（海洋生物学专业论文）大黄鱼gdf8Ⅱ基因克隆与表达分析.pdf

宁波大学硕士学位论文 - i - 大黄鱼 gdf-8基因克隆与表达分析 摘 要 生长分化因子 8growth and differentiation factor-8gdf-8是肌肉生长的负调控 因子又称肌肉生长抑制素myostatinmstn该基因敲除的动物具有生长速 度快肌肉含量高脂肪含量少的特点因此这一基因在动物育种上具有潜在 的应用前景可以通过抑制 gdf-8的活性提高养殖品种的肌肉含量促进养殖品 种的生长 由于鱼类在系统发生过程中有基因重复现象发生从而导致 gdf-8产生两种 基因型本研究在本实验室已获得大黄鱼larimichthys croceagdf-8的基础上 ay842933采用同源克隆的方法 从肌肉组织中获得了大黄鱼 gdf-8基因 dna 序列含起始密码子及终止密码子包括 3个外显子及 2个内含子全长 2357bp eu571244同时以大黄鱼脑组织 cdna为模板 通过 rt-pcr及 race技术 rapid amplification cdna endsrace获得了大黄鱼 gdf- 8 1080bp 完整开放阅读框 opening reading frameorf及 682bp 3-utr3-untranslated region这是目前 国内关于鱼类 gdf-8的首次报道 序列分析发现大黄鱼 gdf-8与 gdf-8基因序列存在较大差异不仅序列的长 度不同序列间相似度也不高59.31 %但在外显子部分不仅序列的长度 一致且序列间相似度也很高86.09 %同时在大黄鱼 gdf-8的 3-utr 并没 有发现存在于大黄鱼 gdf-8?的can微卫星序列 大黄鱼 gdf-8呈现出典型的 tgf-超家族成员的特点完整的 orf 预测的 gdf-8蛋白序列由 359 个氨基酸组成包含三个结构域分别为 118 位氨基酸 残基间的一个潜在的信号肽序列 33239位氨基酸残基间的 tgf- propeptide domain 和 264359位氨基酸残基间的 tgf- domain其中在 tgf- propeptide domain的 c 末 端含有一个保守的蛋白酶加工位点rxxr在 tgf- domain含有 9 个保守的半 胱氨酸残基 用常规 rt-pcr 检测了 gdf-8与 gdf-8在大黄鱼成体和个体发育早期的表达 情况其中 gdf-8主要在肌肉中表达而 gdf- 8则主要在脑和脂肪组织中表达 肌肉中并未检测到表达 这提示大黄鱼两型 gdf- 8 由于基因的复制及不同的进化历 程 可能使它们的功能产生分歧 主要由 gdf-8执行抑制肌肉生长的作用 而 gdf-8 宁波大学硕士学位论文 - ii - 可能与脑和脂肪等的发育调控有关另外gdf-8在个体发育早期的多个阶段 有表达而 gdf-8在这些阶段均未检测到 同时用 fq-pcrfluorescence quantitative real time pcr 检测了 gdf- 8与 gdf- 8 在大黄鱼成体和个体发育早期的表达情况结果表明 gdf-8与 gdf- 8在所有组 织及个体发育的各个阶段均有表达但存在较大的时空表达差异其中 gdf- 8主 要在肌肉中表达而 gdf- 8则主要在脑和脂肪组织中表达这一结果与 常规 rt-pcr检测结果一致gdf-8在个体发育早期阶段的表达量高于 gdf-8且 gdf-8 在发育早期各个阶段基本上处于低水平的表达状态这提示 gdf-8可能在大黄 鱼早期形态建成如肌节形成等方面发挥主控作用而 gdf- 8可能司职其它功能 关 键 词大黄鱼gdf-8racefq-pcr表达 宁波大学硕士学位论文 - iii - molecular cloning and tissue expression analysis of gdf-8 gene in large yellow croaker, larimichthys crocea abstract gdf-8, also called myostatin (mstn), is a negative regulator of muscle growth. the tested animal showed giant phenotype when gdf-8 was knocked out. hence, gdf-8 has a potential role in the improvement of animal production. two types of gdf-8 have been recently found in some teleosts. based on the strategy of homology cloning, 2357 bp gdf-8 was cloned from muscle tissue, ranging from start codon to stop codon. it contains 3 exons and 2 introns (eu571244). in addition, 1080 bp complete orf (opening reading frame) and 682 bp 3-utr (3-untranslated region) of gdf-8were cloned by rt-pcr and race (rapid amplification cdna ends) from total rna of the brain tissue. it is the first cloned gene of gdf-8 in china. the results of the sequence analysis showed a big difference between gdf-8and gdf- 8, including the length and similarity of the two sequences. however, exon? was highly conserved in both length and similarity. besides, it does not exist (ca)n microsatellite in the 3-utr of gdf-8 as it does in gdf-8. the gdf-8 showed a typical characteristics of tgf- superfamily member. the complete gdf-8 orf codes 359 amino acids which contains three domains, a potential signal sequence (residues 118), a tgf- propeptide domain (residues 33239), and a tgf- domain (264359). there was a rxxr proteolytic processing site in c terminal of tgf- propeptide domain and nine conserved cysteine residues in tgf- domain which were common to all tgf- superfamily members. conventional rt-pcr was used to detect the temporal and spatial expression pattern of gdf-8 and gdf- 8.the results showed that gdf-8 was mainly expressed in muscle, whileas gdf- 8 was mainly expressed in brain and adipose. expression of gdf-8 was not detected in muscle tissue. the expression pattern suggested that gdf-8and gdf-8 have different function. gdf- 8 may mainly inhibited the growth of muscle and gdf-8 may be related to the development of 宁波大学硕士学位论文 - iv - brain and adipose. in addition, gdf-8 expressed in the early stages of development of larimichthys crocea, but gdf-8 was not detected in the early stages of development. fq-pcr (fluorescence quantitative real time pcr) was also used to detect the temporal and spatial expression pattern of gdf-8 and gdf-8. the results showed that the two genes of gdf-8 were ubiquitous expression in the whole stage of the early devolopment and all the detected ten tissues of larimichthys crocea. however, there was a big difference between the two genes in temporal and spatial expression. the gdf-8 was mainly expressed in muscle, and gdf- 8 was mainly expressed in brain and adipose. this result was consistent with the result of conventional rt-pcr detection. the expression level of gdf-8 was higher than gdf-8 in the early stages of the