（物理化学专业论文）铬（Ⅵ）、银（Ⅰ）与蛋白质相互作用的研究.pdf

摘要 蛋白质是一类重要的生命物质，担负着生命活动过程中多种极其重要的功能，研究 它们的组成、结构和在生命过程中的各种化学变化，是生物化学研究的重要内容。重金 属离子与蛋白质的作用是很多领域都很重视的问题，人们在这方面也做出了很多有意义 的成果。 在本文中，我们利用荧光光谱和紫外光谱对六价铬离子和银离子与牛血清蛋白、卵 清蛋白、木瓜蛋白酶、溶菌酶和胰蛋白酶的作用进行了探讨。铬是人体必需的微量元素， 但是六价铬又被公认为有致癌性。本文利用荧光数据计算了两种金属离子与蛋白质的结 合常数k a 和结合位点数n ，并且结合热力学公式求出了作用过程中体系的h 、s 、 g 等热力学参数。 本研究得出如下一些有意义的结果：通过对体系热力学参数的分析，并结合紫外光 谱确定了c r ( ) 和a g + 与蛋白质的作用形式不同。c r ( v d 具有氧化性，它与蛋白 质作用时先发生氧化还原反应，然后再结合。初步推断c r ( ) 与含巯基蛋白质作用时， 其反应的蛋白质分子和结合的蛋白质分予是不同的。c r ( ) 与蛋白质的作用分为两个 过程，其先与两个半胱氨酸的一s h 发生电子交换，生成s s 键和c ，( 这是电子交换 过程) ，然后c 一再与另外两个s h 发生配位形成最终产物s - c r - g ( 这是配位过程) 。 而a g + 与蛋白质之间的作用力主要是静电作用。 关键词；铬，银，蛋白质，荧光光谱，紫外光谱 a b s t r a c t p r o t e i ni sak i n do fb a s i l i cl i f em a t t e r s c a r r y i n gv a r i e t yi m p o r t a n tf u n c t i o n si nl i f ep r o c e s s e s i ti sa i m p o r t a n tc o n t e n ti nb i o c h e m i s t r yr e s e a r c hf i e l dt os t u d yt h e i rc o m p o s i t i o n , s t r u c t u r ea n dh n 朗删si n v i v o t h eh n 髓删b e t w e e nh e a v ym e t a li o n sa n dp r o t e i nh a sc a u s e dg r e a tc o n c 咖si nm a n yf i e l d s , a n d i nt h i sp l p c w eh a v eu s e df l u o r e s c e n c es p e c t r aa n du vs p e c u at os t u d yt h e 酬o l l sb e t w e e n h e x a v a l e n tc h r o m i u m ，s i l v e ri o na n df i v ek i n d so f p r o t e i nm o l e c u l e s ( b o v i n es f f l m la l b u m i n ，o v a l b u m i n ， p a p a i n ，l y s o z y m ea n dt r y p s i n ) c h r o m i u mi st h ee s s e n t i a le l e m e n to f h m n a n , b u t t h eh e x a v a l e n tc h r o m i u m h a sb e e nc o n s i d e r e dt ob ec a r c i n o g e n i cm a t t e r w ec a l c u l a t e dt h eb i n d i n gc o n s t a n tt k a ) a n db i n d i n gs i t e s ( n ) f r o mf l u o r e s c e n c ed a t a , a n dc a l c u l a t e dt h c r m o d y l l a m i c sp a r a m e t e r sc n t h a l p yc h a n g e ( d ，e n t r o p yc h a n g e ( s ) a n df r e ee n e r g yc h a n g e ( g ) w i t ht h e s t u d y , s o m ei n t e r e s t i n g r e s u l t sh a v eb e e no b t a i n e d a c c o r d i n gt ot h ea n a l y s i so f t h e r m o d y n a m i c sp m a m e t e r sa n du vs p e c * o a , w eo b t a i n e dt h ec o n c l u s i o nt h a tt h