i s e l u s 中分离到两个可 诱导磺胺尿素代谢的p 4 5 0 基因s u l 和s u 2 1 33 。将s u l ( c y p l 0 5 a 1 ) 基因的前端加上 一段编码叶绿体转运肽序列，使该基因能在叶绿体基质中表达、翻译成目标蛋 白。该目标蛋白的表达，可激活无毒的磺胺尿素r 7 4 0 2 ，使之转化为有巨毒的除 草剂。当s u l 在整株中表达时，用外源的r 7 4 0 2 处理将导致整株死亡。如果该嵌 合基因在绒毡层特异启动子控制下，使该基因在绒毡层组织中表达时，用r 7 4 0 2 处理未成熟的花，则产生雄性不育。 1 3 基因打靶 基因打靶技术( g e n et a r g e t i n g ) 是将外源d n a 分子与受体细胞的染色体上同 源序列之间发生重组而整合到预定位点，对该位点进行定点突变，从而改变细 胞遗传特性的方法，也被称为基因定点同源重组p 训。它是2 0 世纪8 0 年代后半期 发展起来的一种按预期方式精细改造生物遗传信息的技术手段。采用基因打靶 技术对b e l 基因区域进行突变，可以避免传统育种中周期长、工作量大、效率低 及连锁累赘等不良效应，从而快速而有效地培育出水稻苯达松敏感致死的突变 体。 1 3 1 基因打靶研究概述 基因打靶最早应用于酵母中，h i n n e n 等【3 5 j 采用带有野生型酵母亮氨酸生长 素( l e m 2 ) 基因的质粒c o l e l 对l e m 2 一型酵母成功进行修复。由于外源d n a 在酵母中主要以同源重组方式与酵母基因组进行交换，通过对酵母中基因打靶 的研究有助于对同源重组机制的进一步了解 3 6 】。s m i t h i e s 等p7 j 于1 9 8 5 年利用同源 重组将一段外源质粒p a l 3 1 1 7 插入到人类染色体p 珠蛋白位点，为在哺乳动物中 进行基因打靶奠定了坚实基础。两年后，d o e t s c h m a n 3 s 采用电穿孔法对小鼠胚 胎干细胞e s 细胞e 1 4 t g 2 a 中的次黄嘌呤磷酸核糖转移酶( h p r t ) 突变基因成功进 行修复，正常的胛r 珙含有9 个外显子，突变型缺失第1 、2 3 b 显子，通过带有 目的片段的质粒p n m r l 3 3 与靶基因发生同源重组而修复h 袱瑾因，经s o u t h e r n 检测共获得5 个精细打靶克隆，两个为嵌合型细胞，三个为纯合型细胞，因为e s 细胞具有全能性和多能性所以以e s 细胞做为转化受体对基因功能进行研究成为 第1 章引言 一种常规的模式【3 9 1 。随着核移植和体细胞克隆技术的发展，以体细胞为靶细胞 进行打靶也有较大发展。m c c r e a t h 掣4 0 j 构建了载体c o l t - 1 和c o l t - 2 ，分别对 p d f f 2 雌性绵羊矛i p d f f 5 雄性绵羊的原胶原( c o l i a l ) 基因位点进行基因治疗， 他们以绵羊胚胎成纤维细胞做为靶受体，重构3 1 7 枚胚胎，9 0 枚发育到囊胚，最 终培育出3 头存活的成体。基因打靶在动物中迅速发展的同时研究者将该技术应 用于植物的定点突变和基因改造中。p a s z k o w s k i 等【4 l 】首次对番茄进行基因打靶， 随后m i a o 等【4 列通过同源重组将n e o 基因插入拟南芥t g a 3 基因中，使其失活，从 2 5 8 0 个卡那霉素抗性愈伤中筛选出1 个精细打靶株系，检验发现其为嵌合型且不 能再生为打靶植株。r u l 阵 4 3 】对烟草叶绿体基因组的一个功能未知基因) ，够进行 敲除，发现邶基因与光系统i ( p s i ) 相关，这是首例用基因打靶技术对功能未知 基因进行的研究。直至t 2 0 0 2 年，t e r a d a 等m j 采用农杆菌介导法首次对单子叶植物 水稻进行精细打靶，他们以水稻淀粉蜡质基因( w a x y ) 为靶基因，采用潮霉素( a p t ) 为正向选择标记，白喉毒素( d 剐为负向选择标记，对3 2 9 水稻愈伤进行农杆菌 侵染