individual development of larimichthys crocea. the expression level of gdf-8 was very low in the early stages of the development of larimichthys crocea. the result suggests that gdf-8 may play a vital role in the eraly stages of morphogenesis, such as sarcomere formation, whileas gdf-8 may have other function in the early stages of the development of larimichthys crocea. key wordslarimichthys croceagdf-8racefq-pcrexpression 独 创 性 声 明 本人郑重声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工 作及取得研究成果尽我所知除了文中特别加以标注和致谢的地方 外论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果也不包含为获得 宁波大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料与我一同工作 的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中做了明确的说明并表示了 谢意 签名_ 日期_ 关于论文使用授权的声明 本人完全了解宁波大学有关保留使用学位论文的规定即学校 有权保留送交论文的复印件允许论文被查阅和借阅学校可以公布论 文的全部或部分内容可以采用影印缩印或其他复制手段保存论文 保密的论文在解密后应遵循此规定 签名_ 导师签名_ 日期_ 宁波大学硕士学位论文 - 1 - 引 言 大黄鱼larimichthys crocea richardson1846俗称黄鱼黄瓜鱼黄花鱼等 隶属于脊索动物门 chordata脊椎动物亚门 vertebrata硬骨鱼纲 osteichthyes 鲈形目perciformes鲈形亚目percoidei石首鱼科sciaenidae黄鱼属 larimichthys为暖温性集群洄游鱼类是我国主要海产经济鱼类之一分布 于我国黄海南部东海和南海分为 3个地理种群岱衢族闽-粤东族和硇洲族 其肉质鲜嫩除供鲜食外还可加工制成独具风味和特色的水产品此外大黄鱼 还具有很高的药用价值其耳石具清热作用鳔有润肺健脾补气活血之功能 由于近年来海水污染日益严重导致近海资源遭到严重破坏从天然水域中 捕获大黄鱼已经非常困难自二十世纪八十年代大黄鱼人工育苗技术获得突破以 来大黄鱼的养殖规模逐年扩大 近年来大黄鱼已成为我省主要的海水养殖品种产生了显著的经济效益和 社会效益然而经过多年养殖后养殖大黄鱼群体出现了经济性的衰退现象如 生长缓慢性成熟提早亲鱼个体变小及肉质变差等这些因素直接影响到大黄 鱼的产量销售和商品价格利用现代遗传育种手段培育具有优良经济性状的养 殖品种满足广大养殖户的需要成为海洋生物技术研究的当务之急 二十世纪九十年代发现 gdf-8growth and differential factor-8生长分化因子-8 对生长具有负调控作用gdf-8敲除的小鼠其骨骼肌重量明显增加是正常野生 型小鼠的 2 倍左右mcpherron et al.1997a突变小鼠骨骼肌肥大的原因既有肌 细胞的增生也有肌纤维的肥大随后gdf-8 的功能在双肌牛品种比利时蓝牛 belgian blue 和皮尔蒙特牛 piedmontese 得到进一步证明 mcpherron et al. 1997a 之后gdf-8的重要性以及其在动物育种中的潜在应用前景日益得到动物育种学家 的关注可以通过抑制 gdf- 8 的活性提高养殖品种的肌肉含量促进养殖品种的 生长 由于鱼类在系统发生过程中有基因重复现象发生从而导致 gdf-8产生两种 基因型maccatrozzo et al.2001a目前对鱼类 gdf- 8的研究较为深入已在 多种鱼类中克隆到 gdf- 8并对该基因的特征进行了一些分析本实验室也已克 隆得到大黄鱼larimichthys croceaay842933美国红鱼sciaenops ocellatus dq855526和黑鲷acanthopagrus schlegeliidq303480等的 gdf- 8序列而 对 gdf-8的研究则处于起步阶段仅在少数几种鱼类中克隆到其序列国内目前 还没有这方面的相关报道根据研究gdf-8两种基因型在序列的长度相似度及 宁波大学硕士学位论文 - 2 - 时空表达等方面均存在一定的差异如与大黄鱼同属于鲈形目的金鲷sparus aurata其 gdf-8的编码序列全长为 1158bp编码 385 个氨基酸而 gdf-8的编 码序列全长为 1080bp 编码 359个氨基酸 基因序列间无很高的相似度 maccatrozzo et al.2001a属于鲑形目的虹鳟oncorhynchus mykiss其 