ei n t e r a c t i o nb e b v nc r a n dt h ep r o t e i nm o l e c u l ew h i c hc o n t a i nt h i o l ( - s mc o m p o s e do ft w os t e p s t h ef i r s t s t e p j s o x i d a t i o n - r e d u c t i o nr e a c t i o na n dt h es e c o n ds t e pi sc o m b i n a t i o np r o g r e s s t h ep r o t e i nm o l e c u l ew h i c hr e a c t w i t hc ra n dt h ep r o t e i nm o l e c u l ew h i c hc o m b i n ew i t hc ra r en o ts a m eo n e t h ec o n c r e t es t e p sa t et h a t f i r s t l y , c r ( ) a n d - - s h o f t w oc y s t e i n er e s i d u e sr e a c t e d t o f o r m s - sa n d c r ”( t h i s i s t h ee l e c t r o n c h a n g e p r o c e s s ) , a n d t h e n c r 3 + c o m i p o u n d w i t h t w o o t h e r - - s h t o f o r m s - c r - s ( t h i s i s t h ec o o r d i n a t i o n p r o c e s s ) s i n c es i l v e ri o nh a sn o to x i d a t i o n , t h ei n t e r a c t i o no fs i l v e ri o na n dp r o t e i ni sm o s t l ye l e c l r o s t a t i c k e y w o r d s c h r o m i u m , s i l v e r , p r o t e i l l f l u o r e s c e n c es p e c t r a , u vs p e c , h a 独创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究 工作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方 外，论文中不包含其他人已经发表或撰写的研究成果，也不包含为获得河 南师范大学或其他教育机构的学位或证书所使用过的材料。与我一同工作 的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示了谢 意。 签名：堡亟盗日期： 堡丑：鱼! 丝 关于论文使用授权的说明 本人完全了解河南师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查 阅和借阅。本人授权河南师范大学可以将学位论文的全部或部分内容编入 有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编 学位论文。( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 签名：毯生盘导师签名：垒西 日期：坦! z 三 第一章绪论 第一章绪论 生物体是由多种复杂成分组成的。其中有许多的有机分子和金属、非金属离子，也 有各种各样的生物大分子，如多糖、脂质、蛋白质、核酸和生物膜。蛋白质和核酸的作 用最重要，它们是生物体的重要组成物质。脱氧核糖核酸( d n a ) 是遗传信息的载体。 但是遗传信息的复制、转录和表达则要依靠各种蛋白质才能完成。因此，核酸本身的合 成也是依赖于蛋白质的一个复杂过程。从动植物各种生命活动中，也可以看到蛋白质在 起着重要的作用。例如，细胞质中的细胞骨架是由许多种蛋白质构成的三维网状结构， 细胞的各种生命活动都是在细胞骨架上进行的。生命的运动依赖于各种运动蛋白。氧的 运输要靠血红蛋白来完成。机体的代谢活动要依赖各种酶和激素来完成，酶和激素也是 蛋白质( 有些激素是分子量较小的肪) 。可见蛋白质在生命活动中无所不在，生物体内 的蛋白质种类极其繁多，分布极其广泛，所担负的任务也是多种多样的。据人类基因组 的研究估计，人类共有1 0 万个基因，这些基因能编码1 0 万种蛋白质【1 1 。蛋白质是一类 重要的生物大分子【2 】，是生命科学的重要研究对象。蛋白质是生物体内一切组织的基础 物质，并在生命现象和生命过程中起着决定性的作用，它与营养、酶、病毒、免疫、物 质运输、遗传、生命等都有密切关系，因此对蛋白质的研究具有十分重要的意义【3 】。生 命化学是利用化学的理论和方法研究生物体系的组成以及这些物质在生命过程中的化 学变化、能量变化和相互作用情况f 4 】。