（有机化学专业论文）壳聚糖酶的研制及酶法生产壳寡糖.pdf

摘要 本研究从自然界中分离筛选出一株高产壳聚糖酶的微生物菌株，经鉴定为 4 印p r g f 砌s 扣卅喀4 m j 。通过诱变选育，获得了菌株f 4 印咄讹j 知弘m 5j x s d 一9 7 ，并 对其发酵产酶条件进行优化，研究确定其最适产酶培养基组分为( ，w v ) ：壳聚糖 1 6 ，蛋白胨o 4 ，m g s 0 4 7 h 2 0o 0 4 ，k h 2 p 0 40 0 4 ，k c lo 0 5 ，f e s 0 4 7 h 2 0o 0 0 1 ， 起始d h 为5 0 ；最适产酶培养条件是：2 5 0 m l 摇瓶装液量为5 0 m l ，培养温度为2 8 ， 接种量为o 6 m l ，培养时间为9 6 h 。在最适产酶培养条件下，发酵液中壳聚糖酶活力 可达到9 3 5 u m l 。采用7 5 乙醇分级沉淀、透析( 分子量：8 0 0 0 1 4 4 0 0 ) 、 s p s 印h a r o s ef 璃子交换层析对菌株，i 妒哪乒f f 淞胁瞎n m sj x s d 9 7 发酵液中的壳聚糖 酶进行分离提纯，获得了s d s e a g e 呈单条带的壳聚糖酶，分子量为2 5 k d 。对该酶 进行了酶学性质的研究，利用薄层层析分析确认酶解产物为壳寡糖，不含氨基葡萄 糖，证明了该酶为内切壳聚糖酶。该壳聚糖酶的最适温度和最适p h 分别为6 3 和 p h 5 8 ，酶活力在p h 4 5 8 o 范围内和4 5 以下时相对稳定；金属离子m n 2 + 对内切 壳聚糖酶有强烈的激活作用，而h 矿+ ，a 矿，f e 3 + ，c d 2 + ，p b “则有强烈抑制作用。 对内切壳聚糖酶的n 端氨基酸序列进行测定，结果为y n i 孙m l k q 。n - 端氨基酸序 列的测定，为克隆表达该壳聚糖酶的基因做好了准备。 研究了壳寡糖的酶法制备条件。在p h5 8 ，壳聚糖浓度3 ，内切壳聚糖酶加入 量5 u g 壳聚糖的条件下，反应温度4 5 ，酶解反应时间以3 小时较为合适。壳寡糖的 得率为9 5 9 。 研究了利用离子交换树脂来分离纯化壳寡糖。采用大孔弱酸性阳离子树脂d 1 5 5 可以分离纯化寡糖：j k 2 0 4 阴离子交换树脂脱色效果很好。 关键词：壳聚糖酶；、发酵条件；酶解；壳寡糖：分离纯化 a b s t r a c t as t f a i nw i t hh i 9 1 lc h i t o s a n a s ea c t i v i t yw a si s o l a t e d 丘o ms o i ls a m p l e sa l l di d e n t 砸e d a s 爿印哪f f f l 博归脚劬船w i t ht h es t r a i l lm u t a t i o n 卸di l n p f o v e m e n t ，爿妒已r g f f 船 卢m 咖f 螂j x s d 一9 7w a so b t a i n e d t b eo p t i i i i a l m p o s i t i o n so fi h em e d i u mf o rc h i t o s a n 踮e p m d u c t i o nb y 爿置p 哪f 胁巧卢m 增4 m sj x s d - 9 7w e r c a sf o l l o w s ( ，w v ) ：c h i t o s a n 1 6 ， p e p t o n eo 4 ，m g s 0 4 7 h 2 00 0 4 ，k h 2 p 0 40 0 4 ，k c lo 0 5 ，f e s 0 4 7 h 2 0o 0 0 1 ，t h ei n i t i a l p h 6 o t h eo p t i m a lc i l l t i v a t i o nc o n d i t i o n sf o rc h i t o s a n a s cp i o d u d i o nb y4 印e r g 俄啦 扣埘瞎口m sj x s d 一9 7w e r e2 5 0 m l f l a s kc o n t a i n i l l g5 0 m lm e d i u m ，o 6m lo fi n o c u l a d o n ， 2 8 a l l ds h a l 【i n gc u l l i v a t i o na t1 8 0 r p mf o f9 6h o u r s t 1 l ec h i t o s a n a s ea c t i v i t yo f f c 珊e n t e db m t hc o u l dr e a c h9 3 5 u m lw h e n 一印哪甜m s 丘m 妇船j x s d 一9 7w a s i i l c u b a t e di i lf l a s ku n d e rt h eo p t i m a lc u l t i v “i o n n d i t i o n s 1 1 l ec h i t o s a i i