gdf-8在各组织中 普遍表达而 gdf-8则主要在脑组织中表达garikipati et al.2007斑马鱼danio reriogdf-8在个体发育早期各个阶段的表达量总体上高于 gdf- 8helterline et al. 2007这些研究表明鱼类 gdf- 8与 gdf-8存在较大的差异在目前对 gdf- 8进 行较为深入研究的前提下 为更好的阐明 gdf-8对鱼类骨骼肌生长的作用机制及该 基因的其它功能和特点有必要对 gdf-8进行深入的研究 本研究在已获得大黄鱼 gdf-8基础上通过常规 pcr扩增并结合 rt-pcr和 race 技术获取大黄鱼 gdf-8的基因序列并研究其时空表达情况以期进一步 了解大黄鱼 gdf-8的功能及特点为后续利用 rnai等分子生物学手段培育生长速 度快肌肉含量高脂肪含量少的优质大黄鱼品种打下良好的基础 宁波大学硕士学位论文 - 3 - 第一章 综 述 肌肉的生长分化一直是人们感兴趣的的热点问题之一骨骼肌发育过程中的 分化由生肌决定因子mdfs myogenic determinating factors 家族基因调控emerson 1990在脊椎动物中这一家族包括 myodmyf-5myogenin 和 mrf4这些基因 在发育过程中表现出不同的时空表达模式rudnicki et al.1995而且每个基因 都能使体外培养的单核细胞转化成具有成肌特性的细胞weintraub et a1.1991 myod 和 myf-5 在分化前增殖的成肌细胞中cornelison et al.2000和刚分化的肌 纤维中表达emerson1990对成肌细胞的决定和维持起重要作用myogenin 和 mrf4在肌管中表达在肌管形成后调节骨骼肌的正常分化cornelison et al. 2000生长分化因子-8growth and differentiation factor-8gdf- 8是近年来发现的 一类重要的肌细胞生长调控因子它并不属于 mdfs家族但却能通过抑制 mdfs 家族成员转录活性负向调控肌细胞的生长发育它的表达量与肌肉重量的变化呈 负相关因此对这一基因的研究在理论和现实中都有非常重要的意义本章将 对 gdf-8 的研究进展作一综述 1 gdf-8 的克隆 1.1 gdf-8 的发现 1997年美国 john hopkins 医学院的 mcpherron等1997a在筛选小鼠骨骼肌 cdna文库时发现了一种新的生长分化因子growth and differentiation factorgdf 该因子具有转化生长因子 transforming growth factor-tgf-家族的典型特征 但其与 tgf- 家族其它成员的同源性很低最高仅为 45 %因而被归为新的一类 gdf即 gdf-8生长分化因子-8同时发现 gdf- 8 主要在小鼠的骨骼肌中表达 且对骨骼肌的生长具有抑制作用因而又被称为肌肉生长抑制素myostatin mstn进一步研究发现 gdf-8敲除的小鼠其骨骼肌重量增加非常明显单块 肌肉的重量约为野生型小鼠的 23 倍而且突变型小鼠骨骼肌纤维的数量较野生 型小鼠高出 86 %这表明骨骼肌肌肥大的原因既有肌细胞的增生hyperplasia也 有肌纤维的肥大hypertrophymcpherron et al.1997a这是继 1982年 palmiter 等将大鼠的生长激素基因转入小鼠体内产生超级小鼠之后的又一只超级小 鼠palmiter et al.1982除了骨骼肌重量明显增加外gdf-8敲除的小鼠其体 内脂肪形成还明显减少 血清瘦蛋白 leptin 分泌量也相应地减少 lin et al. 2002 宁波大学硕士学位论文 - 4 - 1.2 gdf-8 的自然突变 对双肌牛品种比利时蓝牛belgian blue和皮尔蒙特牛piedmontese的 研究证实了 gdf-8对肌肉生长具有负调控功能grobet 等1997用候选克隆的方 法证明 gdf- 8 与比利时蓝牛的双肌表型有关研究表明比利时蓝牛 gdf-8 的 外显子 3缺失 11 bp937947造成移码突变使得从缺失后面的第 14 个密码 子开始的翻译功能被破坏结果造成仅 c-端的 7个氨基酸被翻译而剩余的 102个 氨基酸274375 全部丢失 导致 gdf-8功能丧失几乎同时 mcpherron等1997b 用 pcr 方法扩增了皮尔蒙特牛 gdf- 8 的 3 个外显子分析表明在皮尔蒙特牛中 存在 2个点突变其中一个是发生在外显子 1中的 ca突变 使得保守的第 94 个氨基酸 leu突变为 phe另一个是发生外显子 3 中的 ga突变导致编码的氨 基酸由高度保守的 cys 变为 tyr 此突变可能导致了 gdf-8功能完全或几乎完全丧 失因为这个 cys 在所有动物的 gdf-8和 tgf- 家族的其他成员中都是保守的 从而导致了双肌表型的发生 laville 等2004对比利时 texel双肌绵羊的遗传机制进行了研究结果 发现双肌羊 gdf- 8 编码区与普通绵羊romanov相比没有碱基的差异采用该 基因侧翼的微卫星标记进行连锁分析表明在 texel 双肌绵羊染色体 2 远端区存 在 1个对肌肉的发育产生效应的 qtl