（水生生物学专业论文）云南高原湖省t4类浮游病毒遗传多样性研究.pdf

硕士学位论文 m a s t e r s t h e s i s 华中师范大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，独立进行研究工作 所取得的研究成果。除文中已经标明引用的内容外，本论文不包含任何其他个人或 集体已经发表或撰写过的研究成果。对本文的研究做出贡献的个人和集体，均已在 文中以明确方式标明。本声明的法律结果由本人承担。 作者签名：刻、矽来 日期：年罗月多r 日 学位论文版权使用授权书 学位论文作者完全了解华中师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：研 究生在校攻读学位期间论文工作的知识产权单位属华中师范大学。学校有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许学位论文被查阅和借阅； 学校可以公布学位论文的全部或部分内容，可以允许采用影印、缩印或其它复制手 段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后遵守此规定) 保密论文注释：本学位论文属于保密，在年解密后适用本授权书。 非保密论文注释：本学位论文不属于保密范围，适用本授权书。 作者签名：受j 、彤匙 日期：9 0 f f 年箩月f 日 导师签名：砀拟从起纠蓦 日期：加，年厂月引日 f 本人已经认真阅读“c a l i s 高校学位论文全文数据库发布章程 ，同意将本人的 学位论文提交“c a l i s 高校学位论文全文数据库 中全文发布，并可按“章程”中的 规定享受相关权益。回童途塞握交厦进卮；旦圭生；旦二生；旦三生筮查! 作者签名：皇j 、幻爪 日期：3 - o r fg - 岁月3 1 日 撕签名：许数饫酗霉 日期：9 o - 4 1g - r 月弓j 日 i 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 摘要 浮游病毒( v i r i o p l a n k t o n ) 是淡水水体中种类最丰富，丰度最高的生物类群。本研 究从云南省1 0 个湖泊采集了1 1 个水样，并对采样点进行了环境因子的检测，发现 水温、营养水平等因素并不直接影响浮游病毒的丰度，但是可能通过影响浮游藻类 和其他病毒宿主而间接影响浮游病毒的丰度。 本实验应用分子生物学方法；浓缩病毒、提取病毒核酸、扩增9 2 3 基因片段、 克隆测序等，对云南的高原湖泊浮游病毒的多样性进行了研究。，对1 1 个不同营养 水平的湖泊样品得到的序列进行系统进化分析、9 2 3 蛋白水平分析、不同营养水平 组内发散度分析。所有序列建立系统进化树，挑取每个样品中有代表性的类群与已 知的t 4 类病毒序列建立系统进化树进行系统进化分析，c 1 ( 茈碧湖) 与c 3 ( 洱海 才村) 处于同一个分支，这说明这两个丛的序列相似性比较高，在这两个湖泊中某 些t 4 浮游病毒的同源关系很接近。此外c 1 0 ( 杞麓湖) 与c 1 ( 茈碧湖) 和c 3 ( 洱 海才村) 在同一个分支上，这显示三个湖泊的t 4 型浮游病毒也表现出一定的同源性。 c 2 ( 碧塔海) 与肠杆菌噬菌体处于一个分支，这说明在高海拔地区也有与肠杆菌噬 菌体同源的噬菌体的分布，更进一步表明浮游病毒分布的广泛性。显示c 5 与c l l 的序列相似度很高并且与s y n l 9 同源性比较高。将这些湖泊分为贫营养、中富营养、 轻度富营养以及中度富营养四组，组内发散度分析发现，营养水平的差异和湖泊的 空间位置都将对浮游病毒多样性产生影响。 关键词：浮游病毒；遗传多样性；单克隆；9 2 3 基因 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s a b s t r a c t v i r i o p l a n k t o ni st h em o s tv a r i o u sa n da b u n d a n te n t i t i e si nf l e s hw a t e r t h ef o l l w i n g r e s e a r c hc o l l e c t s1 1 t e s t e dw a t e rs a m p l e sf r o mt e nl a k e si ny u n n a np r o v i n c e ，a n d m o n i t o r st h ee n v i r o n m e n t a lp a r a m e t e r so ft h e s a m p l i n gs i t e s ，f i n d i n g t h ew a t e r t e m p e r a t u r e ，t r o p h i cl e v e ld o n ti n f l u e n c et h ea