（有机化学专业论文）几种基于苝系衍生物的有机自由基的合成与性质研究.pdf

山东师范大学硕士学位论文 摘要 花系衍生物具有优异的光、热和化学稳定性，对从可见区到红外区的光有很强 的吸收，是一类性能特异的分子电子学材料，在激光材料、荧光探针分子、液晶显 示材料、电致发光器件、场效应晶体管及太阳能电池等方面有着广泛的应用，对它 们的发光性质及其他光物理性质的研究一直以来都是异常活跃的课题。本文设计并 合成了一系列新颖的基于花的荧光探针，并对其光物理性质和磁性质作了研究。论 文主要包括以下内容： 第一章：概述了茈系衍生物的合成、性质及应用研究；自由基的产生、危害及 检测方法；分子荧光探针的合成与检测机理；f e ( h i ) 和c u ( i i ) 的分子荧光探针的发 展研究；将高荧光量子产率的3 ，4 ：9 ，1 0 茈四羧酸二酐设计并修饰成带稳定氮氧 自由基的新颖的荧光开关。 第二章：我们设计并合成了一系列新颖的基于茈的含氮氧自由基的荧光探针， 研究了茈二酰亚胺在连接氮氧自由基前后的紫外可见吸收、荧光和e s r 的变化， 对其与不同金属离子之间的作用比较和分析。研究表明，高荧光量子效率的花二酰 亚胺衍生物可以通过光诱导电子转移效应被共价联接的氮氧自由基有效淬灭，可以 在具有电子受体作用的金属离子、活性氢或羟自由基存在下破坏氮氧自由基而使荧 光团的荧光恢复。 第三章：设计合成了两种连有吡嗪腙基团的花二酰亚胺的衍生物，都具有高的 荧光量子产率，可以和多种金属离子发生配位作用并导致荧光淬灭。对其与不同金 属离子之间的作用的紫外一可见吸收和荧光光谱进行比较和分析。其中二吡嗪腙茈 二酰亚胺是对二价铜离子具有良好的识别作用的荧光探针并对其作用机理进行了 探讨。 第四章：我们设计合成了几种含有8 一羟基喹啉，苯并冠醚希夫碱等不同官能团 的芄二酰亚胺衍生物，并研究了二喹啉花二酰亚胺与金属离子作用的紫外可见系 数和荧光光谱的变化，多种金属离子与二喹啉茈二酰亚胺作用显著，其中以二价铜 离子的反应最明显。研究发现多种金属离子可以使其荧光有不同程度的淬灭，其中 二价铜离子的淬灭效率最高。 山东师范大学硕士学位论文 h 关键词：茈；自由基；荧光探针；f e ( i i i ) ，c u ( i i ) 分类号：0 6 2 1 3 山东师范大学硕士学位论文 a b s t r a c t a sa ni m p o r t a n tc l a s so ff u n c t i o n a lm a t e r i a l s ，p e r y l e n eb i s i m i d ed e r i v a t i v ep o s s e s s m a n ya d v a n t a g e so fs t a b l es t r u c t u r e ，o u s t a n d i n gp h o t o e l e c t r o np r o p e r t i e s ，h i g ht h e r m a l s t a b i l i t ya n de x h i b i tw i d ea b s o r p t i o na n de m i s s i o nb a n d si nt h ev i s i b l e ，w h i c hc a nb e w i d e l yu s e di nl a s e rm a t e r i a l ，f l u o r e s c e n c ep r o b e ，l i q u i dc r y s t a lm a t e r i a l ，o r g a n i cs o l i d s t a t ep h o t o v o l t a i cd e v i c e ，o r g a n i cm i n f i l mf i e l d e f f e c tt r a n s i s t o r , o r g a n i cs o l a rc e l la n d s oo n i nt h i sp a p e r , as e r i e so fn o v e lf l u o r e s c e n c ep r o b ea n do r g a n i cm a g n e t sw h i c h b a s e do n p e r y l e n eb i s i m i d e s ，h a v e b e e nd e s i g n e da n ds y n t h e s i z e d ，a n dt h e i r p h o t o e l e c t r o np r o p e r t i e sa n dm a g n e t i cp r o p e r t i e sh a v e b e e ns t u d i e d f o u rc h a p t e r sw e r e i n c l u d e di np r e s e n tt h e s i s c h a p t e rl ：t h es y n t h e s i s ，p r o p e r t i e sa n da p p l i c a t i o n so ft h ep e r y