（茶学专业论文）茶树叶绿素酶的分离纯化和性质的初步研究.pdf

华中农业火学2 0 0 9 届硕十学位论文 茶树叶绿素酶的分离纯化及性质的初步研究 摘要 叶绿素酶是种位于叶绿体光合膜的内在膜蛋白，在高等植物和藻类中催化叶 绿素水解为植醇和脱植基叶绿素。本文在优化茶树叶绿素酶提取条件及活性分析条 件的基础上，对茶树叶绿素酶的分离纯化及其性质进行了探索，为深入研究茶树叶 绿素代谢和光合作用机制、茶树的栽培以提供了理论基础，并对于绿茶的加工过程 的机理研究提供一定的指导意义。本研究的主要结果如下： 1 鲜叶中叶绿素酶提取和活性分析条件的优化 用叶绿素a 作为底物，以福鼎大白茶品种的鲜叶为材料对茶树的叶绿素酶提取 条件和活性条件进行了分析和优化。结果表明，加入与鲜叶等量p v p 研磨，用p h 7 5 的磷酸二氢钠磷酸氢二钠缓冲液为提取液提取的叶绿素酶活性最高。叶绿素酶的活 性分析最佳条件为在4 0 c 条件下反应1 5 分钟。 2 茶树的不同品种、生长不同部位、加工过程以及不同条件下叶绿素酶活性的变 化 对八个适制绿茶品种鲜叶叶绿素酶的活性进行比较，结果表明，福云6 号中叶 绿素酶活性最高，其次是福鼎大毫、福鼎大白茶、鄂茶l 号、平阳特早、乌牛早， 而在迎霜和龙井4 3 叶片中叶绿素酶活性明显较低。 在茶树生长的不同部位，叶绿素酶活性也存在一定的差异。研究结果表明，在 所测的几个部位中，叶绿素酶活性由高到低的顺序依次为：芽 第一叶 第二叶 第三叶 老叶 嫩茎。 在鲜叶摊放时间6 小时过程中，每隔一定的时间测定叶绿素酶活性，结果显示， 绿素酶活性变化的趋势为先升高后降低而后又大幅升高。 测定茶树叶绿素酶活性的日变化，结果表明，从上午7 ：0 0 到下午1 6 ：0 0 之 间叶绿素酶活性逐渐下降，之后从1 6 ：0 0 到1 9 ：o o 酶活性又开始有升高的趋势。 茶树在不同的生长季节叶绿素酶活性也有差异，选择春、夏、秋三个产茶季节 测定茶树鲜叶叶绿素酶活性。结果表明，春季叶绿素酶活性最高，夏季次之，秋季 的叶绿素酶活性最低。 茶园遮荫也对叶绿素酶活性有一定的影响，本实验对于福鼎大白茶进行了两种 遮光率的遮荫研究，遮荫时间为两个月，结果表明，6 0 和8 0 遮光率的遮荫都能 使叶绿素酶活性下降。 茶树叶绿素酶的分离纯化和忡质的初步研究 3 茶树叶绿素酶的分离纯化 利用硫酸铵分级沉淀、s e p h a d e xg 2 0 0 柱层析和s e p h a r o s ec l 6 b 柱层析三种 方法对福鼎大白茶品种叶片的叶绿素酶进行分离纯化，结果表明，经过三步分离纯 化过程之后，叶绿素酶的纯度提高了5 5 9 6 倍，酶的得率为9 4 5 。通过s d s p a g e 电泳检测纯化后叶绿素酶纯度，图中显示一条较为清晰的蛋白质条带，叶绿素酶亚 基分子量为3 7 2k d a 。 4 茶树叶绿素酶的酶学性质 用纯化后的叶绿素酶研究其酶学性质，结果表明，在茶树中，该酶最适p h 为 7 5 。用p h 4 0 9 0 的缓冲液处理一段时间后，在p h 6 肚8 0 的条件下保存酶活性处 于相对稳定的状态，高于或者低于这个区间酶活性均有不同程度降低，而酸性条件 下酶活力降低幅度更大，说明茶树中的叶绿素酶更不耐酸，在弱碱性条件下保存较 好。 酶促反应温度以3 0 5 0 为宜，其中4 0 c 时候反应活性最高。叶绿素酶不耐 热，在不同温度下保存一段时间后，酶活性均有不同程度下降。其中在7 0 条件下 处理半个小时，8 0 条件下处理1 0 分钟的时候叶绿素酶完全失活。 将纯化的叶绿素酶溶液置于4 冰箱保存一个月，每隔5 天测定酶活性，结果 表明随着存放时间的延长，酶活性逐渐下降，保存一个月后叶绿素酶活性剩余4 5 。 分别加入2 m m o l l 和7 m m o l l 的金属离子( c e + 、m 9 2 + 、z n 2 + 、f e 3 + ) 、e d t a 处理叶绿素酶溶液，结果显示所选的几种金属离子和e d t a 均对于茶树叶绿素酶活 性有一定的促进作用。 关键词：茶树；叶绿素酶；提取；分离纯化；酶学性质 i i 华中农业大学2 0 0 9 屑硕十学位论文 p r e l i m i n a r ys t u d i e so np u r i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no f c h l o r o p h y l l a s ef r o m t e al e a v e s ( c a m e l l i as i n e n s i s ) a b s t r a c t t h ee n z y m ec h l o r o p h y l l a s e ( c h l o r o p h y l l - c h l o r o p h y l l i d e h y d r o l a s e ，c h l a s e ) e c 3 1 1 14 】i sa l li n t r i n s i cm e m b r a n ep r o t e i nt h a ti sf o u n di n c h l o r o p l a s tp h o t o s y n t