（植物学专业论文）抗旱相关基因对玉米和拟南芥的转化.pdf

摘要 干旱强光可造成植物的渗透胁迫和氧化毒害。植物体可以在体内积累甜 菜碱以缓解渗透胁迫。植物体内的过氧化氢酶( c a t ) 可以有效清除植物体 内产生的h 2 0 2 。但是c a t 在植物体内主要存在于过氧化物体中而干旱强 光等胁迫条件下，叶绿体是产生活性氧的主要部位。因此将合成甜菜碱的关 键酶基因也口砌导入植物体中，将c a t 定向导入叶绿体中对于提高植物的 抗旱性具有重要的作用。 将豌豆过氧化氢酶基因( 融合二磷酸核酮糖羧化酶小亚基基因的转运肽 片段以引导基因产物定位于叶绿体) 和甜菜碱醛脱氢酶( b a d h ) 基因构建 到p 3 3 0 1 载体上。将构建好的载体转化玉米和拟南芥，玉米在含有2 0 m g l 除草剂的培养基上筛选得到2 5 个株系，拟南芥在o 5 ( v v ) 的除草剂下筛 选得到l o 个株系通过p c r 、r t - p c r 、植株总蛋白w e s t e r nb l o t 等检测， 证明目的基因已经整合到玉米和拟南芥基因组中，并能在拟南芥中转录和翻 译转基因拟南芥的抗性生理实验表明，在2 0 p e g e o o o 渗透胁迫条件下转 基因拟南芥的质膜损伤程度、叶绿素降解程度和p si i 的受损伤程度都显著 低于野生型，转基因拟南芥的渗透势下降幅度比野生型大。表明在渗透胁迫 条件下转基因拟南芥抵抗渗透胁迫能力比野生型强。转b a d h 和c 讲基因的拟 南芥抗旱的原因在于过量表达了c a t 和b a d h ，提高拟南芥的抗渗透胁迫， 减少渗透胁迫对植物造成的伤害。转基因玉米为大田育种打下基础，转基因 拟南芥为干旱代谢生理研究提供了材料。 关键词：甜菜碱醛脱氢酶：过氧化氢酶；抗旱；基因工程 分类号：q 9 4 5 7 8 a b s t r a c t d r o u g h tu s u a l l yc o m p a n y 、v i t i ls t r o n gl i g h t w h i c hr b s u l tt oo s m o t i cs t r e s s a n do x i d a t i v es t r e s st op l a n t s u n d e rt h ew a t e r - s t r e s s ，b e t a i n eh a sa ni m p o r t a n t r o l ei nr e m a l m i n gt h eo s m o t i cb a l a n c eo ft h ep l a n t s ot r a n s f o r m a t i o no fb a d h w h i c hi so n eo ft h ek e ye n z y m e si nt h et h es y n t h e s i so fb e t a i n ei n t op l a n ts h o u l d i m p r o v et h ep l a n t sd r o u g h t - r e s i s t a n c e c a t a l a s e ( c a t ) i sr e g a r d e da sak e y e n z y l n ei nt h ea n t i o x i d a t i o ns y s t e mo ft h ep l a n t c a tm a i n l yl o c a t e si nt h e p e r o x i s o m e ，n o tt h ec h l o r o p l a s t b u t t h ec h l o r o p l a s ti st h em a i np o s i t i o n p r o d u c i n gr e a c t i v eo x i d a t i v es p e c i e s ( r o s ) s ot r a n s f o r m a t i o no fc a ti n t o c h l o r o p l a s ti si m p o r t a n ts t r a t e g yt oi m p r o v e t h ep l a n t sd r o u g h t - r e s i s t a n c ea b i l i t y i nt h i se x p e r i m e n t , w ec o n s t r u c t i o nt h ev e c t o rp 3 3 0 1 1 2 1 - b ew h i c hh a v et h e i t - c a ta n db a d h s ot h ec a tc a nf u n c t i o ni nt h ec h l o r o p l a s t t h ev e c t o rw a s t r a n s f e r r e dt h ev e c t o ri n t ot h em a i z ea n da r a b i d o p s i st h a l i a n aa n dm e d i a t