l e n eb i s i m i d e d e r i v a t i v e sh a v eb e e nr e v i e w e d t h ed e t e c t i o nm e t h o d so ff r e er a d i c a l sa n df e ( i i i ) ， c u ( i i ) h a v ea l s ob e e nr e v i e w e d t h et h e s i sa i m st ot h ed e s i g no ff l u o r e s c e n tp r o b e s b a s e do np e r y l e n eb i s i m i d e s c h a p t e r2 ：as e r i e so fn o v e lf l u o r e s c e n c ep r o b e sw h i c hb a s e do np e r y l e n e b i s i m i d e s ，h a v eb e e ns y n t h e s i z e di ng o o dy i e l d si nc h a p t e r2 t h ec o m p o u n d sw e r e s t u d i e di nd e t a i l e dw i t hs t e a d y - s t a t es p e c t r o s c o p y , d y n a m i c s t a t es p e c t r o s c o p ya n de s r s p e c t r u m c o m p o u n d7w a s an o v e lf l u o r e s c e n c ep r o b ef o rt h ed e t e r m i n a t i o no ff e ( i i i ) i nc h e m i c a ls y s t e m i tw a sd e s i g n e db yi n c o r p o r a t i n gt h en i t r o x i d et op e r y l e n ei m i d e ， w h i c hw a sp r o v e dt ob eh i g hs e n s i t i v ea n ds e l e c t i v e f e a t u r e di ns t r o n gf l u o r e s c e n c e a b o v e5 0 0i m lt h eh i g hf l u o r e s c e n c ec a nb eq u e n c h e db yn i t r o x i d et h r o u g hap e t m e c h a n i s ma n dr e c o v e r e dr a p i d l yb yt r a p p i n gf e ( 1 1 1 ) ，h y d r o x y lr a d i c a lo ra s c o r b i ca c i d c h a p t e r3 ：t w ot y p e so fp e r y l e n ei m i d ed e r i v a t i v e sc o n t a i n i n g4 - ( 1 一( q u i n o x a l i n 一2 y 1 ) p r o p y l i d e n e h y d r a z o n o m e t h y l p h e n o l s u b s t i t u e n t sw e r e s y n t h e s i z e d t h eh i 曲 f l u o r e s c e n tp e r y l e n ei m i d ed e r i v a t i v e sc a nb eq u e n c h e db yc o o r d i n a t i n gs e v e r a lm e t a l i o n s a m o n gt h a t ，c o m p o u n d ( 9 ) d e m o n s t r a t e ds e n s i t i v i t yt ot h ec u ( i i ) t h em e c h a n i s m w a sr e s e a r c h e da n dan o v e lp r o b ef o rt h ec u ( i i ) w a sd e s i g n e d c h a p t e r4 ：s e v e r a lt y p e so fp e r y l e n ei m i d ed e r i v a t i v e sc o n t a i n i n g8 - h y d r o q u i n o l i n e 山东师范大学硕士学位论文 s u b s t i t u e n t sw e r es y n t h e s i z e d t h eh i g hf l u o r e s c e n tp e r y l e n ei m