h e t i c m e m b r a n e sa n dw a sd i s c o v e r e db yw i l l s t s t e ra n ds t o l li n1913 i tc a t a l y z e st h ef i r s ts t e p o fc h l o r o p h y l l ( c h l ) b r e a k d o w nb yh y d r o l y s i so fc h li n t oc h l o r o p h y l l i d ea n dp h y t o li n h i g h e rp l a n t sa n da l g a e u n d e rt h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n sf o rt h ee n z y m ee x t r a c t i n ga n d a c t i v i t ya n a l y s i s ，c h l o r o p h y l l a s ew a sp u r i f i e da n di t sc h a r a c t e r i z a t i o nw a ss t u d i e df o rt h e f i r s tt i m ei nc h i n a t h i sw i l le s t a b l i s ht h e o r e t i c a lf o u n d a f i o nf o rf u r t h e rr e s e a r c ho nt h e m e c h a n i s mo fc h la n dp h o t o s y n t h e s i s ，t e ac u l t i v a t i o na n dp r o c e s s i n g t h em a i nr e s u l t s a r ea sf o l l o w s ： 1o p t i m i z a t i o no fc o n d i t i o n sf o re x t r a c t i n ga n da c t i v i t ya n a l y s i so fc h l a s e u s i n gc h l aa ss u b s t r a t e ，t h ec o n d i t i o n sf o re x t r a c t i n ga n da c t i v i t yo fc h l a s ei nt e a p l a n t l e a v e sw e r es t u d i e d t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt h ea m o u n t o f p o l i v i n p o l y p y r r o l i d o n e ( p v p ) h a dg r e a ti m p a c to nc h l a s ea c t i v i t y ；e n z y m ea c t i v i t y a t t a i n e dt h ea p e xw h e nt h ea m o u n to fp v pw a se q u a lt ot h a to ff r e s hl e a v e s t h er e s u l t s a l s os h o w e dt h a tc h i a s ea c t i v i t yw a se f f e c t e db yd i f f e r e n tb u f f e r sa n dp hv a l u e s c h l a s e a c t i v i t yi n c r e a s e dt om a xa sp hv a l u er o s et o7 5 ，a n dt h e nd e c r e a s e d a tt h es a m ep h v a l u e ，e n z y m ea c t i v i t yw a st h eh i g h e s tw i t hs o d i u mp h o s p h a t eb u f f e r i tw a sf o u n dt h a t t h ee n z y m er e a c t i o nw a ss t a b l ea t4 0 。