金属离子与氨基酸、肽及蛋白质的结合在生物体 中扮演着很重要的角色。金属离子与生物分子在溶液中导致一系列的化学过程，如：催 化、电子转移、氧气运输、稳定性作用等。而且金属离子在三维生物结构的有机体中起 着关键性作用。 1 1 蛋白质的结构 蛋白质的结构层次可分为一、二、三和四级结构。蛋白质的二、三、四级结构一般 也称为蛋白质的高级结构堋。 本研究得到国家自然科学基金( n o 2 0 6 7 3 0 3 4 ) 和教育部高等学校博士学科点专项科研基金侧o 2 0 0 6 0 4 7 6 0 0 1 ) 的资助 第一章绪论 1 1 1 一级结构 蛋白质的一级结构一般是指构成蛋白质肽链的氨基酸残基以及肽链以外的其他成 分的排列次序，有时也称为残基的序列。这一定义对只含氨基酸的简单蛋白是适用的。 但是在生物体内还有很多复合蛋白，它们除了氨基酸外，还有其它的组成。对复合蛋白， 完整的一级结构概念应该包括肽链以外的其它成分( 例如糖蛋白上的糖链，脂蛋白中的 脂质部分等) 以及这些非肽链部分是以何种方式，接在肽链中哪些残基上。蛋白质的一 级结构是一个无空间概念的一维结构【n 。二硫键的定位也是一级结构的重要内容 2 1 。 1 1 2 二级结构 蛋白质的二级结构是指多肽链骨架的局部空间结构，不考虑侧链的构象及整个肽链 的空间排列，它们是完整肽链构象( 三级结构) 的结构单元，是蛋白质复杂的空间构象 的基础，故它们也可称为“构象单元”。常见的二级结构有洳螺旋、b 折叠等规则结构， 转角、环形等半规则和卷曲无规则结构等。各类二级结构几乎全部是由肽链骨架中羰基 上的氧原子和亚胺基上的氢原子之间的氢键所维系，其它作用力如范德华力，配位键， 二硫键等也有一定贡献。蛋白质的二级结构通常是比较稳定的，这种稳定对生物体有着 重要的意义。但是通过大量的研究发现，蛋白质中的一些构象单元的结构也是可以改变 的，即一些肽段的二级结构可以因环境的改变而转换。如p h 、温度、溶剂极性等环境 因素可以影响单元的变化 4 1 。这种二级结构的转换可能是某些疾病发生的原因，例如由 疯牛病而引起人们关注的朊病毒( p r i o n p r o t e i n , p r p ) 的研究，提供了蛋白质二级结构转 变与疾病发生的一些例证。用圆二色谱和傅立叶变换红外光谱研究都表明，正常的p r p 只含有舡螺旋，但是病变的p r p 却含有4 0 的p 折叠。这表明在疯牛病病变过程中， 一些肽段的二级结构发生了变化，因此，蛋白质的二级结构对蛋白质的功能有着重要的 意义。 1 1 3 三级结构 一个蛋白质的构象，即肽链中的规则的二级结构和其他无规则的肽段一起构成完整 的立体结构称为蛋白质的三级结构。稳定蛋白质三级结构主要是依靠各种非共价键和疏 水作用。然而，绝大多数蛋白质中二硫键对蛋白质的稳定和三级结构的形成也起到相当 重要的作用川。 1 1 4 四级结构 2 第一章绪论 四级结构的概念最早是由b e m a l 于1 9 5 8 年提出的隅, 9 1 ，蛋白质的四级结构是指一些 具有一定空间结构和生物活性的蛋白质肽链，彼此通过非共价的相互作用，从而按一定 的计量比例和特定的排列方式组装成一个有更高层次，具备更完美生物活性的复合体 系。作为蛋白质四级结构组分的肽链被定义为亚基，有时也称为“亚单元”。在亚基间并 不存在共价键，亚基间的相互作用都是非共价键i 。 图1 - 2 蛋白质结构的四个层次 1 2 维持和稳定蛋白质高级结构的因素 蛋白质的二、三、四级结构一般也称为蛋白质的高级结构。除了单键的旋转以外， 肽链内部的一些原子和基团间的相互作用也是蛋白质产生高级结构和稳定蛋白质高级 结构的一个重要的原因。肽链内部一些原子和基团间的相互作用，也是化学中常见的一 些分子和基团问的化学键或相互作用o o - 1 2 1 。常见的有以下几种。 1 2 1 静电作用( 盐键) 组成蛋白质的氨基酸中的多种可解离的侧链基团，在正常的生理条件下，有带正电 荷的，也有带负电荷的。这些解离后的带电侧链，相互间可能产生静电作用，习惯上也 称之为盐键。这种静电作用严格服从库仑定律，其作用强度和电量的乘积成正比，和电 荷间的距离的平方成反比。蛋白质中这些可解离基团的电离情况和局部环境的p h 有很 大的关系，也和局部环境的介电性质有关。蛋白质中一些极性的基团，在分子内其它原 子或基团的作用下，也可能诱导成为有一定稳定性的永久偶极。羰基c = o 经诱导可成 第一章绪论 为s + c = 0 8 - 。这种永久偶极之间以及永久偶极和带电的基团之间也能产生静电作用。不 仅侧链的基团间可能有这种偶极间的静电作用，在肽链骨架中的已形成肽键的羰基间也 有这种方式的相互作用旧。 1 2 2 氢键 在蛋白质肽链骨架中存在着大量的羰基和亚胺基残基，其侧链中有许多是带有极性 基团的。很多基团上的氢原子可以作为形成氢键的氢供体，最主要的是肽键中的亚胺基 上的氢，此外，还有色氨酸侧链吲哚环上和氮原子连接的氢、组氨酸侧链眯唑环上和氮 原子连接的氢、酪氨酸侧链酚基上的氢、一些酸性氨基酸的羰基和酰胺基上的氢以及侧 链羟基上的氢等。作为形成氢键的氢接受体的基团主要是羰基上的氧( 包括肽链骨架中 的羰基和一些酸性残基中的羰基或酰胺基上的羰基) 、侧链上的羟基氧以及甲硫氨酸中 的硫原子等。