i d ed e r i v a t i v e sc a l lb e q u e n c h e db yc o o r d i n a t i n gs e v e r a lm e t a li o n s a m o n gt h a t ，c o m p o u n d ( 1 1 ) d e m o n s t r a t e d s e n s i t i v i t yt ot h ec u ( i i ) t h em e c h a n i s mw a sr e s e a r c h e da n dan o v e lp r o b ef o r t h ec u ( i i ) w a s d e s i g n e d k e y w o r d s ：p e r y l e n ed e r i v a t i v e ，f l u o r e s c e n c es w i t c h ，f l e er a d i c a l ，f e ( i i i ) ，c u ( i i ) c a t e g o r yn u m b e r ：0 6 2 1 3 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人 已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得( 注：如没有其 他需要特别声明的，本栏可空) 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。与我 一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢 意。 学位论文作者签名： 稀板 翮签步 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解堂拉有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并 向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授 权堂撞可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用 本授权书) 肖坟 导师签字： 签字脯：2 0 0 9 稿月7 日 徐旧 锄 刁 到 阳 辎 寸 钙 年 文 帕 泛 加 位 乳 剿 醐 山东师范大学硕士学位论文 1 1 有关茈的简介 第一章前言弟一早刖百 1 1 1概述 3 ，4 ：9 ，1 0 芄四羧酸二酐及其衍生物具有优异的光、热和化学稳定性，对从 可见区到红外区的光有很强的吸收，是一类性能特异的化合物。在激光材料、生物 荧光探针分子、液晶显示材料、电致发光器件、感光体、场效应晶体管1 ，2 、分子电 子学3 5 、太阳能电池6 ，7 、发光二极管8 ，9 ，电子照相技术( 静电复印的光感受器) 1 0 ， 荧光集电极和激光器1 等方面都有很广泛的应用。同时一些包含茈核的自然产品己 经被研究应用于抗病毒剂和细胞抑制剂1 2 ，1 3 等方面。花四羧酸二酰亚胺类化合物是 一类荧光性很强的化合物，荧光量子产率非常高( 接近于1 ) 的原因是茈分子内的极大 的电子共轭度和分子共平面度。因此茈类衍生物是良好的荧光团。 花四羧酸二酰亚胺母体分子( p d i ) 可以看作两个萘分子单元的组合，每一个 萘分子单元连着一个酰亚胺单元，通过s p 2 杂化轨道键合形成一个大的平面芳香体 系，分子结构如图1 1 。p d i 被认为是一个封闭的发色团，荧光量子产率几乎是定量 的，且产率和寿命性质非常稳定。p d i 是一个大的缺电子体系，非常容易被还原， 而难以被氧化，这就是其具有高度稳定性的一个先决条件。 图1 1p d i 的分子结构 茈系衍生物无论在学术研究领域还是在染料颜料等工业应用领域都引起了人 们的广泛兴趣。由于其良好的光、热、化学稳定性以及其着色牢固性，并且通过不 同的化学修饰可以得到红、紫罗兰甚至黑色等各种颜色，1 9 5 0 年即被应用于汽车颜 料领域，1 5 。经过化学修饰后的花酰亚胺类化合物的溶解性能得到了很大程度的提 高，从此这类化合物所具有的一些光电化学方面的优异性能得到了空前的发展，并 山东师范大学硕士学位论文 在各种各样的领域内都有良好的应用。以下的内容就是近年来茈类化合物经不完全 修饰后所取得的在合成、性质及应用等方面的一些有代表性的研究成果。 1 1 2 菲系衍生物的合成研究近况 因为3 ，4 ：9 ，1 0 一芄四羧酸二酐( 简称花酐) 是一个大的平面芳香体系，具有 稳定的共平面结构，冗嘎作用很强具有较大的晶格能，所以其溶解性很差。3 ，4 ：9 ，1 0 茈四羧酸二酐的分子结构及其碳原子的位置编号如下： 56 7s 图1 23 ，4 ：9 ，1 0 芄四羧酸二酐的分子结构及其碳原子的位置编号 现今被研究者们经常采取的增加芄四羧酸二酐溶解性的方式一般有两种：其一 是在茈四羧酸二酰亚胺( p d i ) 的氮原子上引入增溶性的基团，l a n g h a l s 教授的经 典做法1 6 。