ci n15 m i n 2c h a n g e so fc h l a s ea c t i v i t yo fd i f f e r e n tt e ac u i t i v a r s ，d i f f e r e n tg r o w i n gz o n e ， p r o c e s s i n ga n d s oo n t h ec h a n g e so fc h l a s ea c t i v i t ya m o n ge i g h tc u l t i v a r so fc a m e l l i as i n e s i sl w e r e i n v e s t i g a t e di nt h i sp a p e r a sar e s u l t ，t h es e q u e n c eo fc h l a s ea c t i v i t yf r o mh i 曲t ob l o wi s ： f u y u n l i uh a o c h a f u d i n gd a h a o c h a p i n g y a n gt e z a o c h a f u d i n gd a b a i c h a e c h a l h a o w u n i u z a o l o n g j i n 9 4 3 y i n g s h u a n g t h ed i f f e r e n c e so fc h l a s ea c t i v i t yi nd i f f e r e n tg r o w i n gz o n e so ft e ap l a n t sa le s i g n i f i c a n t a sar e s u l t ，t h es e q u e n c eo fc h l a s ea c t i v i t yf r o mh i g ht ob l o wi s ：b u d t h e f i r s tl e a f t h es e c o n dl e a f t h et l l i r dl e a f o l dl e a f y o u n gs t e m i i i 茶树叶绿索酶的分离纯化和性质的初步研究 t h ec h a n g e so fc h l a s ea c t i v i t yi nt h ep r o c e s so fs p r e a d i n gt i m ew e r ed e t e r m i n e d i t w a sf o u n dt h a td u r i n g6h o u r ss p r e a d i n g ，c h l a s ea c t i v i t yi n c r e a s e da tf i r s tt h e nd e c r e a s e d ， a n dt h e ni n c r e a s e dg r e a t l y a n dt h ed i u r n a lc h a n g e so fc h l a s ea c t i v i t y w ed e t e r m i n e dc h l a s ea c t i v i t ya t7 ：0 0 ， 10 ：0 0 ，1 3 ：0 0 ，16 ：0 0a n d19 ：0 0 t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a t ，c h l a s ea c t i v i t yw a sd e c r e a s e d g r a d u a l l yf i o m7 ：0 0t o16 ：0 0 ，a n di n c r e a s e df r o m16 ：0 0t o19 ：0 0 t h e r ea r ed i f f e r e n c e so ft e ac h l a s ea c t i v i t yi nd i f f e r e n tg r o w i n gs e a s o n s c h l a s e a c t i v i t yw a sh i g h e ri nn e ws h o o t so fs p r i n gt e a , a n dn e ws h o o t so fs u m m e rt e at o o k s e c o n dp l a c e ，c h l a s ea c t i v i t yo fn e ws h o o t so fa t u n mt e aw a sl o w e s t t e ap l a n t i n gs u n s h a d ea l s oc a ne f f e c t e dc h l a s e a c t i v i t y t w ol i g h ts h a d i n g p e r c e n t a g e sw a sa p p l i e di nt e ag a r d e n t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ec h l a s ea c t i v i t ya l l d e c r e a s e da f t e r6 0 a n d8 0 l i g h ts h a d i n gp e r c e n t a g et r e a t m e n t 3i s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o no fc h l a s e u s i n gt h em e t h o d so fa m m o n i u ms u l f a t ep r e c i p i