氢键可以用下面的通式表示： - i h a _ 其中d 是氢供体，a 是氢接受体。由于氢供体和氢接受体的负电性有所不同( o n s ) ，故氢键的长度和强度也有所差别。如果氢供体和接受体本身还带有电荷，通过酸 性残基和碱性残基间的氢键，其强度就更强些。在生物体内还存在着大量的水，机体中 的水可以分为两类：游离水和结合水。结合水也可以和蛋白质表面的一些基团形成氢键， 这些结合水在稳定蛋白质的结构中起重要作用，有些结合水还参与了蛋白质的生物活 性。虽然形成氢键的能量变化并不大，但是氢键在蛋白质的结构和功能中，尤其是二级 结构的形成中，却特别重要。 1 2 3 范德华力 蛋白质中的所有原子都在不断地运动，原子中的电子也绕着原子核不停地运动。因 此，一些原子的正负电荷在一瞬间也可能有相对的偏移，造成了瞬间偶极。这些瞬间偶 极之间也能发生相互作用，被称为是色散力，也称为范德华力。尽管这种色散力很弱， 只在很短的距离内有作用，但是由于蛋白质分子内的原子数目是大量的，这种色散力也 不容忽视。 1 2 4 残基的亲水性和疏水性 从某种意义上说，生物体是亲水物质和疏水物质平衡统一的产物。组成蛋白质的2 0 种氮基酸各自带有不同性质的侧链基团，有些是极性的，它们很容易和水作用，或是形 4 第一章绪论 成氢键，或是融合于水环境中；另一些残基的侧链却是非极性的，不表现出和水或其它 极性基团相互作用的能力和倾向，它们在水溶液中和在非极性环境中相比，显然是热力 学上不利的。因此，这些侧链有与同类侧链相互接触的趋向，当它们接触时就会将非极 性侧链周围的多少有些规则的水分子变成了可自由运动的游离的水分子。和上述几种分 子间的相互作用比较，一些非极性残基侧链的聚集所产生的能量变化要大的多。因此， 非极性残基侧链的相互作用在蛋白质稳定的立体结构中的重要性倍受人们重视。这种作 用被称为疏水作用，疏水作用的本质是一种熵驱动的作用。在蛋白质形成的二级结构中， 疏水作用不是至关重要的，但是在蛋白质的三级结构的形成和稳定中，疏水作用是位于 诸多因素的首位。 1 2 5 配位键 一些蛋白质中除了肽链外还含有一些金属，在分类上可称其为金属蛋白。在蛋白质 中已发现的金属有铁、钙、锌、铜、锰、镁、钼等。这是因为组成蛋白质的氨基酸中， 可参与氢键的很多基团都能和一些金属形成配位键，例如色氨酸、组氨酸以及一些酸性 残基的侧链。这些金属对稳定蛋白质的结构有一定的作用，对它们的功能也有贡献。 1 2 6 二硫键 二硫键是一种共价键，多数蛋白质具有二硫键。然而在蛋白质肽链生物合成时，并 不存在和二硫键有关的胱氨酸的密码。在新生肽链合成后，两个半胱氨酸的侧链基氧化 成胱氨酸，肽键中才出现二硫键，它是蛋白质翻译后加工的结果。二硫键的形成使蛋白 质肽链的空间结构更为紧密，对稳定蛋白质的结构起了重要的作用。二硫键也有不同的 构型，因此形成二硫键的两个半胱氨酸残基所在肽段的相对构象也可因二硫键的构型不 同而改变，这从另一方面突出了二硫键在蛋白质立体结构中的重要性。 1 2 7 其它因素 从二硫键这种蛋白质肽链翻译后的加工对蛋白质的立体结构的形成和稳定所起的 作用，很自然地联想到其它的蛋白质肽链翻译后的加工，例如糖基化和磷酸化等，也可 能对蛋白质的构象产生影响。例如糖基化可以明显地改变蛋白质表面的亲水和疏水的平 衡，也必然影响到蛋白质的立体结构和稳定性。 5 第一章绪论 n h 2 盐键；油键； 一疏水作用； 一范德华力；一= 硫键 图1 2 稳定蛋白质三维结构的各种作用力 1 3 蛋白质的功能 1 3 1 酶的催化 构成生物体新陈代谢的全部化学反应都是由具有催化功能的蛋白质一酶所催化的。 几乎所有的酶都是蛋白质，没有酶的催化作用，化学转化在活体中是十分困难的。因此 可以说，蛋白质扮演了一个唯一能决定生物体系中化学转化模式的角色。 1 3 2 机械支持 蛋白质在生物体中还起着机械支持作用。例如，皮肤和骨骼的高抗张强度，是由于 称为胶原的一种纤维蛋白质在生物体所起的机械支持作用。在所有真核生物细胞中都存 在一个细胞骨架，它是由肌动蛋白组成的微丝，由微管蛋白组成的微管和由角蛋白组成 的中间纤维构成的一个网状结构，使细胞具有一定的形状和结构。 1 3 3 运输和贮存 很多小分子和离子是由专一蛋白质来运载和贮存的。例如，血红蛋白在红血球中运 输氧，而铁蛋白作为复合体将铁贮存起来。现已证明，在神经细胞中一些营养物质包装 6 第一章绪论 在囊泡中，靠一种称为力蛋白( d y n e i n ) 的蛋白沿着微管运送到远处。 1 3 4 协调动作 在一些生命活动中，两种或几种蛋白质协调作用，完成某种生物学功能。例如，肌 肉的收缩是通过两种蛋白微丝( 肌动蛋白的细丝和肌球蛋白的粗丝) 的滑动来完成的。 此外，有丝分裂中染色体的运动以及精子鞭毛的运动等，也是由蛋白质组成的微管的运 动产生的。 1 3 5 免疫保护 抗体是高度专一的蛋白质，它们能识别抗原、病毒、细菌以及来自其他有机体的细 胞异物，并与之结合，从而在区别自身和非自身中起着重要的作用。 1 3 6 生长和分化的控制 遗传信息的受控的、按顺序的表达，对细胞有秩序的生长和分化十分重要，细胞的 基因组中每一次只有一小部分被表达出来。在细菌中，阻遏蛋白质是使细胞的d n a 中 某些特殊片段不被表达的重要控制组分。 