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两种酶的人工基因在酵母中的表达及改造 植酸酶的新策略 摘要 植酸酶是应用于饲料工业的一种酶，而脂肪酶则应用于制药、油脂与造纸等 传统与现代工业。植酸酶可以促进单胃动物( 如猪、鸡等) 对植物籽实中以植 酸形式存在的磷的吸收，从而降低饲料的成本，并减轻畜牧业对环境造成的磷 污染问题，具有重要的经济与环境保护价值。迄今在饲料工业中应用的植酸酶 多为来自黑曲霉n r r l 3 1 3 5 菌株的植酸酶( a s p e r g i l l un i g e rn r r l 3 1 3 5p h y t a s e ， a n p ) ；而目前世界上工业应用最广泛的商品化脂肪酶则是褶皱假丝酵母脂肪酶 ( c a n d i d ar u g o s a l i p a s e ，c r l ) ，其中褶皱假丝酵母脂肪酶同功酶1 ( l i p l ) 是 c r l 中最重要的一种同工酶。无论是a n p 还是l i p l ，它们在天然菌株中的产量 都很低下，这两种酶的原始基因在外源宿主中的表达量也都不高。 本文通过改造a n p 与l i p l 的编码基因以实现它们在毕赤酵母( p i c h i a p a s t o r i s ) 中的高效表达。首先将a n p 的编码基因中1 1 4 个宿主只p a s t o r i s 不偏 爱的密码子替换为偏爱密码子。其中主要替换的是编码s 、r 、t 、g 、p 、l 等 氨基酸的密码子，也替换了少量编码a 、c 、v 等氨基酸的密码子。然后将人工 合成的修改基因插入表达质粒p p i c z a a 并转化入只p a s t o r i s 。通过在自控发酵罐 中高密度发酵重组酵母，使重组a n p 蛋白的产量达到了2 9 0 u m l ，约为亲本株 产量的5 0 0 倍左右。同样根据p p a s t o r i s 中密码子的使用情况( 本文使用t r r 编 码f ，t t g 编码l ，a t t 编码i ，a t g 编码m ，g t t 编码v ，t c t 编码s 。t ( 玎 编码c ，a c t 编码t ，g c t 编码a ，g g t 编码g ，c a t 编码h ，c a a 编码q ， a a c 编码n ，a a g 编码k ，g a t 编码d ，g a a 编码e ，c c a 编码p ，t g g 编 码w ，a g a 编码r ，t a c 编码y ) ，将l i p l 成熟多肽序列转换为相应的d n a 序列。然后将该人工合成的改造后基因插入表达质粒p g a p z a a 并转化入只 p a s t o r i s 。通过高密度发酵，使重组l i p l 蛋白的产量达到了7 0 0 0 u m l ，提高到 亲本株产量的7 0 倍左右。 以上对提高a n p 产量进行的研究，只是解决了植酸酶生产的成本问题；植酸 酶的催化性质对其在饲料工业中的应用也有很大的影响。虽然a n p 具有比活高 ( 1 0 0 u m g 蛋白) 且在p h 2 5 、5 0 附近都能保持较高活力等优点；但也存在耐 热性差( 不能制粒) ，底物特异性差，及在p h 4 0 左右活力急剧下降等缺点。而 来自烟曲霉a t c c1 3 0 7 3 菌株的植酸酶( a s p e r g i l l u sf u m i g a t u so h y t a s e 。a f p ) 贝o 在 p h 4 0 - 7 0 范围内都能保持较高的活力且具有很好的耐热性与底物特异性。但a f p 与a n p 相比，存在比活低( 2 3 u m g 蛋白) 及在p h 2 5 左右没有活性等缺点。本 文设想通过引入a f p 的优点以改良a n p 的催化性质，或通过同样策略以改良前 者的催化性质。 本文探索了一种改进植酸酶催化性质的新策略一一基于结构的片段改组 ( s t r u c t u r e b a s e df r a g m e n ts h u f f l i n g ，s b f s ) 来实现上述目的。植酸酶属于组氨 酸酸性磷酸酶( h i s t i d i n ea c i dp h o s p h a t a s e s ，n a p s ) 家族。在h a p s 的三级结构中， 存在一个高度保守的超二级结构r o s s m a n nf o l df r o ，由6 个b 折叠组成。r f 及 1 个保守的a 一螺旋中的一段( 2 3 8 2 4 5 ) 所对应的序列，担当“铰链”的角色。 这样a f p 和a n p 的序列被6 段“铰链”( 4 8 - 5 8 、1 3 4 1 3 8 、1 7 3 - 1 7 7 、2 3 8 2 4 5 、 3 3 0 3 3 7 与3 8 2 4 0 3 ) 划分为相应的两组( s 1 至s 6 、s 8 及s a 至s g ) 各7 个小 片段，其中小片段s 1 ( 1 - 4 7 ) 、s 2 ( 5 9 - 1 3 3 ) 、s 3 ( 1 3 9 - 1 7 2 ) 、s 4 ( 1 7 8 - 2 3 7 ) 、 s 5 ( 2 4 6 3 2 9 ) 、s 6 ( 3 3 8 3 8 1 ) 及s 8 ( 4 0 4 4 4 4 ) 来自a 邱；而s a ( 1 - 4 7 ) 、s b ( 5 9 1 3 3 ) 、s c ( 1 3 9 1 7 2 ) 、s d ( 1 7 8 2 3 7 ) 、s e ( 2 4 6 3 2 9 ) 、s f ( 3 3 8 3 8 1 ) 及s g ( 4 0 4 4 4 4 ) 则来自a n p 。