l a n g h a l s 教授在花四羧酸二酐上引入增溶性的基团的经典做法是：以喹 啉、咪唑或吡啶为溶剂，以醋酸锌为催化剂，菲四羧酸二酐和伯胺，在惰性气体的 保护下回流。对于活泼的脂肪胺，茈四羧酸二酐的酰胺化的条件比较温和，以吡啶 为溶剂即可。但对于反应活性差的芳香胺，茈四羧酸二酐的酰胺化的条件相对苛刻 一些，一般以高沸点的喹啉为溶剂；其二是在1 ，7 或l ，6 ，7 ，1 2 位入增溶性的取 代基，先将1 ，7 或l ，6 ，7 ，1 2 位卤化，再对卤原子进行亲核取代，将苯氧基引入 到茈四羧酸二酰亚胺上，s e y b o l d 教授首次提出的方法1 7 。s e y b o l d 教授首次提出 在茈四羧酸二酐和花四羧酸二酰亚胺的1 ，7 或l ，6 ，7 ，1 2 位上引入增溶性取代基 团的方法：首先将3 ，4 ：9 ，1 0 花四羧酸二酐的l ，7 或1 ，6 ，7 ，1 2 位进行卤化得 到卤化的3 ，4 ：9 ，1 0 花四羧酸二酰亚胺，再用含增溶性基团的化合物与卤化的3 ， 4 ：9 ，1 0 茈四羧酸二酰亚胺发生亲核取代反应生成二或四取代的3 ，4 ：9 ，1 0 茈四 羧酸二酰亚胺。后来研究者发现对芄四羧酸二酐进行溴化可以得n - 溴代的衍生物 1 8 ，继续反应可得n - - 取代的茈系衍生物1 8 - 2 1 。还可以在a i l i h 4 ，b f 3 一t h f 等还原 剂的作用下，茈四羧酸二酰亚胺的羧基还原成相应的亚甲基，经进一步脱氢生成 2 山东师范大学硕士学位论文 d i a z o a r o m t i c 盐2 2 。花四羧酸二酰亚胺还可以作为聚酰胺的单体与一些聚合物单体 发生缩聚反应，如花四羧酸二酐与对二苯胺缩合生成茈聚酰胺2 3 ；茈四羧酸先与水 合肼反应，随后与邻苯二甲酸类化合物缩合生成聚酰胺2 4 , 2 5 及在芄的1 ，6 ，7 ，1 2 位带有苯氧醛的聚酰胺的合成2 6 。关于花聚酰亚胺聚合物( 简称p t c ) ，w a n g 等人 2 7 报道了用脂肪二胺合成含茈聚酰亚胺和含芄共聚酰亚胺，并研究了与电子给体化 合物小分子构成的双层结构膜感光体在电子照相方面的性质。其中l ，6 ，7 ，1 2 位 上有取代基存在时溶解性较好。修饰后的p d i 的分子结构及其碳原子的位置编号如 下： r 5 图1 2 修饰后的p d i 的分子结构及其碳原子的位置编号 研究者们将3 ，4 ：9 ，1 0 芤四羧酸二酐的1 ，7 位或1 ，6 ，7 ，1 2 位卤化，随后 与一级胺反应生成卤化的3 ，4 ：9 ，1 0 茈四羧酸二酰亚胺，再进一步取代得到各种 各样的衍生物，如将酚基2 8 、烷氧基2 9 、氰基3 0 ，3 1 等亲核试剂连接到芄核上，并得到 了奇妙的光学和电化学特征。目前，对花二酰亚胺1 ，7 位进行修饰已经十分成熟， 主要是通过l ，7 位溴化后取代，溴化最常用的是菲四羧酸二酐硫酸法直接溴化。对 3 ，4 ：9 ，1 0 芄四羧酸二酐的一些常规修饰如下( 图1 3 ) ： 图1 3 对3 ，4 ：9 ，1 0 芄四羧酸二酐的一些常规修饰 矗 轴t * - c t 心 k 刖c 地 c 捧叫吲 c 耳轴嘲l c ，啪懈，i hc 3 叶_ 叫 hc l d o 哺叫 r - - c , 。 l c d 时目 r t 以，批 3 曼 尊一黔譬窀 协钯 能 h o，_o 山东师范大学硕士学位论文 1 1 3 菲系衍生物的结构性质 a b c o 、 13 卫! - i 1 4 1 ， o 墨瓤1 飞3 9 兰叠瓤飞兰 忝劣4 2 图1 - 4a 花酰亚胺的化学式；ba m i 计算的四取代苯氧基的结构；c 四取代苯氧基的单晶结 构 茈系衍生物具有良好的平面兀体系。已有单晶结构来证实3 2 - 3 6 。其结构可以看作 两个萘环通过两个c cs p 2 单键连接起来，这样如果在“b a y 区域”引入取代基团则 必然会引起两个萘环的扭曲，也已有单晶结构来证明。四氯取代的芄酰亚胺的扭曲 角度为3 7 0 3 7 ，苯氧基取代的达到了4 0 0 3 8 ( 图1 4 ) 。这种扭曲角度就可以有效的防 止花系物质的聚集，从而我们可以通过此种办法来改善茈系衍生物质的溶解性。 1 1 4 菲系衍生物的光物理性质 大多数分子在室温时均处在基态的最低振动能级，当分子被光线照射时，该物 质的分子吸收了和它所具有的特征频率相一致的光线，而由原来的能级跃迁至第一 电子激发态或第二电子激发态的各个不同振动能级以及各个不同震动能级，分子在 吸收了光而被激发至第一或以上的电子激发态的各个振动能级之后，在很短暂的时 4 山东师范大学硕士学位论文 间内急剧降落至第一电子激发态的最低振动能级，在这一过程中它们和同类分子或 其他分子撞击而以热的形式消耗了相当于这些能级之间的能量，因而不发出光。由 第一电子激发态的最低振动能级继续往下降落至基态的各个不同振动能级时，则以 光的形式发出，所发出的光即是荧光( 图1 5 ) 。 l 工 32 吸吸 无辐射跃迁4 光光 l 1 i 1 吸 荧光5 光 3 2甚 1 态 v = o 图1 5 吸收光谱和荧光光谱能级跃迁示意图 茈系衍生物分子具有复杂的化学结构，因此具有不同的能级。茈分子在3 5 0 6 0 0 n n l 之间有三个典型的吸收谱带，分别在4 2 0n n l ，4 8 0n m 矛n s l on l l l 左右。