1 3 7 神经冲动的产生和传递 神经细胞对特定刺激的反应是由受体蛋白传递的。例如，在突触处，即在神经细胞 的交接处，传递神经冲动的是被像乙酰胆碱这样的专一小分子触发的受体分子。 1 3 8 信号转导 生物能够对外界刺激做出反应。生物体感受到外界的信号如光、气味、激素、神经 递质( 乙酰胆碱) 、生长因子的刺激之后，即与细胞表面的受体缩合成复合物，随后受 体又与g 蛋白相互作用，使g 蛋白的a ，p ，丫亚基解离，然后g 蛋白又与细胞内的效 应物如酶、离子通道等相互作用，使之做出反应。 1 3 9 跨膜运输 生物细胞从外界吸收的各种离子( 如c a 2 + ，k + ) 和水分子都是通过细胞膜上的离 子通道，进行跨膜运输的。现已证明，离子通道( 包括水通道) 都是由蛋白质组成的。 1 3 1 0 电子传递 有些蛋白质能进行电子的传递，简单的如铁氧蛋白能传递电子，复杂的如线粒体上 的呼吸链和能进行光合作用的叶绿体上的光合链，在呼吸链上和光合链上有很多电子传 7 第一章绪论 递蛋白，如各种细胞色素a ，b ，c 等能传递电子，使细胞膜两侧产生电位差，实现某种 生物学功能。 1 3 1 1 代谢调节功能 生物体存在精细有效的调节系统以维持正常的生命活动。参与代谢调节的许多激素 是蛋白质或者多肽，如胰岛素、胸腺素及各种激素等。胰岛素可调节血糖的水平，若分 泌不足可导致糖尿病。 1 4 蛋白质的变性 蛋白质经较剧烈条件处理后得到的肽链，习惯上称为变性蛋白【4 】。天然蛋白质的严 密结构在某些物理或化学因素作用下，其特定的空间结构被破坏，从而导致理化性质和 生物活性的丧失，如酶失去催化活力，激素丧失活性称之为蛋白质的变性作用 ( d e n a t u r a t i o n ) 。变性不涉及肽键和二硫键的破裂，一级结构仍保持完好。 常见的变性包括1 4 】： ( 1 ) 化学基团的暴露，原来隐藏在内部的基团向外暴露而形成化学可亲性基团。 ( 2 ) 物理、化学性质的改变，表现为结晶能力的丧失，溶解度的降低，分子形状 的变化，不对称性增高，相应粘度增加，扩散系数降低，分子大小改变。 ( 3 ) 对蛋白酶水解感受性增加，蛋白质变性后，分子结构伸展松散，易被蛋白水 解酶分解。这就是熟食易于消化的道理。 引起蛋白质变性的原因可分为物理和化学因素两类。天然蛋白质分子受到某些物理 因素如加热、紫外线照射、超声波作用、高压和表面张力等或化学因素如有机溶剂、脲、 胍、酸、碱、重金属盐等的影响时，生物活性丧失，溶解度减低，不对称性增高以及其 它的物理化学常数发生改变。 当变性程度较轻时，如去除变性因素，有的蛋白质能恢复或部分恢复其原来的构象 及功能，这种变性的可逆变化称为复性。是否所有的蛋白质变性都是可逆的，这一问题 至今仍有疑问，至少实践中未能使所有蛋白质在变性后都重新恢复活力。然而多数人都 接受变性是可逆的概念，认为天然构象是处于能量最低的状态，有些蛋白质变性后之所 以不能逆转，主要是所需条件复杂，不易满足的缘故【嘲。 8 第一章绪论 1 5 铬、银研究概述 1 5 1 铬的生理作用 c r 3 + 是铬最稳定的氧化态，是生物体内最常见的。研究表明，铬表现为必需元素还 是有害元素，其价态起决定性作用。c r 2 + 易被氧化，在生物体内不存在，因此c r 2 + 和金 属铬本身的毒性很小或无毒。三价铬是一种生命必需微量元素 1 6 , 1 刀，是正常糖脂代谢所 不可缺少的，缺铬会引起动脉硬化等多种疾病。铬的生理功能可以归纳为【1 8 1 ：它是葡萄 糖耐量( 即人体从血液里摄取糖和葡萄糖的能力) 因子的组成成分，是某些酶的活化剂， 是核糖类的稳定剂，还能促使胆固醇和脂肪酸的生成。六价铬由于其氧化性和对皮肤的 高渗透性，毒性很大，被确认有致癌作用【1 9 - 2 4 1 。上世纪3 0 年代德国、美国、英国及其 他国家的流行病学资料显示铬酸盐工厂职工多患肺癌、鼻癌、咽癌等。c r ( ) 在生物 体内具有很强的流动性，它可以以c r 0 4 2 一、c r 2 0 7 2 一的形态通过带负电的细胞膜，并且 促使其氧化，从而导致病变发生。吸收入血液中的铬是与白蛋白结合而存在的。c r ( ) 的毒性比c 一大1 0 0 倍，它可影响细胞的氧化、还原，能与核酸结合，对呼吸道、消化 道有刺激，有致癌、诱变作用瞄】。一种观点认为六价铬化合物的主要毒性是由六价铬在 细胞内还原为三价铬的过程中的产物所引起的【2 6 】。另一种观点认为进入细胞的六价铬与 细胞内大分子d n a 相结合，引起遗传密码的改变，进而引起细胞的突变和癌变 2 7 1 。 1 5 2 铬的研究概述 铬( c r ) 来自希腊文c a r o m a ，意思为颜色。铬作为金属元素是1 7 9 7 年被法国化学 家v a u q u e l 发现的。铬作为一种常见的金属元素在现代工业尤其是电镀、冶金、制革、 染色、颜料等行业中被广泛应用。铬的化学形态在不同条件下会相互转化，价态有二价、 三价和六价，常见的是三价和六价。c r ( ) 在热力学上是一个较稳定的价态，c r ( ) 在动力学上较稳定，他们在天然条件下可以相互转化。 1 9 5 7 年德国移居美国的医学科学家m e r t z 和s e h w a r z 发现大鼠摄入少量猪肾粉或啤 酒酵母后，可恢复大鼠内源性糖耐量损伤网。