而s b f s p 植酸酶( s b f sp h y t a s e ，s b f s p ) 多肽 序列中的6 段“铰链”又为a l p 中的对应序列。两组各7 个d n a 小片段通过p c r 获得后，又通过o v e r l a p p i n gp c r 技术产生了9 9 种s b f s p 基因( 理论上有2 7 = 1 2 8 种组合) 。通过检测上述嵌合体基因在pp a s t o r i s 中表达产物的活性后，随机选 取了5 0 种有活性组合中的2 3 种s b f s p 。通过超滤浓缩、离子交换色谱( i o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y ，i e x ) 与凝胶过滤( g e l f i l t r a t i o n ，g f ) 等步骤进行纯 化。测定它们在p h5 0 时的酶活，发现所有的s b f s p 的比活都比a n p 大为下降， 只达到3 2 7 0 u m g 蛋白。其中转化有1 2 8 基因的重组酵母所分泌的s b f s p ( 简称 1 2 8 # ，6 个“铰链”被a f p 中的对应序列取代的a n p 突变体) 的比活为6 9 1u m g 蛋白，提示“铰链”的全部或部分与s b f s p 在该p h 的比活下降相关。 1 8 # ( s 4 与s 6 被s d 与s f 取代的a f p 突变体) 为最成功的一种s b f s p 。它 既具有1 2 8 # 的高比活也具有a l p 广泛的底物作用范围；并在p h 2 5 5 5 的范围内 都保持了较高的比活，表明该嵌合体植酸酶整合了a n p 与a l p 在最适p h 方面的 优点。此外，由于1 8 # 具有三段与a f p 耐热性相关的序列( e 3 5 $ 4 2 、g 1 6 3 r 1 6 8 与r 2 4 8 $ 2 5 4 ) ，它也可以为提高a n p 的耐热性提供线索。 另有若干s b f s p 则具有一些亲本植酸酶没有的性质，如6 5 # ( s 1 被s a 取代 的a l p 突变体) 与1 0 1 # ( s i 、s 2 与s 5 被s a 、s b 与s e 取代的a f t , 突变体) 的 最适温度比亲本的高( 7 0 v s5 8 ) 。 本文也通过比较各种s b f s p 的p h 曲线以探索各a n p 来源小片段对它们p h 曲线的影响。发现除s g 外的所有小片段对s b f s p 在各个p h 上的比活都有影响。 s a 在s b f s p 中的出现提高了它们在p h 2 5 7 0 范围内植酸酶的比活。s f 则提高 了它们在p h 3 0 ( 或4 o ) 一7 0 范围内的比活。s b 在不同的组合中对s b f s p 酶 活的影响是不一样的。将a f t , 中的s 2 替换为s b 后，它的p h 曲线毫无变化； 而将1 2 4 # ( s b 被s 2 取代的1 2 8 # 的突变体) 中的s 2 替换为s b 后，它在p h 2 5 5 0 范围内的比活上升。s c 在不同的组合中对s b f s p 酶活的影响也是不一样的。 1 2 2 # ( s b 、s c 被s 2 、s 3 取代的1 2 8 # 的突变体) 中的s 3 被替换为s c 后，它在 p h 2 0 3 0 范围内的比活上升。而2 5 # ( s 6 、s 8 被s f 、s g 取代的a l p 的突变体) 中的s 3 、s g 替换为s c 、s 8 后，它在p h 2 0 4 5 范围内的比活上升，而在p h 4 5 7 0 范围内的比活下降。s d 在不同的小片段组合中对口h 曲线的影响甚至是互相矛 盾的。如将2 5 # 中的s 4 替换为s d 后可以提升其p h 2 5 5 0 范围内的比活。而在 1 2 1 # ( s b 、s c 与s d 被s 2 、s 3 与s 4 取代的1 2 8 # 的突变体) 中，同样的替换 却降低了同样p h 范围内的比活。s e 也在不同的小片段组合中对p h 曲线施加这 种截然不同的影响。6 6 # ( s 1 、s 4 被s a 、s d 取代的a l p 的突变体_ ) 中的s 5 替 换为s e 后，它在p h 2 5 5 0 范围内的比活下降。而a l p 中的s 5 替换为s e 后， 却也导致了它在同样p h 范围内比活的上升。 本文更进一步发现s d 与s e 对曲线所施加的影响互相拮抗从而导致了上述 的这种矛盾：虽然s d 或s e 在s b f s p 中单独出现，可以促进p h 2 5 5 0 范围内 比活的上升；但这两个小片段在s b f s p 中同时出现( 如上述的9 8 # 与6 5 # 比) 却 反而使得该p h 范围内的比活降低。s e 对p h 曲线的影响可以与先前报道的第 2 7 7 位与第2 8 2 位的定点突变实验结果吻合。而其他各种小片段对p h 曲线的影 响，先前均未见报道，可为植酸酶的改造提供新线索。 