t a t i o na n dc o l u m nc h r o m a t o g r a p h y o ns e p h a d e xg 2 0 0 ，s e p h a r o s ec l - 6 b ，c h l a s ei nt h et e al e a v e sw a sp u r i f i e d a f t e rt h r e e s t e p so fi s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o n , i tw a sp u r i f i e d5 5 9 6f o l da n day i e l do f9 4 5 t h e r e i so n ec h l a s es t r i p eb ys d s p a g e 1 1 1 es u b u n i tm o l e c u l a rm a s sw a s3 7 2 k d a 4r e s e a r c ho nc h a r a c t e r i z a t i o no fc h l a s e r e s e a r c ho nt h ec h a r a c t e r i z a t i o no ft h ep u r i f i e dc h l a s ep r o v e dt h a tt h ee n z y m e s h o w e do p t i m a la c t i v i t ya tp h7 5a n d4 0 。c i tw a ss t a b l ei np hr a n g ef r o m6 0t o8 0 c h l a s ea c t i v i t yd e c r e a s e di nl a r g ea m p l i t u d ei na c i d i cc o n d i t i o n s t h er e s u l ti n d i c a t e d t h a ti tw a ss u i t a b l ef o re n z y m ep r e s e r v a t i o nu n d e ra l k a l e s c e n tc o n d i t i o n a f t e rc o n s e r v e di nd i f f e r e n tt e m p e r a t u r eap e r i o d ，e n z y m ea c t i v i t yd e c r e a s e da t d i f f e r e n td e g r e e c h l a s ec o m p l e t ei n a c t i v a t i o na f t e rt r e a t e dw i t ht e m p e r a m e n t7 0 i n 3 0 m i na n d8 0 i i l1 0 m i n n l es u r v i v a lr a t eo fe n z y m ea c t i v i t yr e m a i n e d4 5 w h e ns t o r e d4 cf o ram o n t h a d d i n gm e t a li o n sc a 2 十、m 矿+ 、z n 2 + 、f e 3 + a n de d t a i n t oc h l a s es o l u t i o n t l l e r e s u l ts u g g e s t e dt h a ta p p r o p r i a t ea m o u n to fm e t a li o n sa n de d t ap r o m o t e dc h l a s e a c t i v i t y k e yw o r d ：t e ap l a n t ；c h l o r o p h y l l a s e ；e x t r a c t i o n ；i s o l a t i o n a n d p u r i f i c a t i o n ； c h a r a c t e r i z a t i o n 华中农业大学2 0 0 9 届硕七学位论文 缩略词 v 华中农业大学学位论文独创性声明及使用授权书 学位论文 不 如需保密，解密时间年月 日 是否保密 1 2 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得华中农业大学或其他教育机构的学位或证书 而使用过的材料，指导教师对此进行了审定与我一同工作的同志对本研究所做的任 何贡献均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意 张硒串帆家矿吵年川日 学位论文使用授权书 本人完全了解华中农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须按照学 校要求提交学位论文的印刷本和电子版本；学校有权保存提交论文的印刷版和电子版， 并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位 论文。