e db y t h ea g r o b a c t e r i u mt u m i f a c i e n s m a i z et r a n s f o r m a n t sw e r es e l e c t e d 0 1 1t h e m e d i u mc o n t a i n i n gp h o s p h i n o t h r i c i n ( 2 0 m g l ) ，2 5t r a n s c a t 、b a d hl i n e sw e r e a l i v ea n da r a b i d o p s i st h a l i a n at r a n s f o r m a n t sw e r es e l e c t e db ys p r a y i n g p h o s p h i n o t h r i e i n ( 5 0 0 m l l ) 1 0t r a n s - c a t 、b a d hl i n e sw e r ea l i v e ，n 圮c a ta n d b a d hg e n eh a db e e ni n t e r g r a t e di n t om a i z ea n da r a b i d o p s i st h a l i a n ag e n o m e w h i c hc o n f i r m e db yp c rf o rm a i z ea n db yp c r , r t - p c r , w e s t e r nb l o tf o r a r a b i d o p s i st h a l i a n a w e s t e m b l o tr e s u l t si n d i c a t et h a tg e n eh a de x p r e s s e di nt h e a r a b i d o p s i st h a l i a n an o r m a l l y _ w h e nt h ep l a n t sw e r es u b j e c t e dt o2 0 ( w v ) p e g 6 0 0 0 。t h e ns o m ei n d e x e sw 翻l ed e t e r m i n e db e t w e e nt h en o n - t r a n s g a n i c p l a n t sa n dt h et r a n s g e n i cp l a n t s 1 1 l er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ed e g r e e so fp l a s m a i n j u r y , r e d u c t i o no fc h l o r o p h y l la n dp s i ii n j u r yw e r ea l ll o w e ri nt h et r a n s g e n i c p l a n t si ti si n d i c a t et h a tt r a n s g e n i cp l a n t s w e r eh a v es t r o n g e ra b i l i t yo fo s m o t i c r e g u l a t i o n i nc o n c l u s i o n ，t h et r a n s g e n i ca r a b i d o p s i st h a l i a n as h o w e di m p r o v e d t o l e r a n c et oo s m o t i cs t r e s sb yo v e re x p r e s s i o no fc a t t h et r a n s f o r m e dm a i z es e t t h ef o u n do fh e r e d i t yb r e e d i n g t h et r a n s f o r m e da r a b i d o p s i st h a l i a n ac a nb e f u r t h e rs t u d i e di nt h ep h y s i o l o g i c a lm e t a b o l i s mo fs t r e s sr e s i s t a n c e i i k e yw o r d s ：b e t a m ea l d e h y d e d e h y d r o g e n a s e ；c a t a l a s e ；d r o u g h t - r e s i s t a n c e g e n e t i ce n g e n e e r i n g i i i 符号说明 a m pa m p i c i l l i n 氨苄青霉素 p p t p h o s p h i n o t h r i c i n ，草丁膦 c d n ac o m p l e m e n t a r yd n a 互补d