a s ef 如m 彳印咄f 跏肺f g n m sj x s d 9 7s t r a i l lw a sc x t r a c t e db ye t h a n o lp r e c i p i t a t i o n ( 7 5 ，v v ) ， 柚dp u r i f i e db yd i a l y s i s ( m w ：8 0 0 0 1 4 4 0 0 ) a n di o n e x c h a l l g e c h r o m a t o 伊a p h y ( s p - s e p h a r o s ef fc o l u m ) ，t h er e s u l t si l ls d s - p a g es h o wa 血百eb a l l df o rt h ep u r i f i e d c h i t o s 卸a s e 卸dt h em 0 1 e c u l a rw e i 曲tw a se s t i m a t e dt ob e2 5 k d n ec h i t o s a n a s ew a s i d e n t i 丘e da se n d o - t y p cc h i t o s 柚a s eb yt h ea l l a l y s i so fe n z y m a t i ch y d r o l y s i so fc h i t o s a i l w i l h1 1 h i nl a y e rc l l r o m a t o 舒a p h 1 r h eo p t i l i l a lt e i p e r a t u r e 柚dp hf o rh y d m l y s i so f c h i t o s a nb ym ec h i t o s a n a s ew e r e6 3 a n d5 8 ，r e s p e c t i v e l y ；t h ec h i t o s a n a s ea c t i v i t y w a ss t a b l ei nt h ep hm g eo f 4 8 8 o 柚dm et e m p e r a t u r eu n d e r4 5 ；m n2 + ，e n h a n c e d t h ee n z ) ，m ea c t i v “ys i 印i f i c a n t l y ，w h e r c a sh 矿+ ，a 矿，f e 3 + ，c d 2 + ，p b “n en t e 订n i n a l 锄i i l oa c i ds e q u e n c eo fc h i t o 龃n a s ew a sd e t e m i n e dt ob ey n u n n l k q ，w h i c h p r 0 v i d e su s e f i l li n f 0 珊a t i o nf o rf i i n t l e rg e n ec l o n i n go fm i se l l z y m e e n d o t y p ec h i t o s a n 髂ew a su s e dt op r o d u c ec h i t 0 0 1 i g o s a c c h a r i d e s t 1 l eo p t i m u m c o n d i t i o n sw e r cp h5 8 ，3 s u b s t r a t e n c e n t r a t i o n ，e n z y m ec o n t e n to f5 u 佗c h i t o s a n ， a n d4 5 f o r3h o u t s ，r e s p e c t i v e l y t 1 l ey i e l do f c h i t o o l i g o s a c c h a r i d e si s9 5 9 t i l es e p a n t i o na n dp u r i f i c a t i o no fc h i t o l o l i 9 0 s a c c h a r i d e sw a ss t u d i e d m a c r o p o r o u s i o ne x c h a n g er e s i l l sd 1 5 5a n dj k 2 0 4w e r eu s e dt os 印a r a t ec h i 啪i i g o s a c c h 撕d e sa n d d e c o l o r ” k e y w o r d s ： c h i t o s a n a s e ； f c r m c n t a t i o n c o n d i t i o n s ；e i l z y m a t i c h y d r o l y s i s ； c h i t o o l i g o s a c c h a r i d e s ；p u r i 丘c a t i o n 壳聚糖酶的研制及酶佬生产壳寡糖 第一章绪论 1 1 引言 甲壳素( c h i t i n ) 是地球上存在数量仅次于纤维素的天然有机化合物，估计 自然界每年生物合成的甲壳素将近1 0 0 亿吨【1 】。