1 9 5 9 年m e r t z 和s c h w a r z 进一步分析发现， 有一种无机物质具有恢复大鼠内源性糖耐量正常的作用，即具有g t f 的活性阴。1 9 5 9 年s e h w a r z 等又对多种无机盐分析后认为，大多数三价铬化合物具有g t f 的活性，由 此m e r t z 确认三价铬是组成g t f 的必要成分。从而证实铬是人体必需的矿物元素【3 0 】。 1 9 7 4 年他们又证实g t f 的主要成分是铬与烟酸、谷氨酸、甘氨酸和半胱氨酸的水溶性 9 第一章绪论 配合物。1 9 8 4 年d a n i e lw j k w a a g 和d a v i de p e n n i n g t o n 两人d 1 1 对c r ( ) 氧化l 一 半胱氨酸进行了研究，并且提出了几种可能的机理。2 0 0 0 年a n a t o l yz h i t k o v i c h 等人【3 2 】 在一篇文章中曾报道过c r ( ) 可先将半胱氨酸的s h 氧化，然后再与其结合形成 s - c r 键。 1 5 3 银的研究 有1 4 种微量元素目前已被公认为生命必需微量元素，即v 、c r 、m n 、f e 、c o 、n i 、 c u 、z n 、m o 、f 、s i 、s n 、s e 、i 等。除生物必需元素外，象砷、锑、秘、铂、铑、金、 银等，它们虽然不是人体中的元素，但进入人体后，却可以起着重要的药理和生理作用。 近年来，人类越来越多地利用非必需元素和有毒元素，在医药方面，我们正处于无机药 物复兴时期。抗癌药物如铂配合物、抗炎抗病毒的金化合物、颇有希望治疗糖尿病的钒 化合物和治疗白血病的砷化合物等反映了无机药物的强大活力和潜力【3 3 】。银广泛分布于 自然界，在地壳中含量为1 x 1 0 - 2 ，居地壳中元素丰度的第六十三位，海水中估计每升 含有l u g 银。银不是生命必需的物质，但仍发现在各种生命组织中有痕量的银存在，如 在牛的肝脏和胰腺中分别含银0 0 0 0 5 0 0 0 1 。由于少量的银离子有消毒作用，因此成 为医用药物，李时珍在本草纲目中已有用银入药的记载刚。银对细菌等微生物的生 长繁殖起毒害作用，n a g e l i 将其称为微动效应( o l i g i d y n a m i ce f f e c t ) 。银的微动活性较高， 杀菌力也较强，因此人们早就用银器防止饮料变质，在外科手术中用银箔或银片来处理 骨折1 3 5 】。 国内外对银【3 9 】与蛋白质的作用研究较少。根据金属配合物的软、硬酸碱理论，a g ( d 属于软酸【柏】，与o ，n s 结合的能力顺序是：s n o 。s i d g w i c k 首先提出的各种元素生 成配合物的形式和稳定性的因素中指出a g ( i ) 属于亲硫元素，与硫生成的配合物的稳定 性远大于与氧或氮的。 1 6 本论文研究的目的和内容 1 6 1 研究的目的 对重金属元素毒害作用的研究一直是环境生物化学的一个重要方面和热点问题。化 学家、生物学家和医学家针对不同的目的开展工作，从各个方面、不同角度研究了其对 生态环境的影响，取得了不少可喜的成果。但是由于重金属粒子对动植物作用的毒理学 l o 第一章绪论 机制十分复杂，牵涉很多方面的因素，不同的研究报道并不完全一致。在分子水平上研 究其对生物分子的作用方式，探讨其作用的更深层的原因对理解重金属离子的毒理机制 有重要意义。本实验主要从结构和光谱学性质着手来对比性的探讨铬、银和蛋白质分子 的相互作用。重金属离子会使蛋白质发生交性，变性过程中蛋白质的结构和光谱性质会 发生怎样的变化，可能的作用机理是什么，这是本实验研究的动机。 1 6 2 研究方法的选择和研究的体系 近年来，国内外学者用各种方法如；平衡透析法【4 1 蛔、傅立叶变换红外光谱法 4 7 - s 9 1 、 荧光光谱法 6 0 - 6 2 1 、紫外可见光谱法 6 3 - 6 6 1 、核磁共振法【6 7 侧等各种物理和化学方法对蛋 白质等大分子和c d 冲、c 0 2 + 、n i 2 + 、f e 、c d 2 + 、h 矿、p b 2 + 、m n 2 + 、z n 2 + 、c a 2 + 、a g + 等多种无机离子 6 9 - 7 4 1 的作用进行了研究。而对于c r ( ) 与蛋白质作用的研究【7 5 - 7 7 1 却比 较少。本实验我们尽可能选择在蛋白质结构不受影响的情况下，利用荧光光谱和紫外光 谱法相结合，在p h = 7 0 2 的条件下对牛血清蛋白、卵清蛋白、木瓜蛋白酶、胰蛋白酶 和溶菌酶等五种蛋白质和铬、银的作用进行了研究，用多个参数同时表征了两种金属离 子与蛋白质的作用形式。 第二章实验方法和数据处理方法 2 1 荧光分析法 第二章实验方法和数据处理方法 2 1 1 荧光的产生 当紫外光照射到某些物质的时候，这些物质会发射出各种颜色和不同强度的可见 光。而当紫外光停止照射时，这种光线也随之很快地消失，这种光线称为荧光。蛋白质 中的荧光是由三种芳香族氨基酸产生的，强度比为，色氨酸：酪氨酸：苯丙氨酸= 1 0 0 ： 9 ：o 5 。