b u n d a n c eo fv i r i o p l a n k t o nd i r e c t l y , b u t c a l li n f l u e n c et h ea b u n d a n c eo fv i r i o p l a n k t o nb yi n f l u e n c i n gp h y t o p l a n k t o na n dv i r u s h o s t s t h e f o l l o w i n ge x p e r i m e n t s a i mt od os o m er e s e a r c hi nt h e d i v e r s i t y o f v i r i o p l a n k t o no fp l a t e a ul a k e si ny u nn a np r o v i n c eb yt h em e t h o d so fm o l e c u l a r b i o l o g i c a lt e c h n i q u e p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o na n dm o n o c l o n e t h er e s e a r c ha n a l y s e s t h es e q u e n c ef r o m1 1l a k es a m p l e so fd i f f e r e n tt r o p h i cl e v e l s t h e1 1d i f f e r e n tn u t r i e n t l e v e l sl a k es a m p l e ss e q u e n c ew e r ea n a l y s i s e db yp h y l o g e n e t i ca n a l y s i s ，9 2 3p r o t e i n s e q u e n c ea n a l y s i sa n da l lo fg r o u pd i v e r g e n c e a l ls e q u e n c e st oe s t a b l i s hp h y l o g e n e t i c t r e e ，p i c kar e p r e s e n t a t i v ei ne a c hs a m p l eg r o u pw i t hk n o w nt 4 - l i k ev i r u ss e q u e n c e st o e s t a b l i s hp h y l o g e n e t i ct r e ef o rp h y l o g e n e t i ca n a l y s i s ，f o u n dt h a tc l a n dc 3i nt h es a m e b r a n c h ，i n d i c a t i n gt h a tt h e s et w ob u n d l e so fr e l a t i v e l yh i g hs e q u e n c es i m i l a r i t yi nt h et w o l a k e si ns o m eo ft h et 4v i r u sh o m o l o g yf l o a t i n gv e r yc l o s e i na d d i t i o nc 1 0a n dc 1a n d c 3i nt h es a m eb r a n c h ，i n d i c a t i n gt h a tt h et h r e el a k e s ，t 4t y p ep l a n k t o n i cv i r u ss h o w s o m eh o m o l o g y c 2a n de n t e r o b a c t e rp h a g ei nab r a n c h ，i n d i c a t i n gt h a ta th i 【g ha l t i t u d e s a r ea l s oh o m o l o g o u sw i t he n t e r o b a c t e r i ap h a g e c 5a n de l ls h o w e dh i 。