本人同意华中农业大学可以用不同3 - 式在不同媒体上发表、传播学位论文的全 部或部分内容，同时本人保留在其他媒体发表论文的权力 注：保密学位论文( 即涉及技术秘密、商业秘密或申请专利等潜在需要提交保密的论 文) 在解密后适用于本授权书 撇黼鲐施中孙张弘呼 蛳期：叩年乡月日 黼期月f 日 注：请将本表直接装订在学位论文的扉页和目录之间 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 第一章文献综述 1 关于叶绿素 叶绿素( c h l o r o p h y l l ，c h l ) 是地球上最重要的光合色素( 沈成国等，1 9 9 8 ) ，在 植物生长发育后期，叶片衰老或果实成熟时叶绿素大规模地进行降解，据估计每年 生物圈大约有1 0 1 1k g 叶绿素发生降解，但未留下任何痕迹( h e n d r ye ta 1 ，1 9 8 7 ) 。 叶绿素是高等植物进行光合作用的重要物质，同时也是绿色植物的主要色素， 主要有叶绿素a 和叶绿素b 两种，在一些藻类中还有叶绿素c 和叶绿素d ( 黄持都 等，2 0 0 7 ) 。 叶绿素是脂溶性色素，存在于一切绿色植物中，不溶于水，可溶于丙酮、乙醇 和石油醚等有机溶剂( 孟庆廷，2 0 0 9 ) 。 在分子结构上( 图1 1 ) ，叶绿素由脱镁叶绿素母环、叶绿酸、叶绿醇、甲醇、 二价镁离子等部分构成，叶绿素a 和叶绿素b 在结构上的差别仅在于第1 i 吡咯环上 的一个c h 3 被c h o 所取代( 黄持都等，2 0 0 7 ) 。 从化学性质上讲，叶绿素是一种双羧酸酯，叶绿酸的两个羟基分别被甲醇和叶 绿醇酯化。对光、热、酸敏感，性质不稳定，遇酸时中心金属镁被氢置换脱镁形成 暗绿至暗褐色的脱镁叶绿素。 y l o h ! ：叶罐静基 饧i h n y l c h o ：口i 豫骅托 f 钿h 瓢 c 洲棚一2 c h l i42 c h c h 2 伽 c h 童一c l h - - c h ：- - c h 2 b 删一一c 一c h 2 一 铡j c h 4 图1 - 1 叶绿素结构 f i g 1 - 1t h e s t r u c t u r eo fc h l o r o p h y l l 在植物生长发育的后期，叶片衰老、果实成熟过程中叶绿素开始发生大规模的 降解。图1 2 所示为叶绿素降解代谢的途径。 t k t-i、，j、l_、，-，j 茶树叶绿素酶的分离纯化和性质的初步研究 a 1 1 + 篮白锺复台物 凸l 幡t i 如一董白质童台钧 叶颦蠡醢 脱镁铉台砖 p l 协t d e 瓴化稿 曩质压白厦( 惩原露， 0 c ( 暑) 图1 2 植物体内叶绿素降解途径示意图 f i g 1 - 2d e g r a d a t i v ep a t h w a yo fc h l o r o p h y l l 目前，比较明确的叶绿素降解途径有三步：第一步，叶绿素在叶绿素酶的作用 下发生脱植基反应：第二步，在脱镁螯合酶( m g d e c h e l a t a s e ，m d c a s e ) 作用下由脱 植基叶绿素( c h l o r o p h y l l i d e ，c h l i d e ) 向脱镁叶绿酸a ( p h e o p h o r b i d e ，p h e i d e ) 转变； 第三步，在脱镁叶绿酸单加氧酶( p h e i d em o n o o x y g e n a s e ) 作用下卟啉大环裂解( 周凤 丽，2 0 0 8 ) 。 2 关于叶绿素酶 叶绿素酶( c h l o r o p h y l l a s e ，c h l a s e ) 是人类最早鉴定的植物酶之一( d e b o r ae ta 1 ， 1 9 9 9 ) 。自1 9 1 2 年a r t h u rs t o l l 报道叶绿素酶后，在高等植物叶片及藻类中叶绿素酶 与叶绿素降解之间关系广泛得以研究( f e r n a n d e z l o p e ze t a l ，1 9 9 2 ) 。到目前为止， 2 謦 苛懈 脚 j 耋憎 卜琴 ， r h w 翻 华中农业大学2 0 0 9 属硕士学位论文 叶绿素酶仍是叶绿素酶促降解代谢最为人熟知的酶之一。 作为叶绿素降解关键酶之一，经过多年的研究，叶绿素酶生化机制己逐渐认识 清楚。 现代研究认为，c t d a s e 是种叶绿体膜蛋白，在植物界中广泛存在( g a r c i a 等， 1 9 9 1 ) 。c h l a s e 主要定位于叶绿体膜( e n v e l o p e ) ( r u d i g e r , 1 9 9 7 ) ，而c h l 主要存在于类 囊体中，c h a s e 与c h l 的空间隔离表明c h l a s e 可能是一种潜伏态酶。c h l 降解时， 需要新合成一种蛋白载体，将c h l 运输到叶绿体膜上的相应降解位点。s d s p a g e 表明，c h l a s e 可能是寡聚蛋( t s u c h i y ae t a l ，1 9 9 7 ) 。