n a b i a l a p h o s b a s t ar e s i s t a n c eg e n e ，抗除草剂b i a l a p h o s 或 b a r b a s r a 的基因 d e p c d i e t h y l p y r o c a r b o n a t e 焦碳酸二乙酯 e be t h i d i u mb r o m i d e 演化乙啶 g u s g l u e u r o n i d a s e ，葡萄糖苷酸酶 p e g p o l y e t h y l e n eg l y c o l ，聚7 - - 醇 a s a c e t o s y r i a g o n e ，乙酰丁香酮 g b g l y c i n c b c t a s n e ，督氨酸甜菜碱 b a d hb c t a i n ea i d e h y d ed c h y d r o g c r m s e ，甜菜碱醛脱氢酶 r o sr 船c t i v co x y g e ns p e c i e s ，活性氧 c a t c a t a l a s e ，过氧化氢酶 s o d s u p e r o x i d ed i s m u t a s c ，超氧化物政化酶 r i b u l o s e1 , 5 b i s p h o s p h a t ec a r b o x y l a s e o x y g e n a s e t r n b p 核酮糖1 ，5 二磷酸羧化加氧酶 p c r p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，聚合酶链式反应 h e x a d e c y l 幺t e n i n ea m m o n i u mb r o m i d e ，十六烷基三甲 c 瑚 基溴化铵 e d t a e t h y l e n ed i a m i n ct e t r a a e e t i ca c i d ，乙二胺四乙酸 t 矗s t r i s - h y d r o x y m e t h y la m i n om e t h a n e ，三羟甲基氨基甲烷 k a n k a n a m y e i n ，卡那霉素 i v x - g a l5 - b r o m o 一4 一c h l o r o 一3 i n d o l y l 8 一d g a l a c t o s i d e ，5 - 溴- 4 一 氯一3 一吲哚- 8 - d - 半乳糖苷 r r - p c r r e v e r s e - t r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n 反转 景聚合酶链式蜃应 s d s s o d i u md o d e c y ls u l f a t e ，十二烷基硫酸钠 c 却v3 5 sc a u l i f l o w e rm o s a i cv i r u s3 5 sp r o m o t e r ，花椰菜花叶病 毒3 5 s 启动予 v 第一部分综述 水是人类赖以生存的物质基础，也是植物生长和提供农产品的先决条 件。在高等陆生植物中，水分是它的最大消耗，又是它的最大成分。植物的 种种生理活动，处处都离不开水分。尽管地球表面的7 0 被水覆盖，但是在 地球总储水量中只有2 2 ，5 是淡水。而在这些淡水资源中，还有相当一部 分无法被人们利用。而且这部分淡水在地球的表面分布极不均匀。全世界有 1 3 的可耕地处于干旱半干旱状态，有4 0 多个国家缺水；其它地区也常因受 到周期性或难以预测的干旱雨减产。干旱是全世界农业生产面临的非生物逆 境之一，给作物的产量造成很大的损失【1 】 我国是一个水资源相对贫乏的国家，年均降水量为6 3 0 m m ，低于全球陆 面和亚洲陆面的降水量。我国年平均淡水资源总量为2 1 8 万亿m 3 ，人均占 有水量仅2 3 0 0 m 3 ，只相当于世界入均水平的1 4 ，居世界第1 0 9 位，是世界 上人均占有水资源最贫乏的1 3 个国家之一另外，我国水资源的时空分布 严重不平衡，降水量星东南多西北少、山区多平原少分布特点，雨量大致由 东南向西北递减。在我国8 1 的水资源集中分布在长江流域及以南地区，长 江以北地区的水资源却只占全国的1 9 ，人均占有量为5 1 7 m 3 ，相当于全国 人均量的l ，5 和世界人均量的1 2 0 口】。 农业是我国的用水大户，每年农业用水占用水总量的8 0 。在我国水资 源相对缺乏的条件下，尤其在北方，发展节水农业是解决我国当前用水紧张 的主要出路。相应发展生物节水技术，培育和选择抗旱品种是节水农业的一 个很重要的方面 3 1 。由于我国人多地少，耕地在逐渐减少，在土地资源利用 上充分开发利用干旱、半干旱耕土地己成为主攻目标之一。我国主要产粮区 如华北、东北和西北是我国缺水最严重的地区，春早频繁。抗旱问题已成为 各国政府和科学家最关注的前沿热点课题【4 】。随着分子生物学的发展，通过 基因工程技术是提高植物的抗旱性，培育抗旱性强的新品种是开发利用大面 积干旱、半干旱土地的有效措施。 