结合先前报道，本文提出a l p “铰链”中的v 5 3 、a 1 3 7 、1 1 7 6 、a 3 3 0 、a 3 8 4 与k 3 9 5 中的一个或若干个位点可能与a n p 和a f p 在p h 5 0 左右的比活差异有关。 关键词：植酸酶，脂肪酶，必赤酵母，偏爱密码子，基于结构的片段改组 h i g he x p r e s s i o n o fa r t i f i c i a l g e n e s o ft w o e n z y m e s i n y e a s t a n dn e w s t r a t e g y f o r i m p r o v e m e n t o f p h y t a s ep r o p e r t i e s a b s t r a c t p h y t a s ei su s ei nf e e di n d u s t o r y , a n dl i p a s ei su s e di np h a r m a c y , f a ta n do i l 。 p a p e r m a k i n g a n do t h e ri n d u s t r y s u p p l e m e n t m o n o g a s t r i ca n i m a l s ( s u c ha ss w i n ea n d p o u l t r y ) w i t hp h y t a s ec a l li n c r e a s et h ed i g e s t i o no fp h y t a t e ，t h em a j o rs t o r a g ef o r mo f p h o s p h a t ei ns e e d s ，a n dr e d u c eb o t ht h ef e e dc o s ta n dpp o l l u t i o nb yd e c r e a s i n gt h e u s a g e o fi n o r g a n i c p h o s p h a t e a s p e r g i l l un i g e rn r r l 3 1 3 5p h y t a s e ( a n p ) i si nw i d e s p r e a du s er e c e n t l y a n d c a n d i d a r u g o s al i p a s e ( c r l ) i so n eo ft h em o s tw i d e l ya p p l i e dc o m m e r c i a ll i p a s e c r l l s o e n z y m e l ( i j p a ) i st h em a j o rc o m p o n e n to fi t b o t ha n pa n dl i p la r ep o o r l y p r o d u c e db y t h e i rp a r e n ts t r a i n s a n do r i g i n a l a n pa n d jg e n e s a r ea l s oe x p r e s s e d i nh e t e r ot r a n s l a t i o ns y s t e m s i n e f f i c i e n t l y a n pa n dl i p lg e n e sw e r em o d i f i e df o rh i 曲e x p r e s s i o ni np i c h i ap a s t o r i s 1 1 4 c o d o n so fn o n p r e f e r e n c ei na n pw e r es u b s t i t u t e db ye l ) d o n so fp r e f e r e n c ei n 只 p a s t o r i s m o s to f t h e ma r ec o d o n sf o rs ，r ，tq p ，l a n dt h er e s ta r et h ec n d o n sf o r a ，c ，vt h em o d i f i e da n pg e n ew a sa r t i f i c i a ls y n t h e s i z e da n di n s e r t e di nt h e e x p r e s s i o np l a s m i dp p i c z a a t h er e c o m b i n a n tp l a s m i dw a st r a n s f o r m e di n t op p a s t o r i s t h er e c o m b i n a n ty e a s ts t r a i nc o u l ds e c r e t ea n p i n t os u p e m a t ea tal e v e lo f 2 9 0u m li nh i g h c e l l d e n s i t yf e r m e n t a t i o n ( 5 0 0t i m e sh i g h e rt h a nt h ey i e l do fp a r e n t s t r a i n ) a l s oa c c o r d i n gw i t h t h ec o