g hs e q u e n c e s i m i l a r i t ya n dt h er e l a t i v e l yh i g hh o m o l o g yw i t hs y n l 9 t h er e s e a r c hd i v i d e st h el a k e s i n t of o u rg r o u p s - o l i g o t r o p h i cl a k e ，m e d i u mn u t r i e n tl a k e ，l i g h te u t r o p h i c a t i o nl a k ea n d m e d i u me u t r o p h i cl a k e a v e r a g ee v o l u t i o n a r yd i v e r g e n c eo v e rs e q u e n c ep a i r sw i t h i n g r o u p sa l a l y s i ss h o w d et h a tt h ed i f f e r e n c eo ft r o p h i cl e v e la n dt h es p a t i a lp o s i t i o no f l a k e sw i l li n f l u e n c et h ed i v e r s i t yo fv i r i o p l a n k t o n k e y w o r d s ：v i r i o p l a n k t o n ；t 4 ；g e n e t i cd i v e r s i t y ；m e t a g e n o m e ；9 2 3g e n e 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s mi ii i ii ii ii i i i 目录 摘要 a b s t r a c t 第一章文献综述 i 1 1 浮游病毒研究概况1 1 1 浮游病毒的种类和数量1 1 2 浮游病毒的生态学功能2 2 浮游病毒研究方法2 2 1 病毒丰度的测定2 2 2 病毒生产力的测定3 2 3 病毒对宿主多样性的影响的测定3 2 4 分子生物学技术3 3 浮游病毒遗传多样性研究进展”4 3 1 海洋病毒遗传多样性研究4 3 2 淡水湖泊浮游病毒遗传多样性研究5 3 3 其他水环境病毒遗传多样性研究5 4 本研究的目的和意义6 第二章云南高原湖泊环境指标测定及浮游微生物丰度测定7 1 调查湖泊概况7 2 材料方法：7 2 1 样品的采集7 2 2 浮游病毒，浮游细菌丰度的测定7 2 3 叶绿素a 浓度的测定8 2 4 总氮，总磷，高锰酸盐指数的测定8 3 数据分析8 4 结果与分析。8 5 讨论一1 5 第三章基于g 2 3 基因序列的t 4 类浮游病毒多样性1 8 1 材料与方法1 8 1 1 水样采集与处理1 8 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 1 2 实验方法1 8 2 实验结果与分析2 0 2 1 所得序列2 0 2 29 2 3 核酸序列系统发育分析2 1 2 29 2 3 蛋白水平分析湖泊t 4 类浮游病毒遗传多样性2 5 2 3 组内发散度分析3 6 3 讨论”3 6 参考文献 致谢 附录 3 8 4 5 4 6 硕士学位论丈 m a s t e r st h e s i s 第一章文献综述 病毒( v i r u s ) 广泛分布在生物圈的每一个角落，是地球上地理分布最为广泛的 生物种类之一，它们不仅能游离于各种环境之中，更能寄生于各种细胞的内部。全 球有7 0 的面积被海洋覆盖，所有物种均起源于原始海洋，迄今为止海洋所包含的 生物种类、数量以及生物信息量都十分庞大，无疑在整个生物圈中都占据有相当重 要的地位。当前的研究结果表明，在水生态环境中，病毒是种类和数量最多的有机 物成分【l l ，在水体生态系统中占据有十分重要的生态学作用【2 】，甚至对水体生态系 统中所生存的宿主类群的丰富性、水生态环境中微生物之间的循环、水体甚至整个 的生态系统的稳定都具有重要的意义【3 1 。浮游病毒( v i r i o p l a n k t o n ) 4 1 指的是能在 水体中自由移动，呈悬浮状态的颗粒状病毒，包括了噬菌体、噬蓝藻颗粒病毒，以 及真核藻类病毒在内的多种病毒。颗粒状病毒只能寄生在宿主体内生活，所有类型 的细胞大部分都能被颗粒状病毒感染，生物地化循环及各种生态过程如碳、氮等营 养元素的循环，细菌和藻类的物种多样性和地理分布，有害藻类水华的防治等也受 其影响。 1 浮游病毒研究概况 1 1 浮游病毒的种类和数量 人们对浮游病毒的研究最早开始于海洋环境【2 , 1 4 l ，浮游病毒具有各种不同的外 形，如长尾蝌蚪、短尾蝌蚪、纺锤形、柠檬形、球形等各种不同的形状f 5 , 6 , 7 , 8 , 9 】，4 0 多年前c a r l u c c i 从海洋环境中分离纯化出来第一株噬菌体【l o l ，人们对海洋病毒的研 究兴趣就与日俱增。越来越多的证据表明1 1 1 1 ，水体中的病毒数量至少是水中原核生 物的1 0 倍以上。 根据病毒的外形，主要是其尾部形态特征，以及颗粒状病毒的衣壳直径的大小， 将病毒大致上分成三大类【1 2 】：粘病毒( m y o v i r i d a e ) ，长尾病毒( s i p h o v i r i d a e ) 和短 尾病毒( p o d o v i r i d a e ) 。