由于其振 动能级的形式较为复杂，在它们的吸收光谱中一般呈现两个大范围的吸收带：一是 由基态至第一电子激发态各个不同振动能级的跃迁，呈现一个宽阔的吸收带；二是 由基态至第二电子激发态各个振动的跃迁则呈现另一个宽阔而波长较短的吸收带。 由此可见，分子能够产生荧光必须具备的以下条件：一、- 兀木跃迁类型有利于 发射荧光；二、发光分子中要具有共轭键体系；三、分子具有刚性结构平面。许 多物质会吸收光但并不发生荧光。显然有机化合物的结构与它们的荧光有密切关 系。荧光通常随着于分子结构刚性和平面共轭性的增强，荧光效率也将增大。它们 的荧光光谱也将移向长的波长方向。分子共平面性越大，也就是电子共轭度越大， 其有效的电子非定域性越大。任何有利于提高电子共轭度的结构改变都将提高荧光 效率，或使荧光波长红移。茈系分子的电子共轭度和共平面度极大，因此具有很高 5 第二电子激发态 第一电子激发态 32，伽 32，伽 m 东师范太m 上学位论史 的荧光效率。托系衍生物是一类荧光性很强的化合物，荧光量子产率非常高( 接近 于1 ) 。 图16j 酰胺的h o m o ( 上) l u m o ( 下) 的轨道罔 由于酰亚胺基团上n 原子的h o m o 和l u m o 上产生了结点”( 如图i 一6 所示j 所以在酰亚胺区域引入取代基傲不会影响j t 系衍生物的光物理性质。菲系衍生物 的花核是一个封闭的发色团，存在s 。_ + s 。的跃迁。随着酰亚胺取代基的改变，跃 迁的强度和位置都不发生改变”。然而如果在“b a y 区域”引入取代基团，不仅会 增大芤系衍生物的溶解性，同时也会改变其光物理性质。如果想要在保持芤系衍生 物光物理性质的同时增大其溶解性的话一般采取的手段就是在酰亚胺区域引入能 够增加溶解性的基团，像l a n g h a l s 发现的燕尾型的取代基团极大地增大了j e 系衍生 物的溶解性4 1 。我们采取的办法一般是引入环己基，效果也很好，而且台成也方僵。 还有引入些长链的烷烃也可以达到这个目的4 2 。但是在酰亚胺部分引入了供电子 的基团之后，会发生光诱导的电子转移使荧光淬灭，已有文献报道在酰亚胜区域引 入烷氧基苯后，荧光量子产率降低到了5 以下。这是因为发生了从供电子的 取代基团到菲环平面的电子转移，从而使得荧光量子产率降低。如果在“b a y 区域 m 东师范大学硕士学位论文 引入供电子基团，则发生取代基和菲环之间的电荷转移从而更明显的影响光物理性 质，同时导致荧光量子产率的降低，如果引入的是吸电子基团，则光物理性质几乎 不受影响，并且荧光量子产率也不会出现降低。 菲系衍生物的红外吸收光谱会随n 取代基的不同表现出一定的差别。而茈核本 身的特征吸收是不变的，vc h 伸缩振动在2 9 9 5e m 而”c 田。伸缩振动在1 6 9 7g n l 1 和1 6 5 8e m 14 5 此外，花酰亚胺单酐还在1 7 6 5c m ，1 7 2 5 啪。1 表现出酸酐的特征振 动“7 。 1 1 5 m 聚集性质 托及其衍生物分子问存在着强烈的一堆积，在溶液中的饥堆积吉布斯聚合能 的太小能准确计算4 8 ，人们为其选择性的增加了酰亚胺基团后减小了分子间的聚 合常数，增加了其在非极性溶液中的溶解性。研究者研宄了其基于浓度递变可见光 谱，发现在聚集后，所有菲系衍生物都发生了显著的光谱变化( 图1 7 ) 。 a， 巴二 4 d o4 5 05 5 5 08 0 06 5 0 ，m 图1 7 菲系衍生物基于浓度递变的紫外可见光谱 研究还发现当花平面侧面有取代基而扭曲了分子的体系平面”，小堆积的能 量变小，且取代基越多 e - t t 堆积的能量越小。卅堆积的能量的大小还与溶剂有关 在极性越太的芳香性溶剂以及具有偶极的溶剂中- 摊积的能量越小。对于“j 类型 堆积的聚集体，在聚集状态时，荧光强度不会减小。但因富电子的酰亚胺取代基的 7 0 8：2口b 6 2 0 一euj，o= m 东师范大学顶学位论女 原因，它们的荧光量子产率却会减小，因此在光致电子转移过程中它可用于电子给 体( 图1 8 ) 。 4 | y 。- ， 图l - 8p d i 的j 型堆集 菲系衍生物分子在溶液中平面间在径向和纬向上也有一定的平移，它们间的排 列为一维柱状排列，两端的氨基取代链不影响分子间的聚集，影响分子间聚集的是 茈平面上发色团取代基之间的作用。在酒精和水等菲及其衍生物的不良溶剂中菲及 其衍生物分子的卅堆积也很大，因为它们不能很好的溶解e 表面，“和j a n s s e n t 拘研 究组利用这一性质设计合成了具有折叠形貌的聚合物及膜4 9 。 1 2 自由基的研究进展 1 2 1 概述 自由基是生物活性氧之一，是具有未配对电子的原子、分子或离子。生物体 系活性氧及反应中间体是生物医学、分析化学等领域的重要研究对象。在生命活动 的代谢过程中不断产生各种自由基，其中具有代表性的有超氧阴离子自由基( 0 2 - , ) 、 羟基自由基( h o ) ，脂自由基( r o o ) 、一氧化氮( n o ) 、过氧亚硝基阴离子( o n o o ) 山东9 币范大学硕士学位论文 等，它们与生物体的衰老及许多疾病的发生都有重要关系5 0 。在正常情况下，机体 活性氧中间体的产生、利用、清除三者之间处于一种动态的生理平衡，以保持生命 活动所需要的低浓度水平。