l 植物抗旱的机制及研究进展 为了适应环境，植物在长期的进化中，已逐渐建立起适应和抗性机制。 干旱、高温、低温、盐渍等非生物逆境严重影响着植物的生长，这些逆境因 子均造成植物细胞缺水，使植物的生长受到水分胁迫。当植物受到水分胁迫 时，植物体内会产生一系列生理、生化反应，涉及到许多水分胁迫反应基因 的表达与调控。这一整个过程包括：细胞感知水分胁迫信号、胁迫信号的传 递、第二信使激活一些相关的转录因子、转录因子与顺式元件相互作用诱导 基因的表达、表达的产物直接作为功能蛋白保护细胞免于受到水分胁迫的影 响、或作为转录因子进一步启动另外一些基因的表达，最终体现为植物对水 分胁迫的适应或产生抗性【5 1 。这是一个错综复杂的调控体系，又由于自然界 中的植物种类繁多，种间差异很大，因此各种属的水分胁迫调控通路又有些 差异。目前，距离形成完整的应答调控通路图还相差较远。但近年来，随着 分子生物学的快速发展，人们对这一调控机制的认识逐渐加深，许多相关基 因及一些转录因子相继被鉴定、克隆。特别是美国亚利桑那大学的j i a n - k a n g z l m 研究组和日本的y a m a g u c h i s h i n o z a k i 研究组利用模式植物拟南芥在这一 领域作出了杰出的工作。有关植物响应干旱逆境的分子机制，植物在于旱逆 境下的差异表达基因的研究已经有很多综述报道【6 q 。植物在水分胁迫下诱 导表达的基因对于提高植物的抗旱性具有重要的作用，就水分胁迫胁迫诱导 表达的基因介绍如下： 植物的抗旱涉及一系列的信号转导，信号转导的过程在可分为依赖a b a 和不依赖a b a 两条途径，在a b a 的信号传导中，最近关于a b a 的受体获得了突 破，有两个课题组发现了不同的a b a 受体f 1 2 1 3 l 。大多数的干旱诱导基因能同 时被a b a 所诱导【1 4 瑚。a b a 逶过诱导特异基因的表达广泛参与植物对环境 胁迫( 干旱、低温、盐害等) 的响应过程【1 9 1 。对水分胁迫的研究已在多种植 物上进行，如；重要的作物水稻、玉米、豌豆等，模式植物拟南芥，还有一 些特别耐早的复苏植物( r e s u r r e c t i o np l a n t s ) 等。研究发现，在植物受到水 分胁迫时，大量的基因会表达，表达的产物功能各异，这些基因有些已知其 功能，有些是未知功能的。这些基因的产物不仅仅在于保护细胞，而且在水 分胁迫信号转导方面起重要作用。因此这些基因产物大致可以分为两类：一 是调控蛋白；二是功能蛋白。 1 1 抗旱反应的调控蛋白 2 调控蛋白是指在胁迫信号转导和功能基因表达过程中起调节作用的蛋 白质因子。在植物胁迫信号传递过程中，涉及到为数众多的信号分子。这一 部分现在正是研究植物对水分胁迫响应的重点和难点所在，只有越来越多的 信号分子被发现，它们之间的相互作用及调控途径才有可能被阐明。目前， 发现的信号分子主要有以下几种： 第一种是包含b z i p 、m y b 、m y c 、e r e b p a p 2 等典型d n a 结合基序 的转录因子刚。这些转录因子能够被水分胁迫强烈诱导，它们的表达能进一 步调控各种功能基因的表达。a r e b 在依赖a b a 的基因表达中作为顺式作用 元件f 2 1 1 。d r e b 是这一领域的重要发现【捌。 第二种是感应和转导胁迫信号的蛋白激酶。如：m a p 激酶、c d p 激酶、 受体蛋白激酶、核糖体蛋白激酶、转录调控蛋白激酶等，这些激酶通常能够 起到胁迫信号级联放大的作用。其中，最重要的莫过于促分裂原活化蛋白激 酶( m a p k ) 级联中所包含的三个关键激酶：m a p k 、m a p k k 、m a p k k k 。 在植物中已发现多种m a p k s 2 a ，如：在拟南芥中发现了大量编码m a p k s 的基 因。但植物中m a p k 级联成员之间的相互作用机制还有待进一步阐明。 第三种是与第二信使生成有关的蛋白酶，如：磷酸酯酶，磷酸酯酶c 等。 钙离子和三磷酸肌醇( i n o s i t o l1 , 4 ，5 - t r i p h o s p h a t e ， 3 ) 是最受注目的第二信使。 在水分胁迫下，植物的生长便会受到抑制，因此植物往往通过降低生长所需 要的膨压阙值来得以继续生长，膨压的降低是干旱胁迫效应中最原初的生理 反应之一，而瞬时的细胞质c a 2 + 浓度升高是细胞膨压降低的一个必要条件。 1 3 是另一种第二信使，它可增加钙离子浓度，催化形成口3 的关键酶一一磷 脂酶c ( p h o s p h l i p a s ec ，p l c ) ，其活性及基因表达均能为干旱强烈诱导。盐 胁迫也会导致水分胁迫，而盐胁迫信号转导也可通过钙离子介导。 1 2 抗早响应机制 1 2 1 渗透调节 在受到轻度水分胁迫时，植物能够通过渗透调节降低水势，保持膨压， 进而增强植物的保水能力，稳定体内的渗透平衡，使植物能忍耐失水所带来 的负面影响。参与渗透调节的物质主要有：脯氨酸( p r a l i n e ) 、甘露醇 ( m a n n i t 0 1 ) 、甜菜碱( b e t a i n e ) 、蔗糖、海藻糖等可溶性溶质( c o m p a t i b l e s o l u t e s ) 这些渗透分子具有亲水性强、又不会影响细胞内蛋白功能发挥的特 点，可以保持细胞的水势和膨压不致降低太多。