有研究表明，水体中绝大多数颗粒状病毒的衣壳直径在 3 0 n m 7 0 n m 之间，其中最普遍的是直径在3 0 n m 6 0 n m 的病毒种类，占所有病毒总 数的6 5 以上1 1 3 】。 水体中浮游病毒的浓度并非一成不变，w o m m a c k 等人曾报道浮游病毒的丰度 在1 0 4 v l p s m l 1 到1 0 9 v l p s m l 1 的范围内发生波动，浮游病毒丰度变化的原因 主要是受到水体中其他浮游生物的影响，如藻、细菌等宿主对浮游病毒的影响，同 时也与环境中的其他因素有一定关系1 2 , 1 5 】。 硕士学住论文 m a s t e r st h e s i s 1 2 浮游病毒的生态学功能 早期对浮游病毒的认识主要集中在水环境中的某些致病病毒上如肠道病毒，以 大肠杆菌为宿主的噬菌体等，还有一些以藻为宿主的噬藻体。对浮游病毒的生态功 能是近年来的热点，已经有很多研究表明，浮游病毒能特异性裂解宿主( 细菌和浮 游植物等) ，从而成为其宿主的特异性控制因子。国外已经证明了浮游病毒不仅在 海水和淡水中都大量存在。浮游病毒以细菌、藻类作为宿主，进而对海洋的初级和 次级生产力产生影响。f u h r m a n 研究表明浮游病毒在控制水体初级生产力方面起着 重要的作用，病毒能够杀死水体中1 0 5 0 的浮游细菌，地球2 6 的碳循环经海洋 病毒完成，充分说明了浮游病毒能调控海洋中有机碳的循环。v a ne t t e n 等报道从 4 0 余种真核藻类中分离到了寄生病毒或类病毒颗粒，而藻类承担着水生态系统中 重要的初级生产者角色，在调控水体生物种群结构过程中噬藻体必然起重要作用。 s u t t l e 等在“n a t u r e ”发表研究文章进一步指出海洋中的病毒可降低海洋近8 0 的初 级生产力。w o m m a c k 等研究认为浮游病毒是水体浮游食物链中的重要环节。水体 中有机物的分解和转化，碳和氮素的循环，都与细菌的作用分不开，病毒可以通过 对这些细菌的裂解作用来影响细菌和藻类的种群分布和生物多样性，从而改变了c 、 n 、p 、f e 等生命要素在海洋中的循环途径【1 6 一1 1 。病毒的致死作用可以藻类种群结 构【1 2 f1 3 1 5 】着对水体富营养化的控制和治理有着积极意义。t h i n g s t a d 等【3 2 】还发现浮 游病毒能够介导水生态系统中微生物之间的基因转换，对水环境乃至整个生态系统 都具有重要影响【3 3 j 此外，水体中的这些病毒的宿主通过抗原免疫应答和改变抗性等 来抵御这些病毒，通过病毒与宿主的相互作用可以促进生物种群的进化【卅。总之通 过这些研究奠定和提升了浮游病毒的生态学地位。 2 浮游病毒研究方法 2 1 病毒丰度的测定 2 1 1 间接计数法；空斑法和m p n 法 将适量的宿主菌和噬菌体混合后接种固体培养，在培养基表面可形成透亮的溶 菌空斑。一个空斑是由一个噬菌体浸染宿主细菌复制增殖并裂解细菌形成的称为噬 菌斑。将噬菌体按一定比例稀释，通过计数噬斑就可计算一定体积内噬菌体的数量。 另外还可以利用液体培养基作最大可能数h ( m p n ) 分析，其优点是实验操作简单易 行，灵敏度高，检出限可达每毫升1 个病毒。其缺点是劳动强度较大，精确度和准 确性也不如p f u 法。 2 1 2 直接计数法 2 1 2 1 透射电镜技术( t r a n s m i s s i o ne l e c t r o nm i c r o s c o p y ，t e m ) 2 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 最早计数水体病毒的方法是用电镜观察。通过0 孤m 滤膜的过滤不可避免的截 留下少量的病毒颗粒，观察到的结果比实际要偏小。电镜观察技术的优点是同时提 供病毒形态方面的证据包括蛋白外壳和尾部大小；缺点是装备要求高，如需要透射 电子显微镜和超速离心机，此外样品准备和分析也是相当耗时繁琐。 2 1 1 2 荧光显微镜技术( e p i f l u o r e s c e n c el i g h tm i c r o s c o p y ，e l m ) 荧光显微镜计数病毒相对来说是比较精确且比较简单易行的一种方法。优点是 对低浓度的浮游病毒样品得出精确的计数结果。缺点是小的浮游细菌和大的病毒颗 粒不易区分，造成病毒计数的偏差。 2 1 2 3 流式细胞仪技术( f l o wc y t o m e t r y ，f c m ) 流式细胞术最初用于区分与计数植物种群，后来用于异养细菌群落研究，最近 几年才被用于水体病毒研究1 9 3 1 。优点是能快速分析大量细胞，对得到数据易于进行 多元分析，检测下限与灵敏度都得到提高。 2 2 病毒生产力的测定 放射性标记技术最初用于测定细菌的二次生产力阳，s t e w a r d 开始了评价病毒 生产力的方法，基于【3 h i - f i 3 2 p 】被病毒核酸吸收【9 5 1 。