（植物学专业论文）猪伪狂犬病毒（prv）糖蛋白gd基因的植物转化与表达研究.pdf

摘要 本文以模式植物烟草为对象，研究了猪伪狂犬病病毒( p s e u d o r a b i e sv i m s ，p r v ) 糖 蛋白g d 基因在转基因植物中的表达。并在此基础上，以p r v 糖蛋白g d 基因和玉米胚乳 特异表达启动子( g i o b i l i i n i ) 构建的重组质粒p g l b - g d 为载体，应用农杆菌介导法转化 超甜玉米幼胚，成功获得了转基因植株；同时研究了根癌农杆菌浓度、共培养时间与温度 对玉米转化率的影响。主要研究结果如下： 1 利用叶圆片法，通过根癌农杆菌介导将p r v 糖蛋白g d 基因导入烟草叶肉细胞，经 愈伤组织诱导、筛选、继代及再生，成功获得了再生植株。通过p c r 分子标记、p c r s o u 【也e m 分子杂交确认g d 基因已整合进烟草再生植株细胞的基因组中，经w b s t 啪一b l o t t i n g 杂交证 明外源的p r v 糖蛋白g d 基因能在转基因烟草中正确表达。 2 在2 6 2 8 条件下，分别以0 3 、o 6 、1 o 的菌液浓度( o d 6 值) 浸染玉米幼胚5 i n i n ， 然后在2 2 下进行共培养、恢复性培养和抗性愈伤组织筛选等过程，发现原菌液浓度在 0 d 6 0 0 值为o 5 ，感染浓度在o 3 时，转化效率最高，抗性愈伤组织的形成率为2 3 7 。 3 在原菌液浓度和感染浓度分别为o d 6 0 0 值0 5 和0 1 3 时。以2 2 、2 5 和2 8 3 个 温度分别进行1 d 、2 d 和3 d 时间的共培养，分别统计幼胚抗性愈伤组织的形成率，结果显 示，在2 2 共培养3 d 的条件下转化效率最高，抗性愈伤组织的幼胚的形成率为2 4 6 。 4 由根癌农杆菌转化玉米幼胚获得的转基因玉米植株，经分子鉴定、点杂交、s o u t h e m 印迹杂交，确认p r v 糖蛋白g d 基因成功整合进玉米植株细胞的基因组中。 关键词：烟草；超甜玉米；农杆菌；p c r 检测：p c r _ s o u t l l 锄杂交；w b s t e m 杂交： 点杂交；s o u l l l e m 印迹杂交 a b s t r a c t t a k j n gt o b a c c oa sm et y p ep l a n t ，t h ep r e s e n tt h e s i ss t u d i e s 血ee x p r e s s i o no fp s e u d o r a b i e s v i r u s ( p r v ) g l y c 叩r o t e i ng dg e n ei nt r a i l s g e i l i cp l a n t sa n ds e t su pas e to fm e t h o d sf o rp l a l l t t r 孤s f o n n i n 岛t r a n s g e n i cp l a ms c r e e m n 】e a fp r o t e 砸e x t r a c t i n ga n do t h e r s ；a l lt h e s em e t h o d s h “el a i dt h eg r o u n d w o r kf o rt r a n s g e n i cm a i z e 0 ns u c hab a s i sw et r a n s f o r mh y p e r - s w e e tm a i z e i m m a t u r ee m b r y ow i t ht h ep g l b g dp l a s m i dw h i c hw a s 叭1 tb yp g l bp l a 锄i d ，g l o b u l p r o m o t e ra n dp r v 出y c o p r o t e i ng dg e n et h o u g hm em e d i a t i o no fa g r o b a c t e r i u mt u m e f a c i e n s 卸ds u c c e s s 删l yo b t a i nt h em m s g e n j cp 】a 工l t s ，t h ei n 丑u e n c eo fa g r o b a c t “u mn u n e f a c i e n s d e n s i t y ，t 1 1 e1 e n g 血o fc o c u l “v a t i o np e f i o da 1 1 dt e m p e m t u r eo nm m s f o n n a t i o nr a t eh a sb e e n s t u d i e di i lt h ee x p e r i m e m t h ef i n d i n g so f t h ee x p e r i m e m a ls t u d ya r ea sf o l l o w s ： 1 b ym e a n so f1 e a f - d i s c 廿卸s f o m a t i o nm e 也o d ，t o b a c c oi st r a n s f o r m e db ya g r o b a c t e r i u m t 啪e f - a c i e n s ，s u c c e s s 如i l yi n d u c i n gc a 工i u s ；t h ec a i l u st h r o u 曲s e c o n d a r yc u i t i v a t i o n 静o w si n t oa n i n d e p e n d e n tp l a n lp c rd 或e c t i o n ，p c r s o l l t h e r nh y 城d i z a t i o na n dw e s t e m 坶蹦d i z a l i o na l l p r o v e 恤tp i 西y c o p r o t e i ng dg e n eh a sb e e ni n t e g r a t e di n t ot h et o b a c c og e n o m ea n de x p r e s s e d i n 也er i 曲tw a y ；t h j ss h o w st h a tp r vg l y c o p r o t e i ng dg e n ec a nb er i g h t l ye x p r e s s e di i lp l a i l t s 2 w h e nt h et e m p e r a t t l r es t a y sb e t w e e n2 6 t o2 8 a 1 1 dt h eo d 6 0 0v a l u eo f t h eb a c t 丽u m s o l u t i o na r er e s p e c t j v e l yo ，3 ，o 6a 1 1 d1 o ，t h em a i z ei m m a t u r ee m b r y oa f t e r5m i n u t e si n f e c t i o n u i l d e r g o e sc o c u l t i v a t i o n ，r e s t o r a t i v ec u l t i v a t i o na r l dr e s i s t a l l tc a l i u ss c r e e n j n ga t2 2 ni sf o u n d t 1 1 a t 廿1 em m s f o r n l a t i o nr a t ei st h eh i g h e s ta n df o m u l a t i o nr a t eo fr e s i s t a n tc a l l u sr e a c h e s2 3 7 、v h e nt h eo d 6 0 0v a l u eo f m eo r i g i n a lb a c t e r i 啪s o l u t i o ni so 5a n di n f e c t i o nd e n s i t yi s0 3 3 t h e0 d 6 0 0v a l u ef o ro r i g i n a lb a c t e r i u ms o l u t i o nd e n s i t ya n di n f e c t i o nd e n s i t yb e i n go 5 a n d0 3 ，t h er e s i s t a n tc a i l u sf o n n u l a t i o nr a t co fi m m a t u r ee m b r y oi s b e 洫gs t u d i 。da t t 1 1 e t e m p e r a t l l r eo f2 2 ，2 5 a n d2 8 f o ro n e ，t w oa n dt h r e ed a y se a c h ht 啪so u tt l l a tt h e t m s f o n n a t i o ne m c i e n c yr a t eg o e sh i g h e s ta t2 2 f o rt h r e ed a y s 、v i t l la2 4 6 f 0 咖u l a t i o nr a t e o f r e s i s t a n tc a l l u s 4 t r a n s g e n i cm a i z ep l a n t sa r eo b t a i n e dw i 也m a i z ei m m a t u r ee m b r y ot h r o u g ht 1 1 em e d i a t b n o fa g m b a c t e r i u mt u i l l e f 如i e n s a ni n v e s t i g a t i o no ft h et r a n s g e n i cm a i z e l o l c c u l e st h r o u g hd o t h y 晡d