（海洋生物学专业论文）东海原甲藻增殖细胞核抗原基因表达量与生长关系的研究.pdf

东海原甲藻增殖细胞核抗原基因表达量与生长关系的研究 摘要 浮游藻是海洋食物链的重要一环，在能量转移和营养盐循环等方面起着重要 作用。对浮游藻现场生长率等基本生理生态学参数的测定，是估算浮游藻生产力、 研究浮游藻种群变迁、构建生态动力学模型乃至赤潮预测的基础，特别是现场测 定单种浮游藻的生长率显得尤为重要。但目前尚缺乏一种准确估算单一种类浮游 藻现场生长率的方法。近年来，国际上对细胞周期标志物的研究显示，增殖细胞 核抗原( p r o l i f e r a t i n gc e l ln u c l e a ra n t i g e n ，p c n a ) 可能在浮游藻生长率研究中有巨 大的潜在应用价值，这为藻类生长率的估算提供了新的研究方向。 本研究以我国东海海域常见的赤潮藻东海原甲藻( p r o r o c e n t r u m a o n g h a i e n s e ) 为研究对象，首次克隆得到了东海原甲藻的p c n a 基因和其细胞 色素b 基因的e d n a 全长序列，分别设计了符合实时荧光定量p c r 检测要求的 引物和t a q m a n 探针，建立了检测东海原甲藻p c n a 与c y t b 基因的实时荧光定 量p c r 方法，系统研究了东海原甲藻p c n a 基因表达量在不同细胞周期中的变 化及其与生长率之间的关系，为运用分子生物学技术实现东海原甲藻现场生长率 的估算奠定了基础。 主要研究结果如下： ( 1 ) 通过反转录p c r ( r t - p c r ) 和c d n a 末端快速扩增技术( r a c e ) ， 首次克隆得到了东海原甲藻长为1 0 5 7 b p 的p c n a 基因的c d n a 全长序列和长为 1 1 2 4 b p 的细胞色素b ( c y t o c h r o m eb ，c y tb ) 基因的c d n a 全长序列，并分别对 p c n a 和c y tb 进行了序列比对和系统进化树分析。 ( 2 ) 根据得到的p c n a 与c y tb 基因序列，分别设计了符合实时荧光定量 p c r ( r f q p c r ) 检测要求的引物和t a q m a n 探针，并以1 2 种藻为参照藻，对 所设计p c n a 基因的i 讧q p c r 引物的特异性进行了分析。采用s y b rg r e e ni 染料和t a q m a n 探针两种荧光体系建立了检测东海原甲藻p c n a 与c y tb 基因的 实时荧光定量p c r 的标准曲线。采用s y b r g r e e ni 染料体系得到的曲线方程分 别为：对p c n a ，y = 3 4 0 3 x + 4 0 0 4 8 ，( r = 0 9 9 9 ，其中x 为细胞数对数值，y 为c t 值，r 为相关系数) ；对c y tb ，y = - 3 5 0 1 x + 3 9 3 5 1 ，( r = 0 9 9 9 ) ；采用t a q m a n 探针体系得到的曲线方程分别为：对p c n a ，y = 3 2 1 l x + 3 9 3 0 2 ，( r = 0 9 9 9 ) ； 对c y tb ，y = 3 3 4 0 x + 4 1 0 4 1 ，( r = 0 9 9 7 ) 。通过对标准样品的检测，验证了所 建立标准曲线的准确性。 。( 3 ) 运用建立的定量p c r 方法，系统研究了东海原甲藻p c n a 基因表达量 在不同细胞周期中的变化及其与生长率之间的关系。结果表明，c y tb 基因表达 稳定j 平均单细胞表达量为( 4 5 4 + 4 7 ) 拷贝，在不同的生长阶段表达量变化很小， 是一个潜在的良好的内参基因。与此不同，平均单细胞中p c n a 表达量在培养 的不同阶段变化较大，指数期的含量比平台期高4 倍左右，说明p c n a 表达量 与细胞分裂密切相关。以c y t b 基因为内参基因，p c n a 基因为目的基因，进一 步研究了不同培养条件下p c n a 基因的相对表达量( r e l ) 与生长率之间的关系， 结果发现，r e l 与生长率呈正相关性。 ( 4 ) 以流式细胞术分析了同步培养的东海原甲藻的细胞周期，以r f q p c r 测定了p c n a 基因表达量，研究了不同细胞周期中p c n a 基因表达的变化。结 果表明，同其他物种的p c n a 类似，东海原甲藻p c n a 表达与细胞周期相关， 表达量从g i 后期开始升高，在s 期表达量最高。 本研究为建立p c n a 相对表达量与东海原甲藻生长率之间的关系，进而运 用分子生物学技术实现东海原甲藻现场生长率的估算奠定了基础。 