它由n 乙酰氨基葡萄糖( g l c n a c ) 以b 1 ，4 糖苷键连接而成，一般难以熔化，不溶于水，也不溶于酸、碱。壳聚糖 ( c h i t o s a n ) 是甲壳素n 脱乙酰基的产物。一般而言，其结构式中n 一乙酰基脱去 5 5 以上就可以称之为壳聚糖了；或者说，能在1 乙酸或1 盐酸中溶解1 的脱 乙酰几丁质，即能被称之为壳聚糖。而作为工业品的壳聚糖，n 一脱乙酰度应在 7 0 以上。壳聚糖为高分子，分子量一般在1 0 0 万以上，一般可溶于稀酸中但不 能直接溶于水中，应用中受到很大的限制。壳寡糖( c h i t o o l i g o s a c c h 撕d e s ) 由壳聚 糖降解得到，由2 1 0 个糖单位连接而成的，分子量( m w ) 小于2 0 0 0 。壳寡糖分 子链长与壳聚糖相比大大降低，性质及功能与高分子壳聚糖相比有许多不同， 具有许多独特的新功能。壳寡糖的分子结构式如下： r ， r o h 、 枷瞄土 图1 1 壳寡糖的分子结构式 1 2 壳寡糖的性质、功能及用途 1 2 1 壳寡糖的抗肿瘤及免疫调节作用 许多研究表明壳寡糖具有高活性的抗肿瘤作用，特别是聚合度为6 8 的壳寡 糖。1 9 8 5 年，s u z u k i 等1 2 】就壳六糖的抗肿瘤作用作了报道。他们对移植了s 瑚的 d d y 鼠静脉注射壳六糖，采用1 0 0 m k d ，连续3 次，结果发现产生明显的肿瘤 细胞抑制作用，抑制率为和9 3 ：当注射次数增加至连续5 次时，则能完全抑制 肿瘤生长。同样，向移植了m m 4 6 实体瘤的c 3 h h e 鼠静脉注射壳六糖也产生明显 肿瘤抑制效果。 壳聚糖酶的研制及酶法生产壳寡糖 接着，s u z u l 【i 等【3 】又做了一系列实验，证明壳六糖对m e t h a 纤维肉瘤细胞也 有明显抑制作用，且以l 嘶班g 时作用最强。他认为，氨基葡萄糖( g 1 c n ) 残基 与巨噬细胞表面受体结合后，激活巨噬细胞释放i l l ，同时引起t 细胞表面i 【，2 受体表达，而这又加速了t 细胞成熟而释放i l ，2 ，i l 2 与受体结合后，进一步加 速t 细胞分化成熟为细胞毒性t 细胞，从而产生抗肿瘤作用。迟发性超敏反应的 存在说明t d 佣也起了协同抗肿瘤作用。 1 9 9 0 年，0 r i l c h it 等1 4 】研究发现，壳寡糖通过六亚甲基空间通道与5 氟尿嘧啶 ( 5 一f u ) 共轭结合后，其抗肿瘤作用强于5 f u 。把该复合物注入p 3 3 8 淋巴细胞白血 病小鼠的腹腔中，小鼠的生存时间延长；通过皮下注射应用于m e t h a 纤维肉瘤 或m h l 3 4 肝细胞癌小鼠，发现产生对肿瘤的生长抑制作用。而且此复合物还有 以下优点：1 ) 不引起急性中毒；2 ) 不引起体重的迅速下降。 目前国内也有壳寡糖抗肿瘤及免疫调节作用的报道。王中和掣5 】用壳寡糖对 临床患者进行辅助治疗，结果发现白细胞、淋巴细胞的总数保持稳定，1 事昧巴细 胞的数量显著上升，说明壳寡糖糖能调整机体免疫机能，减少放疗对患者免疫 功能的影响，有较好的抗肿瘤辅助疗效。 杜星光【6 l 等对患s 1 8 0 腹水癌的昆明小白鼠作抑瘤试验，将壳寡糖与磺化甘 露寡糖和甘露寡糖样品进行了比较，结果表明壳寡糖的抑瘤率远高于其他来源 的寡糖和磺化寡糖。对小鼠肝癌高淋巴道转移癌细胞系h c a f 抑瘤实验表明，壳 寡糖对高淋巴道转移癌细胞系h c a - f 具有较强的体外杀灭能力。壳寡糖结构及聚 合度分布不同，对癌细胞d n 蛤成的抑制作用差别较大。壳寡聚糖对人肝癌细 胞、子宫内膜癌、红白血病、淋巴瘤、小鼠肝癌腹水细胞等5 种肿瘤细胞生长均 有明显的抑制作用，抑瘤率高达7 9 ( 顺铂阳性对照的抑瘤率为7 5 ，1 0 u 咖l ) ， 其中以对人肝癌细胞生长抑制作用效果最好。 刘莹等【7 j 探讨了壳寡糖对人结肠癌l o v o 细胞株生长的影响。采用细胞计数 法比较不同浓度壳寡糖作用下细胞生长情况；苏木精伊红染色后，光镜下观察 细胞生长情况及病理变化。结果显示，高浓度壳寡糖( 1 0 0 、2 0 0 、4 0 0 m 扎) 对 l o v 0 细胞的生长有抑制作用，而低浓度( 1 0 、5 0 1 1 1 l ) 未显示抑制作用。柳红 等【8 】进一步研究表明，通过调节b c l 2 、b a 】【的表达而诱使肿瘤细胞凋亡是壳寡糖 抗肿瘤作用机制之一。 吴海明等l9 】通过接种肿瘤的小鼠尾静脉注射壳寡糖，用相对定量的逆转录 聚合酶链反应( r t - p c r ) 技术和酶联免疫吸附实验( e u s a ) 检测壳寡糖对巨 壳聚糖酶的研制及酶虚生产壳寡糖 噬细胞相关细胞因子转录和翻译水平的影响。结果表明，壳寡糖对s 1 8 0 肉瘤的 抑瘤率为3 5 0 2 ，具有良好抑制肿瘤生长和转移的作用；巨噬细胞加入壳寡糖 作用2 4 h 后，细胞因子的表达明显增强。 