i z a t i o na 1 1 ds o u 也e mb l o th y 确d i 列i o ng u a r a l l t e e su s 血ef a c tt h a tp r vg l y c o p r o t e i ng d g e n eh a sb e e ns u c c e s s m l l yi n c o r p o r a t e di n t ot l l em a i z eg e n o m e t t k e y w o r d s ：t b b a c c o ；h y p e r - s w e c tm a i z c ；a g r o b a 咖r i 啪t 嘲e f a c i 吼s ； p c rd e t e c t i o n ； p c r - s o u m e mh y b r i d i z a t i o n ；w e 咖nh y b r i d i 枷o n ；d o th y 晰d i 蒯o n ；s o u m e mb l o t h y b r i d i z a t i o n i i i a m p b p c t a b d n t p d d t t e b e d t a h h r p i p t g k b k d k m l b m m l n p a g e p b s p c r p e g p m s f p r v p v p r n a s e r ，m l n 缩略语 a m p l i c i l l i n b a s e p a i r h e x a d e c y l t r i m e t h y l m n n l o l l i 唧b 1 _ o m i d d e o x y i l u c l e 勰i d e 埘p h o s p h a c e d a y d i m i o t l l r i t 0 1 廿l i d i u mb r o m i d c e t l l y l e n e d i a l l l i n e a c e t i ca c i d h o l l r h o r s e r a d i s hp e r o x i d 骶e i s o p r o p y i t l l i o p d - g a l a c t o s i d e k i l o b a s e l i l o d a l t o n k a n a m y c i n h m ab r o m m o l e p c r l i 姗 m i n u t e p o i y a c r y i 锄i d eg e le l 咖p ：h o r e s i s p h o s p h a t e - b 1 】蝈ds a l i n e p o l 肿e r a s ec h a i nr e 删蚰 p o l y e t l l y l e n eg l y c o l p h e n y l m e t h y l s u f b n y ln u o r i d e p s e u d o r d b i e sb i m s p o l y v i n y l p ”o l i d o n e r i b o n u l e a s e r e v o l u t i o n sp e rm i n u t e r v 氨苄青霉素 碱基对 溴化十六烷基三甲基胺 脱氧三磷酸核苷 天 二硫苏糖醇 溴化乙啶 乙二胺四乙 小时 辣根过氧化物酶 异丙基硫代b d 半乳糖苷 千碱基 千道尔顿 卡那霉素 l 嘣a 肉汤培养基 摩尔每升 分钟 聚丙烯酰胺凝胶电泳 磷酸盐缓冲液 聚合酶链反应 聚乙二醇 苯甲基磺酰氟 伪狂犬病病毒 聚乙稀吡咯烷酮 核糖核酸酶 每分钟转数 s d s s p t b s t e 1 _ r i s u t a e b s a d a b a b a n c s o d i u md o d e c y ls u l f j t e s p e c t l n o m y c m t r i s _ b u f f 色r e ds a l i n e 1 h s e d t ab u 航r t r i s ( h y d r o x y m e t l l y i ) 一盯n i n o m e t h a l l e u n i t e t “s c l ，a c e t a t e ，e d t ab u f r e r b o v i n es e r u ma i b u m i n d i a m i n o b e i l z i d i n e a b s c i s i ca c i d m 仃o c e l l u l o s e v 十二烷基磺酸钠 壮观霉素 t r i s 缓冲盐溶液 t r i s e d l a 缓冲液 三羟甲基氨基甲烷 酶活力单位 t r i s 乙酸缓冲液 牛血清白蛋白 二氨基联苯胺 脱落酸 硝酸纤维素 前言 1 前言 长期以来，研究者一直致力于利用分子生物学技术改良植物( 特别是农作物) 的性状， 以满足人们的多种需要，如希望创造出优质高产、抗病虫、抗除草剂、抗旱、耐盐碱等优 良性状的农作物，或者利用植物作为生物反应器生产药用餐白等【”。