（生态学专业论文）同域分布的偏花报春和海仙报春的传粉生态学研究.pdf

兰州大学硕士学位论文 摘要 从传粉生物学的角度来看，同域分布的植物通过开花物候、传粉昆虫而形 成一个有机的整体，每种植物的繁殖适合度都会受到其它植物繁殖对策的影响。 尤其是当同域分布的是亲缘关系很近的植物物种时，这种关系会更加复杂，因 为它们有可能相互杂交，而杂交是植物进化一种重要的驱动力，研究两个同域 分布的物种以及它们之间形成的杂交群体一直以来就是来植物进化研究的热点 领域之一。在云南香格里拉两型花柱植物偏花报春和海仙报春存在同域分布， 并且在它们其间发现了一些疑似杂交个体，本研究从具体问题出发，验证自然 杂交类群的真实存在，探讨偏花报春和海仙报春的生殖隔离机制，以期对这两 种同域分布的两型花柱植物的传粉生态学有个全面的了解。 疑似杂交后代的多数形态特征都介于两个亲木之间，但是植株高以及花冠 管长是越亲性状，比亲本显著的高或者长；疑似杂交后代的i t s 序列，在亲本 之间有变异的位点都呈现重峰，而克隆测序分别得到了两种亲本的i t s 类型， 从而证明自然杂交类群的真实存在。我们进一步利用叶绿体基因r p l l 6 内含子 序列来分析这些杂交个体的母系来源，结果显示所有的2 6 个个体中，有1 6 个的 r p l l 6 内含了序列和海仙报春一致，而另外1 0 个和偏仡报春一致。说明这两个 物种都作为母本参与了杂交个体的形成；因而它们之间的杂交是双向的，而不 是单向的。 在上一步研究的基础上，我们对同域分布的偏花报春和海仙报春的传粉生 物学进行了研究，并以此来估算它们之间的生殖隔离。其中这两个物种的开花 物候基本一致，故对生殖隔离完全没有贞献；由于传粉者的类群基本相一j 且它 们的专一性不高，故导致传粉者对生殖隔离只有一定的贡献，对于偏花报春和 海仙报春，其值分别为0 3 7 0 6 3 和0 4 1 5 5 8 ；由于前面的生殖隔离强度还不是很 大，紧跟其后的花粉竞争的隔离对于阻断这两种物种之间的生殖隔离有较强的 作用，对于偏花报春和海仙报春，其值分别为0 6 1 5 0 7 和0 4 1 4 2 2 。虽然f l 代杂 i 兰州大学硕士学位论史 合子种子萌发能力很差，但是由于是最后发挥作用，就导致其对偏花报春和海 仙报春生殖隔离的贡献有限，对于偏花报春和海仙报春，其值分别为o 0 1 4 1 8 和0 1 5 l l o 。总的说来，虽然偏花报春和海仙报春之间存在自然杂交类群，但是 它们之间的生殖隔离机制基本完好，同时海仙报春的总生殖隔离指数小于偏花 报春( 0 9 8 0 9 0 1 0 ) 。 关键词：杂交；两型花柱；开花物候；传粉昆虫专一性；花粉竞争；f l 代杂合 子适合度。 兰州大学硕士学位论文 a b s t r a c t r e p r o d u c t i o nb ym o s tp l a n ts p e c i e so c c u r si nac o m m u n i t yo fo t h e rf l o w e r i n g s p e c i e sa n dad i v e r s ef a u n ao fp o t e n t i a lp o l l i n a t o r s t h i sc o m m u n i t yc o n t e x ts h a p e s b o t hp o l l i n a t o rb e h a v i o ra n de c o l o g ya n dt h eo u t c o m ea n de v o l u t i o no fp l a n t r e p r o d u c t i o n w h e nt h ec o o c c u r r i n gp l a n t sa r ec l o s er e l a t e ds p e c i e s ，t h ef a c tt h a t t h e yc o u l de a s i l yh y b r i d i z ew i t ha n o t h e rm a k et h es i t u a t i o nm o r ei n t r i g u i n g ，b e c a u s e h y b r i d i z a t i o ni so n eo ft h em o s ti m p o r t a n te v o l u t i o nf o r c e d i s t y l o u sp l a n tp r i m u l a s e c u n d i f l o r aa n dp p o i s s o n i ia r es y m p a t r i cd i s t r i b u t e da ts h a n g r i l ac o u n t y ， y u n n a n ，c h i n a ，a n ds o m ec u r i o u si n d i v i d u a l sw i t h i n t e r m e d i a t em o r p h o l o g y o c c a s i o n a l l yh a p p e n e di nt h ef i e