因此，大多数情况下，可以认为蛋白质所显示的荧光主要来自色氨酸残基的贡 献，而且包含色氨酸残基的蛋白质的天然荧光及其变化直接反映了蛋白质中色氨酸残基 本身和周围的变化。 2 1 2 荧光分析法 荧光分析方法包括：常规的荧光分析法、同步荧光测定、三维荧光光谱技术、导数 荧光测定、时问分辨荧光测定、相分辨荧光测定、荧光偏振测定、荧光免疫测定、低温 荧光测定、固体表面荧光测定、荧光动力学分析方法等1 7 8 1 。近十几年来，在其它学科迅 速发展的影响下，随着激光、微处理机和电子学的新成就等一些新的科学技术的引入， 大大推动了荧光分析法在理论方面的进展，并且相应地加速了各式各样新型的荧光分析 仪器的问世，使荧光分析法不断朝着高效、痕量、微观和自动化的方向发展，方法的灵 敏度、准确度和选择性日益提高，方法的应用范围大大扩展，遍及于工业、农业、医药 卫生、环境保护、公安情报和科学研究等各个领域中。如今，荧光分析法已经发展成为 一种重要且有效的光谱化学分析手段。 荧光光谱法具有灵敏度高、选择性强、试样量少和方法简便等优点，而且无机离子、 无机化合物、有机化合物、药物、糖类、维生素、甾族类化合物、氨基酸、蛋白质 7 9 1 、 酶、核酸等都能够用荧光分析法进行定性定量测定。该法也是化学工作者、生化工作者、 药物和食品分析工作者所利用的重要分析手段之一。 荧光猝灭指的是荧光物质分子与溶剂分子或溶质分子之间所发生的导致荧光强度 下降的物理或化学作用过程。与荧光物质分子发生相互作用而引起荧光强度下降的物 质，称为荧光猝灭剂。猝灭过程实际是与发光过程相互竞争从而缩短发光分子激发态寿 命的过程。荧光猝灭过程可以分为两种：一种是动态猝灭，另一种是静态猝灭。动态猝 第二章实验方法和数据处理方法 灭是由于荧光物质分子和猝灭剂分子之间发生碰撞而引起的猝灭，而静态猝灭是由于二 者之间生成配合物而引起的猝灭。在动态猝灭中，荧光的量子产率是由光反应的动力学 所控制，而在静态猝灭中，荧光的量子产率通常只受基态的配合作用的热力学所控制。 正如一切事物都有两重性一样，荧光猝灭作用在荧光分析中有降低待测物质的荧光强度 的不良作用一面，但另一方面，人们也可以利用某种物质对某一荧光物质的荧光猝灭作 用而建立对该猝灭剂的荧光测定方法嗍。 荧光光谱属于辐射光谱，运用荧光光谱技术等研究某些金属离子或有机小分子与蛋 白质等生物大分子相互作用模式和作用特征，发现如药物等有机小分子的作用靶和作用 前后蛋白质分子构型的变化，借以获取蛋白质分子的有关信息，对于研究药物的药理作 用、毒物的毒理作用及环境污染对生命物质的影响等均具有重要意义i s l 。通过测定金属 离子对蛋白质分子中内源发色基团残基荧光影响的一些参数，不但可以做一般的定量分 析，而且还可以推断蛋白质分子在各种环境下的构象变化，从而阐明蛋白质结构与功能 之间的关系。 2 1 3 荧光分析法的数据处理 动态猝灭方程式- - s t e r n - v o l m e r 方程 s 2 1 争= l + k q f 0 q = l + k 。纠 ( 1 ) 其中，k 为双分子猝灭过程速率常数，甸为猝灭剂不存在时物质的荧光寿命， q 】 为猝灭剂的浓度，k d 为s t e r n - v o l m e r 猝灭常数。s t e r n - v o l m e r 方程式说明，f o ，f 与猝灭 剂的浓度呈线性关系。由鲁对【q 】作图可求出k d ， 置。：垒 ( 2 ) f 0 便- - f 以计算求得双分子猝灭过程的速率常数k ，单位为( m o l l 1 ) 一s - 1 。由于生物大 分子的荧光寿命1 8 2 , 8 3 1 为1 0 n s 数量级，假如猝灭过程是扩散控制的，各种猝灭剂对生物 大分子的最大扩散碰撞猝灭常数州为k = 2 0 1 0 1 0 ( m o l l - 1 ) s 1 如果根据s t e r n - v o l m e r 方程计算出的k 2 0 1 0 1 0 ( m o l l - 1 ) s 1 ，猝灭过程则为 形成化合物所引起的静态猝灭，而不是由于分子碰撞所引起的动态猝灭。动态和静态猝 灭也可根据不同温度条件下的结果得以区别。动态猝灭依赖于扩散，而增高温度导致扩 1 3 第二章实验方法和数据处理方法 散加快，因此猝灭常数将随着温度的升高而增大。但温度升高将导致配合物的稳定性降 低，因此，静态猝灭常数的值将随温度的升高而减d d s s , 蛔。 当小分子和生物大分子结合平衡时，它们的相互作用结合位点数符合以下方程 8 7 - 9 1 】 b 掣 啦喇 ( 3 ) f ，f o - 分别为有猝灭剂和无猝灭剂时的荧光强度 k a 蛋白质与猝灭剂的结合常数 n 结合位点数 【o 】- 猝灭剂平衡浓度 根据方程( 3 ) 以l o 旦笋 为纵坐标，以l 。g 纠为横坐标作图，通过斜率和截距 可以求出蛋白质与猝灭剂之间的结合常数和结合位点数。 2 1 4 束缚模型 在体系温度变化很小时，h 可以看作是一个常数。根据方程( 4 ) 和( 5 ) 便可以 求出体系的h 、s 、g 等热力学参数。 1 n 生：竺f 当一7 11( 4 ) k l rl 五疋j 、7 a g = 埘一飓s = - r t i n k ( 5 ) 蛋白质分子的结构由分子中的共价键和非共价键作用决定 9 2 , 9 3 1 ，其中非共价键作用 包括氢键，范德华力，疏水作用力和静电作用。