关键词：东海原甲藻；生长率；细胞周期；增殖细胞核抗原；细胞色素b t h es t u d yo ft h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h ep r o l i f e r a t i n gc e l l n u c l e a ra n t i g e ng e n ee x p r e s s i o nl e v e la n dt h eg r o w t ho f p r o r o c e n t r u md o n g h a i e n s e a b s t r a c t p h y t o p l a n k t o ni sas i g n i f i c a n tc o m p o s i t i o no ft h em a r i n ef o o dc h a i n ，a n dp l a y s a n i m p o r t a n tr o l e i ne n e r g yt r a n s f e ra n d n u t r i e n tc y c l e t h em e n s u r a t i o no ft h e p h y s i o l o g i c a la n de c o l o g i c a lp a r a m e t e r ss u c ha st h ei ns i t ug r o w t hr a t e i st h eb a s i co f u n d e r s t a n d i n gt h er e g u l a t i o no fp h y t o p l a n k t o nd y n a m i c s ，c o n s t r u c t i n gt h ee c o l o g i c a l d y n a m i cm o d e l sa n de v e nf o r e c a s t i n gt h eh a p p e n i n go fr e dt i d e t h e r e f o r e ，t h e m e a s l l r e m e mo ft h ei ns i t ug r o w t hr a t eo fs i n g l es p e c i e ss e e m st ob ee s p e c i a l l y i m p o r t a n t w h i l eac o r r e c t l ye s t i m a t i n gm e t h o do f t h ei ns i r eg r o w t hr a t ei ss t i l ll a c k i nr e c e n ty e a r s ，t h es t u d i e so nt h em o l e c u l a rm a r k e r so fc e l lc y c l eh a v es h o w nt h a tt h e p r o l i f e r a t i n g c e l ln u c l e a ra n t i g e n ( p c n a ) i sp o t e n t i a lt ob e u s e dt os t u d yt h e p h y t o p l a n k t o ng r o w t hr a t e ，w h i c hp r o v i d e san e wo r i e n t a t i o no fs m d y i n gt h ea l g a l g r o w t hr a t e i nt h i ss t u d y , p r o r o c e n t r u md o n g h a i e n s e ，o n ed o m i n a n ts p e c i e so fr e dt i d ea l g a e i ne a s tc h i n as e aa r e a , w a st a k e na st h eo b j e c t t h ef u l ll e n g t he d n as e q u e n c e so f p c n ag e n ea n dc y t o c h r o m eb ( c y tb ) g e n eo fp d o n g h a i e n s ew e r eo b t a i n e df o rt h e f i r s tt i m e t h ep r i m e r sa n dt a q m a np r o b e sw e r ed e s i g n e db a s e do np c n aa n dc y tb s e q u e n c e s f u r t h e r m o r e ，t h er f q p c rm e t h o d s w e r ec o n s t r u c t e dt od e t e c tt h et w o g e n e s t h ea b o v em e t h o d sw e r ea p p l i e dt ot h es t u d yo ft h ev a r i a t i o no fe x p r e s s i o n l e v e lo fp c n ag e n ei nd i f f e r e n tc e l lc y c l ep h a s e sf o rpd o n g h a i e n s e ，a n dt h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e ni t se x p r e s s i o nl e v e la n dt h eg r o w t hr a t eg ( d 。