由此可见，壳寡糖( 特别是聚合度为6 8 的壳寡糖) 可以活化人体中的淋巴 细胞、抑制癌细胞的繁殖，具有很强的生理活性，在抗癌新药开发方面具有较 大发展前景。 1 2 2 壳寡糖的抗感染作用 壳寡糖具有抗感染作用，其中以壳六糖最强。夏文水等【1 0 l 的研究结果表明， 平均分子量分别为1 5 0 0 的壳寡糖具有显著的抑菌作用。b o n g k ”c h o i 等【l i 】研究 发现，脱乙酰度为9 1 5 的壳寡糖对伴放线放线杆菌和变异链球菌两种口腔病原 体有灭活作用。通过电镜观察，壳寡糖可导致伴放线放线杆菌细胞膜的破裂。 因此，壳寡糖有可能用于治疗由伴放线放线杆菌引起的牙周疾病。严钦等f 1 2 】通 过抑菌试验表明，浓度为0 2 的分子量在9 5 0 1 3 5 0 的壳寡糖对大肠杆菌和金黄 色葡萄球菌均有明显的抑制作用。刘碧源等【1 3 】采用涂布法和滴注法测定壳寡糖 对金黄色葡萄球菌、大肠埃希菌、枯草芽孢杆菌、白假丝酵母菌的抗菌作用。 结果表明，壳寡糖对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强，o 5 的浓度可完全抑制 其生长；大肠埃希菌次之，需1 的浓度；枯草芽孢杆菌需2 ：对白假丝酵母 菌的作用最弱，需4 的浓度。抗菌活性随壳寡糖的浓度增加而增强。 郑连英等【1 4 】探讨了不同相对分子量壳聚糖抑制细菌生长的原理：相对分子 量较高的壳聚糖在溶液中可以在细菌表面形成微膜，阻碍营养物质进入细胞内 部；相对分子量较低的壳低聚糖和壳寡糖可以进入到细胞内部，与其中带有负 电荷的m 姨结合，阻碍其正常的复制转录。 1 2 3 壳寡糖在食品方面的应用 ( 1 ) 作为微生态调节剂：壳寡糖本身无毒副作用，作为一种双歧因子，能选 择性地刺激肠道内的有益菌( 如双歧卡t 菌) 生长繁殖或增强其代谢功能，从而 提高肠内有益于健康的优势菌群的构成和数量。实验证明，壳寡糖对小鼠肠道 菌群失调具有一定的调整作用1 1 5 】；服用壳寡糖可使肠道内的双歧杆菌、乳杆菌 等有益菌的数量明显增高i 圳。同时可抑制肠内有毒、有害菌的生长繁殖和腐败 物质的生成，起到增强宿主机体健康的作用【1 7 】【1 8 】。 ( 2 ) 作为功能性甜味剂：壳寡糖具有非常爽口的甜味，在保湿性、耐热性 等方面优于砂糖，不易被体内消化液降解，几乎不产生热量，是糖尿病人、肥 3 壳聚糖酶的研制及酶庄生产壳寡糖 胖病人理想的功能性甜味剂【1 9 l 。 ( 3 ) 作为食品防腐剂：壳寡糖具有很好的防腐性能【驯1 2 l 】【2 2 l 】，而其防腐性 能与其分子量有关，有研究认为分子量在1 5 0 0 左右的壳寡糖的抗菌活性最高， 大大高于高分子的壳聚糖【1 0 1 。将壳寡糖加入到酱油中，其抑制酵母菌群生长的 作用优于苯甲酸与苯甲酸钠，而且不影响酱油的口感和颜色【驯【2 5 1 。由于游离胺 基的电离程度与p h 值有关，因此，其抗菌活性也同样与p h 值有关，在酸性条件 下更有划2 6 1 。 9 2 3 的壳寡糖。 由此可见，壳聚糖酶在制各壳寡糖方面，非常有利用价值。 1 3 3 2 溶菌酶 溶菌酶( i y s o z y m e ) 广泛存在于人的唾液和鸡蛋蛋白中。人唾液中提取的 溶菌酶对口一1 4 糖苷键有较强的裂解能力【5 l 】【5 2 】，它在一定的条件下可以有效地 降解壳聚糖，并且初始速度很快。若先对壳聚糖的乙酸溶液进行适当的处理， 在3 7 用溶菌酶进行较长时间的降解，则经分离可得到较高收率的二糖至四糖 产物。 溶菌酶有6 个亚基，在催化反应中，活性部位需要有n 一乙酰氨基葡萄糖上n 一 乙酰基团的结合。溶菌酶对壳聚糖的水解能力随着脱乙酰度的增加而降低，并 且不能催化水解脱乙酰度9 5 以上的壳聚糖。 1 3 3 3 脂肪酶 夏文水等【5 3 j 使用麦胚脂肪酶( i i p a s e ) 对壳聚糖及其衍生物进行水解，研究 发现麦胚脂肪酶在微酸性条件下能非常有效地降解壳聚糖及其衍生物，在几分 壳聚糖酶的研制及酶庄生产壳寡糖 钟内快速降低壳聚糖粘度，降低其分子量。 p a n t a l e o n e 等人1 5 4 j 利用来自猪胰腺的脂肪酶( l i p a s ea i e ) 对壳聚糖进行非 专一性水解研究，在一定的蛋白质与壳聚糖比率下，粘度降低率( v d p ) 可达1 0 0 。 1 3 3 4 其他非专一性酶 壳聚糖和纤维素都是由b 一葡萄糖以糖苷键连接聚合形成起来的多糖化合 物，由于结构上的相似性，纤维素酶对壳聚糖也应该有相似的降解作用。 p a n t a i e o n e 等人【h j 就纤维索酶和一些其他酶在一定条件下对不同均分子量 壳聚糖溶液的降解作用进行了研究：对于较低粘度的壳聚糖溶液，一些聚糖酶 ( g y c a n a s e ) 对壳聚糖有显著的降解作用，其中纤维素酶丁v ，a p 和果胶酶的粘度 降低率( v d p ) 可达9 9 ，半纤维素酶的v d p 为9 3 淀粉酶( a m y ia s e ) 和葡聚糖酶 ( d e x t r a n a s e ) 的v d p 为7 0 8 0 ；对于较高粘度的壳聚糖溶液，在试验所用的3 8 种酶中，v d p 在6 0 1 0 0 的有1 7 种，v d p 在2 0 6 0 的有1 2 种，还有9 种酶只有 轻微的降解作用或完全没有降解作用( v d p 为o 1 5 ) 。