l d t ou n d e r s t a n dt h ep o l l i n a t i o ne c o l o g yo ft h et w o s y m p a t r i cd i s t r i b u t e dd i s t y l o u sp l a n t s ，w ee x p l o r e dt h et r u en a t u r eo ft h e s e i n d i v i d u a l sw i t hi n t e r m e d i a t em o r p h o l o g y , m e a s u r e dt h er e p r o d u c t i v ei s o l a t i o n m e c h a n i s m sb e t w e e nps e c u n d i f l o r aa n d 尸p o i s s o n i i ，a n de v a l u a t e dt h ee f f e c to f n e c t a rr o b b i n go nr e p r o d u c t i v ef i t n e s so fp s e c u n d i f l o r a m o s tm o r p h o l o g i c a lc h a r a c t e r so ft h e s ec u r i o u si n d i v i d u a l sw e r ef o u n dt ob e i n t e r m e d i a t eb e t w e e np a r e n t a ls p e c i e s ，b u tp l a n th e i g h ta n dc o r o l l at u b el e n g t hw e r e s i g n i f i c a n t l yt r a n s g r e s s i v e m o l e c u l a ra n a l y s e sb a s e do nn u c l e a ri n t e r n a lt r a n s c r i b e d s p a c e r ( i t s ) a d d i t i v i t ya n d o rt w ot y p e so fc l o n e ds e q u e n c e s ( c o r r e s p o n d i n g r e s p e c t i v e l yt ot h o s eo ft w op a r e n t a ls p e c i e s ) c l e a r l ys u g g e s t e dt h a tt h e s ei n d i v i d u a l s h a v eh y b r i d o r i g i nb e t w e e npp o 括s o n i ia n dps e c u n d i f l o r a w ef u r t h e ru s e d m a t e r n a l l yi n h e r i t e dc h l o r o p l a s td n af r a g m e n t ( r p l l6i n t r o n ) t ot r a c em a t e r n a l c o m p o s i t i o no ft h eh y b r i d s a m o n g2 6h y b r i d s ，16 ( t e nt h r u m s ，s i xp i n s ) p o s s e s s e d t h e 尸p o & s o n i ih a p l o t y p e ，w h i l et e n ( t w ot h r u m s ，e i g h tp i n s ) h a dt h e 尸s e c u n d i f l o r a h a p l o t y p e t h e s er e s u l t ss u g g e s tt h a tb o t hs p e c i e sh a dt o g e t h e rs e r v e da st h em o t h e r d o n o r so ft h eh y b r i d sa n dr e c i p r o c a lh y b r i d i z a t i o nb e t w e e nt w os p e c i e ss e e m st ob e s y m m e t r i c a l ，r a t h e rt h a nu n i d i r e c t i o n a l 鼍州大学硕士学位论文 e m p i r i c a le s t i m a t e so ft h er e l a t i v ei m p o r t a n c eo fd i f f e r e n tb a r r i e r st og e n ef l o w b e t w e e nr e c e n t l yd i v e r g e d s p e c i e sa