1 ) i tp a v e saw a y f o r u s i n gm o l e c u l a rb i o l o g i c a lm e t h o d st oe n u m e r a t ep d o n g h a i e n s ei ns i t ug r o w t hr a t e a c c u r a t e l y t i l em a i nr e s u l t sa r ea sf o l l o w s ： ( 1 ) 1 1 1 e10 57 b pl e n g t hf u l le d n as e q u e n c ee n c o d i n gp c n ag e n eo fp a o n g h a i e n s ew a sc l o n e df o rt h ef i r s tt i m eb yr t - p c ra n dr a c et e c h n i q u e m o r e o v e r ，t h e112 4 b pl e n g t hf u l le d n ao fc y t o c h r o m eb ( c y tb ) g e n eo fp d o n g h a i e n s ew a so b t a i n e d w e d i dt h e s e q u e n c ea l i g n m e n t sa n dc o n s t r u c t e d p h y l o g e n e t i ct r e e so fp c n a a n dc y tb r e s p e c t i v e l y ( 2 ) t h ep r i m e r sa n dt a q m a np r o b e sw e r ed e s i g n e db a s e do np c n aa n dc y tb s e q u e n c e s ，n l es p e c i e s - s p e c i f i c i t yo ft h er f q p c rp r i m e r sf o ra m p l i l y i n gp c n a w a st e s t i n gb yt h eo t h e r12a l g a ls p e c i e s 1 1 1 es t a n d a r dc u r v e sw e r ec o n s t r u c t e dt o d e t e c tt h et w og e n e sb ys y b rg r e e nia n dt a q m a np r o b es y s t e m s ，r e s p e c t i v e l y f o r s y b rg r e e nis y s t e m ，t h ee q u a t i o nf o rd e t e c t i n gp d o n g h a i e n s ep c n aw a sd e f i n e d a sy 亍一3 4 0 3 x + 4 0 0 4 8 ( r = 0 9 9 9 ) w h e r exw a st h el o g a r i t h mo ft h ep l a s m i dc o p y n u m b e r a n dyw a st h ec tv a l u e s ；t h ee q u a t i o nf o rc y tbw a sd e f i n e da sy2 - 3 5 0 1 x + 3 9 3 51 ( r = 0 9 9 9 ) f o rt a q m a np r o b es y s t e m ，t h ee q u a t i o nf o rd e t e c t i n gp d o n g h a i e n s ep c n a w a sd e f i n e da sy = 3 211 x + 3 9 3 0 2 ( r = 0 9 9 9 ) ；t h ee q u a t i o nf o r c y tbw a sd e f i n e d 嬲y = - 3 3 4 0 x + 4 1 0 4 1 ( f 0 9 9 7 ) t h ea c c u r a c yo ft h es t a n d a r d c h iv e sw a sv e r i f i e db yd e t e c t i n gt h ep l a s m i ds a m p l e sw i t ht h ek n o w nc o n c e n t r a t i o n ( 3 ) 1 1 1 ea b o v em e t h o d sw e r ea p p l i e dt ot h es t u d yo ft h ev a r i a t i o no fe x p r e s s i o n l e v e lo fp c n ag e n ei nd i f f e r e n tc e l lc y