另外，离子通道和水通道蛋 白的变化调节着离子和水分进出细胞，也是渗透调节的重要方面。现已发现 很多渗透物质合成的关键酶类以及糖类、脯氨酸的转运蛋白等等并通过基 因工程手段进行转基因研究，已经确实证实了这些基因的抗旱作用。 1 2 1 1 腑氨酸的渗透调节 。 脯氨酸是一种亲水性氨基酸，是谷氨酸通过1 毗咯啉5 羧酸合成酶 ( 1 - p y r o l i n e 一5 c a r b o x y l a t es y n t h e t a s e ，p 5 c s ) 和1 一吡咯啉- 5 - 羧酸还原酶 ( - p y r o l i n e - 5 一e a r b o x y l a t er e d u c t a s e ，p 5 c g ) 两步催化后形成，它的合成和代 谢都受水分胁迫逆境所控制。p 5 c s 酶活性受脱水、盐害和a b a 所诱导。脯 氨酸脱氢酶催化脯氨酸降减为p 5 c ，受脱水逆境所抑制表达而被回复供水所 诱导。因此脯氨酸在干旱逆境下的积累是由于参与其合成和代谢的酶被干旱 逆的动态调节所控制 1 2 1 2 甜菜碱的渗透调节 甜菜碱广泛存在于植物体中，特别是藜科及禾本科的植物。甜菜碱是一 种四价季铵类化合物，在生理p h 条件下不带净电荷，而且溶解度很高。植物 中甜菜碱主要有1 2 种，其中最简单同时也是研究最多的一类是甘氨酸甜菜 碱，简称甜菜碱。多数高等植物在盐碱或缺水的环境下，在细胞中积累甘氨 酸甜菜碱类物质，以维持细胞的正常膨压。甜菜碱起着无毒渗透保护剂的作 用，。甜菜碱合成后几乎不再被进一步代谢，属于永久性或半永久性渗透调节 剂，已在植物耐旱研究中越来越受到重视。一般认为甜菜碱定位于细胞质， 在胁迫条件下细胞质中大量积累甜菜碱，通过渗透调节作用平衡液泡与细胞 质、细胞与环境的渗透势差，使细胞免受伤害，并能使细胞保持水分。甜菜 碱除作为有机渗透调节剂外，其作用还表现在能稳定光合放氧和光系统 ( p si i ) 外周多肽 2 4 1 ，甚至可以起到稳定膜的作用f 2 5 1 。n o m u r a m 等 2 6 1 认为， 在受到盐胁迫的细胞中甜菜碱可以起到一种低分子量伴侣分子的作用，能够 稳定酶蛋白的构象并使酶处于有功能的状态，从而部分抵消了高浓度的盐对 细胞所造成的伤害。 一般认为植物体内甜菜碱的合成是以丝氨酸为原料，经过一系列的反应 4 生成胆碱，再由胆碱在胆碱加单氧酶( c m o ) 的催化下生成甜菜碱醛，甜菜碱 醛在甜菜碱脱氢酶0 3 a d h ) 的催化下生成甜菜碱：即，胆碱一甜菜碱醛一甜 菜碱。由于甜菜碱合成途径相对简单。进行遗传操作非常简便，所以甜菜碱 合成酶基因被认为是最重要和最有希望的胁迫抗性基因之一。因此，随着编 码c m o 和b a d h 基因的相继克隆成功，很多学者对甜菜碱合成酶的基因工 程进行了研究。迄今为止已经有很多植物被成功地导入了b a d h 基因。梁峥 等阅、郭北海等【勰1 、李银心等【2 9 j 分别将b a d h 基因转入烟草、小麦、豆瓣 菜中所获得的转基因植株都不f 司程度地提高了其抗盐性和抗旱性。 b a d h 是由单一核基因编码的多肽二聚体，等电点为5 6 5 ，当p h 为7 5 9 5 时，酶活性不受影响，天然状态下的酶是由2 个分子量为6 3k d 的亚基组成。 各物种b a d h 基因编码区编码的氨基酸序列中，均含有高度保守的十肽 ( v 眦l ( 船k s p ) 以及与功能有关的半胱氨酸( c ) 残基，这段保守序列可 能与n a d 的结合及催化反应的位点有关。目前对于参与甜菜碱合成的酶从基 因水平到生理功能的研究都取得很大的进展，但有关b a d h 活性的调节以及 影响因素等细节尚有许多不清楚之处大量实验证明，n a c i 胁迫可诱导 b a d h 基因表达量增加，酶活性上升。 关于b a d h 在细胞内的定位尚存在一定争议。在已报道的b a d h 氨基酸 序列中，存在两种有关该酶的信号肽。一种是n 端信号肽，氨基酸序列为 q l f i d g e ，被认为是定位于叶绿体的信号，但该信号肽缺乏典型性，菠菜、 甜菜等植物中b a d h 位于叶绿体中，但是b a d he d n a 不编码典型的转导肽。 r a t h i n a s a b a p a t h i 等 3 0 l 推测其转导肽可能由7 8 个很不保守的氨基酸组 成，明显少于典型的进入叶绿体的信号肽。另一种是c 端信号肽，很多单子 叶植物( 如大麦、水稻、高粱等) 的b a d h 基因所编码的多肽在c 端有一个三 肽序列s k l 。s k i _ , 是已知的将前体蛋白定位于过氧化酶体的信号肽 t o s h i h i d e 等【3 l 】用免疫金标记技术分析转基因烟草( 外源基因为大麦的b a d h ) 中b a d h 蛋白的细胞定位时见到，金粒主要在过氧化酶体中检测到，在线粒 体和叶绿体中也检测到少量的金粒。 1 2 1 3 可溶性糖的渗透调节 植物通过积累可溶性糖来保持组织的水势0 2 1 。