其中仍以聚糖酶的降解 效率最高，木瓜蛋白酶和单宁酶“a n n a s e ) 也显示了较强的降解能力。 a j b a 等人l ”j 研究用低成本的脂酶、纤维素酶和半纤维素酶制剂生产高聚合 度的低聚糖。研究发现：当使用脂酶、纤维素酶和半纤维素酶制剂时，乙酰化 度2 2 的壳聚糖( 2 0 0 m g ) 经过一系列反应后，添加甲醇选择沉淀可获得五糖 ( 1 1 ) ，六糖( 6 9 ) 和七糖( 18 ) 的混合物( 5 5 m g ) 。通过凝胶过滤色谱分离后，纯 的六糖和七糖产量分别为3 5 m g 和5 m g 。乙酰化度1 0 3 0 的壳聚糖用这些酶水解 后，再用乙酸酐进行n 一乙酰化反应，用高效液相层析h p l c 可以在反应混合物中 测到六糖和七糖的产率分别超过2 0 和1 0 ，因此认为，此法可以制备高产率的 壳寡糖。 除了酶法降解外，甲壳素酶和溶菌酶还有转糖苷活性，可以将g i c n a c 二聚 体的链长增加到六聚体或七聚体。诺卡氏放线菌和木霉属具有较高糖转移能力 的甲壳素酶可使二糖链发生连接反应，得到六糖的白色沉淀。也可以五糖为底 物可合成七糖。但此法同样须有n 一乙酰基团的参与，不能制备完全脱乙酰的壳 寡糖。 与其他降解方法相比，酶法降解条件温和，污染小，选择性好，产物比较 单一而且安全。因此，酶降解壳聚糖生产壳寡糖在工业化上极有前途。 l4 壳聚糖酶 1 4 1 壳聚糖酶的发现 壳聚糖酶的研制及酶法生产壳寡糖 壳聚糖酶( c hit o s a n a s e ) 是一类水解酶，最早由m o n a g h a n l 5 6 】等人从2 0 0 多种微 生物中分离得到，并提出它是一种不同于几丁质酶的新酶。1 9 9 2 年，壳聚糖酶 被系统命名( e c 3 2 1 9 9 ) 。壳聚糖酶能催化水解完全脱乙酰的壳聚糖形成壳 寡糖，同时也能选择性切断部分乙酰化壳聚糖的g 1 c n g 1 c n 和g i c n g 1 c n a c 或 gic n a c g 1c n 自营苷键【5 ”。 1 4 2 壳聚糖酶的来源 壳聚糖酶主要存在于真菌和细菌细胞中，在单子叶和双子叶植物的不同组织 中也发现有该酶活性。另外，在病毒中也发现壳聚糖酶。现已经从细菌如 鞲y x o b a c t e r m a t s u e b a c t e r 。8 a ci | | u i 蕊s t r e p t o 晴y c e 酶i i ；) j 毳! 廛毽，：t t 些i 酶大多为内切酶，它们能在壳聚糖等物质存在下诱导产生；真菌如月印e 俘j ，“岛 踟a ，增，j a ，厅培吖j 泖中也发现壳聚糖酶的存在，有诱导型的，如占妇“”，0 ”j ， 也有组成型的，如几铂，删s d ，册厂，5 9 1 。有些壳聚糖酶己从发酵液中纯化得到。 1 4 3 壳聚糖酶的分离纯化 目前常用于分离纯化壳聚糖酶的方法有凝胶色谱法、亲和色谱法、离子交 换色谱法等。用这些分离纯化手段可以分离得到专一性酶，以便深入研究各底 物类似物、抑制剂与酶的互相作用方式。 1 4 4 壳聚糖酶的理化性质 一般来说，植物中分离得到的壳聚糖酶分子量为1 0 0 0 0 2 3 0 0 0 ，而从微生 物中分离得到的壳聚糖酶分子量为2 0 0 0 0 4 0 0 0 0 。壳聚糖酶大部分为碱性蛋白， 等电点pl 为7 0 8 5 ，最适p h 为4 5 8 o ，可是崩弦d 6 a c 拈，a l - 1 的壳聚糖酶有 两个最适p h 分别为5 0 和6 8 。在p h 为6 0 8 0 ，3 7 时壳聚糖酶非常稳定，超 过4 0 后酶很快失活，从白c ，心声生的壳聚糖酶的最适温度却为大约6 0 。 夏文水等【删从来源于绿色木霉的商品化的纤维素酶中分离纯化出同时具有 壳聚糖酶和纤维素酶活性的双功能酶，该酶的最适p h 为5 2 最适温度为6 06 c ， 具有典型的米氏动力学常数，i ( i i l 和v m a x 分别为1 0 m g m l 和0 1 6 4u m l 。壳 聚糖酶解产物为一至四糖，也有更高聚合度的寡糖。 y a l jn gc h e n 等【6 1 】将蜡样芽胞杆菌出口，坩c e ，e 船n t u f c - 4 的发酵液用 7 0 丙酮沉淀获得粗酶。粗酶中的壳聚糖酶采用反胶束萃取，可以回收大约7 0 的总壳聚糖酶活性，与发酵液相比，壳聚糖酶的纯度提高了3 0 倍，酶活为 6 0 3u m g 。 xia o ec h e n 等 6 2 】使用7 5 乙醇沉淀、c m s e p h a r o s ef f 离子交换色谱、 壳聚糖酶的研制及酶法生产壳寡糖 s e p h a c r yls 一2 0 0 凝胶过滤色谱和p h e n yis e p h a r o s ec l - 4 b 疏水色谱分离纯化 技术，对曲霉c j2 2 3 2 6 发酵液中的内切壳聚糖酶进行分离纯化和性质研究。 