d o n su s a g ei n1 7 p a s t o r i s ，t h em a t u r ep e p t i d e s e q u e n c eo fl i p lw a s r e v e r s e - t r a n s l a t e di n t od k a s e q u e n c e ( 砸u s e df o r 毪喇 u s e d f o r k a 竹u s e d f o r i ，a t gu s e d f o r m ，g 订u s e d f o r v ，t c r u s e d f o r s ，t g t u s e df o rga c tu s e df o rt ，g c tu s e df o ra ，g g tu s e df o rg ，c a tu s e df o r 珏 c a a u s e d f o r q ，a a cu s e d f o r n ，a a gu s e d f o r i ( ，g a t u s e d f o rd g a a u s e d f o r e ，c c au s e df o rp ，t g gu s e df o rw ，a g au s e df o rr ，t a cu s e df o rn t h e m o d i f i e d l i p lg e n ew a sa r t i f i c i a ls y n t h e s i z e da n di n s e r t e di nt h ee x p r e s s i o np l a s m i d p g a p z a a t h er e c o m b i n a n tp l a s m i d w a st r a n s f o r m e di n t orp a s t o r 括t h e r e c o m b i n a n ty e a s ts t r a i nc o u l ds e c r e t el i p li n t os u p e r n a t ea tal e v e lo f7 0 0 0 u m l i n l l i g hc e l l - d e n s i t yf e r m e n t a t i o n ( 7 0t h n e sh i g h e rt h a nt h ey i e l do fp a r e n ts t r a i n ) a l t h o u g ht h ep r o d u c t i o nc o s to fa n p c a nb ec u td o w na sm e n d o n e d a b o v e ，t h e c a t a l y t i cp r o p e r t i e so fp h y t a s ea r e a l s o i m p o r t a n tt o f e e d i n d u s t r y a n ph a sh i g h s p e c i f i ca c t i v i t yf o rp h y t a t e ( 1 0 0 u m gp r o t e i n ) a n dt w op ho p t i m a a t2 5a n d5 0 b u t i tc a nn o tr e s i s th i 。g ht e m p e r a t u r ed u r i n gf e e d p e l l e t i n g ，a n dh a sp o o ra c t i v i t yf o r o t h e rs u b s t r a t e s i tl o s t s6 0 o fm a x i m u m s p e c i f i ca c t i v i t y a r o u n d p h 4 0 a s p e r g i l l u sf u m i g a t u sp h y t a s e ( a f p ) h a s ab r o a dp ho p t i m u mi nt h er a n g e4 0 - 7 3 ， u n u s u a lt h e r m o s t a b i l i t ya n db r o a ds u b s t r a t es p e c i f i c i t y b u ta f ph a sal o ws p e c i f i c a c t i v i t y ( 2 3 u r a gp r o t e i n ) a n dh a s r i oa c t i v i t ya r o u n dp h 2 5 t h ec a t a l y t i cp r o p e r t i e s o f a n p m a y b ei m p r o v e di ft h ea d v a n t a g e so f a f p c a nb ei n t r o d u c e di n t oi t a n dt h e c a t a l y t i cp r o p e r t i e so fa f pm a y a l s ob ei m p r o v e di ft h ea d v a n t a g e so fa n pc a nb e i n