quantitative trait loci该座位很可能就是 gdf- 8 因此可以推断影响 gdf-8 表达的区域可能在 3或 5端的非翻译区或内含子部 分 2004年美国 john hopkins 大学 schuelke 等2004报告了 1例因 gdf- 8 突变而 导致的大力士男童的病例这名还不满 5岁的德国男童腿部肌肉的横断面 面积为同龄儿童的 2倍而皮下脂肪却只有同龄儿童的一半经检测虽然 gdf-8 编码区未发生突变但该基因内含子 1 的第 5 个核苷酸却发生了 ga 突变从 而影响了 3 个外显子的剪接剪接后的 mrna 70 %被改变第 1个外显子上增加 了 109 个核苷酸出现了终止密码子使得正常 gdf-8 含量很低在血清中几乎 完全缺失该病例证实了与其他哺乳动物如牛小鼠等一样gdf-8在人肌 细胞生长过程中也起着重要的负调控作用 最近mosher 等2007在惠比特犬whippet身上发现了双肌表型 这只狗被称为 double muscled whippet研究发现这只狗的 gdf-8发生了纯合突变 导致其肌肉比正常狗大很多但在其它也具有很多肌肉的该品种狗身上未发现这 种突变有趣的是研究人员在被用于竞速赛跑的惠比特犬身上发现了 gdf- 8 的杂 合体这种狗身上的肌肉虽没有双肌狗多但其在速度上却具有优势联系 宁波大学硕士学位论文 - 5 - 到大力士男童的母亲是位职业运动员同时她的 gdf- 8也是杂合体这一现象 提示低水平的 gdf-8 蛋白浓度可能具有更强的运动能力 1.3 gdf-8 的合成与加工 gdf-8和其他的 tgf-超家族成员一样先以前体蛋白precursor proteins形式合 成随后在合成位点以水解的方式加工后具有生物活性的成熟肽进入循环系 统培养的牛成肌细胞提取物 western blot 分析表明gdf-8特异性抗体检测到了 以 gdf-8 前肽52 kda和 laplatency-associated peptide40 kda两种形式存在的 gdf-8该实验表明gdf-8 确实在成肌细胞中合成并且水解加工根据已经报道 的 tgf- 蛋白水解加工机制及其主要结构特征gdf-8 的加工位点可能就发生在 保守的 rsrr 残基中thomas et al.2000 2 gdf-8 的功能 2.1 gdf-8 的表达 最初mcpherron等通过 northern杂交分析发现小鼠 gdf-8 mrna仅存在于成 熟小鼠的骨骼肌中在其它组织肺胸腺脑肾胰腺肠脾辜丸肝 卵巢等中均检测不到mcpherron et al.1997a但随后的研究发现gdf-8 mrna 及其蛋白同样存在与其它组织中sharma 等1999 应用 rt-pcr和免疫组化技术 发现 gdf-8的表达不仅局限于骨骼肌在胎儿和成年牛的心脏中也有表达进一步 研究表明 心脏中的 gdf- 8 mrna定位于的 purkinje 纤维和心肌细胞中 这说明 gdf-8 在心脏的发育过程中起重要作用ji 等1998发现在猪的乳腺中也存在 gdf-8 mrna这提示 gdf- 8 可能在乳腺的发育和哺乳期中起作用同时他们还发现 gdf-8 mrna 的水平在出生前达到最高到了出生后直至成熟不断下降这可能与其参 与调节初生猪的体重相关gonzalez-cadavid 等1998在体重下降的 hiv 感染者 中发现 gdf-8的浓度明显升高wehling等2000的研究表明即使在完全分化 的肌肉细胞中gdf-8的表达同样受到调节其表达量与肌肉重量变化呈负相关 胡兰等2003采用 rt-pcr法检测了 gdf-8 在大骨鸡不同器官中的表达情况结 果表明gdf-8在大骨鸡骨骼肌中表达水平较高在心肌肾脏脑肠舌中也 有微量表达但在肺肝脏中未检测出 gdf-8 mrna而且在 14日龄时表达水平 高于 35 和 56 日龄 2.2 gdf-8 与脂肪积累的关系 gdf-8突变会对脂肪的沉积起抑制作用mcpherron等1997a研究发现gdf- 8 突变纯合体小鼠的脂肪量比对照组平均少 70 %推测可能是 gdf-8直接作用于脂 宁波大学硕士学位论文 - 6 - 肪组织调节其代谢过程或由于骨骼肌中 gdf-8信号缺乏而间接引起脂肪组织 中 gdf-8 的改变从而影响脂肪代谢例如骨骼肌组织gdf-8突变可改变能量 代谢以防止体内脂肪的积累lin 等2002对 gdf- 8 基因敲除小鼠和野生型小 鼠在 4周龄8周龄和 12 周龄时进行对比研究后发现gdf- 8 基因敲除小鼠在 8周 龄 12周龄时臀肌明显大于野生小鼠 12周龄时基因敲除小鼠脂肪沉积明显下降 12 周龄时血清瘦蛋白浓度显著低于野生型小鼠腹股沟处脂肪组织中瘦蛋白 mrna表达量也显著降低 gdf-8突变对脂肪的沉积起抑制作用的另一种可能的解释是肌肉缺乏 gdf-8信号 会影响假设的第二信使的作用它们由肌肉释放作用于脂肪组织mauvais-jarvis et al.2000间接方式的一个证据是其它遗传改变的小鼠在肌肉量增加的同时 也有类似的脂肪积累效应例如骨骼肌中过度表达 igf-1musaro et al.2001 或 ski sutrave et al.1990 的转基因小鼠实际上均缺乏脂肪缺乏定量分析结果 为弄清 gdf- 8 