r ei m p o r t a n tf o ru n d e r s t a n d i n gp r o c e s s e so f s p e c i a t i o n ii n v e s t i g a t e dt h ef a c t o r sc o n t r i b u t i n gt or e p r o d u c t i v ei s o l a t i o nb e t w e e n t h es y m p a t r i cd i s t r i b u t e dp p o & s o n i ia n dps e c u n d i f l o r a t h es t u d i e dr e p r o d u c t i v e i s o l a t i o nm e c h a n i s mi n c l u d e d f l o w e r i n gp h e n o l o g y , p o l l i n a t o rf i d e l i t y , p o l l e n c o m p e t i t i o n ，a n dr e l a t i v eh y b r i df i t n e s s e x c e p tf l o w e i n gp h e n o l o g y ，w ef o u n d s u b s t a n t i a lr e p r o d u c t i v eb a r r i e r sa t m u l t i p l es t a g e s i nt h el i f e h i s t o r y o fp s e c u n f i f l o r a a n dpp o i & o n i i f o rp s e c u n d i f l o r a ，p o l l i n a t o r f i d e l i t y , p o l l e n c o m p e t i t i o n ，a n dr e l a t i v eh y b r i df i t n e s s a r e0 3 7 0 6 3 ，0 615 0 7a n d0 01418 ， r e s p e c t i v e l y f o rpp o i s s o n i i ，t h e ya r e0 4 1 5 5 8 ，0 4 1 4 2 2 a n d0 1 511 0 ，r e s p e c t i v e l y o u rr e s u l ts u g g e s t e dt h a ta l t h o u g ht h e r ew e r es o m eh y b r i d si nt h ef i e l d ，t h e r e p r o d u c t i v ei s o l a t i o nm e c h a n i s m sb e t w e e n 尸s e c u n d i f l o r aa n d 尸p o i s s o n i iw e r e a l m o s tc o m p l e t e l yi n t a c t ；a n dt h ef a c tt h a tt h et o t a lr e p r o d u c t i v ei s o l a t i o ni n d e xo fp p o & o n i iw a ss m a l l e rt h a nps e c u n d i f l o r a s ( 0 9 8 0 9 0 0 9 9 9 8 8 ) ，a r ec o n s i s t e n tw i t hp p o & s o n i id e v o t e dm o r em o t h e rd o n o rt h a nps e c u n d i f l o r a k e yw o r d s ：h y b r i d i z a t i o n ；d i s t y l y ；f l o w e r i n gp h e n o l o g y ；p o l l i n a t o rf i d e l i t y ；p o l l e n c o m p e t i t i o n ；fish y b r i df i t n e s s v 原创性声明 本人郑重声明：本人所呈交的学位论文，是在导师的指导 下独立进行研究所取得的成果。学位论文中凡引用他人已经 发表或未发表的成果、数据、观点等，均已明确注明出处。 除文中己经注明引用的内容外，不包含任何其他个人或集体 己经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究成果做出重要 贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的 法律责任由本人承担。 论文作者签名：扭时间：垆1 年 匆，日 学位论文使用授权的声明 本人在导师指导下所完成的论文及相关的职务作品，知 识产权归属兰州大学。