c l ep h a s e sf o rpd o n g h a i e n s e ，a n dt h e r e l a t i o n s h i pb e t w e e ni t se x p r e s s i o nl e v e la n dt h eg r o w t hr a t e ( d 1 ) w ef o u n dt h a tt h e e x p r e s s i o nl e v e lo fc y tbw a ss t e a d ya n dh a dn oo b v i o u s l yv a r i a t i o nd u r i n gd i f f e r e n t c u l t u r es t a g e s ，a b o u t ( 4 5 4 - 4 - 4 7 ) c o p i e s c e l l ，w h i c hs u g g e s t e dt h a tt h ec y tbc o u l db e ar e f e r e n c eg e n ei npd o n g h a i e n s e t h ee x p r e s s i o nl e v e lo fp c n ag e n eh a dh i g h v a r i a t i o ni nd i f f e r e n tc u l t u r es t a g e s ，a n dv a r i e da b o u t4 - f o l db e t w e e nt h ee x p o n e n t i a l a n ds t a t i o n a r yp h a s e s ，w h i c hs u g g e s t e dt h a tt h ee x p r e s s i o nl e v e lo fp c n ag e n e c o r r e l a t e dw e l lw i t ht h ec e l ld i v i s i o n u s i n gp c n a g e n ea st h eo b j e c t i v eg e n ea n dc y t bg e n ea st h er e f e r e n c eg e n e ，w es t u d i e dt h er e l a t i o n s h i pb e t w e e nt h er e l a t i v e e x p r e s s i o nl e v e lo fp c n ag e n e ( r e l ) a n dt h eg r o w t hr a t ep ( d _ ) u n d e rd i f f e r e n t c o n d i t i o n s i ts h o w e dt h a t ，r e lh a dap o s i t i v ec o r r e l a t i o n 晰廿lt h eg r o w t hr a t e “ ( 4 ) w ea n a l y s e dt h ec e l l c y c l ep h a s eo ft h es y n c h r o n i z e d c e l l so f 户 d o n g h a i e n s eb yf l o wc y t o m e t e r , a n do b t a i n e dt h ee x p r e s s i o nl e v e lo fp c n ag e n eb y i v r f q p c r f u r t h e r m o r e ，w ea n a l y s e dt h ev a r i a t i o no ft h ee x p r e s s i o nl e v e lo fp c n a g e n ei nd i f f e r e n tc e l lc y c l ep h a s e s i tf o u n dt h a t ，t h ee x p r e s s i o nl e v e lo fp c n ag e n e w a sr e l a t e dw i mt h ec e l lc y c l ep h a s el i k i n go t h e ro r g a n i s m ，w h i c hi n c r e a s e df r o mt h e l a t eg 1p h a s e ，a n dp e a k e di nt h esp h a s e t h i sr e s e a r c hp a v e daw a y 。