是否可作为抑制肥胖的有效靶日标mcpherron等2002采用肥胖基 因obesity的两种 gdf- 8 突变模型 ay和 ob/ob进行了研究发现即使保持正常的 食物供给正常体温和代谢速率稍降gdf-8缺失小鼠随年龄增加其脂肪积累明 显减少说明 gdf-8的缺失除了影响骨骼肌外还会影响脂肪组织最终导致脂肪 积累的部分抑制和葡萄糖代谢的异常因而推断阻断 gdf-8功能的药物同时可以 减慢或抵抗肥胖和 ii 型糖尿病 彻底阐述 gdf-8在体内调节脂肪代谢机制需要对遗传操作动物进行分析 它们 的 gdf- 8 信号途径成分在骨骼肌或脂肪组织中被专一性地阻止在体外将 gdf-8 与 act ra 和 act rb 结合与 gdf-8敲除小鼠相比骨骼肌中 act rb的表达 呈显性负效应形式dominant negative form转基因小鼠骨骼肌急剧增加初步 分析发现这些转基因小鼠的脂肪积累也下降这与 gdf-8对脂肪组织的间接作用 相吻合lee et al.2001 2.3 gdf-8 与肌肉生长的关系 最初 gdf-8被发现时就与其控制肌肉的生长的特性有着密切联系 gdf-8 c-端生 物活性区基因敲除的缺陷突变型纯合小鼠能够存活并能正常生育产生后代且其 体重比突变杂合体或野生型小鼠重 30 %左右与年龄性别无关进一步研究 发现该纯合体小鼠肩和臀部的肌肉明显肥大单块肌肉的重量是野生型小鼠的 23倍mcpherron et al.1997a之后发现自然条件下的人工选育的双肌牛 比正常品种的牛拥有更加发达的肌肉 深入的研究发现其 gdf- 8 都有不同程度的缺 失或突变导致其功能的丧失grobet et al.1997mcpherron and lee1997b同 时在德国发现的大力士男童schuelke et al.2004及最近在美国发现的双 宁波大学硕士学位论文 - 7 - 肌狗double muscled whippetsmosher et al.2007也都是由于 gdf-8发生突变 导致的这些例子也进一步表明 gdf-8 对骨骼肌生长具有负调控作用 作为一种骨骼肌生长的负调控因子许多科学家对其在肌肉衰竭状态下的作 用进行了研究研究表明 hiv 感染者随体重下降血清中 gdf-8浓度增加说明 增加的 gdf-8可能是导致 hiv 病人肌肉衰竭的原因之一gonzalez et al.1998 2.4 gdf-8 的作用机理及其调控 2.4.1 gdf-8 的作用机理 tgf-通过使细胞周期停留在 g1期而抑制多种类型的哺乳动物细胞的细胞周 期进程li et al.1995这种发生在细胞周期某一阶段的停滞arrest据认 为与细胞周期中的许多因子有关但是与 gdf-8 有关的细胞生长性停滞似 乎只是通过 p21发生特异性调节因为在 gdf-8处理的成肌细胞中只有 p21的 水平被正调控此外p21表达增加与 cdk2蛋白表达轻微下降相关该相关将进 一步增加 p21与 cdk2 比率从而导致 cdk2活性降低thomas et al.2000一般 认为 在细胞周期的 g1 期 需要 cyclincdk复合体使 rb the retinoblastoma susceptibility gene product成视网膜细胞瘤易感性基因产物磷酸化亚磷酸化的 rb 与 s 期基 因的转录激活所需的转录因子例如 e2fdp1结合lam et al.1994在 g1-cdks 的作用下rb蛋白的磷酸化也就是失活可能会促进 s期转录因子的释放使得信 号通过限制点restriction pointla thangue1996反之通过 g1-cdk 的失活 rb 亚磷酸化形式的累积要么增加 ckiscyclin kinase inhibitor细胞周期素蛋白激酶 抑制子的浓度要么降低 cdks的蛋白浓度最终导致细胞在 g1 期发生停滞 sherr1994zhang et al.1994thomas et al.2000 2.4.2 gdf-8 的调控 在胚胎发育过程中及出生后gdf- 8 的表达受到与肌肉发生有关因子的转译调 控研究发现来自牛猪小鼠和人约 1.6 kb 的启动子序列能立即上调 gdf- 8 的表 达说明一些 dna 序列与肌肉专一性的基因转译相关它们在这些物种是保守 的最 有 名 的 肌 肉 专 一 性 转 译 因 子 是e-box 与mrfs如myodmyogenic determinationmyf5myogenin及 mrf4其中myodmyf5 在胚胎成肌系统发 育的早期就有表达说明它们对成肌细胞的决定和增殖有作用sharrna 等研究发 现在牛的肌肉发育过程中myod最高表达在 70120 d而 gdf- 8 在 90120 d这与 次级纤维形成的开始时间一致sharma et al.2001由于发育过程中 gdf- 8 的表 达时间与 myod基本一致并且两者在快肌中都有优势表达carlson et al.1999 因此 myod可能是肌肉发育过程中成肌细胞增殖分化时调节 gdf-8表达的一个主要 调控因子已知 myodigf-1 和 myogenin 基因产物与肌肉细胞分化及其特异性基 宁波大学硕士学位论文 - 8 - 因表达有关marsh et al.1997mrf-4 