大多数植物中叶绿素酶是酸性 蛋白质，经过纯化后的叶绿素酶经不同的方法测定出的分子量差异较大( 甘志军等， 2 0 0 2 ) 。 叶绿素酶在高等植物和藻类中催化叶绿素降解的第一步反应。在这个反应过程 中，叶绿素脱植醇( p h y t y l ) 得到脱植基叶绿素( c h l o r o p h y l l i d e ，c h l i d e ) 。随后脱植 基叶绿素的代谢产生一系列非荧光叶绿素降解产物。叶绿素降解发生在特殊发育时 期的色素转换过程中，包括叶片衰老和果实成熟过程，以及极端温度和干旱造成的 细胞死亡过程中( k i a n ie ta 1 ，2 0 0 6 ) 。 近年来，色谱技术与分子生物学技术的发展，推动了叶绿素酶的相关研究。 以柑橘( c i t r u sl i m o n u ml ) 叶片为试材研究叶绿素降解时发现，单独的叶绿素 蛋白复合物不表现叶绿素酶活性，当加入2 5 - 3 2 丙酮或有去垢剂存在时，叶绿 素酶活性提高，因而认为叶绿素酶是一种内源性疏水膜蛋白，主要定位于叶绿体膜 上( g a r c i a e t a l ，1 9 9 1 ) 。在应用蔗糖密度梯度离心分离叶绿体色素蛋白复合物进一 步研究叶绿素酶在叶绿体内的定位时发现，叶绿素酶活性与光系统i i ( p si i ) 有关 ( s c h e l l e n l l e n b e r ge t a l ，1 9 9 5 ) 。研究发现虽然在类囊体膜上也有叶绿素酶，但叶绿 素酶主要还是定位于叶绿体膜，在叶片衰老叶绿素降解时，需要新合成一种蛋白载 体，将类囊体色素复合物中的叶绿素转运到叶绿体膜上的降解位点( m a t i l ee ta 1 1 9 9 7 ) 。 有研究显示，叶绿体的被膜片段中也存在叶绿素酶的活性( b r a n d i se ta 1 ，1 9 9 6 ； m a t i l ee ta 1 ，1 9 9 7 ) 。发现在硅藻p t r i c o m u t u m 中叶绿素酶是一种糖蛋i 兰t ( t e r p s t r a , 1 9 8 1 ) ，表明在内质网存在一种修饰( 糖基化) ( t o t 肌e t a l ，1 9 9 9 ) 。 关于叶绿素酶与叶绿素降解的关系，有研究表明，叶片衰老过程中伴随着叶绿 素酶活性提高，叶绿素降解加剧，但也有研究发现叶绿素酶活性的变化在不同植物 上表现不同，叶绿素酶活性的提高与叶绿素含量的下降并不完全一致( 甘志军和王 晓云，2 0 0 2 ) 。 另外，在一些植物的幼嫩组织中也发现了叶绿素酶的活性( m c f e e t e r se ta 1 ，1 9 7 1 ； o g u r a1 9 7 2 ；k u r o k ie ta 1 ，1 9 8 1 ；t a n a k ae ta 1 ，1 9 8 2 ) 。有报道说叶绿素酶可能跟叶绿素 合成有关( m i n g u e z - m o s q u e r aa n dg a l l a r d o - g u e r r e r o ，1 9 9 6 ) ，而且叶绿素酶不仅催化 茶树叶绿素酶的分离纯化和性质的初步研究 水解过程，而且在体外还催化酯化和酯交换反应( s h i m i z ua n dt a m a k i ，1 9 6 3 ； e l l s w o r t h ，1 9 7 1 ) 。 在茶叶加工过程中，有报道指出经过蒸青加工过程之后的茶叶还有一定的叶绿 素酶活性，剩余的活性为鲜叶中叶绿素酶活性的1 2 0 ( k a t s u n o r ik o h a t a , e ta 1 ， 1 9 9 8 ) 。 研究证明，叶绿素酶是一种潜伏态酶，它在叶片衰老过程中仍可处于潜伏态， 这种潜伏态也许就是叶绿素酶与其底物叶绿素在空间位置上的隔离造成的 ( m i n g u e ze ta 1 ，1 9 9 6 ) 。 用乙烯处理后，柑橘果皮中叶绿素酶活性可以提高2 5 4 0 倍( k r h i r s c h f e l d a n de e g o l d s c h m i d t 19 8 3 ) 。 关于叶绿素酶在植物体内的作用，有报道提出，叶绿素酶保护植物组织在植物 防御调节途径中不受氧化损伤( t a i j a ，e t a l ，2 0 0 5 ) 。 3 叶绿素酶的分离纯化的研究进展 3 1 茶树叶绿素酶的分离纯化的研究进展 在茶树中，日本研究学者曾经运用鲜叶一粗酶液一透析一硫酸铵沉淀的方法得 到简单纯化的可溶性叶绿素酶，而后用s d s 处理，丙酮沉淀和透析的方法得到了不 溶性的叶绿素酶。并且研究了p h 、温度、丙酮浓度和叶绿素a 浓度以及加热等对 于叶绿素酶活性的影响，结果显示，可溶性叶绿素酶对于p c m b 、脂肪酶以及热处 理有更高的抗性。两种酶的最适温度不同，但是最适p h 相同，k m 值也相同。在 3 0 和5 0 的丙酮中反应k m 值均为( 7 “m ) 。因此，虽然可溶性和不可溶性叶绿素 酶的定位和提取方法不同，但在茶树叶片中的叶绿素酶可以归于同一种酶( n a g a o o g u r a , 1 9 7 2 ) 。 1 9 8 0 年日本学者从薮北种嫩芽中通过硫酸铵沉淀以及s e p h a d e xg 。