近年来，随着植物转 基因技术的不断发展，其目标在逐步地实现。 植物转基因技术是指通过体外重组d n a 技术将外源基因转入到植物的细胞或组织 中，从而使再生植株获得新的遗传特性。转基因技术可将任何来源的基因转入植物，这不 仅扩大了重要农艺性状相关基因的来源，而且可以打破种问基【型交流的界限；这对于分子 遗传学研究和植物改良都具有特别重要的意义 1 】a 迄今，通过植物转基因技术，人们不仅 培育出了许多具有优良性状的植物新品种，而且还利用植物生物反应器生产出多种药用蛋 白。 1 1 植物的遗传转化方法及特点 植物基因工程研究的关键是通过特定的方法将外源基因导入受体植物细胞内，使之发 生定向、永久性的遗传变异，即所谓的檀物遗传转化( g e n e t i c s f o l l l l a t i o n ) 吵为了方 便有效地将外源基因导入植物体内，人们不断地探索、发展新的植物遗传转化方法。目前 发展较为成熟的有d n a 直接转化法和介导法等方法。d n a 直接转化技术包括化学方法和 物理方法，如基因枪法、电击法、p e g 法、花粉管通道法、微注射法、激光法等，介导法 主要有农杆菌介导法、病毒介导法等；其中农杆菌介导法和基因枪法是较为有效的两种方 法吼 1 1 1d n a 直接转化法 1 1 1 1 基因枪转化法 基因枪转化法( p a n i c l eg u n ) 又称微弹轰击法( m i c m - p r o j e c t i l eb o m b a r d m e n t ；p a r t i c l e b o m b a r d m e n t ；b i 0 1 i s n c s ) ，是一种d n a 直接转化技术。其原理是将外源d n a 包被在微小 的金粒或钨粒表面，在高压作用下将微粒高速射入受体细胞或组织，从而实现基因转化。 该技术是1 9 8 7 年由美国康杂尔大学的s a n f b r d 等人发明的一种基因直接导入法。k i e i n 等 在1 9 8 7 年首次以此方法把外源d n a 导入洋葱表皮细胞，且观察到外源基因能表达，证明 在1 9 8 7 年首次以此方法把外源d n a 导入洋葱表皮细胞，且观察到外源基因能表达，证明 刖鬲 此方法是可行的【2j 。1 9 8 8 年，m c c a b e 等用外源d n a 包被的钨粒对大豆茎尖分生组织进行 轰击，结果约有2 的组织通过器官发生途径获得再生植株，并且在、r 1 代植株中检测 到了外源基因的表达1 9 9 0 年g o r d o n k a m m 等用基因枪法将g u s 报道基因和p a t 选择性 基因导入玉米悬浮细胞系，且再生的转基因玉米植株熊够结实，首次获得转基因玉米鸭 另外，h a d i 等用1 2 个质粒、s i n u n o n d s 等用两个质粒分别轰击大豆未成熟子叶，经抗性筛 选和s o u t h e m 杂交检测确认获得阳性克隆和再生植株酗】。 由于基因枪法导入外源基因的技术本质上是一种物理过程，因此它具有以下多种优 点；( 1 ) 不用原生质体再生培养；( 2 ) 受体材料来源广泛，不受基因型限制；( 3 ) 缩短了 获得转基因植株的周期；( 4 ) 获得的转基因植株变异率低，通常具有正常的育性等【”。特 别是在单子叶禾本科植物中得到了较为广泛的应用。但是基因枪法也有自身的缺点，如转 化效率不高，大多在o 1 1 o 的范围内，难以选择；外源基因序列常是多拷贝插入，因 而容易导致基因沉默；转入的基因有时是呈非盂德尔遗传：费用较高等1 8 】。 1 1 1 2 聚乙二醇法 聚乙二醇法( p o l y e t h y l e n eg l y c 0 1 ，p e g ) 是一种通过化学物质p e g 处理去细胞壁的原 生质体，改变细胞膜的通透性而使原生质体获得转化的方法。鼬e n s 等首次通过此法转化 烟草获得成功【9 】。此后在双子叶和单子叶植物如烟草、矮牵牛、水稻、玉米等作物上都获 得了成功f f 。由于p e g 法具有实验成本低廉、结果也较稳定、重复性好、无需特殊的仪 器设备等特点，因而在发明起初也成为应用较为广泛的方法。但是此法具有明显的缺点： 原生质体培养再生难度较大；受转化受体的基因型限制；原生质体再生培养的转化植株变 异率高，易产生白化苗；转化率低峭j 。目前，该种转化方法在植物中很少采用。 1 1 1 3 显微注射法 显微注射法( m i c m 埘e c t i o n ) 是用显微注射器将遗传物质注射到培养细胞中，通过组 织培养最终获得转化植株。如1 9 8 7 年n e u h a u r 等用油菜( b r 日s s f c n 印榔l ) 花粉起源的 1 2 细胞期的体细胞胚注射n p ti t 基因的d n a ，获得转基因植株的频率高达2 7 5 l 。 此项技术起初主要应用于动物，八十年代中期开始应用于植物的遗传转化。1 9 8 9 年刘博林 等用微注射法将a t r a z i n e 抗性基因向大豆叶绿体中转移，获得转基因抗性再生植株。 虽然该法具有d n a 注射的准确性、可预见性、克服远源杂交的困难等优点，但其又 有工作效率低、表达不稳定等缺点，故其应用受到了限制b 】。