本人完全了解兰州大学有关保存、使 用学位论文的规定，同意学校保存或向国家有关部门或机构 送交论文的纸质版和电子版，允许论文被查阅和借阅：本人 授权兰州大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有 关数据库进行检索，可以采用任何复制手段保存和汇编本学 位论文。本人离校后发表、使用学位论文或与该论文直接相 关的学术论文或成果时，第一署名单位仍然为兰州大学。( 保 密论文在解密后应遵守此规定) 研究生签名：客塾笙l 导师签名： 兰州大学硕士学位论文 1 引言 生命体的定义就是可以自我繁殖的有机体，生命体是靠繁殖延续下去的， 个体的适合度也就由其繁殖能力来衡量，所以繁殖是进化过程的核心，对于任 何影响个体繁殖成功的因素都会受到强烈的选择。由于植物固着牛长的特性， 不能主动回避不利环境，必须忍受其生存的环境，其繁殖过程就很容易受到其 它非生物因子和生物因子的影响，这样反而导致植物进化出了多种多样的繁殖 对策。 植物繁殖的多样性体现在多种多样的传粉媒介、性系统的多样性以及花部 特征的多样性。植物的传粉媒介可以是无生命的比如风和水，也可以是有生命 的各种动物，比如昆虫和鸟类，植物也往往进化出了和特定媒介相关联的极其 多样的花部特征和适应机制。如风媒植物的花通常是单性，雌雄异株或者雌雄 异化同株，如果是后面一种情况时，同株植物雌雄的性表达还往往存在时空分 离，常见的是空间排列方式为植株内雌花处于雄花的上方，这样花粉不会落在 植株自己的柱头上，就可以防止自交的发生；同时风媒花通常产牛大量的花粉， 花粉粒很小，光滑，这样有利于在风中漂浮和长距离传播，而单花的胚珠数很 少，柱头通常膨大分叉以利于捕获花粉。 被予植物具有构件生产的特性，花和花序多级重复构成一个繁殖单位，这 使得植物能通过时间和空间上不同组合以不同方式来行使雌雄配子的功能。虽 然雌雄配子在空间上的的组合方式是多种多样的，但大多数被子植物都是雌雄 同体的，并日大部分是雌雄同花( y a m p o l s k y & y a m p o l s k y1 9 9 2 ) 。这样的好处 就是雌性功能和雄性功能可以同时行使，共用一套吸引传粉者的装置，使得两 个性别同时受益，就节省了吸引传粉昆虫的投资( 张大勇2 0 0 4 ) 。但是雌雄i 司花， 植物就可以自交，自交对植物繁殖适合度的影响是很复杂的。一方面可以起到 繁殖保障的作用，当种群密度很低或者缺少传粉者导致外来花粉不足时，自交 就可以提高植物的繁殖成功率，达尔文就认为繁殖保障是主要推动自交进化的 因子( d a r w i n1 8 7 7 ) ；自交还具有自动选择优势，即自交同时通过花粉和胚珠 1 兰州大学硕士学位论文 途径向后代传递遗传物质。但是另一方面，雌雄同花的不利一面也是显而易见 的，其主要体现在白交衰退和雌雄t 扰。自交衰退是指自交后代相对异交后代 其平均适合度的降低，因为自交会导致有害基因的纯和，自交植物也只能通过 家系间的选择来适应环境的改变( j a r n e & c h a r l e s w o r t h1 9 9 3 ) ，因此很容易被环 境所淘汰并导致灭绝。自交往往还伴随着较高的交配代价，这是因为自交可以 导致异交花粉输出量的下降，即花粉贴现，或者导致异交胚珠量的下降，即胚 珠贴现( l l o y d19 8 4 ；b a r r e t t2 0 0 2 ) 。 为了促进花粉有效传播，消除自交和自交带来的不利影响，植物发展出多 利，多样的方式来避免自交。自交不亲和是植物最常见的一种阻止自交、促进异 交的机制。但是自体授粉在这些植物中仍然存在，就可能导致胚珠贴现和花粉 贴现，带来很高的交配代价。所以仅仅自交不亲和往往不能完美的解决白交带 来的不利因素。因此有花植物还进化出了各种奇妙的花部机制来避免自交和两 性功能的冲突。其中最普遍的就是雌雄异熟和雌雄异位，前者是雌雄功能时间 上的分离，后者是空间上的分离，它们都可以减少白花传粉的几率。 其中两型花柱是种较为特殊的雌雄异位现象。是指同，居群中的个体存 在两种不同的花表型，其中一种表型的花柱很长，而花丝很短( 长花柱表型) ； 另一种表型的花柱很短，但是花丝很长( 短柱头表型) ，这两种类型在柱头高度 和花药高度呈互补对应( 图1 ) 。这种柱头和花药的两型性往往伴随着由孢子体 控制的、双位点自交和l j 型不亲和系统以阻止自交和i 一型交配，l 司时往往还具 有系列附属的花部特征多样性，包括花的颜色( w o l f e2 0 0 1 ) ，花的大小( p a i l l e r & t h o m p s o n1 9 9 7 ) ，花粉和柱头的大小以及形态( o m d u f f1 9 7 0 ) ，和花蜜含量 ( a r r o y o & d a f n i1 9 9 5 ；c o n t r e r a s & o m e l a s1 9 9 9 ) 。已经报道的具有两型花柱的 植物分布在2 8 个科中( g a n d e r s1 9 7 9 ；b a r r e t te ta 1 2 0 0 0 ) 。自达尔文以来，进化 生物学家就对两型花柱复杂的性器官安排方式有着了浓厚的兴趣，一直以来都 是研究植物繁育系统演化以及花部形态适应的热门材料。 2 簟州大学硕士学位论文 短花柱表型( t h r u m )长花柱表型( p i n ) 图l 两种表犁的柱头高度和花药高度旱互补对应。