t r o d u c e di n t oi t an e w s t r a t e g y , s t r u c t u r e - b a s e df r a g m e n ts h u f f l i n g ( s b f s ) ，w a sd e v e l o p e dh e r e t or e a c ht h et a r g e tm e n t i o n e da b o v e p h y t a s e sb e l o n gt oh i s t i d i n ea c i dp h o s p h a t a s e s ( h a p s ) f a m i l y s i m i l a rt ot h es t r u c t u r e so fm a n y o t h e rn a p s ，t h es t r u c t u r eo fa n po r a l p h a sac o n s e r v a t i v es u p e r s e c o n d a r ys t r u c t u r e ，r o s s m a n nf o l d ( r 0 ，w h i c hc o n s i s t s o fs i xb - s h e e t s t h es e q u e n c e so fr fa n dac o n s e r v e dp a r to fo d ea h e f i x ( 2 3 8 2 4 5 ) w e r et a k e na sc r o s s o v e r si ns b f s t h es e q u e n c e so fb o t ha n pa n da l pw e r e s e p a r a t e db y s i xc r o s s o v e r s ( 4 8 - 5 8 ，1 3 4 - 1 3 8 ，1 7 3 1 7 7 ，2 3 8 - 2 4 5 ，3 3 0 - 3 3 7a n d3 8 2 4 0 3 ) i n t ot w o g r o u p s o fs m a l lf r a g m e n t s ：s 1 ( 1 4 7 ) ，$ 2 ( 5 9 1 3 3 ) ，$ 3 ( 1 3 9 1 7 2 ) ，$ 4 ( 1 7 8 - 2 3 7 ) ， $ 5 ( 2 4 6 3 2 9 ) ，$ 6 ( 3 3 8 3 8 1 ) a n d $ 8 ( 4 0 4 - 4 4 4 ) d e r i v e d f r o m a f p ；a n ds a ( 1 4 7 ) ， s b ( 5 9 1 3 3 ) ，s c ( 1 3 9 1 7 2 ) ，s d ( 1 7 8 - 2 3 7 ) ，s e ( 2 4 6 3 2 9 ) ，s f ( 3 3 8 3 8 1 ) a n ds g ( 4 0 4 4 4 4 ) d e r i v e df r o ma n p t h ec o r r e s p o n d i n gs e q u e n c e so fc r o s s o v e r si n 蛳w e r e u s e di na l l s b f s p h y t a s e ( s b f s p ) t w og r o u p s o fs m a l ld n a f r a g m e n t sw e r e o b t a i n e db yp c r ； t h e nm i d d l e s i z e dd n a f r a g m e n t s w e r eo b t a i n e df r o md i f f e r e n tc o m b i n a t i o no fs m a l l d n a f r a g m e n t sb yo v e r l a p p i n g p e r a n da tl a s t ，b yo v e d a p p i n gp c r a p p r o a c ha g a i n ， v i d i f f e r e n tc o m b i n a t i o no fm i d d l e - s i z e dd n a f r a g m e n t sw e r ep e r f o r m e d t oo b t a i n e d9 9 c h i m e r a g e n e s ( 2 7 = 1 2 8t h e o r e t i c a l l y ) 9 9s h u f f l e dg e n e sw e r ee x p r e s s e d i n 只p a s t o r i s ， r e s p e c t i v e l y a m o n gt h e m ，5 0r e c o m b i n a n t sc o u l ds e c r e t ea c t i v es b f s p 2 3o f5 0 a c t i v e s b f s p w e r e s e l e c t e d ，c o n c e n t r a t e d a n d p u r i f i e db y i o n e