在此情况下，具有高活性的氧中间体不仅不会损伤机体， 而且还最大限度地直接或间接发挥对机体的有益生物效应，如解毒功能、吞噬细胞 杀菌作用、环核苷酸的合成和植物的光合作用等5 1 。如果生物体失去这个生理平衡， 自由基在生物体内就会产生危害，对物体内的各种大分子物质均有不同程度的损 害，例如破坏脂质、核酸与蛋白质。活性氧自由基对生物体的损伤作用虽然已经逐 步获得公认，在2 0 世纪受到了极大关注5 2 ，然而，由于生物体内活性自由基的寿命 非常短，导致通常情况下稳态浓度极低，而短寿命和低浓度意味着自由基的测定异 常困难，特别是在生物活体内( i nv i v o ) 与直接原位( i ns i t u ) 的检测目前尚未有突 破有s e t s u k i n a i 5 3 等合成了一种选择性极高的测定h o 的新型荧光探针，这种荧光探 针能够与h o 发生特异性反应，而不与超氧阴离子自由基、双氧水、单线态氧等其 它非自由基活性氧反应，但不能应用于生物体系。国内厦门大学的杨小峰、郭祥群 基于无荧光的顺磁性荧光分子氮氧自由基复合物与自由基作用后，变成抗磁性物 质，荧光恢复这一原理，设计合成了哌啶类氮氧自由基自旋标记荧光探针5 4 5 5 ，用 荧光法测定了f e n t o n 反应产生的h o 自由基。华东师范大学的金利通、鲜跃仲等研 制出一系列n o 自由基微型传感器，用电化学方法对生物体内的n o 自由基进行实 时、在体分析5 6 - 5 8 。另外生物体内还存在着预防自由基损伤的内在抗氧化防护体系5 9 ， 因而至今为止人们尚无法直接动态观测到某些器官中活性自由基的产生，对它们的 生成机制，生理作用及其动态损伤生物机体的过程都缺乏足够的认识和充分的实验 证据，因此，针对动、植物生物活体内自由基开创新的分析与检测技术是具有挑战 性的前沿课题之一。 1 2 2 自由基的淬灭 活性氧自由基对生物体的损伤作用虽然已经逐步获得公认，在2 0 世纪受到了极大 关注6 0 ，然而，由于生物体内活性自由基的寿命非常短，导致通常情况下稳态浓度 极低，而短寿命和低浓度意味着自由基的测定异常困难，自由基的淬灭也称为自由 基的失活，即破坏自由基上所含的单电子。当今常用的方法一般有：一、自由基与 更活泼的自由基( 如羟基自由基) 结合，两个顺磁性的物质结合就变成抗磁性的物 质。各种自由基中，羟自由基( o h ) 是一种氧化能力很强的自由基，它能够很容易 9 山东师范大学硕士学位论文 地氧化各种有机物和无机物，氧化效率高，反应速率快，是造成组织脂质过氧化、 核酸断裂、蛋白质和多糖分解的活性氧，与机体的衰老、肿瘤、辐射损伤和细胞吞 噬有关。由于o h 的反应活性大、寿命短、存在浓度低，所以关于o h 的检测方 法就显得特别重要。通常认为体内羟基自由基是通过f e n t o n 型反应由亚铁离子和 过氧化氢反应产生的6 1 ：f e 2 + + h 2 0 f e 3 + + 。o h + o h ；二、与活泼氢( 如v c 上的 活泼氢) 相结合也会导致自由基失活，其e p r 信号减弱和荧光强度增大。维生素c 也 称为l 抗坏血酸，是一种水溶性的不饱和多羟基内酯类化合物，其分子内c2 和c 3 之间的烯醇式羟基上的氢原子容易解离下来与自由基结合，使自由基解除活力，其 生理功能是以抗氧化剂的形式清除自由基，保护机体免受内源性自由基的损伤6 2 - 6 4 。 v c 的分子式如下： h h o o o h【) h 图1 - 9v c 的分子结构 v c 与自由基反应保护了机体组织细胞，通过反应v c 自身也转变为脱氢v c 。适量浓 度的v c 以抗氧化剂的形式清除自由基，低浓度时可加速自由基反应过程己为许多实 验所证实6 5 - 6 7 ，高浓度就会破坏生物体内的自由基平衡显示了其不良的作用，因此 v c 的生理功能具有双重性，其生物效应与浓度密切相关。三、与具有电子能力的 电子受体相结合，女d f e 3 + 等。自由基上的单电子就会与金属离子受体相结合，从而 淬灭了自由基的活性。 1 2 3自由基的检测方法 自由基对生物体的损伤作用虽然已经逐步获得公认，然而生物体内活性自由基 的寿命非常短，稳态浓度极低，因此自由基的测定异常困难，目前经常试用的测定 自由基的方法，主要有电子自旋共振法( e s r ) 或电子顺磁共振法( e p r ) 6 8 ，6 9 、高效液 相色谱法( h p l c ) 7 0 、化学发光法7 l ，7 2 、分光光度法、荧光法7 3 ，7 4 、电化学方法7 5 刁7 等。e s r 是目前测定自由基比较可靠有效的方法，但生物样品的e s r 检测较困难。 其原因主要有三个：( 1 ) 生物样品中含有大量的水分，严重影响e s r 检测的灵敏 1 0 山东师范大学硕士学位论文 度。( 2 ) 由于e s r 检测需要较高浓度的捕获剂，这限制了它用于活体内自由基的检 测。( 3 ) e s r 的选择性低，用于活体检测时很难解释捕获到的是哪种自由基，而且 在生物体系中e s r 信号不稳定，随时间而降低7 8 。h p l c 能够同时检测多种自由基， 对具有不同加合位点的捕集加合物能够进行分离与检测，但它对捕获剂的要求较 高，不仅要求捕获剂能够捕获自由基，反应产物要有一定的稳定性，还要求产物便 于h p l c 的分离与检测。