箭头方向代表合法花粉流方向。 f i g 1r e c i p r o c a la n t h e ra n ds t i g m ap o s i t i o n si nt h ep i na n dt h r u mf o r m so fad i s t y l o u sp l a n t t h ea r r o w si n d i c a t et h ed i r e c t i o n so fc o m p a t i b l ep o l l i n a t i o n s 由于每种植物都是生活在特定群落之中的，其繁殖对策还受到其它同域分 布植物的影响，这样各种植物通过开花物候、传粉昆虫而形成一个有机的整体。 首先开花物候对于植物成功繁殖有着至关重要的重用( k u d o2 0 0 6 ) 。如果不同 植物物种选择相继开花时，每个物种就像接力赛的选手一样，可能会在不同时 期提供给传粉者食物，从而每种植物都可以成功繁殖( r a t h c k e1 9 8 3 ) 。对于在 相同时间开花的植物来说，它们可以选择不同的传粉昆虫来避免相互之间的干 扰，但当它们的传粉者较一致时，它们之间就有可能存在对传粉者的竞争，同 时导致自己花粉的损失和异种花粉的干扰( r a t h c k e1 9 8 3 ) 。相同时间开花也可 能供给更大的传粉者群落( s a k a ie ta 1 1 9 9 9 ；l o b oe ta 1 2 0 0 3 ) ，就有可能提高传 粉昆虫的对每种植物的拜访频率，推动所有植物成功繁殖，传粉者还有可能使 用身体的不同部位给不同植物传粉，使得物种间产生机械隔离，因此每个植物 物种的繁殖适合度都会得到很大的提高。 当同域分布的是亲缘关系很近的植物物种时，这种关系会更加复杂，因为 它们有可能彼此杂交。而杂交是植物进化的一利一重要驱动力。由于杂合了的适 合度。般都比较低，这样就会导致亲本用于投资杂交后代的那部分资源被浪费， 因此使得亲本的适合度降低了。对于亲缘关系很近而同域分布的植物，植物往 往通过强化作用进化出有效的生殖隔离机制，这些机制就包括物候的隔离、传 粉者的专一性以及机械隔离等。杂交会增加遗传多样性，为植物抵抗不良环境、 3 簟州大学硕士学位论文 占领新牛境提供遗传基础。杂交也可能导致新物种的形成，特别是芹源杂交多 倍化是新物种形成、多样化的重要机制之一( a m o l d1 9 9 7 ；a r n o l d2 0 0 3 ；r i e s e b e r g e ta 1 1 9 9 8 ) 。研究两个同域分布的物种以及它们之间形成的杂交群体也就一直以 来是来植物进化研究的热点领域之一。 其中对同域分布的亲缘关系很近的物种之间的生殖隔离机制更是具有十分 重要是理论意义，因为物种的不断分化造就了现今的牛物多样性，而牛殖隔离 的产生是物种形成的中心问题( d o b z h a n s k y1 9 3 7 ；m a y r1 9 4 2 ；c o y n e & o r r 2 0 0 4 ) 。研究物种生殖隔离机制可以帮助我们理解在什么条件下物种形成可能发 生，以及自然选择在物种形成过程中所扮演的角色，并促进物种形成过程的分 子生物学研究。根据时间先后，生殖隔离可以被分为合子前的隔离( p r e z y g o t i c i s o l a t i o n ) 和合子后的隔离( p o s t z y g o t i ci s o l a t i o n ) ( m a y r1 9 6 3 ；g r a n t1 9 8 1 ) 。合 子前的隔离包括生态地理的隔离( e c o g e o g r a p h i ci s o l a t i o n ) ，物候的隔离 ( t e m p o r a li s o l a t i o n ) ，花部的隔离( f l o r a li s o l a t i o n ) 以及配子隔离( g a m e t i c i s o l a t i o n ) ；合予后的隔离可以是内在的( i n t r i n s i c ) ，也可以是外在的( e x t r i n s i c ) ( m u l l e r1 9 4 2 ；d o b z h a n s k y1 9 3 7 ) ，前者包括杂交类群生活力低下以及杂交个体 不育，而后者包括杂交个体对牛态环境的适应力低下( h y b r i de c o l o g i c a l i n f e r i o r i t y ) 以及低的繁殖机会( l o wm a t i n gs u c c e s s ) 。由于近十年来分子生物 学的迅猛发展，无论在理论上还是实验上，同域物种形成被证明都是有可能发 生的( p e n n i s i2 0 0 6 ) ，但是被广泛接受的物种形成机制一直都是异域物种形成， 在异域物种形成过程中，最初产生的生殖隔离机制是生物体对各种异质环境适 应的副产品( c o y n e1 9 9 8 ；d o b z h a n s k y1 9 3 7 ；m a y r1 9 5 9 ) ，并在_ 次接触过程中 由于杂交后代的适应性低下，使得合子前的隔离得到加强一强化作用 ( r e f o r c e m e n t ) ( d o b z h a n s k y19 3 7 ；n o o r19 9 7 ) 。 