自基因枪法诞生以来，这种 转化方法在植物上的应用走入了低谷。 2 h q鬲 1 1 1 4 电激法及激光法 电激法( e l e c t r o p o r a t i o n ) 是八十年代初发展起来的一种转化技术，其主要原理是利用 高压脉冲作用，在原生质体膜上“电激穿孔”，形成可逆的瞬间通道，从而促进外源d n a 的摄取。李宝健等人在1 9 8 5 年首次将这种方法用于植物细胞的基因转化，并用此法获得 了水稻转基因植株4 1 。之后，又有研究者运用此法将c a t 基因( 氯霉素乙酰转移酶基因) 转移到烟草、胡萝h 、玉米等植物的原生质体中并得以表达【1 3 1 。 激光法同电激法类似，一定波长的激光聚焦后直径达0 3 0 5 微米时，高能量的激光 束可引起细胞膜的可逆性穿孔，短时问内又可自动修复，因而可利用激光束将外源d n a 导入到细胞中。w e b e r 等利用此法将荧光素酶基因导入油菜叶绿体中，t o p e r 转化烟草【1 6 】、 中国的傅荣昭等转化小麦均获得成功1 7 】。激光法和电击法均可用于双子叶植物和单子叶植 物，转化受体材料广泛。由于这种方法的转化效率低、使用范围小、存在问题较多，因而 其发展缓慢。 1 1 1 5 花粉管通道法 花粉管通道法( p o l l e n t u b ep a t h 、v a y ) 又称子房注射法( o v e r yi n j e c t i o n ) ，是利用花粉 管通道导入外源d n a 的技术，其主要原理是授粉后使外源d n a 能沿着花粉管渗入，经过 珠心通道进入胚囊，转化尚不具备讵常细胞壁的卵、合子或早期胚胎细胞f 1 8 1 。 这是一种在整体植株水平上的转化方法，可使外源基因转移的操作直接在栽培作物上 进行，免除了细胞和组织培养程序，并可直接获得转化的种子，开创了整株活体基因转化 的新途径。l u o 等报道了用花粉管通道法将含p 3 5 s n p t i i h i s t 3 的质粒d n a 转入藤坂五号 水稻品种中，分子杂交检测证实了外源d n a 已整合到水稻基因组中。谢道昕等将两个 b t 杀虫基因分别构建在植物表达载体p b i l 2 1 2 和g a 6 4 3 上，通过花粉管途径，将这两种 杀虫基因导入我国棉花品种中，获得转基因植株1 9 l 。此外，刘德璞等用此方法也获得抗s m v 的大豆转基因植株【2 0 l ；徐香玲等将几丁质酶基因转入大豆栽培品种中获得再生植株，斑点 分子杂交证明了几丁质酶基因已转入大豆中口”。 1 1 1 6 荚他直接转化方法 除上述一些主要的直接转化方法外，还有脂质体法、离子束介导法、超声波介导法、 萌发种子的电泳法和种子浸泡法等。它们各有其优缺点及适用范围，对于特定的受体材料 需用特定的方法。例如，d e s h a y e s 等用脂质体介导法将n p ti i 基因转化烟草叶肉原生质体 m 】；程各久等用a r + 注入将比克氏棉和红麻的d n a 导入泗棉2 号【2 3 】；许宁等利用超声波 3 删吾 的空化作用诱导小麦幼胚获得外源基因转移1 2 4 1 。 1 1 2 介导法 1 1 2 1 病毒介导法 病毒具有感染寄主细胞并在寄主细胞内进行复制和表达自己基因的能力，因此可以作 为基因工程的载体。 常见植物基因工程的病毒载体有：单链r n a 病毒( 如，雀麦花叶病毒b r o m em o s a i c v i m s b m v ) ，单链d n a 病毒( 如，双子座病毒组g e m i n i v i m s e s ) ，双链d n a 病毒( 如， 花椰菜叶纹病毒( c a u l m o w e rm a s a i cv i m s ，c a m v ) 等【2 2 】。可作为载体的植物病毒主要是 c a m v ( 即花椰菜叶纹病毒c a u c i f i o w e rm o s a i cv i m s ) 。 外源基因可插入到与c a m v 活性无关的区域，随后此基因在c a m v 感染的植株中表达， 从而获得转基因植物口”。 1 1 2 2 农杆菌介导法( a g r o b a c t e r i u m m e d i a t e d ) 农杆菌是一种革兰氏阴性土壤杆菌，主要有根癌农杆菌( a t 啪e f 缸i e n s ) 和发根农杆 菌( a r h i z o g e n e s ) ，它们在自然情况下可以通过伤口侵染植物，导致受伤部位产生冠瘿瘤 或毛发根。根癌农杆菌含有肿瘤诱导质粒( t i ) ，t i 质粒上包含可转移d n a ( t - d n a ) 区、 毒性区( r 区) 、结合转移区( c o n 区) 和复制起始区( o r i 区) 4 部分【”。其中与冠瘿瘤 生成有关的是v i r 区和t - d n a 。t - d n a 区在农杆菌侵染植物时可以插入植物基因组中，使 其携带的基因在植物中表达。v i r 区用于编码t _ d n a 加工、转移及整合的功能蛋白，协助 t - d n a 整合进宿主基因组中。