f o re s t a b l i s h i n gaf o r m u l ab e t w e e nt h er e l a t i v e e x p r e s s i o nl e v e lo fp c n ag e n ea n dt h eg r o w t hr a t ep ( d 1 ) ，a n da l s oe n u m e r a t i n gt h e p d o n g h a i e n s ei ns i t ug r o w t hr a t ea c c u r a t e l yu s i n gm o l e c u l a rb i o l o g i c a lm e t h o d s k e y w o r d s ：p r o r o c e n t r u md o n g h a i e n s e ；g r o w t hr a t e ：c e l l c y cle ：p o n a ；c y tb v 本文所用缩写词 c t ：c y c l et h r e s h o l d ，每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数 e d n a - c o m p l e m e n t a r yd n a ，互补d n a c y tb - c y t o c h r o m eb ，细胞色素b d e p c ：d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e ，焦碳酸二乙酯 d n t p - d e o x y r i b o n u c l e o s i d et r i p h o s p h a t e ，脱氧核糖核苷三磷酸 d t t ：d i t h i o e r y t h r i t o l ，二巯基苏糖醇 e b ：e t h i d i u mb r o m i d e ，溴化乙锭 e d t a ：t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d ，乙二胺四乙酸 f c m ：f l o wc y t o m e t r y ，流式细胞术 i p t g ：i s o p r o p y lp - d - 1 - t h i o g a l a c t o p y r a n o s i d e ，异丙基1 3 - d - 硫代半乳糖苷 k d a ：k i l o d a l t o n ，千道尔顿 n c b i n a t i o n a lc e n t e rf o rb i o t e c h n o l o g yi n f o r m a t i o n ，美国国立生物技术信息中心 n u p ：n e s t e du n i v e r s a lp r i m e r ，巢氏通用引物 o r f - o p e nr e a d i n gf r a m e ，开放阅读框 p c n a p r o l i f e r a t i n gc e l ln u c l e a ra n t i g e n ，增殖细胞核抗原 p i ：p r o p i d i u mi o d i d e ，碘化丙锭 p b s ：p h o s p h a t eb u f f e r e ds a l i n es o l u t i o n ，磷酸盐缓冲液 p c r ：p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n ，聚合酶链式反应 r a c e ：r a p i da m p l i f i c a t i o no f e d n ae n d s ，e d n a 末端快速扩增技术 r e l ：r e l a t i v ee x p r e s s i o nl e v e l ，相对表达量 i 强q p c r ：r e a l t i m ef l u o r e s c e n c eq u a n t i t a t i v ep c r ，实时荧光定量p c r r t - p c r ：r e v e r s et r a n s c r i p t a s ep c r ，反转录p c r 技术 t m ：m e l t i n gt e m p e r a t u r e ，d n a 熔解温度 u p m ：u n i v e r s a lp r i m e rm i x ，通用引物混合液 u t r ：u n t r a n s l a t e dr e g i o n ，非编码区 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得( 洼；如遣直 基丝噩噩堑型直盟的：奎拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证书使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并 表示谢意。 学位敝作者躲赵丽设签字嗍垆多月多日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，有权保留并向 国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授 权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影 印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同时授权中国科学技术信息研 究所将本学位论文收录到中国学位论文全文数据库，并通过网络向社会公众 提供信息服务。