2 0 0 和 s e p h a r o s ec l - 6 b 凝胶过滤的方法得到纯化1 6 0 倍的可溶性叶绿素酶，通过 s d s p a g e 电泳检测显示出两个条带，比活力为每m g 蛋白质每m i n 水解2 6 9 m o l 叶绿素。通过s e p h a r o s ec l - 6 b 测得分子量为9 1 0 ，0 0 0 m r 和3 5 0 ，0 0 0 m r ，显示为高 分子聚集体。通过s d s p a g e 测得亚基分子量为3 8 ，0 0 0 m r 。等电点为3 9 。在乙 酸缓冲液中最适p h 为5 5 ，对于叶绿素a 的k m 值为1 0 0 m 。研究表明，该酶既不 需要巯基物质，也不需要金属离子如m g + 的参与( m i o k ok u r o k ie ta 1 ，1 9 8 1 ) 。 3 2 其他植物中叶绿素酶的分离纯化的研究进展 由于叶绿素酶的来源不同，性质差异也较大，因此，不同的植物中分离纯化叶 绿素酶的方法也有一定的差别。 已经从一些高等植物和藻类中分离出纯化的叶绿素酶，同时叶绿素酶的一些性 4 华中农业人学2 0 0 9 届硕士学位论文 质也得到了研究，这些植物包括包括甜菜叶片( b a c o na n dh o l d c n ，1 9 7 0 ) ，茶树幼叶 ( k u r o k ie ta l ，1 9 8 1 ) ，绿色黑麦种子( t a n a k ae ta 1 ，1 9 8 2 ) ，柑橘果皮( s h i m o k a w a , 1 9 8 2 ； t r e b i t s he ta 1 ，1 9 9 3 ) d x 球藻( t a m a ie ta l ，1 9 7 9 ) 和三角褐指藻( k h a l y f ac ta 1 ，1 9 9 5 ) 藜 ( t o h r ut e ta 1 。1 9 9 7 ) 等。从不同的植物中纯化后的叶绿素酶的分子量从2 7 k d a 到 6 5 k d a 不等，最适p h 也各不相同。研究表明大多数植物叶绿素酶是酸性蛋白质 ( t o h mt e ta l ，1 9 9 7 ) 。 在一些植物中用丙酮和硫酸铵沉淀法纯化叶绿素酶时发现，3 0 、3 5 丙酮和 6 0 、7 5 硫酸铵沉淀组分叶绿素酶活性较高。f e r n a n d e z 等( 1 9 9 2 ) 以铁盐胁迫的 柑桔( c i t r u sl i m o n ) 为试材经4 0 6 0 硫酸铵沉淀、透析、葡聚糖g 1 0 0 凝胶过滤 等处理后得到了纯化8 6 倍的叶绿素酶，经聚丙烯酰胺葡聚糖s - 2 0 0 凝胶过滤测定 其分子量是1 5 8 k d a ( g a r c i a e t a l ，1 9 9 1 ) 。从藜( c h e n p o p d i u ma l b u m ) 叶片中分离的叶 绿素酶经过疏水层析、伴刀豆球蛋白a ( c o n a ) 琼脂糖凝胶层析、肝素亲和层析、 m o n o q 离子交换层析、硅胶过滤层析等进行纯化，得到的酶经过琼脂糖c l - 6 b 凝 胶过滤测得其分子量是3 7 6 k d a ，其中利用伴刀豆球蛋白a 琼脂糖凝胶层析和硅胶 过滤层析的纯化效率较高( t o h r ue ta 1 ，1 9 9 7 ) 。从乙烯( e t h ) 处理的柑橘 ( c i t r u s s i n e n s i sl ) 果皮中制备的叶绿素酶经过凝胶过滤、疏水层析和制备性 s d s p a g e 后可纯化4 0 0 倍并且均一性良好( t r e b i t s h ，1 9 9 3 ) 。 从银杏叶片中提取的叶绿素酶粗酶液经过有机溶剂沉淀、d e a e 纤维素凝胶柱 层析、制备型聚丙烯酰胺凝胶电泳纯化等步骤，纯化后的叶绿素酶经过s d s p a g e 检测为单一条带，分子量为2 7 k d a ( 周凤丽，2 0 0 8 ) 。 现在，通过体外研究已经比较详细地了解了叶绿素酶的催化特性，比如动力学 参数、p h 值与温度的影响等。由于叶绿素酶是一种膜蛋白，因此该酶的测活体系 与一般的酶有所不同：在有有机溶剂或去垢剂存在时，叶绿素酶在室温时即可表现 活性，而在以水为微环境的反应体系中，其表现活性的温度较高( 6 5 7 5 ) 。大多 数植物的叶绿素酶在微碱性( 7 5 8 o ) 环境中催化活性高，研究表明橄榄( o l e a e u r o p a e al ) 叶绿素酶的最适p h 值是8 5 ( m i s a b e lm i n g u e z m o s q u e r ae ta 1 ，1 9 9 4 ) ， 柑桔( c i t r u sl i m o n ) 叶片绿素酶最适p h 值是7 8 ( h i r s c h f e l de ta l ，1 9 8 3 ) 。对叶绿素酶 的k m 、v r 呱值的研究表明，不同物种来源的叶绿素酶的k m 值的范围是3 1 - - , 2 7 8 1 t m o l l ，以叶绿素b 为底物，叶绿素酶的k m 值比以叶绿素a 为底物时的k m 值小， 这表明叶绿素酶对叶绿素b 的亲合性较高，而以脱镁叶绿素a ( p h e o p h y t i na ) 为底 物时，叶绿素酶催化其反应的速率比以脱镁叶绿素b ( p h e o p h y t i nb ) 为底物快 ( m i n g u f z - m o s q u e r a , e ta 1 ，19 9 4 ) 。 