虽然前人对各种生殖隔离方式都做了很多的研究，但是很少有人系统的评 估过这系列生殖隔离机制各自的相对作用( r a m s e y2 0 0 3 ；c o y n e1 9 9 7 ； h u s b a n d2 0 0 4 ；k a y 2 0 0 6 ；k a y2 0 0 6 ；m a r t i n2 0 0 7 ) 。各种生殖隔离是相继发生作 用的，每种生殖隔离方式对总的基因流的阻断作用一仅取决于它本身的强度， 也取决于它发生的次序。只研究其中一部分生殖隔离方式就有可能歪曲它对基 4 簟州大学硕士学位论文 因流阻断的实际作用。两个物种问的牛殖隔离可能也不是对称的，由于基因流 的方向不同，生殖隔离的机制也有可能有些区别( l e v i n1 9 7 8 ；a r n o l d1 9 9 6 ； c o y n e1 9 9 8 ) 。囚此为了深入研究生殖隔离在物种形成过程中的相对作用，应该 考虑基因流的方向，分别对这一系列的生殖隔离方式进行评估。 但是在物种形成过程中，到底那种生殖隔离最开始发生作用是很难判断的。 并不是所有的分歧( d i v e r g e n c e ) 都会导致物种形成，只有那些能影响基因流的 分歧才能使物种开始分化，一旦生殖隔离存姊妹种中形成，它们会继续加深基 因还有表型特征上的不同，而这些也会显著地加深它们之间的生殖隔离，要从 现在物种之间的生殖隔离来判断导致物种分化的那些凶素就会十分困难。比如， 合子后的隔离己经在实验室中被深入地研究了，但是我们不知道它是在物种形 成过程中还是物种形成后形成的，也就不能推断它在物种分化过程中扮演了什 么角色。研究正在分化的物种或者亲缘关系很近的物种之间的生殖隔离，能直 接地了解到物种形成过程的驱动力( c o y n e & o r r2 0 0 4 ) 。 生物多样性是物种形成结果的直接表现，凶此生物多样热点地区一直是研 究物种形成与生殖隔离的关键地区。横断山区位于喜马拉雅山脉的东端，地理 范围_ 丰要包括我国西藏东部、四川西部和云南西北部的广大地区，由一组近南 北走向的许多大江切割而成的”横断”山系。该地区复杂的地形与多变的气候条 件结合致使其生物多样性极其丰富，拥有大量的特有动植物物种，在面积大约 为5 0 万平方公里的一个范围内，分布有8 0 0 0 余利- 种了植物，可能是是北温带 生物多样性最高的地区( m y e r se ta 1 2 0 0 0 ；b o u f f o r d1 9 9 8 ) 。 许多植物在横断山区广泛的快速成种，尤其引人注目的是龙胆属，报春花 属，马先蒿属，杜鹃花属等等，属内的物种数在3 0 0 以上。但是关于它们快速 成种的机制还没有得到深入而系统的研究。已有的研究主要集中在分子生物学 上( l i u2 0 0 6 ；l i u2 0 0 6 ；m e n g2 0 0 7 ；w a n g2 0 0 7 ) ，野外工作还比较分缺乏。导致 横断山区生物多样性如此之高的原因可能有如下儿个：1 横断山区经历了非常 巨大的地史变迁过程。在地质变迁过程中形成复杂独特的自然地理条件和气候 条件，造就了环境广泛的异质性和地理隔离，环境的异质性致使物种各自适应 性进化，而地理隔离又有效的阻止了基因流，物种就在在这样的环境中快速辐 s 兰州大学硕士学位论文 射成种。2 在第四纪，气候在冰期和问冰期反复改变，在横断山区形成了很多 的避难所，许多第三纪以及北极成分的植物从北向南迁移，各类成分这里保存、 汇集、分化发展。3 传粉者在某一些类群的发展过程中可能发挥了关键作用。 比如在这里马先蒿得到了广泛的发展，大概有3 0 0 个利- 分布于此，虽然各利- 马 先蒿的传粉者主要都是熊蜂，但是种间花部特征却显示了很大的变异。可能在 青藏高原的隆升过程中或者冰期，横断山区的气温总的变低，很多传粉昆虫开 始灭绝，存活下来的数量也减少了。因此植物面对着很强的传粉限制，由于传 粉者的缺失植物受到强烈的选择，而发展出了不同的手段来吸引能适应新环境 的主要传粉昆虫，面对这种快速进化，有限的基凶流不能阻挡物种的分歧，最 终可能进化出不同的物种，即使它们有时候都去适应相同的传粉者，但是由于 用不同的花结构去适应，就有可能机械隔离或者传粉者的偏好导致牛殖隔离的 产生。 报春花属( p r i m u l a ) 是报春花科( p r i m u l a c e a e ) 最大的属，全世界大约有4 3 0 种，该属主要分布于北半球温带和高山地区，其巾巾国横断山区是报春花属植 物最集中分布的地区( r i c h a r d s2 0 0 3 ) 。大部分报春花都是两型花柱植物，其被作 为两型花柱植物研究的模式物种而受到广泛的关注，因此长期以来对其繁殖牛 态学的研究较多，但是大多数都是关于pv e r i s 、pv u l g a r i s 、和ps i e b o l d i i 三个 物种的研究，而对于中国众多的该属物种的研究却并不多。 报春花属灯台报春组大约有2 0 个种，全分布于巾国。