在耐极端干旱的复苏植物 5 和不耐极端干旱的菠菜中，都发现干旱可以诱导蔗糖磷酸合成酶活性增加， 蔗糖含量升高。在严厉干旱条件下，糖保护植物细胞免受伤害的机制是通过 形成玻璃状物质来完成的。在玉米种子中发现有玻璃状物质形成，与种子具 有萌发力密切相关。玻璃状物质可以填补脱水后留下的空隙防止细胞塌陷。 磷酸果糖激酶是一个四聚体酶，在干旱胁迫下被不可逆地转化为二聚体失去 功能。体外实验证明蔗糖、麦芽糖和海藻糖具有稳定磷酸果糖激酶作用。利 用体外模型肌浆网状组织膜研究发现，干旱胁迫使囊泡融合失去转运c a 2 + 的能力，可是如果加入海藻糖可以保护囊泡的运转功能不受影响。许多研究 表明糖也可以保护膜系统免受伤害，认为糖可以改变膜系统的物理特性以便 束缚那些亲水性的生物分子。用远红外光谱技术，观察到海藻糖的羟基与蛋 白的极性氮基酸残基可以形成氢键，进而保护蛋白免受降减。 1 2 1 4 离子通道和水通道蛋白的调节着离子和水分进出细胞 离子通道和水通道蛋白的变化调节着离子和水分进出细胞，也是渗透调 节的重要方面。钾离子通道控制钾离子的吸收和调节钠离子的吸收，与耐盐 适应性有着重要的关系水通道蛋白运输水分的进出细胞，可能在细胞遇到 水分胁迫时参与保持细胞的水势1 3 3 3 4 1 2 2 抗氧化防御系统 植物细胞在水分胁迫的条件下，随着叶片含水量下降、气孔关闭和c 0 2 吸入量的降低，光呼吸代谢增强，乙醇酸氧化酶( o l y c o l a t eo x i d a s e ) 活性升 高，致使产生过量的h 2 0 2 ，造成植物细胞膜系统和核酸遗传物质受到伤害， 尤其会对线粒体和叶绿体产生伤害。在活性氧代谢中参与清除活性氧的酶有 抗坏血酸过氧化物酶( a s c o r b a t cp c r o x i d a s e ，a p x ) 和s o d ( s u p c r o x i d e d i m u t a s e ) ，过氧化氢酶( c a t ) ，过氧化物酶( p o d ) 等抗氧化酶类。这些酶的活 性在于旱胁迫下都被诱导提高，在抵抗干旱中起着重要的作用h 2 0 2 的积累还 作为第二信使参与植物响应干旱逆境的信号转导【3 5 】【3 6 i 和调控气孔的开闭。干 旱缺水通常伴随着强烈的阳光造成的高光强，从机理上讲，干旱可造成植物 的渗透胁迫伤害，造成叶片气孔关闭，c 0 2 供应不足，致使强烈阳光的大量光能 不能被作物叶片光合作用的c 0 2 同化所利用，而光反应在不断的进行，导致叶 绿体中产生和积累大量的活性氧( h 2 0 2 ) 和过氧物自由基( 0 2 ) ，这些活性氧和 6 自由基破坏叶片光合器官的结构与功能，使叶绿体的吸能、传能、转能平衡 破坏，光合作用降低，植物处于饥饿状态，生长受阻，甚至死亡。 因此要提高植物对干旱环境的适应性，必须考虑干旱条件下植物的渗透 胁迫和光抑制闯题。在正常情况下，植物细胞巾存在着自由基的产生和消除 过程，只有超氧化物歧化酶( s o d ) 、过氧化氢酶( c a t ) 和过氧化物酶( p o d ) 三者协调一致，才能使生物自由基维持在一个低水平，从而防止自由基毒害 当植物处于各种逆境下，自由基的产生与消除就会遭到破坏，而有利于自由 基的产生，这种积累的自由基将会引发膜脂的过氧化作用，造成细胞膜系统 的伤害【3 ”。就植物而言，光是植物重要的能量来源，植物通过光合作用将光 能转变成化学能贮存于体内。在一定光照强度范围内，光强的增加可引起植 物光合效率的升高，超过一定的光照强度。光合效率则受到抑制甚至会下降， 进而引起植物光合机构的损伤。转基因植物证明，抗氧化酶的过度表达可在一 定程度上减轻这种抑制或损伤状况【3 8 q 9 】s h i k a n a i 等( 1 9 9 8 ) 4 0 l 将细菌过氧化 氢酶基因导入烟草并表明过氧化氢酶与植物抗旱性密切相关；m o h a n e d 等【4 1 j 将此基因导入番茄提高了转基因植物的抗光氧化能力；m a t s u m l l r a 等| 4 2 j 研究 表明小麦过氧化氢酶基因的导入提高了水稻对低温的抗性；过氧化氢酶的缺 少也影响高光诱导的基因表达【4 3 】。 1 2 2 1c a t 的生化特性 c a t 是一类含有f e d l i ) 原卟啉的氧化还原酶，由四个亚基组成，分子 量大约为2 5 万左右，其活性中心是血红素辅基，它可催化如下反应：2 h 2 0 2 2 h 2 0 + 0 2 在植物中， c a t 和抗坏血酸过氧化物酶( a p x ) 都能清 除h 2 0 2 ，c a t 和a p x 的不同之处在于c a t 不需要还原力且具较高的酶活 速率，但对h 2 0 2 的亲和力较弱，而a p x 需要还原性底物并对h 2 0 2 具有较 高的亲和力，此外，c a t 主要定位于过氧化物体和乙醛酸循环体，而a p x 主要存在于叶绿体中。由于其定位的不同它们在清除植物体中产生的h 2 0 2 时也具有不同的作用。c a t 在清除光呼吸产生的h 2 0 2 时具有重要的作用， 而a p x 主要在叶绿体中发挥作用。