当植物受到伤害分泌含有酚类化合物的汁液时，这些酚类化 合物诱使农杆菌向植物受伤部位移动并附着于细胞表面，随后经过蛋白磷酸化、去磷酸化、 d n a 剪切及转运等一系列反应过程，t - d n a 最后插入宿主细胞并以单或多拷贝的形式随 机整合到核染色体上，完成t - d n a 由农杆菌向植物的转移及整合过程。研究表明t - d n a 优先整合到转录活跃区，而且在t i d n a 的同源区与d 小认的高度重复区，t - d n a 的整合频 率也比较高【2 “。 农杆菌作为一种天然的植物基因转化系统，其介导的转化属于一种纯生物学的方法， 与其它转化方法相比具有明显的优点：( 1 ) 转化频率高：( 2 ) 可导入大片段的d n a ，且导 入植物细胞的片段确切；( 3 ) 导入基因拷贝数低，大多只有1 3 个，表达效果好，稳定 遗传，多数符合孟德尔遗传规律；( 4 ) 农杆菌转化方法使用的技术、仪器简单【2 7 j 。由于上 d 前言 述优点，这种方法成为目自口应用最广泛的转化方法。 1 2 转基因植物研究现状 1 2 1 转抗虫基因植物 虫害一直是全世界范围内制约作物高产、稳产的一个重要因素。使用农药等方法防治 害虫虽然效果显著，但是农药杀虫剂的大面积使用既破坏了害虫和天敌之间的生态平衡又 给环境造成了严重污染。因此，培育抗性品种，己成为害虫综合防治计划的最佳选择。目 前，植物抗虫基因工程中使用的抗虫基因主要有两大类，一类是从细菌中分离出来的抗虫 基因，另一类是从植物中分离出来的抗虫基因口8 1 。 1 2 1 1 来源于微生物的抗虫基因 b t 基因是苏云金芽孢杆菌( b a c i l l u st l l m i n g i e n s i s ，b t ) 晶体蛋白基因的简称。出于b t 在芽孢形成时产生的晶体蛋白具杀虫活性，故称其为“杀虫晶体蛋白( m s e c t i c i d a lc r y s t a l p m t e i n s ，i c p s ) ”或“6 一内毒素( 6 一e n d o t o x i n ) ”【2 “。b t 杀虫晶体蛋白具有高效的杀虫活 性，对哺乳动物、鸟类、鱼类和一些有益昆虫不产生毒害作用，且不造成环境污染，具有 良好的应用前景。1 9 8 7 年，美国a g r o c e t u s 公司利用农杆菌t i 质粒首次将b t 一内毒素基因 转入商品棉，育成对鳞翅目幼虫抗性稳定的转基因棉捌。之后，抗虫转基因工程迅速发展 起来。到目前为止，b t 一内毒素基因己成功转入水稻、棉花、玉米、大豆、马铃薯、番茄、 烟草、苹果、唐棣、核桃、杨树、蚕豆、白三叶、菊花、酸果等植物中3 0 出】，其中前1 1 种已转入大田试验，有的已开始大面积种植。例如，1 9 9 6 年美国m o n s a i l t o 公司研制培育 的转b t 基因抗虫棉，具有抗棉铃虫、红铃虫及烟草夜蛾幼虫的能力，已在美国大规模种植。 我国科学工作者在这方面亦作了努力，1 9 9 1 年中科院遗传所将修饰后的b t 基因导入棉花， 获无抗虫性的工程植株；为提高其表达量，依照植物偏爱密码子的原则，人工全序合成了 b t 杀虫蛋白基因，并于1 9 9 3 年导入我国棉花主栽品种，获高抗棉铃虫的转基因抗虫棉【4 3 1 。 迄今为止我国已培育了转b t 基因的中棉2 9 、中棉3 0 、中棉3 8 、晋棉7 、晋棉2 6 等【4 5 】。 异戊烯基转移酶( i p t ) 是细胞分裂素合成中的关键酶。来源于农杆菌的i p t 基因在烟 草、番茄中表达后，可减少烟草夜蛾对叶片的损伤，并降低桃蚜的生存力。然而，i p t 基因的表达对植物发育有负面影响，如使根系发育不完全，降低叶绿素含量等；因此，如 何兴其利除其弊，应成为研究者今后研究的重点。 5 | j q鬲 胆固醇氧化酶基因，来源于链霉菌类，对棉铃象甲幼虫有极高的毒性，并能延缓美洲 烟草夜蛾的生长。研究表明，胆固醇氧化酶的作用机理在于破坏昆虫中肠膜的完整性，最 终导致细胞裂解死亡，因此，将胆固醇氧化酶基因转入作物中对昆虫也有很好的抗虫潜力 【4 7 i 。 1 2 1 2 来源于高等植物的抗虫基因 蛋白酶抑制剂( p m t e i ni n h i b i t o r ，p i ) 是对蛋白酶有抑制活性的一种小分子蛋白质，它 能抑制昆虫或动物消化系统中蛋白酶的活性，是植物对付昆虫及病原体侵袭的一种天然防 御体系。自1 9 8 7 年首次将豌豆蛋白酶抑制剂( c o w p e a 哪p s i n i n l l i b i t o r ，c p t i ) 基因转入 烟草并获得抗虫植株以来，转p i 基因获得抗虫转基因作物的研究取得了很大的进展【4 ”。 目前至少有1 4 种蛋白酶抑制剂基因转入作物中，其中大部分工作集中在来源于豆科、茄 科和禾本科的s e r 蛋白酶抑制剂，这种抑制剂主要对鳞翅目昆虫起作用，同时也对某些鞘 翅类、直翅类害虫起作用。现在发现活性最强的一种是豇豆胰蛋白酶抑制剂( c p t i ) ，它 是一种s e r 蛋白酶抑制剂，具有抗虫谱，。、对人畜无害、害虫不易产生抗性等特点1 4 引。实 验表明，c p t i 对大部分鳞翅类和鞘翅类起作用【4 9 】。例如，在加利福尼亚田间试验成功的 c p t i 转基因烟草可导致棉铃虫幼虫极高的死亡率。