纯化后的内切壳聚糖酶c h ；b 相对分子质量为2 9 k d a 。酶c h i b 作用最适p h 值为 6 0 ，最适温度为6 5 。2 5 棚m n ”可提高c h i b 的活性1 5 倍，2 5 蒯a f ， h 9 2 + a n df e ”对c h i b 有强烈抑制作用。酶c h i b 作用的活性高，反应的专一性 强，有利于生产聚合度较高的功能性壳寡糖。 1 4 5 壳聚糖酶的催化降解性质 1 4 5 1 壳聚糖酶降解壳聚糖不同取代产物的活性比较 h u t a di lo k 等研究了壳聚糖酶对部分n 一乙酰化的壳聚糖和不同0 一取代壳聚 糖衍生物的水解作用的动力学行为，在均相反应中，随着n 一乙酰度的提高，米 氏常数i ( i l i 增加，而最大反应速度v m a x 降低；当n 一取代的脂肪族酰基中碳链增长 时，k m 增加，而v m a x 影响很小；对其它衍生物的水解作用则i ( i i 为：0 一羧甲基壳 聚糖 壳聚糖 o - 羟乙基壳聚糖，而v m a x 为：壳聚糖 0 一羟乙基壳聚糖 o _ 羧甲基 壳聚糖。 1 4 5 2 壳聚糖酶降解部分乙酰化壳聚糖的特异性 壳聚糖酶对底物要求严格。壳聚糖酶在酶解过程中的活性是随着n 一乙酰化 度而变化的。在非均相反应中，具一定取代度的n 一乙酰化壳聚糖比壳聚糖更容 易被水解，但当脱乙酰化度小于3 6 时，壳聚糖不溶于水，因而难以被水解。当 底物质量分数一定时，随着壳聚糖酶质量分数的增加、粘度的下降，其降解所 产生的还原糖量会增加。 f u k a m i z o i 删根据壳聚糖酶特异性切断部分乙酰化壳聚糖的信息提出以下假 设：壳聚糖酶邻近催化位点的两个亚单位之一对g i c n a c 基团亲和力很小，只能 结合g 1 c n 基团，然而另一个亚单位比较灵活，能够同时识别g i c n a c 和g 1 c n 基团。 因为( gj c n ) n 以b 一1 ，4 一糖苷键相连而构成不同构型( d 或b 型) ，所以与壳聚 糖酶作用时，( g 1 c n ) n 的氨基基团可以在溶液中发生构型转换而与结合位点结 合。 1 4 6 壳聚糖酶降解产物的分析 降解产物可通过阳离子交换色谱、薄层层析等方法分离鉴定，酶作用时间、 底物的乙酰化度都会影响降解产物的种类。从腑，垤s p 7 一m 制得的壳聚糖酶 只切割g i c n - g i c n ，而从出c ，坩口，鹏b n 一2 6 2 制得的壳聚糖酶切割 g l c n a c g l c n 及g l c n g l c n ，壳聚糖酶降解部分脱乙酰化壳聚糖都得到杂壳寡糖。 壳聚糖酶的研制及酶法生产壳寡糖 用幽c ，船s p r 一4 产生的壳聚糖酶降解脱乙酰化度为8 0 及1 0 0 的壳聚糖时发 现，对于脱乙酰化度为1 0 0 的壳聚糖，酶解6 h 时可生成2 糖至6 糖，酶解4 8 h 时得 到的主要是2 糖、3 糖、4 糖，且得率较高。 用高效液相色谱分析酶解产物，壳聚糖酶比非专一性水解酶降解壳聚糖产 生的还原糖量要高。反应产物中有乙酰氨基葡萄糖和氨基葡萄糖等单糖，几丁2 糖、壳2 糖等2 糖，几丁3 糖、壳3 糖及杂3 糖等3 糖。壳聚糖酶作用部分乙酰化壳 聚糖的产物经过减压浓缩后，用柱色谱( 如s e p h a d e x ) 洗脱，将洗脱液浓缩干燥 并采用b 一氨基葡萄糖苷酶( b g i c n a s e ) 和p 一乙酰氮基葡萄糖昔酶( b g i c n a c a s e ) 两种酶作用上述产物，从而鉴定出产物还原端的组成和产物的序 列，也可以利用亚硝酸降解含有氨基葡萄糖( g l c n ) 残基不降解含有乙酰氨基葡 萄糖( gic n a c ) 残基的壳寡糖，进一步确认产物的组成。 研究发现从s t r 印f 明膳e ss p n 1 7 4 菌株产生的壳聚糖酶降解( g l c n ) 。的产物 都是a 型【吲，所以壳聚糖酶是构型转化酶，鼬c ，雌p 删，册刚一2 6 2 的壳聚糖 酶也得到同样的结果。这种特异性依赖催化位点的精细结构，在碳水化合物酶 中，催化位点的两个催化羧基在构型保留酶中紧密相连，例如溶菌酶【6 2 】，但是 在转化酶中距离很远，对乳，印t 凸缈ss p n 17 4 菌株的壳聚糖酶定位突变研究 发现，氨基酸g iu 一2 2 和a s p _ 4 0 可能为催化基团，在该酶的三维结构，两个催化 基团的羧基距离为1 3 8 n m ，所以这与壳聚糖酶为转化酶的假设相一致。对于不 同来源的壳聚糖酶在降解壳聚糖时的产物构型特异性也可能不相同，需要对这 些壳聚糖酶进行深入研究。 1 5 本研究的目的和意义 开发应用壳寡糖是甲壳素和壳聚糖天然资源开发应用的核心问题，也是当今 生物制药领域的热点之一。目前壳寡糖产品的研究开发主要集中在日本、韩国 等国家，我国对该产品的研究起步较晚，研究开发力度还远远不够。因此，开 发专一性的壳聚糖酶，并用以制备高品质壳寡糖产品，是开发利用甲壳素资源 的重要突破点，具有巨大的经济效益和社会效益。 本实验致力于生产高品质壳寡糖的关键技术研究。