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：赵厕驾艮 导师签字： 签字日期冲年占月占日 | 丕瀣厦里蘧埴殖细胞弦抗厘基国麦达量墨生拯羞丕的巫究 第一章前言 1 1 东海原甲藻与赤潮 1 1 1 海洋浮游藻 浮游藻是一群具有叶绿素，能够进行光合作用，并生产有机物的自养型 生物。这类生物的藻体仅由一个细胞所组成，所以也称为单细胞藻。浮游藻的 运动能力非常弱，只能随波逐流地漂浮或悬浮在水中作极微弱的浮动。浮游藻 既包括真核生物( e u k a r y o t a e ) ，如硅藻( d i a t o m s ，b a c i l l a r i o p h y t a ) 、甲藻 ( p y r r h o p h y t a , d i n o f l a g e l l a t e ) 、绿藻( c h l o r o p h y t a ) 、金藻( c h r y s o p h y t a ) 、黄藻 f x a n t h o p h y t a ) 等；也包括原核细胞型生物( p r o k a r y o t e s ) ，如蓝藻( c y a n o p h y t a ) 。 绝大多数浮游藻的身体直径一般只有千分之几毫米，只能在显微镜下才能看清 楚其形态结构。浮游藻是海洋中最重要的初级生产者，又是养殖鱼、虾、贝的 饵料。目前已在中国海记录到浮游藻已近两千种。 1 1 2 赤潮 赤潮是指海洋中某种藻类或其他微型生物可能在一定环境条件下爆发性增 殖或聚集达到某一水平，引起水色变化或其它海洋环境异常，并对海洋中其他生 物产生危害，如引起鱼虾贝类的死亡或在海洋生物体内蓄积毒素，最终对摄食这 些有毒种类的其他生物包括人类产生毒害作用的一种生态异常现象。赤潮不仅严 重破坏海洋生态平衡，恶化海洋环境，危害海洋水产资源，危及海洋生物，甚至 威胁着人类的健康与生命安全。随着环境污染的加剧和人类对环境监测重视程度 的提高，有关赤潮爆发的报道越来越频繁，赤潮发生规模也呈现急剧扩大的趋势。 我国是赤潮发生较多的国家之一，其中广东、浙江、山东、辽宁和上海近海， 长江口、珠江口、辽东湾、渤海湾、莱州湾、杭州湾、大亚湾等海域都是赤潮的 多发区。自9 0 年代起，赤潮发生频率和危害性迅速增加，仅1 9 9 0 年就记载了3 4 起赤潮事件。1 9 9 8 2 0 0 0 连续三年在渤海、东海发生了多次面积达到几千平方公 里的特大赤潮，世界罕见，其中渤海1 9 9 8 年9 月发生有史以来最大的一次赤潮， 面积达6 0 0 0 平方公里，造成各种经济损失达6 5 亿元( 郭皓等，2 0 0 4 ) 。进入2 1 世纪 虫国篷注盘堂簋兰位论奎 后，中国赤潮发生的频率明显增加，2 0 0 1 年2 0 0 8 年，中国全海域共发生赤潮6 9 6 起，累计面积1 3 8 4 4 8 平方公里，全海域共发生面积超过1 0 0 平方公里的赤潮2 0 2 次，累计面积约1 2 5 0 6 3 平方公里。赤潮呈现出发生频率高，受害面积扩大等特点 和其它海区相比，近几年无论是赤潮发生的频率还是面积都以东海为最。2 0 0 5 2 0 0 8 年以来，我国海域共发现赤潮3 2 5 次，其中渤海2 8 次，黄海2 7 次，东海2 2 1 次，南海“次，累计面积约7 2 2 5 8 平方公里，而东海的赤潮累计面积高达5 6 2 9 7 平方公里，占赤潮总发生面积的7 7 9 ( 图1 1 ) ( 中国海洋环境质量公报，2 0 0 5 ， 2 0 0 6 ，2 0 0 7 2 0 0 8 ) 。 b 图l12 0 0 5 - 2 0 0 8 年中国沿海吾海区总共笈生赤潮次数( a ，次) 和面积( b 平方公里) 数 据引自中国海洋环境质量公报( 2 0 0 5 2 0 0 8 ) f i g l i t h e f m q u e n e y a n da r e a o f h a b h t h e c o m o f c h i n a f r o m2 0 0 5 t o2 0 0 8 赤潮爆发会对海洋生态系统造成严重的破坏，给海水养殖和捕捞业带来巨 大的损失。赤潮发生过程中，水体会出现高叶绿素a 、高溶解氧，而水质、p h 值也发生显著变化。由于大量的赤潮藻类在光合作用过程中消耗水体中大量的 c 0 2 ，水体酸碱度随之发生较大变化，从而影响了生活在该水体中各类海洋生物 的生理活动，导致海洋生物群落结构的改变；同时，水体表面的大量赤潮生物， 阻挡了阳光到达水体的深度，降低了水体的透明度，从而导致生长于水体深层的 水草和海洋动物大量死亡，底层生物量锐减；赤潮生物竞争性消耗水体中的营养 物质，并分秘出一些抑制其它生物生长的物质造成了水体中生物种类数量减少； 一些赤潮生物( 如某些甲藻) 产生的粘液附着在海洋动物的鳃上，妨碍了呼吸作 用，使大型水生动物窒息而死。另外赤潮毒素对无脊椎动物、野生生物种群和养 殖鱼类等的物理性刺激作用或降低溶解氧或通过毒素对机体产生的伤害可以引 起海洋生物的大量死亡，同时也可能通过鱼类和贝类的富集最终对人类产生毒害 簟雀li 。 一 童 * 0 a 女_ # 丕瀣厘里蘧增殖细胞接抗厦基国麦达量生生长羞丕的研究 作用。