mrna表达在出生后增加在成年肌肉 中为主要因子除 gdf- 8 外还有其它抑制型基因产物如 iddna结合抑制子 尽管己揭示了体外这些特别蛋白的调控机理但人们对它们在体内的作用认识还 很少 3 鱼类 gdf-8 的研究进展 由于 gdf- 8 对肌肉生长具有负调控作用因此受到广泛关注gdf- 8 相关研究 目前己成为分子生物学领域的研究热点由于鱼类物种的多样性多种鱼类的 gdf-8 已被克隆通过研究初步表明鱼类 gdf- 8 可能更加复杂但这方面的工作还 有待深入以下将对鱼类 gdf-8 的研究进展做个综述 3.1 鱼类 gdf-8 的不同基因型 1997年mcpherron等l997b首次分离克隆了鱼类的 gdf- 8序列即斑马鱼的 gdf-8 cdna 序列到目前为止已在多种鱼类克隆得到 gdf- 8国内也有这方 面的相关报道表 1.1同时本实验室也已克隆得到大黄鱼larimichthys crocea ay842933美国红鱼sciaenops ocellatusdq855526和黑鲷acanthopagrus schlegeliidq303480等的 gdf-8序列 由于鱼类在系统发生过程中有基因重复现象发生从而导致 gdf-8产生两种 基因型自从 roberts等2001从溪红点鲑salvelinus fontinalis中首次克隆获得 了 gdf- 8的第二种基因型后到 2005年为止已在 8种鱼类中报道发现了 gdf-8的 第二种基因型如虹鳟oncorhynchus mykiss大西洋鲑salmo salar金鲷sparus aurata斑马鱼danio rerio溪红点鲑银大麻哈鱼oncorhynchus kisutch 红鳍东方鲀fugu rubripes和石首鱼umbrina cirrosa等但 kerr等2005对 包括上述鱼类在内的所有鱼类和其它哺乳动物及鸟类等的 gdf- 8 进行系统发生分 析结果发现之前克隆到的一些鲑鳟鱼的 gdf-8实际上仍为 gdf- 8属于 gdf-8 的种间同源基因orthlog如虹鳟大西洋鲑溪红点鲑和银大麻哈鱼这一 研究基本上澄清了两种 gdf- 8 基因型在分类上的混乱之后garikipati等2007 和 ostbye 等2007相继在虹鳟和大西洋鲑中发现了其真正意义上的 gdf-8第二种 基因型即 mstn-2a 和 mstn- 2b进一步研究表明它们的 mstn-2b 由于发生基 因突变属于假基因因此到目前为止仅在金鲷ay046314红鳍东方鲀 ay445321石首鱼ay059386斑马鱼ay687474虹鳟dq138301 dq177320和大西洋鲑ef392863ef392863等 6种鱼类中克隆获得真正意义上 的 gdf-8国内目前还未有相关报道 宁波大学硕士学位论文 - 9 - 研究发现鱼类的两型 gdf- 8 在序列上存在较大差异如金鲷的两型 gdf- 8 编 码的蛋白具有 68 %的相似性maccatrozzoet al.2001a而大西洋鲑的两型 gdf-8 编码的蛋白具有 70 %左右的相似性ostbye et al.2007kerr 等2005克隆了 斑马鱼 gdf- 8序列并对其启动子区进行了分析 研究发现相比于斑马鱼 gdf-8 gdf-8启动子区存在更多的肌肉特异性 cis 调控元件而且有些仅存在于 gdf- 8启 动子区 表1.1 目 前 已 克 隆 获 得 的 鱼 类gdf-8序 列 table.1.1 the gdf-8 sequence of the fish which have been cloned at present 序 号 no. 物 种 species genbank登 录 号 genbank accession no. 参考文献 reference af540956zfmstn-1 xu et al.2003 1 danio rerio ay687474zfmstn-2 kerr et al.2005 af258448sbmstn-a 2 sparus aurata ay046314sbmstn-b maccatrozzo et al.2001b maccatrozzo et al.2001a ay445322myostatin 1 3 fugu rubripes ay445321myostatin 2 unpublished unpublished af316881sdgdf-8a 4 umbrina cirrosa ay059386sdgdf-8b maccatrozzo et al.2002 unpublished af273035tmyostatin-1a af273036tmyostatin-1b rescan et al.2001 dq138301rtmstn-2a 5 oncorhynchus mykiss dq177320rtmstn-2b garikipati et al.2007 ef392862mstn-1a nm_001123634mstn-1b ostbye et al.2001 ef392863mstn-2a 6 salmo salar ef392864mstn-2b ostbye et al.2007 