从自然界中选育获得了具 有自主知识产权的壳聚糖酶高产菌株，并进行了菌株鉴定；研究了其产酶的最 适条件，壳聚糖酶解的最佳条件，以及酶解产物的分离纯化技术，为进一步实 现工业化提供条件。 1 0 壳聚糖酶的研制及酶法生产壳寡糖 第二章产壳聚糖酶菌株的筛选和鉴定 2 1 前言 在第一章中，已经知道壳聚糖酶存在于在细菌、放线菌、真菌等广泛的微 生物群体中。而不同来源的微生物，其壳聚糖酶系有所不同，酶学性质差异较 大。有些微生物产壳聚糖酶的酶系既有内切壳聚糖酶，又有b 氨基葡萄糖苷酶 ( 即外切壳聚糖酶) 等。其中，内切壳聚糖酶水解壳聚糖为壳寡糖，可以将壳 三糖以上的低聚糖进一步水解但不能水解壳二糖；b 氨基葡萄糖苷酶水解壳聚 糖为氨基葡萄糖，并能将壳二糖进一步水解成氨基葡萄糖。 在进行产壳聚糖酶菌株筛选时，首先考虑的指标是发酵液的酶活高低；其 次是水解壳聚糖时得到的水解产物的组成；再次是考虑菌株的遗传稳定性和培 养的难易。除此之外，产酶微生物的选择以分泌型菌株为优，有利于酶的分离 提纯。 2 2 材料与方法 2 2 1 主要仪器 l p 5 0 2 a 型电子天平常熟衡器 b c d 一2 1 6 型海尔冰箱青岛海尔 d 【b a 4 5 0 型数码显微镜厦门m o t i c z d 一8 5 型恒温振荡器( 气浴)常州国华 d s x 2 8 0 a 型手提式蒸汽灭菌器上海申安 l d z x 4 0 s b i 型立式蒸汽灭菌器上海申安 f i 蚰i p i p e n e 可调式移液器 1 1 l e m ol a b o s y s t e m s w g 9 0 0 d s 也3 k 6 型格兰仕微波炉顺德格兰仕 g p s 9 0 8 0 m b e 型培养箱- 上海博讯 t g l l 6 g 高速台式离心机上海安亭 b i o f u g e 低温冷冻高速台式离心机 德国k c n d r o 可调式电炉天津泰斯特 电热恒温鼓风干燥箱上海实验仪器总厂 h t _ 1 3 0 0 u 超净工作台苏州安泰 7 2 0 0 型分光光度计上海尤尼柯 2 2 2 主要试剂 氨基葡萄糖盐酸盐( 9 9 )n u k a 公司 壳聚糖酶的研制及酶法生产壳寡糖 壳聚糖( 脱乙酰度9 0 ，水分8 ，灰分1 o ，粘度( m p s ) 1 0 0 ) 国药集团化学试剂公司 3 ，5 二硝基水杨酸( c p ) 蛋白胨( 生化试剂) 酵母浸膏( 生化试剂) 硫酸铵( a r ) 盐酸( a r ) 氢氧化钠( a r ) m g s 0 4 - 7 h 2 0 ( a r ) k 2 h p 0 4 ( a r ) k h 2 p 0 4 ( a r ) n a n 0 3 ( a r ) k c l( a r ) f e s 0 4 7 h 2 0 ( a r ) 冰醋酸( a r ) 醋酸钠( a r ) 茚三酮( a r ) 无水乙醇( a r ) 麦芽汁( 新鲜) 蔗糖( a r ) 琼脂粉f 生化试剂) 薄层层析硅胶g 2 2 3 分析试剂的配制 中国医药集团上海化学试剂公司 中国医药集团上海化学试剂公司 上海冠生园添加剂制品有限公司 广东西陇化工厂 南昌市鑫光精细化工厂 天津市福晨化学试剂厂 天津市福晨化学试剂厂 广东西陇化工厂 广东西陇化工厂 广东西陇化工厂 广东西陇化工厂 广东台山化工厂 天津市福晨化学试剂厂 上海化学试剂有限公司 上海精析化工科技有限公司 天津市永大化学试剂开发中心 南昌亚洲啤酒有限责任公司 上海化学试剂有限公司 杭州微生物试剂厂 青岛海洋化工有限公司 ( 1 ) 靴m o l m l 氨基葡萄糖标准液 准确称取8 0 烘至恒重的氨基葡萄糖盐酸盐1 0 7 8m g ，置于小烧杯中，加 少量蒸馏水溶解后，转移到1 0 0 m l 容量瓶中，用蒸馏水定容至1 0 0 m l ，混匀，4 冰箱中保存备用。 ( 2 ) 3 ，5 二硝基水杨酸( d n s ) 试剂 将6 3 9d n s 和2 6 2 m l2 m o 扎卜h o h 溶液，加到5 0 0 m l 含有1 8 5 9 酒石酸钾 钠的热水溶液中，再加5 9 结晶酚和5 9 亚硫酸钠，搅拌溶解，冷却后加蒸馏水 定容至1 0 0 0 m l ，贮于棕色瓶中备用，一周后便可使用。 1 2 壳聚糖酶的研制及酶珐生产壳寡糖 2 2 4 土样 从江西各地采集土样2 9 份，包括湖泊淤泥、水产市场土壤等。 2 2 5 培养基 分离平板培养基( l ) ：壳聚糖1 0 ，m g s 0 4 7 h 2 00 5 ，k h 2 p 0 40 5 ，、k c l0 5 ， f e s 0 4 7 h 2 0 0 0 1 ，琼脂2 0 ，p h 6 5 ，1 2 l 灭菌1 5 分钟。 菌种保藏斜面培养基( l ) ：壳聚糖1 0 ，蛋白胨5 ，m g s 0 4 7 h 2 0o 5 ，k h 2 p 0 4 0 5 ，k c lo 5 ，f e s 0 4 7 h 2 0o 0 1 ，琼脂2 0 ，p h5 6 ，1 2 1 灭菌1 5 分钟。 产酶平板培养基留l ) ：壳聚糖1 0 ，蛋白胨5 ，m g s 0 4 叮h 2 00 5 ，k h 2 p 0 4o 5 ， k a0 5 ，f e s 0 4 7 h 2 0o 0 1 ，琼脂2 0 ，p h6 5 ，1 2 1 灭菌1 5 分钟。 