这些毒素主要包括麻痹性贝毒( p a r a l y t i cs h e l l f i s hp o i s o n i n g ，p s p ) 、腹泻 性贝毒( d i a r r h e t i cs h e l l f i s hp o i s o n i n g ，d s p ) 、神经性贝毒( n e u r o t o x i cs h e l l f i s h p o i s o n i n g ，n s p ) 、记忆缺失性贝毒( a m n e s i cs h e l l f i s hp o i s o n i n g ，a s p ) 、西加鱼 毒素( c i g u a t e r af i s hp o i s o n i n g ，c f p ) 和蓝细菌毒素( c y a n o b a c t e r i at o x i np o i s o n i n g ， c t p ) 等( 李淑冰等，2 0 0 0 ；郭皓等，2 0 0 4 ；刘仁沿等；2 0 0 4 ；卫玮等，2 0 0 4 ) 。藻毒素 经食物链的方式传送到鱼中，人进食时，间接进入人体内，从而使人类中毒。此 外，接触有害藻会引起皮肤不适；一些挥发性毒素还能对眼睛和呼吸道产生刺激 作用等。赤潮毒素具有毒性大、反应快、防治难等特点，1 9 8 3 - - 一1 9 9 2 年因麻痹 性贝毒引起的中毒人数达1 1 2 人，死亡3 4 人，世界各地也发生多起因食用受污 海产品而引起大范围中毒的事件( 郭皓等，2 0 0 4 ) 。 引发赤潮的生物统称为赤潮生物。赤潮生物除少数属于细菌和原生动物外， 绝大部分属于浮游微藻类，分别隶属于细菌纲、蓝藻纲、裸藻纲、硅藻纲、甲藻 纲、隐藻纲、针胞藻纲、定鞭金藻纲、硅鞭藻纲和原生动物等1 0 个纲类( f u k u y o e ta 1 ，2 0 0 3 ；林永水等，1 9 9 3 ) 。 由于营养盐状态和气候条件的不同，在不同国家或地区引发赤潮的浮游植物 种类并不完全相同。据邹景忠等统计，分布于中国沿海的赤潮生物有1 4 8 种，包 括曾引发赤潮的赤潮生物和尚未引发赤潮但数量以及危害性均较大的赤潮生物 种类，其中已经引发赤潮的赤潮生物有4 3 种，有毒藻2 8 种( 邹景忠，2 0 0 4 ) 。其 中，海洋甲藻是赤潮原因种家族中最重要的类群。近年来我国东海区频繁发生甲 藻赤潮，第一优势种均为东海原甲藻( p r o r o c e n t r u md o n g h a i e n s e ) 。( 这里的东 海原甲藻即具齿原甲藻( 吕颂辉等，2 0 0 3 ) ) 。 赤潮的频发和带来的巨大经济损失受到了全世界的关注，为此联合国政府 间海洋学委员会( i o c ) 和海洋研究科学委员会( s c o r ) 组织了赤潮联合工 作组，并于1 9 9 8 年在丹麦联合发起了全球有害藻华生态学与海洋学研究计划 “g l o b a le c o l o g ya n do c e a n o g r a p h yo fh a r m f u la l g a lb l o o m s ( g e o h a b ) ”，协 调世界各国相关的研究活动。我国也专门成立了相应的组织( c e o h a b ) ， 对赤潮的产生、监测和防治进行研究。而在这些研究计划中，赤潮的监测尤其 是赤潮生物检测技术研究成为其中的重要内容( k i me ta 1 ，1 9 9 8 ；m u d i e e ta 1 ， 2 0 0 2 ) 。通过先进的赤潮生物检测和分析技术可以阐明赤潮发生的机制，并进行 监测、预警、预报和防治，这已成为海洋学家、生物和生态学家必须面临的一个 空国盘洼盘坐墁坐位论毫 极具挑战性的课题f z i n g o n ea n de n e v o l d s e n , 2 0 0 0 ) 。 1 1 3 东海原甲藻 东海原甲藻属于甲藻纲，原甲藻目，原甲藻科，原甲藻属。细胞呈不对称梨 形，长i s 一2 2 m 宽9 1 4u m ，营单细胞生活，但有时形成2 4 个细胞短链( 图12 ) ， 是目前原甲藻属中唯一己知能形成细胞短链的种类( 陆斗定等，2 0 0 3 ) 。本种主要 分布在东海长江口与浙江沿岸水域，垂直分布的特征是在大多数情况下分布在表 层和次表层，赤潮水体的厚度可达1 0 m 左右，赤潮水体的颜色为稀释的酱油色， 赤潮时最大细胞密度达3 6 x 1 0 8c e l l 一，海水温度为1 7 2 0 。c ，盐度为1 9 2 8 。此 种在广东和香港海域也有出现的记录( 1 0 d g k i s s a n d y a n g ，2 0 0 0 ) 。本种在日本和韩 国海域也有分布o o f i g u c l l i ，te 【a 1 ，1 9 9 0 ；l ue ta l ，2 0 0 2 ；l u a n d g o e b e l ，2 0 0 1 ) 。 l 气 【甭 图12 东海原甲藻的光学显微镜和扫描电镜照片( 引自( l u da l ，2 0 0 5 ) ) f i g 1 2 0 d t j c m a ds e a n n m ge l e c t r o n m i c r o s c o p i c i m a g e s o f p d o n g h a i e n s e 东海是我国四个海区赤潮最为频繁的海区。