x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y a n d g e lf i l t r a t i o n t h e p u r i f i e ds b f s p w e r ea s s a y e df o rt h e i rc a t a l y t i cp r o p e r t i e s a l lo f t h e m ，h a d l e s ss p e c i f i ca c t i v i t i e s ( 3 2 7 0 u m gp r o t e i n ) f o rp h y t a t et h a nt h a to fa n pa tp h5 0 a n dt h es b f s ps e c r e t e db yt h er e c o m b i n a n ty e a s tt r a n s f o r m e dw i t h1 2 8g e n e ( 1 2 9 蛾 a n pm u t a n t ，o fw h i 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g e df r o m2 5t o7 0 s fc o u l d i n c r e a s e dt h es p e c i f i ca c t i v i t yo fs b f s pi nt h ep hr a n g e df r o m3 0 ( 4 o ) t o7 0 s b h a dd i f f e r e n ti n f l u e n c e si nd i f f e r e n ts b f s p ；s u b s t i t u t i o no fs 2w i t hs b h a dn oe f f e c t o nt h ep h p r o f i l eo fa l p ；a n ds u c hs u b s t i t u t i o nc o u l d i n c r e a s et h es p e c i f i ca c t i v i t yo f 1 2 4 # ( 1 2 8 # m u t a n t ，o fw h i c hs b w a ss u b s t i t u t e db y s 2 ) i nt h ep hr a n g e df r o m 2 5t o v i i 5 0 s ca l s oh a dd i f f e r e n ti n f l u e n c e si nd i f f e r e n ts b f s p ；s u b s t i t u t i o no fs 3w i t hs c c o u l di n c r e a s et h es p e c i f i ca c t i v i t yo f1 2 2 # 靠2 8 警m u t a n t , o fw h i c hs ba n ds c w a s s u b s t i t u t e db ys 2a n ds 3 ) i nt h ep h r a n g e df r o m2 0t o3 0 ；a n ds u b s t i t u t i o no fs 3 s g 旗壤 s c ,s 8 c o u l di n c r e a s et h es p e c i f i ca c t i v i t yo f2 5 # ( m om u t a 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3 a 1 3 7 , 1 1 7 6 , a 3 3 0 , a 3 8 4a n dk 3 娇m a y b ei n v o l v e di nt h ed i f f e r e n c e b e t w e e nt h es p e c i f i ca c t i v i t i e so f a r pa n da n pa tp h 5 0 k e yw o r d s ：p b y t a s e ；l i p a s e ；p i c h i a p a s t o r & ；c o d o n s o f p r e f e r e n c e ； s t r u c t u r e b a s e df r a g m e n ts h u f f l i n g 中山大学博士学位论文 两种酶的人工基因在酵母中的表达及改造 植酸酶的新策略 贝锦龙 导师：王殉章，教授 专业：生物化学与分子生物学 研究方向：基因的表达与调控 答辩委员6 - ( 签名) ： 主席酬箍县 颈：洳沈 百密l 组 中山大学生物防治国家重点实验室，广州5 10 2 7 5 2 0 0 4 年1 1 月 骥 贝锦龙中山太学博上毕业论文 缩略词 a f pa s p e r g i l l u sf u m i g a t u s a t c c1 3 0 7 3 p h y t a s e 烟曲撵a t c c1 3 0 7 3 植酸酶 a n a pa s p e r g i l l u sn i g e rp h 2 5a c i dp h o s p h a t a s e 黑萄霉p h 2 5 酸槛磷酸酶 a 娌堙e l a s p e r g i l l u sn i g e r 黑曲霉