荧光标记病毒( f l u o r e s c e n t l y l a b e l e dv i r u s e s ，f l v ) 技术与放射性标记的原理一样，能同时测定病毒降解率、生 产率和转化率。 2 3 病毒对宿主多样性的影响的测定 病毒对水生态系统最重要的影响是对群落构成的影响。原因如下；( 1 ) 病毒对宿 主具有特异性，通常认为是种类特异性【3 8 】：( 2 ) 侵染是一个依靠丰度的过程。在宿主 密度高的情况下，高接触率导致高侵染率。基于上面两个原因有人提出“杀死优胜 者一( k i l l i n g t h e w i n n e r ) 的假设。在存在和缺乏病毒两种情况下，测定细菌群落的 改变就是测定病毒对宿主多样性影响的试验。 2 4 分子生物学技术 浮游的颗粒状病毒十分微小，仅靠生理生态水平的研究结果，难以为其系统发 育提供可靠的信息，而对于某些有保守基因的病毒种类，基因组中的保守基因序列 可直接提供可靠且有意义的系统发生信剧6 5 舯】。对病毒进行培养是检测水体病毒的 方法之一，但检测周期较长，且目前有相对大一部分的病毒难以进行分离和纯培养， 很多病毒的宿主范围也尚未确定，某些宿主也尚未建立可供研究的细胞系，因此， 难以用传统的培养方法来检测环境中多种类型的病毒。而分子生物学技术主要是以 p c r 为核心，直接对其遗传物质中的目的片段( 一般为保守片段) 进行检i 9 1 1 1 6 7 , 6 8 , 6 9 】， 是研究水体中超微型浮游病毒多样性的重要方法。 3 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 应用分子生物学技术来检测水生态环境中的病毒，需要建立在对水样的浓缩和 病毒核酸的纯化和提取基础之上，使用特定的技术方法对浮游病毒的遗传物质进行 检测，从而对水中的病毒进行定性、鉴定甚至定量等研究。基于分子生物学的技术 方法主要包括有两大类，即核酸杂交法和p c r 法，目前对病毒基因进行分析，主要 是基于p c r 反应，常用的具体方法有两种：p c r 克隆病毒核酸序列，使用特异的 限制性内切酶对病毒核酸进行酶切后，再通过凝胶电泳、核酸杂交等下游技术，分 析酶切片段的多态性；或者直接对p c r 反应得到的产物进行测序，与g e n e b a n k 中 已公布的序列进行相似性比对，分析该序列片段的基因型和多态性，这种方法通常 先用适当的方法来浓缩水样中的浮游病毒，然后使用特异引物对特异性d n a 序列 进行p c r 扩增，最后使用d n a 杂交、d g g e 、c e 等高灵敏度的检测方法对p c r 产物进行检测i 引。 3 浮游病毒遗传多样性研究进展 3 1 海洋病毒遗传多样性研究 t 4 类噬菌体的9 2 3 基因是最广泛应用于鉴定t 4 类噬菌体多样性的基因。国内 外对海洋环境中的浮游病毒的研究开始最早，对其种类的了解也最多。有尾噬菌体 作为海洋环境中丰度最大的生物群体，却很少为人们所认识，因为其赖于生存的宿 主都很少被培养出来。为了对浮游病毒了解更多，f i l e e ，j 等人针对t 4 病毒的9 2 3 基因设计了一系列p c r 引物【7 1 1 ，该基因能编码所有t 4 类噬菌体( 最重要的有尾病 毒) 的主要头部蛋白。用该引物扩增不同海洋环境的9 2 3 相关序列( 英国哥伦比亚 海湾，墨西哥湾东部，北冰洋西部等水体) ，显示出明显的分子水平的多态性，而 此前对病毒的了解只限于颗粒状病毒的形态多样性。系统发育研究发现，尽管这些 序列与之前已经研究十分透彻的t - e v e n 病毒类群密切相关，它们仍然构成5 个新的 类群。这些数据表明t 4 类病毒的宿主范围远远超出此前的想象，并且t 4 病毒在生 物圈中相当广布和多样。 随后，越来越多的研究表明海洋病毒包括浮游病毒以及沉积物中的病毒种 类多样性都十分可观，越来越多的新类群被发现出来。 4 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 表1 - 1 浮游病毒特异目标基因及扩增引物 t a b l e 1 - 1 p l a n k t o n i cv i r u s - s p e c i f i ct a r g e tg e n e sa n dp r i m e r s 3 2 淡水湖泊浮游病毒遗传多样性研究 s t e v e nw w i l h e l m 等人2 0 0 6 年检测了病毒在加拿大伊利湖中的分布及多样性。 部分淡水噬蓝藻颗粒病毒能侵染海洋蓝细菌聚球藻属( s y n e c h o c o c c u s ) w h 7 8 0 3 株， 从伊利湖西部、中部和东部都能分离出裂解此株蓝细菌的病毒：对编码头部组装蛋 白9 2 0 ( 噬蓝藻颗粒病毒的的保守基因，可作为系统发育分析的标志) 的基因分析 表明，这些病毒与自然群落，以及民用船只沙囊里的病毒一样，与海洋噬蓝藻颗粒 病毒具有相关性，并形成一个单独的进化支刚。 