我国郝贵霞、朱桢等也进行了c p t i 转 化毛白杨的研究【5 。到目前为止，c p t i 基因已被转入至少l o 种植物中。尽管在蛋白酶抑 制剂的研究方面已取得显著进展，但遗憾的是至今未见有一种转蛋白酶抑制剂基因的植物 投入商业化种植。 植物凝集素是一类糖结合蛋白，也是植物防御系统的一个组成部分。凝集素抗虫的作 用机制可能是在昆虫肠腔部位与糖蛋白结合，降低膜透性，从而影响营养物质的正常吸收； 同时诱发病灶，促进消化道内细菌繁殖，使昆虫得病或引起拒食、生长停滞甚至死亡5 2 1 。 目前成功用于植物抗虫基因工程的凝集素基因有：雪花莲凝集素( g n a ) 基因、豌豆凝集 素( p l e c ) 基因、麦胚凝集素( w g a ) 基因、半夏凝集素( p r r 、a ) 基因。1 9 9 7 年g a t e h o u s e 等将g n a 基因转入马铃薯，发现g n a 可延缓马铃薯桃蚜的发育期，降低其生殖力，抑制 其种群生长【5 。我国周岩等用g n a 基因转化烟草，其抗蚜活性强，平均抑制桃蚜4 5 6 0 的虫口密度【5 ”，梁辉等用基因枪法将g n a 基因转化豫麦6 6 ，成功获得转基因植株， 转基因植株对麦长管蚜和禾谷缢管蚜的进食均起到明显的抑制作用【55 1 。到目前为止，g n a 基因己被转入9 种作物中，包括马铃薯，番茄，烟草等【5 ”。 几丁质酶是广泛存在于微生物和植物体内的一类蛋白质，催化真菌细胞壁的主要成分 6 日高 几丁质的水解，从而抑制真菌的生长增殖，提高植物抗菌能力【5 3 】。1 9 8 9 年r y a i l 等从 j o b 草中分离得到一种几丁质酶，发现它能抑制淀粉酶的活性，从而有效抑制蝗虫等昆虫 类【5 7 】。于海波等也发现蚕豆几丁质酶可抑制早期若蚜的存活和生殖发育 5 3 】。刘伟华等用基 因枪法将菜豆几丁质酶基因导入小麦，转基因小麦的白粉病症状得到了很大程度的缓解 f 5 8 】。吴家和等通过农杆菌介导法将几丁质酶基因和6 1 ，3 葡聚糖酶基因导入陆地棉品种冀 台3 2 1 和中棉所3 5 ，获得的7 个转化株系均表现不同程度的抗或耐黄萎病性 5 9 】。现在几丁 质酶基因虽已转入几种植物中，但并未显示对番茄夜蛾幼虫具有抗性，只对桃蚜有微弱的 作用。 另外，来源于长春花的色氨酸脱羧酶( t d c ) 对虱虫有抗性，该酶基因在烟草中表达 后，可使烟草白粉虱的繁殖力降低达9 7 。 1 2 i 3 来源于动物的抗虫基因 动物来源的抗虫基因主要是哺乳动物和烟草夜蛾的s e r 蛋白酶抑制剂基因。现在人们 发现，胰蛋白酶抑制剂( b p t l ) 、旺1 一胰蛋白酶抑制剂( q 1 a t ) 、脾抑制剂( s i ) 是很有发 展前景的抗虫蛋白，但将这些抑制剂基因转入植物中后发现并未产生抗虫性或只产生很弱 的抗虫性【5 6 j 。 另外，一些昆虫毒素，如蝎子毒素、蜘蛛毒素等对昆虫也有毒害作用，可引起神经麻 痹，使昆虫失去知觉，不能取食而死亡【5 6 】。这些毒素也己开始应用于基因工程，但未见报 道在生产应用上的抗性表现。 1 2 2 转抗病基因植物 植物病毒是造成多种农作物减产的重要病原，每年全世界的农作物因病毒侵害的损失 高达2 0 0 亿美元【6 ”。传统的抗病育种、农药防治、组织脱毒等预防病害的方法不仅耗时费 力、污染环境，而且有很大的局限性。伴随植物基因工程技术的发展，研究者认为利用转 基因技术获得抗病毒转基因植物会成为防御病毒侵害的有效方法。 1 2 2 1 来源于病毒的抗病基因 病毒外壳蛋白介导的抗性是研究的最早、也是目前比较成功的抗病毒手段。该策略主 要是将病毒的外壳蛋白( c o a t p r o t e i n ，c p ) 基因转化到植物细胞内并得以表达，从而使转 基因植物获得抗病毒的能力。自b e a c h y 等首先利用病毒外壳蛋白基因转化烟草获得稳定 遗传的抗病毒植株以来 6 2 j ，利用c p 基因提高植物抗病性这一方法得到了广泛应用。迄今 7 h u再 为止，已经克隆了至少1 5 个病毒组中3 0 种病毒的c p 基因，并成功转化了2 0 多种植物， 有些株系己进入田间试验并显示了与实验室一致的抗病效果6 3 l 。比如，在苜蓿花叶病毒 ( a l m v ) c p 介导的抗性研究中，无论c p 表达水平高与低，都表现出对完整病毒粒子的 抗性，而且c p 表达水平高的植株还对裸露的r n a 具有抗性【6 4 l 。 尽管c p 介导的抗病毒植株已获得了成功，但还存在很多问题。其一，迄今所获得的 基因工程植株多数只表现为延迟发病和降低发病严重度，免疫类型和高抗类型较少惭j 。其 二，具有潜在危险性，导入植物中的外源c p 基因的表达产物可能包装另外一种病毒或其 它致病因子的基因组而形成一种新的致病因子。因此，c p 介导的抗病毒植株离推广应用尚 有一段距离【6 6 】。 植物正链r n a 病毒的复制酶属于依赖r n a 的r n a 聚合酶( r n a d e p e n d e n tr n a p o l y m e r a s e ，r d r p ) ，通常由1 2 种由病毒编码的蛋白质和多种寄主成份构成。