摇瓶复筛液体培养基( g ，l ) ：壳聚糖1 0 ，蛋白胨5 ，硫酸铵5 ，“酵母浸膏1 ， m g s 0 4 7 h 2 00 5 ，k h 2 p 0 4 0 5 ，k a0 5 ，f e s 0 4 7 h 2 0o 0 1 ，p h5 6 ，1 2 l 。c 灭菌 1 5 分钟。 查氏琼脂c a ( g ：n a n 0 33 o ，k 2 h p 0 41 0 ，k c lo 5 ，m g s 0 4 7 h 2 0o 5 ， f c s 0 4 7 h 2 00 0 1 ，蔗糖3 0 ，琼脂1 5 ，p h 自然，1 2 1 灭菌1 5 分钟。 查氏酵母膏琼脂c w 辽g ，l ) ：在查氏琼脂c a 的基础上添加酵母膏5 9 l ，1 2 l 灭菌1 5 分钟。 麦芽汁琼脂w a ( l ) ：新鲜麦芽汁，加水调至1 0 波林，再加2 琼脂，1 2 1 灭菌1 5 分钟。 2 3 分析方法 2 3 1 氨基葡萄糖标准曲线的绘制 取3 3 支2 0 m l 黾塞刻度试管，编号o l o ，共三组。按表2 1 分别加入浓度为 和m o l m l 的氨基葡萄糖标准液、蒸馏水和3 ，5 二硝基水杨酸( d n s ) 试剂，配 成不同氨基葡萄糖盐酸盐含量的反应液。将各管摇匀，置于沸水浴中准确加热 5 m i n 显色，然后以流水迅速冷却，冷却后加水至1 0 m l ，摇均匀。用o 号管调零点， 在5 2 0 i l m 处测定1 1 0 号管的吸光度值，取三组数据的平均值，填入表2 1 中。 1 3 壳聚糖酶的研制及酶法生产壳寡糖 表2 1 氨基葡萄糖盐酸盐标准曲线制作 标准液蒸馏水d n s氨基葡萄糖5 2 0 m 吸光值 管号( m l )( l )( l )盐酸盐含量( o d 5 2 0 咖) ( um 0 1 ) 0 01 o1 0oo 1o 10 91 oo 5o 0 3 2 20 20 81 o 1 00 0 5 7 30 3o 71 o 1 50 1 4 9 40 4o 61 o 2 o 0 2 4 7 50 50 51 02 50 2 9 0 60 6o 41 0 3 o0 3 8 1 7 o 7o 31 o3 50 ，4 7 4 80 8o 21 o4 o0 5 3 8 9o 9o 11 04 5o 5 9 8 1 01 001 0 5 0 0 6 8 8 以5 2 0 i l m 吸光值为纵坐标，氨基葡萄糖盐酸盐含量( 伽0 1 ) 为横坐标，采用 e x c e l 绘出标准曲线，见图2 1 。 0 8 酒o 6 蠢叫 兽 o 2 。 0 0 2 氨基葡萄糖含量( um 0 1 m l ) 图2 1 氨基葡萄糖标准曲线 2 3 2 酶活力测定方法 壳聚糖酶活力的测定采用改进的u c h i d a 法【删。将9 5 叽l 1 壳聚糖( 用 o 0 5 m o l lp h 5 o 的醋酸缓冲液配制) 和5 印l 酶液混合均匀，5 0 水浴保温反应 1 4 壳聚糖酶的研制及酶珐生产壳寡糖 1 0 分钟。然后加入1 m u ) n s 试剂终止反应，沸水浴加热5 m i n ，冷却后加水至 1 0 1 1 l l 。4 0 0 ，m i n 离心1 0 分钟，取上清液于5 2 0 i l m 测定吸光值。对照氨基葡萄 糖标准曲线，即可计算还原糖的释放量。在上述条件下，1 个酶活力( u ) 单位定 义为每分钟释放相当于m m o l 还原糖的酶量。本文酶活力数据均为测三组，取 平均值。 2 3 3 酶解产物分析方法 采用平板透明圈法筛选产壳聚糖酶微生物时，无法直接判定酶解产物的组 成，因此还得结合薄层层析来分析酶解产物，才能确定产酶菌株，这一步工作 常常被忽视。通过摇瓶培养获得的粗酶液，可以用于水解壳聚糖，来分析酶解 产物。 5 0 毗l1 壳聚糖( 用o 0 5 m o l lp h 5 0 的醋酸缓冲液配制) 和5 0 毗l 酶液混合 均匀，5 0 水浴保温反应6 0 m i t l 。用硅胶g 薄层层析分析酶解产物的成分【6 7 1 。 薄层层析的展开剂( 体积比) ：乙酸乙酯一乙醇一水一氨水5 ：5 ：4 ：o 3 。显色剂：o 2 茚三酮乙醇溶液，该显色剂能使壳寡糖和氨基葡萄糖显红色或紫色。标准品采 用氨基葡萄糖盐酸盐。 2 4 菌种的筛选 2 4 1 分离平板筛选 将土样用无菌水梯度稀释，在分离平板上均匀涂布，于3 0 恒温箱中倒置 培养，不时观察菌落生长情况和菌落周围的水解透明圈产生情况。培养3 7 天 后，挑取生长良好且能产生透明圈的单菌落，接至菌种保藏斜面培养基上保存。 2 4 2 产酶平板筛选 将分离平板筛选出的各菌株点接至产酶平板上，3 0 恒温箱中倒置培养。 培养3 7 天后取出平板，测量各菌落直径的大小( d ) 和各菌落周围相应的透明圈 的大小( d ) ，以d 州比值和d 值为指标挑选产壳聚糖酶能力强的菌株。 2 4 3 摇瓶培养条件 将产酶平板筛选所得的各菌株培养活化后，从培养斜面上刮取一环菌体， 接入装有5 0 m l 复筛液体培养基的2 50 i 】! l