在法国最大的自然湖泊b o u r g e t 湖表层水进行噬蓝藻颗粒病毒群落基因多样性 及进化情况调查中1 7 6 1 ，9 2 0 基因克隆文库中随机筛选的4 7 个核酸序列的分析结果表 明，有3 5 种不同的蓝藻肌尾病毒基因类型，这些序列属于7 个不同起源的操作分 类单元( o t u ) ，其中的3 个o t u 的距离与已经报道的海洋类群的距离相当。同时也 发现，噬蓝藻颗粒病毒群落组成有明显的季节性变化，可以反映其生物，化学，和 物理环境的变化。 3 3 其他水环境病毒遗传多样性研究 2 0 0 8 年，t a k e s h if u j i i a 等人从肥沃的稻田提取d n a 并使用9 2 3 特异引物进行 p c r 扩增，用d g g e 电泳，从d n a 水平得到3 9 个不同的克隆子【8 4 1 。发现这些克 隆子的氨基序列与n c b i 数据库里的克隆子有2 7 9 9 的相似性，与淡水环境得到的 序列有明显差异，其中大多数序列形成6 个新的类群，并指出，稻田里的t 4 类噬 菌体群落与海洋环境的噬菌体在系统进化关系上相距甚远。 g u a n g h u aw a n g 等人2 0 0 9 年对t 4 类噬菌体的衣壳蛋白基因9 2 3 进行研究，醇3 基因扩增产物用变性梯度凝胶电泳进行分离，结果分离到5 6 个条带，其中只有9 5 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 个条带属于t 偶噬菌体( t - e v e n s ) 、p s e u d o t - e v e n s 和e x o t - e v e n s ，其他条带大多编 类p a d d yg r o u p i v i ，发现病毒群落在日本范围内没有差异性分布，并且稻田的9 2 3 基因不同于海洋环境，其分布更分散。其中的两个9 2 3 克隆子的氨基序列较短，表 明稻田土壤中有新病毒种类的存在晔】。 需要注意的是，国内本实验室的研究【9 1 , 9 2 】主要侧重于淡水噬蓝藻颗粒病毒( 蓝 藻病毒) 的遗传多样性分析，而目前对淡水浮游病毒及高原浮游病毒遗传多样性缺 乏更为全面的研究。 4 本研究的目的和意义 水生态系统中浮游病毒种类丰富，数量巨大，所以对水体中浮游病毒多样性的 研究毫无疑问具有巨大的潜在空间。上世纪末，国际上才开始了对水体浮游病毒的 研究，在我国对浮游病毒的研究才刚刚开始，对高原淡水湖泊的浮游病毒遗传多样 性研究几乎仍处于空白。调查高原淡水湖泊中浮游病毒的多样性，以及分析浮游病 毒与水体环境因子之间的关系有利于明确浮游病毒在水体生态系统中的生态位和 作用。对不同营养水平的高原湖泊进行遗传多样性分析，可以对浮游病毒种群动态 进行研究，有利于了解浮游病毒的群落结构及其与环境因素的相互关系。 6 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 第二章云南高原湖泊环境指标测定及浮游微生物丰度测定 云贵高原为我国淡水湖泊分布较多的地区之一，其中面积1 0 k m 2 以上的湖泊 6 0 个，合计面积1 1 9 9 4 k m 2 ，约占全国湖泊总面积的1 3 ，大于1 0 o k m 2 的湖泊1 3 个，合计面积1 0 8 8 2 k m 2 ，占本区湖泊面积的9 0 8 ，主要包括云南省的滇池、洱 海、抚仙湖、程海、泸沽湖、杞麓湖、星云湖、异龙湖、阳宗海等1 1 个湖泊。 1 调查湖泊概况 本次调查选取云南省境内的滇池，阳宗海，抚仙湖，杞麓湖，茈碧湖，洱海， 星云湖，纳帕海，一共1 0 个湖泊进行调查，湖泊具体位置如图1 所示。 f i g 2 - 1d i s t r i b u t i o no fs a m p l i n gl a k e s 2 材料方法 2 1 样品的采集 在2 0 1 0 年1 0 月到1 1 月期间，采集云南省境内的1 0 个高原湖泊的水样，其中 洱海设置了两个采样点，一共采集了1 1 个湖泊水样。用有机玻璃采样器采集水平 面以下3 0 厘米处的水样于洁净的棕色玻璃瓶中，同时使用水银温度计测量水温， 用h a n n ah 1 9 8 1 0 3p h 计测定p h 值、用直径2 0 c m 的黑白盘测定透明度。 2 2 浮游病毒，浮游细菌丰度的测定 在5i l l l 的水样中加入粗制d n a 酶和r n a 酶至终浓度为1ug m l ，室温消化3 0 分钟，然后取水样适当稀释，取l m l ，在稀释液中加入终浓度为0 2 5 的s y b rg r e e n 7 硕士学位论丈 m a s t e r st h e s i s i 染料，遮光染色1 5 m i n 。然后再用0 0 2 p m 的a n o p o r e 氧化铝滤膜( a n o d i s c2 5 ， 2 5 m 的直径，w h a t m a n 生产) 过滤，接着在同一滤膜上过滤5 m l 的新制抗褪色剂， 使抗褪色剂覆盖到整个滤膜。