在病毒编 码的复制酶蛋白质中存在多个保守序列；其中一个是存在于所有r n a 聚合酶中的甘氨酸 天冬氨酸天冬氨酸三肽基元序列( g d dm o t i f ) ，它对聚合酶的活性是必不可少的；另一保 守序列是三磷酸核苷酸结合结构域( n t p b i n d i n gd o m a i n ) ，位于另一种由病毒编码的蛋白 质中或与g d d 序列共处于同一蛋白质中：此保守序列与螺旋酶活性有关，在病毒复制时 r n a 双链复制型的解旋过程中超重要作用【6 6 】。烟草花叶病毒( t m v ) 的5 4 k d 蛋白是该 病毒复制酶的核心部分，g o l e m b o s k i 等将该蛋白基因转化烟草，获得的转该基因烟草对 t m v 表现出高度抗性 6 7 】。a n d e r s o n 等将黄瓜花叶病毒( c m v ) f n y 株系的r n a 内部缺失 9 4 个核苷酸后导入烟草( 缺失区包含g d d 三肽基元序列) ，结果，缺失造成开放阅读框的 移码，其翻译产物只有完整的9 7 k d 蛋白的7 5 左右，但仍然表现出对c p v 的高度抗性【6 8 】。 根据现有的研究结果来看，复制酶基因介导的抗性既可以在蛋白质水平上又可以在 r n a 水平上实现。在蛋白质水平上，c a 等认为转基因植物表达的复制酶蛋白在病毒的侵 染过程中作为一种调节蛋白发挥正常功能，从而打破了病毒正链和负链复制的平衡，或者 是干扰了控制复制酶活性的反馈抑制途径；在r n a 水平上，有学者认为是转录出的“埘a 与病毒的复制酶进行了无效结合而抑制其正常功能，或者是m i 矾a 诱导了植物的自然抗病 性等等【6 9 】。 病毒运动蛋白基因( m o v e r n e n t p r o t e i n ，m p ) 在植物的病毒防治方面也起一定的作用。 l a 口i d o t 等人发现，将t m v 的缺陷型m p ( d m p ) 基因转入烟草中后能获得抗t m v 的植株， 进一步的实验表明转d m p 基因的烟草不仅对t m v ，还对烟草花叶病毒组其它成员，以及 其它种类病毒如a l m v 、c m v 等具有不同程度的抗性。这表明各种病毒m p 之间虽然 8 h u鬲 缺乏同源性但却具有相同的功能。不同病毒来源的m p 可与同种植物胞问连丝结合，抗性 是由于缺陷型m p 与野生型m p 竞争胞问连丝上的结合位点而得以实现的6 0 1 。由此，激发 了人们用缺陷的或异源的m p 介导广谱病毒抗性的设想和实验，使得转一种基因而抗多种 病毒成为可能，这一抗病毒途径可能具有广阔的应用前景。 1 2 2 2 来源于植物的抗病毒基因 植物在其长期的进化过程中也逐渐获得了系列复杂的防御机制来保护自己，如病程 相关蛋白( p a t h o g e n e s i s r e l a t e dp r o t e i n ，p r ) 基因在植物受病毒或其它病原体感染时编码 病程相关蛋白直接对病原体进行攻击【删。虽然目前转p r 基因植物的抗性水平并不理想， 但随着植物防御机制的深入研究，这种抗病毒手段应该具有很好的应用前景。 核糖体失活蛋白( r i p s ) 是许多高等植物能自身合成的具有酶功能的蛋白质，它能够 专一性水解真核生物核糖体2 6 s 2 8 s r r n a 上一段1 4 碱基的高度保守序列，从而阻止 e f 2 g t p 复合物与核糖体6 0 s 大亚基的结合，抑制蛋白质的合成【6 3 1 。l o d g e 等通过对美洲 商陆( 尸自w o 肠c c 日爿卅j ，f c d n 订l ) 核糖体失活蛋白基因编码的c d n a 进行克隆、体外重组、 构建表达载体后再转化烟草植株，攻毒试验表明，表达p a p 的转基因植物能抵抗多种病毒 ( p v x 、p v y 、c m v 等) 的侵染。张海燕等对美洲商陆r i p s 的c d n a 进行克隆、测序， 再构建到植物表达载体p b p 2 1 ，经农杆菌转化，将p a p 的c d n a 导入油菜后也获得了抗 t u m v 的油菜植株1 6 。 1 2 2 3 利用核酶基因抗病毒 核酶( r i b o 纠m e ) 是一类具有特殊二级结构、能特异性催化切割自身以及其它r n a 分 的小分子r n a ，它广泛存在于一些类病毒和病毒卫星r n a 序列中【7 2 1 。研究者根据核酶 切割位点的序列保守性，人工合成切割不同病源性i 矾a 的核酶，在生产实践中取得了令 人兴奋的成果：杨建华等将设计的特异切割烟草花叶病毒i 斟a 的锤头型核酶r z 2 转化 烟草原生质体，通过检测t m v 对烟草原生质体的侵染性发现，转基因原生质体中t m v 侵染性明显低于未转基因的对照组【7 3 1 ；赵志英等将切割番木瓜环斑病毒( p a p a y ar i n g s p o t m s ，p r v ) r n a 的核酶基i 习转入番木瓜，获得的转基因番木瓜对p r v 具有一定的抗性 | 7 4 】。这是继杨建华【7 3 】等人之后，我国将核酶基因成功转入植物并获得抗性植株的又一成 功实例。 9 日u晶 1 2 2 4 多基因策略 以上方法所利用的都是单一的抗性基因，而且大多是针对某一种病毒的某一步侵染过 程来设计的，因而