c a t 在过氧化物体中的定位主要是由其 c 末端的一个三肽序列：s e r - a r g - l e u 决定的，但是并不是所有c a t 都具有 这个三肽序列，例如在拟南芥c a t l 、玉米c a t 3 以及棉花种子两个c a t 亚 7 基上就不存在这个三肽序列，在拟南芥c a t l 和玉米c a t 3 上被t h r - a r g - l e u 所代替，由于1 1 1 r 代替了s e r 将可能使得拟南芥c a t l 不能定位于过氧化物 体中，并将使得玉米c a t 3 定位于线粒体中。植物体内存在多种c a t 同工酶， 根据c a t 表达的位置以及由此推测的功能可将其划分为i 组类型第1 型 c a t 是在光合作用的细胞内强烈表达，主要分解光呼吸期间所产生的h 2 0 2 ； 型的表达很难确定，位置随不同种类的植物而变化；i 型c a = r 通常在种 子、幼苗和植物衰老部位表达，其作用主要是分解乙醛酸循环体内进行的脂 肪酸b 氧化所产生的h 2 0 2 。 1 2 2 2c a t 的作用及其转基因研究 在植物的长期进化过程中，为了应对氧化胁迫在体内形成了一套由酶促 ( s o d 、舭x 、c a t 等) 和非酶促( 抗坏血酸、谷胱苷肽等) 组成的活性氧 清除系统。在正常条件下可有效清除植物体内产生的活行氧。但在各种逆境 ( 干旱、光氧化等) 条件下，植物体内活性氧产生与清除的代谢系统失调， 从而导致活性氧过量积累而造成伤害。在植物体内s o d 可将o _ 2 歧化为 h 2 0 2 ，而c a t 和a p x 等则可将h 2 0 2 转化为无毒的h 2 0 和0 2 。如果h 2 0 2 在植物体内累积，将可能通过h a b e r - w e i s s 反应或f e n t o n 反应生成毒性更大 的o h 。一般情况下o _ _ 2 、h 2 0 2 不能直接启动膜脂过氧化，然而，通过进一 步反应生成的* o h 则可在其形成位点以扩散控制速率与大多数有机化合物 反应启动膜脂过氧化因此，有效的清除植物体内产生的过量h 2 0 2 将显得 至关重要。w i l l e k e n sh 等的研究表明，c a t 是c 3 植物中h 2 0 2 清除的关键 酶，而且是c 3 植物耐受胁迫所必需的。他们用只有野生型1 0 c a t 活性的 转基因烟草作为材料进行研究发现，c a t 缺乏的植株在低光强下与正常烟草 植株相似并未表现出任何异常，而在高光强下与正常烟草植株相比其叶片上 则更快地出现白色的坏死斑。以前人们认为在于旱等胁迫条件下，植物体内 的h 2 0 2 主要由a p x 清除，c a t 只起到次要作用。而日本的s h i k a n a i t 等 4 0 】 的研究则得到了与此完全相反的结果。他的研究表明a p x 只是在植物处于 正常条件下才起作用，而在干旱、光氧化等胁迫条件下则完全失去活性，但 c a t 活性则不受干旱和强光的影响，因此，c a t 在清除干旱等逆境条件下产 生的h 2 0 2 时可能占据主要的地位。另外，虽然c a t 主要定位于过氧化物体 8 和乙醛酸循环体，在清除脂肪酸b 氧化和光呼吸产生的h 2 0 2 时发挥重要的 作用，但由于h 2 0 2 可自由穿膜，因此c a t 在清除叶绿体中产生的h 2 0 2 时 可能也具有重要的作用 过量表达抗氧化酶类如s o d 3 9 1 和p o d 3 s 来提高植物的抗氧化件已作了 大量的研究，并取得了一定的进展。c a t 基因工程研究近几年也得到人们的 重视。由于各种植物之间甚至与微生物和动物相比c a t 都有很高的同源性， 因此将不同种生物来源的c a t 基因转入植物体中都有可能发挥相同的催化 作用。日本的s h i k a n a it 等【柏1 将大肠杆菌k a t e 转入烟草，获得了在叶绿体 中超表达c a t 的转基因植株他们的研究表明，转基因植株在干旱条件下 其光合作用能耐较高的光辐射，而在同样的条件下野生型植株的光合作用受 到严重的破坏。m o h a m e d 等m l 将大肠杆菌k a t e 导入番茄叶绿体后也得到了 类似的结果。转基因番茄后代中的c a t 活性大约比野生型的高3 倍。 m a t s u m u r at 等【4 2 将小麦c a t 导入水稻中显著提高了转基因水稻的低温胁迫 耐性。在5 下培养8 天，野生型水稻的第4 叶有超过9 0 的叶片萎蔫，而 转基因水稻的第4 叶仅有5 0 6 0 萎蔫。这些结果充分显示，通过基因工程 的手段将e a t 导入植物体中并过量表达能显著提高由强光，干旱胁迫和冷胁 迫等所引起的氧化胁迫耐性。 1 2 3 脱水保护机制 在严重干早条件下，超出渗透调节范围时，有些植物仍然能够存活，恢 复供水后迅速恢复生长，其机理在于，这些植物在失水时产生的一些大分子 和小分子具有脱水保护功能。这类脱水保护蛋白多具有保守的序列单元，含 有较多的极性氨基酸，大多高度亲水，一般具有热稳定性，不易变性，可以 创造一种起保护作用的水相环境，防止其它蛋白进一步变性，甚至能帮助己 变性的蛋白复性。这类蛋白的代表是l e a 蛋白( 1 a t ee m b r y o g e n e s i s - a b u n d a n t p r o t e i n ，胚胎发生后期富集蛋白) ，l e a 蛋白基因被诱导表达首先在种子发育 的成熟阶段被发现，随后在于早诱导的营养器官中也被发现显著地诱导提 高。