af247650myostatin-1a roberts et al.2001 7 salvelinus fontinalis af313912myostatin-1b ay434465mstn-1a roberts et al.2001 8 oncorhynchus kisutch af394687mstn-1b 9 oreochromis mossambicus af197193 rodgers et al.2001 10 ictalurus punctatus af396747 kocabas et al.2002 11 ictalurus furcatus ay540992 gregory et al.2004 宁波大学硕士学位论文 - 10 - 12 morone chrysops af197194 rodgers et al.2001 13 morone americana af290911 rodgers et al.2001 14 morone saxatilis af290910 rodgers et al.2001 15 ameiurus catus ay540994 gregory et al.2004 16 lateolabrax japonicus ay965685 ye et al.2007 17 larimichthys crocea ay842933 xue et al.2006 18 acanthopagrus schlegelii dq303480 xue et al.2008 19 epinephelus coioides dq493889 ko et al.2006 20 paralichthys adspersus eu443627 delgado et al.2008 21 paralichthys olivaceus dq997779 钟其旺2007 22 kareius bicoloratus ef683114 钟其旺2007 23 scophthalmus maximus ef683115 钟其旺2007 24 cynoglossus semilaevis ef683116 钟其旺2007 25 micropterus salmoides ef071854 李胜杰等2007 26 cyprinus carpio ef551058 李兴美等2007 27 misgurnus anguillicaudatus ef551059 彭扣等2007 28 sciaenops ocellatus dq855526 薛良义等2008 29 pagrus major ay965686 叶寒青等2006 3.2 鱼类 gdf-8 的表达 与高等脊椎动物相比鱼类的 gdf- 8的表达范围更广其中 gdf- 8在不同鱼类 的几乎所有组织中都有检测到表达ostbye at al.2001但鱼类 gdf-8的表达也 具有自身的特点不仅在不同物种间存在时空表达方面的差异即使是相同物种 在不同基因型间也存在不同的时空表达模式 这提示鱼类 gdf- 8 的表达模式比高等 脊椎动物可能更加复杂其在鱼类发育调控中所起的功能可能也更加多样 3.2.1 gdf-8 在鱼类不同组织的表达 根据目前的一些研究两型 gdf-8之间不仅存在较大的组织表达差异而且它 们在不同鱼类的同一种组织中也存在较大的表达差异 在金鲷上的表达研究表明maccatrozzo et al.2001amaccatrozzo et al.2001b gdf-8在骨骼肌脑眼心和肠等表达比较明显在脂肪组织和肾中也存在微 量表达而 gdf- 8则主要在中枢神经系统中表达在性腺中也检测到一定程度的 表达 rescan等2001发现虹鳟的 gdf-8a在鱼体各组织中呈广谱性表达红肌 白肌脑肠精巢卵巢心肾鳃和肝其中在肌肉中的表达可能是组 宁波大学硕士学位论文 - 11 - 成型的而 gdf-8b仅在肌肉和脑组织中表达 garikipati等2007 发现虹鳟的 gdf-8 a表达模式与 gdf-8的不同gdf-8a主要在脑中表达比其它所检测组织表 皮鳃丝鳃弓心脏肾脏脾脏肠胃肝脏眼红肌白肌卵巢和 睾丸表达量至少高 10倍因此garikipati等2007认为虹鳟的 gdf-8可能是 鲑鳟鱼对其基因组四倍体化的一种补偿和适应gdf- 8与 gdf- 8产生分歧后可能 只与神经系统的发育有关 helterline 等2007用 real time pcr方法研究了两型 gdf-8在斑马鱼的表达模 式研究发现 gdf-8在脑肌肉心脏和睾丸中的表达量最高比其它所检测组 织鳃眼表皮胃肠道脾脏肝脏鱼鳔卵巢高 13 个数量级而 gdf-8 在脑眼脾脏和睾丸中表达量要比其它所检测组织肌肉心脏鳃表皮 胃肠道肝脏鱼鳔卵巢高 14 个数量级同时gdf-8在大部分所检测组 织中的表达量要高于 gdf-8 3.2.2 gdf-8 在鱼类不同发育期的表达 根据目前的一些研究显示 两型 gdf-8在鱼类早期发育过程中有着不同的发育 调控模式这提示两型 gdf-8 对鱼类早期的生长发育起着不同的作用 在金鲷个体发育早期gdf-8在 113141日龄的幼鱼中可检测到表达而 在 2 日龄的胚胎中并未检测到此时体节的发育已经完成因此maccatrozzo 等