同时e s r 与h p l c 所需仪器昂贵，操作也较繁琐。分光 光度法操作简单，但灵敏度较低，化学发光法选择性较差，不适于低浓度的生物样 品的测定。荧光法灵敏度高，选择性好，用于自由基的测定具有明显的优势。 s e t s u k i n a i 7 9 等合成了一种选择性极高的测定h o 的新型荧光探针，这种荧光探针 能够与h o 发生特异性反应，而不与超氧阴离子自由基、双氧水、单线态氧等其它 活性氧反应，但不能应用于生物体系。国内厦门大学的杨小峰、郭祥群基于无荧光 的顺磁性荧光分子一氮氧自由基复合物与自由基作用后，变成抗磁性物质，荧光恢 复这一原理，设计合成了哌啶类氮氧自由基自旋标记荧光探针8 0 ，8 1 ，用荧光法测定 了f e n t o n 反应产生的h o 自由基。目前对自由基的测定，大多采用间接方法来研 究胁迫条件下生物体内自由基的变化与生物体损伤之间的关系，如采用测定s o d 等酶活性的方法，或者采用测定脂质过氧化产物的方法。这种间接方法不能测定出 生物体内的自由基含量变化。荧光法灵敏度高，选择性好，操作简单，用于自由基 的测定具有明显的优势。但目前有关此类探针的应用多集中于d n a 、蛋白质、核 酸等生物大分子上8 2 - 8 4 ，而将红外、近红外荧光探针用于自由基的识别检测分析还 未见报道，属于空白。因此设计合成红外、近红外荧光探针试剂用于生物体中自由 基的识别检测分析，具有诱人而广阔的应用前景和重要的科学意义。 1 3 荧光探针概述 荧光分子探针( f l u o r e s c e n tm o l e c u l a rp r o b e ) 是荧光分析法中经常使用的概念。一 般来说，凡是在一定体系内，当某种物质或体系的某一物理性质发生变化时，该分 子的荧光信号能发生相应的改变，这种分子就可称为某一物质或物理性质的荧光分 子探针。荧光分子探针在环境科学、化学和生物化学中的设计、应用与日俱增，占 有重要的地位。很多化学和生物化学领域的被分析物或物理性质都可以用荧光分析 法来检测，如有机污染物、重金属离子、毒性气体、湿度、p h 值等，其原因就在 山东师范大学硕士学位论文 于荧光分析法具有灵敏度高、取样量少以及可供选择的参数多而有利于提高方法的 选择性等优点。自然界广泛存在分子识别现象，特别是在生命过程中，分子识别起 着极其重要的作用。人们需要借助一定的技术手段通过探知伴随分子事件发生所产 生的物理信号，从而解分子间的变化。荧光作为传感信号具有很多优点：高灵敏性、 可实现开关、人与分子的通讯、对亚微粒具有可视的亚纳米空间分辨并且是亚毫秒 时间分辨的。人们已经积累了许多关于分子结构、超分子结构以及环境因素对分子 荧光影响的知识并在一定程度上揭示了其内在的规律。所以人们设计、合成了大量 的各种结构的荧光分子探针。 1 3 1 荧光探针的设计合成 分子荧光探针的主要有两个组成部分：分子识别基团和荧光团。 荧光分子探针中的荧光团是信号单元，通过给出荧光强度的变化，以及荧光峰 值波长的位移等信息来反映微观世界的分子识别作用。然而，尽管关于荧光分子探 针的研究工作较多。通常选择芳香族化合物做荧光分子探针的荧光发色团，以蒽8 5 - 8 9 、芘9 0 、萘9 1 - 9 4 、茈等稠环芳烃类都具有强而稳定的荧光。目前应用比较广泛的 并且实现生物应用的有荧光素和罗丹明为代表的荧光化合物9 5 ，9 6 和菁类荧光染料 9 7 。这些荧光团的特点是波长可调范围大，经过修饰可以进入近红外区，能有效避 开生物体系的背景荧光，提高探针的灵敏性和实用性可直接用于生体内的检测。吡 咯甲川类荧光团9 8 ，9 9 的特点是荧光量子产率高，可通过改变取代基来调节其波长范 围，不易受环境p h 的影响。1 8 一萘酰亚胺也是一类重要的荧光化合物1 0 0 ，10 1 ，特别 是4 位有强烈供电基团如氨基的衍生物都能够发射强荧光、光稳定性好、荧光发射 波长适中、斯托克斯位移大，也经常被用于荧光分子探针的合成。探索环境相容性 好、荧光量子产率高、稳定抗干扰能力强的新型荧光分子仍然是荧光探针研究领域 的一项重要课题。 识别基团即检测基团是为实现对目标物种的检测而合成的探针的结构单元之 一。对于阳离子识别，除少数荧光化合物本身所带的基团对离子具有识别能力外， 绝大多数荧光分子探针需要一个主要为结合客体而合成的识别基团。荧光分子探针 中常用的识别基团有冠醚1 0 2 、开链聚醚1 0 3 、多乙烯多胺、多羧甲基胺1 0 4 ，1 0 5 、环糊 精、杯芳烃1 0 6 、多肽1 0 7 ，吡啶1 0 8 1 1 0 等。 除上述的几种识别基团外，近年来以n i t 类衍生物作为荧光分子探针的识别基 1 2 山东师范大学硕士学位论文 团得到了广泛应用，用于各种金属离子的荧光分子探针中。近年来针对这类探针的 研究非常活跃，许多相关的荧光分子探针己成功地应用于清除活细胞体内的一氧化 氮自由基的研究中。 1 3 2 荧光探针的识别机理 光诱导电子转移1 1 1 ，1 1 2 ( p e t ，p h o t o i n d u c e de l e c t r o nt r a n s f e r ) ，在分子荧光探 针领域最成功也是最经常用到的识别机理理。