a b a 也可诱导l e a 基因表达。在植物中已经克隆到很多l e a 蛋白基因。 l e a 蛋白以不同浓度分布于植物的各种细胞中，主要定位于细胞基质当中。 在种子中，l e a 蛋白的浓度占非结构组成胞质蛋白的4 l e a 蛋白具有极 9 强的由亲水特性，所以被认为在维持蛋白和细胞膜的结构、束缚离子、结合 水分中扮演着重要的作用。可以说，l e a 蛋白的发现是这一领域最重要的发 现之一。x u 等将来源于大麦的1 基因h v a l 导入水稻悬浮细胞，过量表达大 麦的h v a l 基因可以增强水稻的抗旱性和耐盐能力。将番茄的l e 2 5 基因在酵 母中过量表达也可以增强酵母的耐高盐和抗高温的能力。脱水诱导蛋白 ( d e h y d r i n ) 、r a b 和d 1 1 都属于u ；a 蛋白，在种子成熟期和各种逆境下均被 诱导表达。这直接证明了u a 蛋白的保护功能。脱水素也是一种l e a 蛋白湖。 水孔蛋白( a q u a p o r i n , a q p ) 具有运输水分功能的一类蛋白质。a q p 在生物膜 上的存在，能使植物快速灵敏地调节细胞内与细胞间的水分流动，在植物水分 运输中起非常重要的作用m 】。脱水保护蛋白中还有一类伴侣蛋白，如：热击 蛋白( h e a t - s h o c kp r o t e i n s ) 及泛素( u b i q u i t i ne x t e n s i o np r o t e i n ) 等。从拟南 芥中分离到泛素伸展蛋白( u b i q u i t i ne x t e n s i o np r o t e i n ) 是一种融合蛋白，要 在蛋白水解酶的作用下才能将泛素释放出来。在干旱胁迫早期，泛素伸展蛋 白被诱导表达，进而被蛋白酶水解释放泛素，被用作蛋白降减的识别标签参 与蛋白的降减。在干旱逆境下，蛋白残基可以被进行脱氨基、异构化或氧化 的化学修饰，相应地参与蛋白修复的酶被干旱诱导表达。l 异天冬氨酰甲基 转移酶( 1 , - i s o a s p a r t y lm e t h y l t r a n s f e r a s e s ) 可以将受伤害蛋自的。异天冬氨酰 残基转化为l 天冬氨酰残基，这种修复作用在植物适应干旱胁迫中有降低蛋 自质降减速率的作用。利用差异筛选法从拟南芥中分离到两个干旱诱导的热 激蛋白的基因，在水分胁迫下有助于修复变性和折叠错误的蛋白。 这些分子伴侣，通过与变性或异常的蛋白质结合防止它们凝聚，或对在 水分胁迫时蛋白质错误折叠后，恢复其天然构象起修补作用。从而避免细胞 结构损伤。 1 2 4 形态结构的变化 植物可以通过改变细胞壁的物理特性和化学组成来适应干旱逆境。如 s 腺苷蛋氨酸合成酶( g e n e se n c o d i n gs - a d e n o s y l m e t h i o n i n es y n t h c t a s e ) 的 表达。其表达的增加与细胞壁木质化相关，因为此酶催化合成的s 一腺苷蛋 氨酸可作为木质素合成过程中的甲基供体，在干旱逆境下被诱导表达可提高 植物细胞壁的木质化程度。随着干旱胁迫时间的延长，细胞延伸生长停止， 1 0 而后木质化过程开始。细胞木质化后，不仅可限制水分和营养物质向外扩散， 还可增强抗真菌的能力。 1 2 5 调整代谢途径 干旱逆境下发生着基本代谢的变化。如从复苏植物( c p l a n t a g i n e u m ) 中分离到的3 - 磷酸一甘油醛脱氢酶被干旱和a b a 诱导增强表达，并且在其它 的环境胁迫下也能提高表达水平，这反应了当植物受到胁迫时对能量需求的 增加，表现在能量代谢上的变化。蛋白酶( p r o t e a s e s ) 也是胁迫代谢途径中 重要的酶类，比如，巯基蛋白酶( t h i o lp r o w a s e s ) 、泛醌蛋白酶等。蛋白酶 ( p r o t e a s e s ) 基因表达增强是逆境代谢的一个重要特征，用以降减液泡贮藏 多肽释放氨基酸供合成大量新蛋白，这对于植物受胁迫时需要大量合成一些 新的蛋白质而言尤其重要。代谢途径的转变还包括光合途径的转变，c 3 途 径是白天开放气孔进行c 0 2 的吸收和固定，夜晚关闭气孔，这样不利于在干 旱条件下保持水分；而景天酸代谢途径( c r a s s u l a c e a ma c i dm e t a b o l i s m ，c a m ) 是夜间开放气孔进行c 0 2 的吸收和固定，白天关闭气孔减少蒸腾失水。这方 面研究较多的是午时花( m e s e m b r y a n t h e m u mc r y s t a l l i n u m ) , 它在干旱和高温 胁迫时，c a m 途径的关键酶：磷酸烯醇式丙酮酸羧化酶( p e p ) 、磷酸丙酮 酸水合酶等能诱导表达，有利于水分损失下的碳固定。 以上提及的抗旱机制，分类并非很严格，植物还可能存在其它的抗旱机 制，况且一些功能蛋白也不只是在某一种机制中起作用。因为植物对水分胁 迫的反应错综复杂，各种机制闾也存在相互影响，相互制约，最终才体现为 植物整体的抗性。就调控蛋白