这个组有两个比较特 殊的地方，一是组内种与种之间几乎都可以杂交( r i c h a r d s2 0 0 3 ) ；另外这个组的 繁育系统比较复杂，有5 个种的花同型，还有1 3 个种存在花两型，另外3 个种 花同型或者两型。这个组内分布较多较广的两个种是偏仡报春( p p o i s s o n i i ) 和海仙报春( ps e c u n d i f l o r a ) ，其染色体基数都是2 n = 2 2 。 最初不同分类学家对偏花报春的系统位置提出不同的意见。早期分类学家 认为其应位于钟花报春组，比如b a l f o u r 根据其钟状花冠，于1 9 1 3 年将其放在 钟花报春组，并且在s m i t h 和f o r r e s t ( 1 9 2 8 ) 提出的分类系统中被沿用。但是也 有部分分类学家认为其应位于灯台报春组，比如w e n d e l b o ( 1 9 6 1 a ，1 9 6 1 b ) 认为 偏花报春叶常绿，种子表面不光滑，花表面不被粉，这与钟花报春组植物特征 6 兰州大学硕士学位论文 明显不同，建议将偏花报春置于灯台报春组。近年来的细胞学证据( 朱慧芬e ta 1 2 0 0 1 ) 和分子生物学的证据( m a s te la 1 2 0 0 1 ) 表明偏花报春应该位于灯台报春 组，并且和海仙报春的系统位置很接近。 在香格里拉，海仙报春和偏花报春分布都较为广泛，并且在一些地方它们 存在同域分布，在这些样地中，往往容易发现些形态特征居于它们中间的个 体，而这些个体有可能是它们的自然杂交后代。我们认为海仙报春和偏花报春 这两种植物是研究两型花柱植物传粉生物学以及同域物种生殖隔离机制彳i 可多 得的材料，因此在2 0 0 6 2 0 0 8 开展了以下工作。 1 ) 偏花报春和海仙报春自然杂交类群的鉴定 通过对偏花报春、海仙报春和疑似杂交后代的形态特征比较和运用分子生物 学的方法，证明海仙报春和偏花报春之间自然杂交群体的存在。 2 ) 偏花报春和海仙报春的传粉生态学研究 在前面的基础上，对偏花报春和海仙报春各自的传粉生态学进行了研究，并 进一步用来估算它们之间的生殖隔离。 7 鼍州大学硕士学位论文 2 1 研究地点 2 材料和方法 本研究于2 0 0 6 年、2 0 0 7 年和2 0 0 8 年在云南西北部的香格里拉高山植物园 及其附近区域进行。香格里拉高山植物园( s g b ，2 7 5 4 n9 9 3 8 e ，3 3 0 0 m ) 位于 县城以北1 3 公里，该地是一处湿生草甸。另外部分实验开展于纳帕海自然保护 区的号目古村庄( h m g ) ，植物园旁的贡兵村( g b ) ，纳帕海乃日村庄。香格里拉 的年平均气温为5 4 、最冷月平均气温3 8 ，最热月平均气温1 3 2 。5 4 ， 年均降雨量2 6 8 - - 9 4 5 毫米，无霜期1 2 9 一1 9 7 天。 研究地点地位于横断山区的腹地。横断山脉( 介于北纬2 2 0 一- 3 2 0 0 57 ，东 经9 7 0 1 0 3 0 ) 位于青藏高原东南部，通常为四j i i 、云南两省西部和西藏自治区 东部南北向山脉的总称。东起邛崃山，西抵伯舒拉岭，北达昌都、甘孜至马尔 康一线，南抵中缅边境的山区，面积6 0 余万平方公里。横断山及东喜马拉雅地区 被认为是世界上1 0 个生物多样性热点地区之一( m y e r se ta 1 2 0 0 0 ) 。该地区东 与成都盆地接壤，西邻青藏高原，复杂的地理和气候条件造就了这里独特的生 物多样性。地势从海拔几百米的河谷地带陡然攀升到六、七千米的山脉顶部， 错落生长着谱系完整的植被类型：海拔较低的地方是热带、亚热带常绿阔叶林， 再往高处依次是温带落叶阔叶林、阔叶针叶混交林、伴有茂密竹林和杜鹃等下 层林木的亚高山针叶林，。直到树木线以上的高山草甸。这一地区的树木线可 达到海拔4 6 0 0 米的高度，堪称世界之最。夏季月份位于西北部的青藏高原把东 南季风挡在了该区之内，致使该地区形成多云潮湿的封闭环境，其高山植物之 茂盛是别处所罕见的。该地区复杂的地形与有利的湿润条件的独特结合致使其 生物多样性极其丰富，拥有大量的特有动植物物种，可能是世界上温带区域植 物物种最丰富的地区。另外在该地区已发现的1 2 0 0 0 多种高等植物中有2 9 是 本地区的特有种( m y e r se ta 1 2 0 0 0 ) 。此外，横断山区南北向的江河和峡谷，便 于植物的南北交流，热带植物上升和温带植物下降都在长期连续进行( 吴征镒 和王荷生1 9 9 3 ) 。另外，地质历史上的各类事件，如喜马拉雅的隆升，使得这 8 鼍州大学硕士学位论文 一区域内几乎拥有了北半球的各类植物区系成分，成为了许多物种和类群的现 代分化中心。 2 2 标本记录 网上查阅中科院植物所标本馆( p e ) 、中科院昆明植物标本馆( k u n ) 、中科 院西北高原生物研究所植物标本馆( h n w p ) 、中科院华南植物园标本馆( i b s c ) 的偏花报春和海仙报春两个种的标本记录，了解标本的采集点、生境、采集时 间以及总的分布情况，并对两个种的分布地进行野外实际调查。 2 3 偏花报春和海仙报春之间的自然杂交 2 3 1 取样方法 研究地点位于云南省香格里拉县纳帕海自然保护区的号目古村庄( h m g ) ， 海仙报春和偏花报春同域分布的样地( 2 0 0 m x1 0 0 m ) 。