抗褪色剂配方为5 0 甘油，5 0 p b s ( 1 2 0 m gn a c l ，1 0 m g n a h 2 p 0 4 ，p h = 7 5 ) ，0 1 对苯二胺。将经过上述处理的滤膜放在荧光显微镜( l e i c a d m r ) 下计数，重复5 次后取平均值。最后换算实际数值时乘以稀释倍数。 2 3 叶绿素a 浓度的测定 叶绿素a 浓度的测定依据l ：水与废水监测第四版中的丙酮法进行测定。 2 4 总氮，总磷，高锰酸盐指数的测定 总氮，总磷，高锰酸盐指数的测定依据水与废水监测第四版中的方法进行 检测，使用过硫酸钾氧化一紫外分光光度法检测总氮含量，使用铝锑抗分光光度法 检测总磷含量，使用高锰酸盐指数法检测c o d 的含量。 3 数据分析 用g r a p h p a dp r i s m 软件作图。用软件s p s s i1 5 对数据进行相关性分析 4 结果与分析 在浮游病毒，细菌丰度的检测过程中，由于加入了粗制的d n a 酶，粗制的r n a 酶进行消化，所以水体中游离的d n a 和r n a 片段都已分解，消化后的水样经o 0 2 微米的氧化铝滤膜过滤，水体中的浮游病毒和细菌被截留在氧化铝滤膜上。如图所 示为荧光显微照片，照片中黄绿色光斑较大的是细菌，光斑较小的是病毒颗粒。 图2 - 2 浮游病毒，浮游细菌的荧光显微照片 f i g 2 - 2f l u o r e s c e n c em i c r o g r a p h so f p l a a k t o n i cv i n l 9 e sa n dp l a n k t o n i cb a c t c d a s 8 硕士学位论丈 m a s t e r s t h e s i s e 牛 、， 巡 警 漂 整 疑 湖泊采集水样点的浮游病毒( 图2 3 ) 丰度如图所示。 矿矿夕矿、矿， 毋 图2 31 1 个湖泊采样点的浮游病毒丰度 f i g 2 3t h ea b u n d a n c eo fp l a n k t o n i cv i r u s e sa t1 1l a k es a m p l i n gs i t e s 图2 3 显示各采样点的浮游病毒丰度，滇池的浮游病毒数量最高，碧塔海的浮 游病毒数量最低。 一 型 遥 赛 箍 艇 枣梦梦萝矿爹 誉 图2 41 1 个湖泊采样点的浮游细菌丰度 矿 o n i cb a c t e r i a sa t1 1l a k es a m p l i n gs i t e s 9 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 湖泊采集水样点的总氮，总磷，叶绿素a ，高锰酸盐指数，温度，p h 值，透明 度的测量结果如图2 5 至2 1 1 所示。 d 西 e v 器 蹈 矿矿夕矿。矿。， 毋 图2 41 1 个湖泊采样点的总氮含量 f i g 2 4t o t a ln c o n c e n t r a t i o na t1 1l a k es a m p l i n gs i t e s 图2 4 显示采样点的总氮含量，滇池，杞麓湖，星云湖的总氮含量比较高，其 余的湖泊的总氮含量相差不大。 o 2 0 o 1 5 西 eo 1 0 燧 龆 挚秽梦矿爹矿 图2 51 1 个湖泊采样点的总磷含量 f i g 2 5t o t a lpc o n c e n t r a t i o na t1 1l a k es a m p l i n gs i t e s 1 0 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 5 0 毫 1 。3 0 曩 壤 瑟 吉2 0 1 0 o 1 1 d 詈 、一， 黎 鼙 翻 口 逛 帮 窿 枣矿妒字矿擎矿 萨挚 图2 - 61 1 个湖泊采样点的叶绿素a 含量 f i g 2 6c h l o r o p h y l la a t1 1l a k es a m p l i n gs i t e s 零矿苓矿霉爹 挚 图2 71 1 个湖泊采样点的高锰酸盐指数 f i g 2 7p e r m a n g a n a t ei n d e xa t1 1l a k es a m p l i n gs i t e s p 囊 餮 革 z e l 硕士学位论文 m a s t e r st h e s i s 莽矿 梦扩梦矿扩 毋 图2 81 1 个湖泊采样点的水温 f i g 2 8t e m p e r a t u r ea t1 1l a k es a m p l i n gs i t e s 辇矿矿梦矿爹 挚 图2 - 91 1 个湖泊采样点的p h 值 f i g 2 9p hv a l u ea t1 1l a k es a m p l i n gs i t e s 5 o 6 o 5 o 5 o - i o 5 o 5 o 5 o 7 7 6 6 5 5 4 4 3 3 2 2 ，o o 硕士擘位论丈 m a s t e r st h e s i s 5 5 4 4 。 