一些热力学参数如吉布斯自由能变g ， 焓变a h 和熵变a s 是确定束缚模型的主要依据i 9 4 1 。a g 是负值，那么束缚过程就是自 发的。氨基酸和电解质离子之问的作用由三种效应组成，( a ) 静电效应( b ) 溶质的部 分去溶剂化效应( c ) 溶剂的重组效应。静电效应主要发生在离子和极性氨基酸之间， 静电作用是放热的，并且对焓有负效应。部分去溶剂化效应是由溶剂的溶剂化层半球重 叠引起的 9 y j ，因此，部分去溶剂化效应将对焓产生正效应。而溶剂重组效应对焓的影响 要对具体反应体系进行具体分析，通常，如果溶剂的重组增强了溶剂的结构，它将对焓 产生负效应，如果减弱了将产生正效应。根据氨基酸和电解质反应模型 9 6 1 ，电解质离子 是通过静电作用束缚到氨基酸的极性基团上的，这种效应将导致焓和熵的负效应。水溶 液中蛋白质是高度水合的，尤其是在带电基团的周围，电解质离子也是高度水合的。它 1 4 第二章实验方法和数据处理方法 们之间的静电作用伴随着溶质的部分去溶剂化，部分去溶剂化效应是吸热的，并且它会 破坏溶质溶剂层的水结构，因此，对焓和熵产生正效应。如果静电作用小于部分去溶剂 化作用，那么h 和s 都是正值，相反，如果大于去溶剂化作用，h 和k s 则都是 负值。 2 2 紫外光谱法 2 2 1 紫外光谱的产生 紫外和可见光谱( u l t r a v i o l e ta n dv i s i b l es p e c t r o s c o p y ，u v - v i s ) 统称为电子光谱。这 类光谱是由于分子的价电子或外层电子发生跃迁产生的。电子光谱的波长范围为1 0 8 0 0 r i m ，该波段又可分为：可见光区( 4 0 0 8 0 0 n m ) ，有色物质在这个区域有吸收；近 紫外区( 2 0 0 4 0 0 n m ) ，芳香族化合物或具有共轭体系的物质在此区域有吸收，这是紫 外光谱研究的主要对象；远紫外区( 1 0 2 0 0 n m ) ，由于空气中的0 2 、n 2 、c 0 2 和水蒸 气在这个区域有吸收，对测定有干扰，远紫外光谱的操作必须在真空条件下进行，因此 这段光谱又称为真空紫外光谱，通常所说的紫外是指2 0 0 4 0 0 n m 的近紫外光谱。 影响紫外吸收波长的因素：( 1 ) 共轭体系的形成使吸收红移：共轭体系的形成使分 子的最高已占轨道能级升高，最低空轨道能级降低，胂矿跃迁的能量降低，胂矿能量 差减小，紫外光谱的最大吸收移向长波方向。( 2 ) 超共轭效应：当烷基与共轭体系相连 时，可以使波长产生少量红移。这是因为烷基的c h 的。电子与共轭体系的耳电子云发 生一定程度的重叠，扩大了共轭范围，从而使丌靓跃迁能量降低，吸收红移。( 3 ) 溶 剂效应：在霄帆跃迁中，因激发态的极性大于基态，所以在极性溶剂中，极性溶剂对 电荷分散体系的稳定能力使激发态和基态的能量都有所降低，但程度不同，前者大于后 者，这就是导致跃迁吸收能量较在非极性溶剂中减小，故吸收带红移。在n 朔跃迁中， 极性溶剂对它的影响与兀专矿相反，溶剂使得1 1 - - - 瓶* 跃迁的吸收带随着溶剂极性增加而 蓝移。( 4 ) 立体效应：立体效应是指因空间位阻、构象、跨环共轭等影响因素导致吸收 光谱的红移或蓝移，立体效应常常伴随增色或减色效应。( 5 ) p h 对紫外光谱的影响： p h 的改变可能引起共轭体系的延长或缩短，从而引起吸收峰位置的改变，对一些不饱 和酸、烯醇、酚及苯胺类化合物的紫外光谱影响很大。如果化合物溶液从中性变为碱性 时，吸收峰发生红移，表明该化合物为酸性物质；如果化合物从中性变为酸性时，吸收 峰发生蓝移，表明化合物可能为芳胺。 第二章实验方法和数据处理方法 2 2 2 蛋白质的紫外光谱 蛋白质通常有两个特征紫外吸收带，一个在1 9 0 2 2 0 n m ，是由肽键的吸收引起的， 肽链的构象会影响该位景的吸收，另一个在2 5 0 2 8 0 r t m ，是由蛋白质中酪氨酸、苯丙 氨酸和色氨酸三种芳香族氨基酸引起的。无机化合物的紫外光谱通常是由两种跃迁引起 的，即电荷迁移跃迁和配位场跃迁。所谓电荷跃迁，指在光能激发下，配合物中的电荷 发生重新分布，导致电荷可从配合物的一部分迁移到另一部分而产生的吸收光谱。这种 光谱产生的条件是配合物中有一部分能作为电子给予体，而另一部分能作为电子接受 体。由于在激发过程中，电子在分子中的分布发生了变化，因此认为电荷迁移的过程实 际是配合物内部的氧化还原过程。过渡金属离子及其化合物除了电荷迁移跃迁以外， 还可能发生配位场跃迁。配位场跃迁包括d 跃迁和“f 跃迁。在配位场的影响下， 处于低能态d 轨道上的电子受激发后跃迁到高能态的d 轨道，这种跃迁称为d 斗d 跃迁。 镧系和锕系元素含有f 轨道，在配位场的影响下，处于低能态f 轨道上的电子受激发后 跃迁到高能态的f 轨道，这种跃迁称为f f 跃迁。配体不同，同一中心离子产生跃迁所 吸收的能量也不同，即吸收波长不同。由于d 轨道跃迁易受外界的影响，d - d 跃迁的吸 收谱带较宽；f 轨道属于较内层的轨道，吸收受外界影响小，吸收峰为尖锐的窄峰 7 4 】。 含有非键电子的酸性基团s h 等共轭7 【电子体系的