根据我们对该样地随机 选择的1 5 个小样方( 1 5 m 1 5 m ) 的计数表明，后者分布较前者数量多( 2 2 2 ： 3 6 5 ) ，在此基础上我们粗略估计该样地总共有海仙报春1 5 0 k 个体和2 0 0 k 偏花 报春个体。我们找遍了该样地，总共发现2 6 个疑似杂交个体，其中包括1 4 个 长花柱个体和1 2 个短花柱个体。另外偏花报春和海仙报春各随机选择了1 0 个 个体( 5 p i n s ， 5 t h r u m s ) ，个体之间的距离为1 0m 以上。新鲜叶片用硅胶干燥 保存。凭证标本存于中国科学院西双版纳热带植物园标本馆。 2 3 2 形态特征 我们选择了8 个形态特征进行测定，包括植株高、花色、花序结构、花婷 上是否具粉、环状附属物结构、花管长、柱头高、和花药高。植株高、花色、 花序结构、花婷上是否具粉、和环状附属物结构等数据通过在野外直接观测。 9 兰州大学硕士学位论文 每个类型一般至少随机选择3 0 个体用来测定植株高、花管长、柱头高、和花药 高。由于疑似杂交个体的植株数目不足3 0 ，其株高全测量。花特征的测定，一 般一个植株只取一朵花，由于疑似杂交后代的个体数较少，一个个体可能取了 多朵花。所有数据的分析都采用统计软件s p s sf o rw i n d o w sv e r s i o n1 5 分析， 各类群之间的比较我们采用甲因素方差分析。为了比较各类群内和类群之间的 的异型百补的能力，相对互补率r e l a t i v er e c i p r o c i t yr a t i o s ( r r r ) 采用r i c h a r d s & k o p t u r ( 1 9 9 3 ) 的方法加以计算：r r r = ( 花药高一互补的柱头高) ( 花药高+ 互补的柱头高) 。如果两表型之间完全的互补，那么r r r 的值将接近于0 。 2 3 3 分子鉴定 比较杂交类群与亲本种之间在母系以及双亲遗传的d n a 组成、分化和基因 树，能很好鉴别杂交个体以及它们的父母亲本来源。首先，叶绿体在大多数被 r 了植物巾都是母系遗传，而核基凶是双亲遗传，通过分了标记的方法找到假定 的亲本和杂交个体之间的d n a 差异，就可以确定杂交群体是否存在以及亲本 的来源( a r n o l dm l2 0 0 3 ；k o c h2 0 0 3 ；r i e s e b e r g19 9 8 ；r i e s e b e r g2 0 0 3 ) 。i 动i t s 和r p l l 6 内含子在报春花的研究中被广泛使用过( m a s te ta 1 2 0 0 1 ；z h ue ta 1 2 0 0 2 ； m a s te ta 1 2 0 0 6 ；g u g g i s b e r ge la 1 2 0 0 6 ；w a n ge la 1 2 0 0 8 ) ，包括遗传多样性，种 间分化和系统学的研究。所以我们首先使用核基凶i t s 序列来确定亲本之间的 分歧以及疑似杂交个体的身份，然后使用叶绿体的片段r p l l 6 内含子来鉴定杂 交后代的母系起源，同时估计杂交的方向。 总d n a 提取采用c t a b 法( d o y l e & d o y l e ，1 9 8 7 ) 。i t s 区扩增使用引物 “，峦l ”和“i t s 4 ”( w h i t ee ta 1 ，1 9 9 0 ) ；r p l l 6 内含子片断扩增使用引物“f 7 1 ” ( j o r d a ne ta 1 1 9 9 6 ) 币d “r 1 5 1 6 ”( b a u me ta 1 1 9 9 8 ) 。p c r 总反应体积为2 5pl ，包 括2 5m m o l lm g c l 22ul ，1 0 t r i s h c l 反应缓冲液2 5l il ，1 0m m o l ld n t p 0 5ul ，1 0p m o l ul 的引物各lul ，1 2 5 u n i tt a q 酶，扩增程序为：9 4 * ( 25m i n ， 接以3 4 个循环的9 4 c4 5s 、4 6 。c ( i t s ) 或者5 4 。c ( r p l l 6 内分子) 6 0 s 、7 2 。cl m i n ， 最后以7 2 * ( 21 0 m i n 终止反应。扩增产物用t a k a r a 试剂盒纯化。产物经纯化后 1 0 兰州人学顾。i j 学位论文 在a b i3 1 3 0 x ld n as e q u e n c e r 型自动测序仪上进行测序。另外一个疑似杂交 后代的i t s 序列通过载体p g e m t ( p r o m e g a ，m a d i s o n ，w i s ) 克隆后，1 0 个阳性 克隆使用“s p 6 ”和“t 7 ”测序测序结果使用c l u s t a lx1 8 1 ( t h o m p s o ne ta 1 1 9 9 7 ) 进行比对。 我们直接比对检测类群内和类群间的变异位点。 兰州人学硕l 学位论文 2 4 偏花报春和和海仙报春的传粉生态学 2 4 1 开花物候 为了量化偏花报春和海仙报春的开花物候，以及了解是否物候会对它们之 间的生殖