3 s3 型2 皇 篷2 o o 辇矿萝矿爹矿 挚 图2 1 01 1 个湖泊采样点的透明度 f i g 2 - 1 0t r a n s p a r e n c ea t1 1l a k es a m p l i n gs i t e s 在所采集的湖泊中，滇池，杞麓湖，星云湖的总氮，叶绿素和高锰酸盐指数含 量都是比较高的，其他湖泊的总氮含量相差不多。星云湖的总磷含量是所采样湖泊 中最高的，其次是滇池。纳帕海的c o d m 。也是比较高的，这与纳帕海出的地理位 置有关，在其周围坐落这几个藏族的村落，周围的人畜都以纳帕海为水源。碧塔湖 和纳帕海的水温是最低的，这与两个湖泊位于高海拔地区有关。 采用综合营养状态指数法，引自金相灿等著的中国湖泊环境，根据各个湖 泊采样点的总氮，总磷，叶绿素a ，透明度4 个指数来测定各个湖泊采样点的营养 状态指数t l i ( ) 。 t l i ( c h l a ) = 1 0 ( 2 5 + 1 0 8 6 1 n c h l a ) t l i ( t p ) = 1 0 ( 9 4 3 6 + 1 6 2 4 1 n t p ) t l i ( t n ) = 1 0 ( 5 4 5 3 + 1 6 9 4 1 n t n ) t l i ( c o d m n ) = i o ( o 1 0 9 + 2 6 6 1 1 n c o d m n ) 式中：c h l a 单位为m g m 3 ；其它项目单位均为m g l 。 各个湖泊采样点的营养水平如表2 - 1 所示。 1 3 表2 11 1 个湖泊采样点的营养水平 t a b l e 2 1n u t r i t i o n a ll e v e lo f1 1l a k es a m p l i n gs i t e s 营养状况贫营养 中营养轻度富营养中度富营养 鬻 ( t l i = 2 7 8 ) ( t l i = 4 5 6 4 ) ( t l i = 5 7 6 ) ( t l i = 6 7 3 2 ) 碧塔湖茈碧湖杞麓湖 ( t l i = 2 6 3 ) ( t l i = 4 0 1 ) ( t l i = 6 3 4 ) 洱海( 才村) 采样点 ( t u = 3 8 6 ) 纳帕海 ( t u = 4 0 1 ) 洱海( 桃源) ( 田l i = 3 8 4 ) 海西海 一 ! 旦三三2 ：三! 一一一一 - _ _ - - - _ _ _ _ - _ _ _ _ - _ - _ _ _ _ _ _ - _ - - - _ - _ _ _ _ _ _ _ 一。一 采样点水环境因子与浮游病毒丰度相关性分析如下表2 - 2 所示。 表2 2 采样点水环境因子与浮游病毒丰度的相关分析 t a b l e 2 2c o r r e l a t i o nb e t w e e ne n v i r o n m e n t a lf a c t o r so fs a m p l i n ga n da b u n d a n c eo f p l a n k t o n i cv i r u s 浮游病毒丰度 1组：所有采样点组2 ；贫中营养水平采样点 组3 ；冒霄乔米样点 s p e a r m a n pn s p e a r m a n pn s p e a r m a n 上，州 相关系数 相关系数 相关系数 0 8 0 60 0 3 1 105 3 91 6 8 8 10 0 0 浮游细 1 o 0 。 j 蓖( b ) 总氮 c r n ) 总磷 f r r ) 叶绿素 a ( 叫 c o d m , 透明度 ( s d ) 温度m p h 值 海拔 ( a ) 0 7 0 9 b 0 6 9 9 b 0 7 1 8 b 0 5 9 7 o 8 2 7 1 0 3 3 6 0 4 9 5 - 0 6 8 5 b 0 3 1 00 4 5 68 0 5 0 00 6 6 7 3 0 3 5 90 3 8 2 o 4 5 2 o 2 6 0 0 1 8 0 o 6 6 7 0 6 7 0 0 0 7 1 o 1 9 00 6 5 1 o 8 3 0 h 0 0 1 1 0 7 5 5 b0 0 3 1 0 5 0 00 6 6 7 o 5 0 0o 6 6 7 1 0 0 0 i 0 5 0 00 6 6 7 _ o 5 0 0o 6 6 7 1 0 0 0 | o 0 0 0 1 0 0 0 i 。 一_ _ - - _ _ _ _ _ l - l _ _ _ _ _ _ - _ _ _ _ _ _ - l _ _ l _ - _ - i _ _ _ _ _ _ _ _ - - _ - 一 a ；c o r r e l a t i o ni ss i g n i f i c a n ta tt h eo 0 1l e v e l ( 2 - t a i l e d ) b ；c o r r e l a t i o ni ss i g n i