4 叶绿素酶同工酶 利用藜成熟叶片中分离的叶绿素酶进行m o n oq 离子交换层析后发现，叶绿素 茶树叶绿素酶的分离纯化和性质的初步研究 酶分成两高一低三个活性不同的组分，其中两个高活性组分进一步纯化后经 s d s p a g e 测得其分子量分别为4 1 3 k d a 与4 0 2 k d a ，而其最适p h 、k m 值相同， n 一端氨基酸序列也基本相同，仅第1 0 个氨基酸残基侧链有差异，因此认为藜叶片 中至少存在两种叶绿素同工酶即类型1 叶绿素酶( t y p e1c h l a s e ) 和类型2 叶绿素 酶( t y p e 2c h l a s e ) ( t o h r ue ta 1 ，1 9 9 7 ) 。 唐蕾比较了银杏叶绿素酶春秋季活性的变化，推测秋季银杏叶中可能有2 种叶 绿素酶同工酶存在，而春季只有一种。并且春季酶参与叶绿素的合成，秋季活性下 降，导致总活性下降；另外一种同工酶催化叶绿素的降解，秋季活性上升。说明， 可能由于同工酶的存在，从而促成了叶绿素合成的降解和动态平衡( 唐蕾，2 0 0 2 ) 。 5 叶绿素酶基因的克隆研究 自从发现叶绿素酶之后，关于该酶的分离、纯化方法、酶学性质，以及内外因 子如植物激素、温度、金属离子等对酶活性的影响得到了广泛研究。尽管从各种不 同植物和藻类中多次提纯了叶绿素酶，并且得到了相应的抗体和n 端氨基酸序列 ( t r e b i t s h , 1 9 9 3 ；t s u c h i y a , 1 9 9 7 ) ，但全部的氨基酸序列、功能基因、调节和表达等 相关信息，直到1 9 9 9 年两个独立的研究小组相继克隆出叶绿素酶基因之前，在相 当长的一段时间里一直未能解决( t s u c h i y a e ta 1 1 9 9 9 ) 。 目前在许多植物中叶绿素酶已经成功得到克隆并测序( h t t p ：a u e x p a s y o r 9 0 ，比 如瓜栗( p a c h i r am a c r o c a r p a ) 叶绿素酶c h l o r o p h y l l a s e1 、c h l o r o p h y l l a s e2 ，花椰 菜( b r a s s i c ao l e r a c e a ) 叶绿素酶，烟草( n i c o t i a n at a b a c u m ) 叶绿素酶，大豆( g t y c n e m a x ) 叶绿素酶c h l o r o p h y l l a s e1 ，藜( c h e n o p o d i u ma l b u m ) 叶绿素酶c a c l h ，柑橘 叶绿素酶c h l a s e l ，柠檬( c f t r u sl i m o n ) 叶绿素酶，银杏( g i n k g ob i l o b a ) 叶绿 素酶等。 克隆出的叶绿素酶基因共有4 种并且均在大肠杆菌种表达成功，分别是藜叶绿 素酶c a c l h ( t o h r ue t a l ，1 9 9 7 ) 、柑橘叶绿素酶c h l a s e l ( t a m a r e t a l ，2 0 0 8 ) 和 拟南芥叶绿素酶a t c l h l 、a t c l h 2 ( t o h r ue ta 1 ，1 9 9 9 ) 。 序列比对发现，尽管他们的n 端氨基酸序列各部相同，同源区域仅占3 1 - - 4 2 ，但仍然有一些共同点，比如均有以丝氨酸为活性中心的脂肪酶保守区，这与叶 绿素酶的水解特性相一致。在所有被克隆的叶绿素酶种的n 端都有各自的转运肽， 而a t c l h l 却不具备这种转运肽。c a c l h 含有典型的内质网( e r ) 导向转运肽系列。 e r 被认为是蛋白质糖基化的主要场所，这与叶绿素酶被认为是糖蛋白，能够有效 被c o n a 亲和层析分离相一致( t s u c h i y a e t a l ，1 9 9 7 ) 。c h l a s e l 的转运肽由2 1 个氨基酸构成，由于c h l a s e ln 端序列与从叶绿体中分离得到的叶绿素酶n 端 序列相同，所以此转运肽被认为和叶绿素导向有关，但与经典的叶绿素转运肽相比 仍有定的差异。 6 华中农业大学2 0 0 9 届硕士学位论文 在分子水平上，近年来叶绿素酶的克隆和测序方面取得了一定的进展。通过对 于基因功能的研究，也验证了叶绿素酶的许多生理和生化的功能，同时，推测出叶 绿素酶至少有两个以上的同工酶。这些研究都为叶绿素酶功能进一步揭示及应用奠 定了坚实的基础。 6 本课题研究的内容及意义 6 1 本课题研究的主要内容 本课题研究内容主要是： 1 茶树叶绿素酶的活性分析，包括酶的提取条件、活性测定条件的优化。茶 树不同品种、不同部位和鲜叶摊放过程，以及不同条件下叶绿素酶活性的变化。 2 茶树叶绿素酶的分离纯化及叶绿素酶动力学性质的初步研究。 6 2 本课题研究的目的和意义 叶绿素酶的分离纯化及性质研究在很多