典型的p e t 荧光探针体系是由具有电 子给予能力的荧光基 ( f l u o r o p h o r e ) ，连接基团( s p a c e r ) ，识别基( r e c e p t o r ) - - 部分 相连接构成。其中荧光团的作用是吸收光和发射荧光信号，其荧光发射强度与识别 基团的结合状态相关；识别基团的功能是结合客体并且将信息传递给荧光团。在 p e t 荧光探针中，荧光团与识别基团之间的识别信息与荧光信号之间的转化是靠光 诱导电子转移完成的。具有给电子能力的识别基团将其处于最高能级的电子转入激 发态，荧光团因电子激发而空出的电子轨道，使被光激发的电子无法直接跃迁回原 基态轨道发射荧光，就完成了荧光淬灭。当识别基团与客体结合后，就降低了识别 基团的给电子能力，p e t 过程被中断，荧光团荧光就得以恢复，因此这类探针也被 称为分子荧光开关( 图1 1 0 ) 。 + l u l el i l h o i e x c e e da c c e p t o rd o n o r h o j 斗h 。 * 厂 ac c e p t o r 。d o n o r r a d i c a la n i o nr a d i c a lc a t i o n 图1 1 0p e t 机制的前线轨道理论示意图 山东师范大学硕士学位论文 图卜1 1 几种p e t 荧光探针 图1 1 2p e t 荧光开关原理示意圈 分子内共轭电荷转移川川2 ( i c t ，i n t r a m o l e c u l a r c h a r g e t r a n s f e r ) 。i c t 分子荧 光探针是由荧光团与识别基团直接相连构成。这类探针的荧光团上同时连有供电子 基团和吸电子基团而且供电子基团和吸电子基团又充当识别基团。当荧光团被光 激发后，会进一步增加从电子给体到电子受体的电荷转移。识别基团与客体结合时， 对荧光团的推拉电子产生影响( 减弱或强化电荷转移) ，从而导致荧光光谱蓝移或 中弱节 瀣。 l 、0，幻e 毽 山东师范大学硕士学位论文 红移。一般情况下，i c t 荧光探针对荧光强度的影响没有p e t 荧光探针那样显著( 图 l 1 3 )。 几几几几 双h0 0 hqp ，n hh n 、 o = ：声。 图1 1 3 几种i c t 荧光探针 荧光共振能量转移1 1 3 ，1 1 4 ，( f r e t ，f l u o r e s c e n c er e s o n a t ee n e r g yt r a n s f e r ) 。当能 量给体荧光团与能量受体荧光团相隔的距离远大于两者的碰撞直径时，只要给体与 受体的基态和第一激发态两者的能级间能量差相当，即给体的发射光谱与受体的吸 收光谱可以有效重叠，就可能够发生从给体到受体的非辐射能量转移，又称为长距 离能量转移。实际上发生这种能量转移条件要求是很苛刻的，两者除了光谱重叠外， 还必须以适当的方式排列。受体可以是荧光团，也可以是荧光淬灭团。前一种情形， 激发给体时，将观察到受体的荧光发射。而后一种情形，则只能观察到给体的荧光 变化，多用于核酸检测1 1 5 ( 图1 1 4 ) 。 图1 1 4 两种典型的f r e t 荧光探针 1 5 弱 山东师范大学硕士学位论文 除了上述几种设计原理以外， 甚至是意外所得，但效果却非常好。 也有一些荧光分子探针是按照其它原理设计， 1 1 6 1 8 。 1 4 三价铁离子荧光探针的发展 铁是生物体系中大量的代谢过程所必需的元素，也是生物生长发育及生命活动 中必须的营养元素之一，但也有可能产生有害的影响，一方面铁作为许多酶的结合 物，它是生命所不可缺少的，和含铁的非亚铁血红素蛋白结合或者和亚铁血红素蛋 白结合，血红蛋白参与众多的生物功能：血色素、氧化酶、过氧化物酶和过氧化氢 酶等等。此外，含铁蛋白对于胶原质、酪氨酸和儿茶酚胺的代谢也是必需的。另一 方面，对生物功能如此有用的铁的化学性质又会对活的生物体产生很多问题。存在 两种氧化状态：f e ( i i ) 和f e ( i i i ) ，它们分别可以提供和接受电子。然而这些氧化还 原反应可能会变成对机体有害的羟基自由基。在生理p h 值和氧气浓度下，f e ( i i ) 被平稳地氧化成为f e ( i i i ) ，后者会快速地形成不溶的f e ( o h ) 3 聚合物。此外，铁除 非被适当的螯合，否则由于它在单电子氧化还原反应中的催化行为，对有害的氧自 由基的生成过程中起着关键作用，过量的氧自由基最终会导致对重要细胞结构的过 氧化损伤。即使在痕量过渡金属如铁存在的情况下，也会催化0 2 与h 2 0 2 反应产生 高度有害的而且反应性极强的羟基自由基( 图1 1 5 ) 。 f e 2 + + h 2 0 ， f e 3 + +o h + o h f e 3 + + 9 2 f e 2 + + 0 2 图1 1 5 生物体内f e ( i i1 和f e ( i i i ) 相互转化模拟 因此机体被迫去解决生命中众多矛盾中的一个：那就是把“自由铁 的浓度保 持在必要的最低水平，而且这个浓度仍然能保证为合成血红素蛋白和其它含铁分子 提供足够的铁。在生物进化的过程当中已经发形成专门的分子在溶液中去获得、