东海在地形、流场及与外海的水 交换等方面较其它海域更为复杂，营养盐在平面分布上由于受长江冲淡水和沿岸 流的影响，呈现出河口、沿岸区浓度高，外海水浓度低的趋势：在黑潮深层水， 黑潮次表层水沿陆坡的涌升处，陆架边缘的冷涡和上升流区也出现了营养盐的高 值区( 林以安，2 0 0 0 ) 。垂直分布上，春、夏、秋层化现象明显，呈现表层低、底 层高的成层现象，冬季较为均匀( 陆赛英等，1 9 9 6 ) 。季节分布上，夏季最高，春 季和冬季次之，秋季最低( 王保栋，2 0 0 3 ) 。由于这里的流系复杂，出现了上升流 和锋面等有利于赤潮发生的物理过程，地处暖温带南界和亚热带北限，温度和光 照适合许多浮游植物的生长( 朱明远等，2 0 0 3 ) 。据报道，东海区共发现1 4 1 种 赤潮肇事藻。近几年甲藻引发的赤潮占主导地位，以东海原甲藻居多，并呈逐年 上升趋势( 表i1 ) 。在东海海区尤其是在长江口海域和舟山海域超过1 0 0 0 平方 公里的大规模赤潮时有出现，特别是自1 9 9 8 年以来，每年都会发生大规模的东海 原甲藻赤潮，赤潮面积大都超过1 0 0 0 平方公里，持续时间常常超过一个月；2 0 0 0 年5 月在舟山中街山海域出现持续2 0 天、最大范围达7 0 0 0 平方公里的赤潮；2 0 0 1 年的5 月在舟山中街山海域和长江口海域分别发生3 0 0 0 平方公里和1 0 0 0 平方公里 的赤潮；2 0 0 2 年5 月在舟山虾峙门海域赤潮持续近1 个月，最大范围达1 0 0 0 平方 公里；2 0 0 3 年5 月在浙江中部鱼山列岛附近海域发现面积达1 0 0 0 平方公里的赤潮； 2 0 0 4 年5 月份在浙江海域发生了超过8 0 0 0 平方公里的东海原甲藻赤潮。在2 0 0 5 和 2 0 0 6 年，出现了东海原甲藻和米氏凯伦藻的混合赤潮，面积超过了1 0 0 0 0 平方公 里，世界罕见( 王金辉等，2 0 0 3 ；陈翰林等，2 0 0 6 ；龙华等，2 0 0 8 ) 。 表1 12 0 0 1 2 0 0 8 年东海主要赤潮藻种 t a b l e1 1c a u s i f i v es p i e c i e so fh a bi nt h ee a s tc h i n as e af r o m2 0 01 - 2 0 0 8 引自中国海洋灾害公报( 国家海洋局，2 0 0 1 2 0 0 8 ) 根据现场调查资料，东海原甲藻在长江口海域和舟山海域赤潮形成的时间一 般在水温低于2 0 的5 月份前后( 王金辉等，2 0 0 3 ) ，5 月下旬至6 月上旬，当水温升 至2 0 - 一2 3 时，东海原甲藻与中肋骨条藻共同占优势；6 月中旬以后，当水温超 过2 3 时，中肋骨条藻成为优势种群。东海原甲藻和中肋骨条藻这两种东海常见 的赤潮生物，自然条件下在其赤潮形成过程中有明显演替现象。赤潮形成涉及复 杂的生态学和海洋学过程，受多种因素的影响，如海水温度、盐度、营养盐组成、 生物间相互作用( 包括摄食、种间竞争、细菌等) 、水动力过程、天气等都会影 响到赤潮的形成。为了研究这两种赤潮生物暴发机理、两种生物间的相互作用以 5 及其它理化因子对其爆发赤潮的影响，近几年来开展了很多研究工作( 王金辉， 2 0 0 3 ；李瑞香等，2 0 0 3 ) 。大部分学者认为，东海原甲藻的最适温度在1 8 2 1 ( 王 金辉，2 0 0 3 ) ，而该海域5 月份时的温度和盐度正适合东海原甲藻的生长需求。在 对营养盐的需求方面，东海原甲藻可以忍受低营养盐环境，而中肋骨条藻细胞增 长需要较丰富的营养盐环境( 王宗灵等，2 0 0 6 ；李瑞香等，2 0 0 3 ) 。在长江口等磷限 制性富营养化环境中，东海原甲藻在磷含量较低时具有较强的种间竞争能力，中 肋骨条藻的生长则受到限制( 王金辉，2 0 0 3 ；李瑞香等，2 0 0 3 ；陈炳章等，2 0 0 5 ) 。但 是5 月以后随着降水量的增多，磷酸盐得到补充，在营养盐充足的环境中中肋骨 条藻具有竞争优势，因此中肋骨条藻靠快速繁殖取代了东海原甲藻爆发( 王宗灵 等，2 0 0 6 ；李瑞香等，2 0 0 3 ) 。 为了进一步探索东海原甲藻赤潮形成机理，大多学者对东海原甲藻的生理生 态学方面进行了大量研究。一般认为，长江口海域和舟山海域的富营养化是连续 几年发生罕见的大规模赤潮的物质基础。因此主要对东海原甲藻的营养盐的营养 生理及重金属的毒性效应等方面进行了研究( 王长友等，2 0 0 8 ；吕颂辉等，2 0 0 6 ； 欧美珊等，2 0 0 6 ) 。也有人研究其他微藻，如塔玛亚力山大藻( a l e x a n d r i u m t a m a r e n s e ) 及某些大型藻，如孔石莼( u l v ap e r t u s a ) 、龙须菜( g r a c i l a r i a l e m a n e i f o r m i s ) 、小珊瑚藻( c o r a l l i n a p i l u l i f e r a ) 、鼠尾藻( s a r g a s s u mc i n e r e u m ) 等对东海原甲藻产生的化感效应( w a