（生物化学与分子生物学专业论文）乙醇脱氢酶的克隆表达及生物活性分析.pdf

摘要 浙江大学硕士学位论文 人乙醇脱氢酶( a l c o h o ld e h y d r o g e n a s e ，a d h ，e c1 1 i 1 ) 是含锌原子 n a d 依赖的胞质二聚体酶，能可逆氧化各种醇为相应的醛酮，是乙醇代谢的 关键酶。它可分成五大类，共七个基因，具有基因多态性、种族特异性、性 别特异性、组织特异性和时间特异性。目前对其动力学性质，结构和功能的 研究较多，但整个乙醇脱氢酶体系作用的机制还不清楚。 小量摄取酒精对身体有益，但过度饮用却会引起酒精敏感性反应( 表现 为脸红、心博加快、血压下降、头晕、恶心、呕吐等) ，甚至导致器官病变( 如 肝硬化、上下消化道癌、心脏病等) 随着酒销售量的增加，人们对解酒保肝 类物质的需求日益迫切。人a d h 制成的保健品在来源上比同类产品更具优势， 基本没有副作用，用它来研制解酒药将会是一项重要的应用和未来发展的趋 势。在人乙醇脱氢酶中，a d h l b 2 同工酶的活性最高，它的基因工程研究有 重要的经济价值和社会价值。 本文以人肝脏总r n a 为模板，r t - p c r 扩增得到a d h ! b 2 基因，克隆到 p u c m - t 载体。再利用引物上的酶切位点，把, a d h i b 2 基因重组到原核表达载 体p 脚o e xh t b 中，构建成p p r o e x - a d h l b 2 质粒。a d h ! b 2 基因与6 x h i s 的编 码序列在大肠杆菌b l 2 1 ( d e 3 ) q ，进行融合表达。在最佳表达条件3 7 c 、0 5m m i p t g 浓度、诱导表达7h 后，a d h i b 2 融合蛋白以包涵体的形式高效表达，其 外源基因表达量占全菌蛋白的5 8 ，刷新了原核表达a d h l b 2 高产的新记录。 二次洗涤包涵体，可以获得纯度较高的目的蛋白，这为工业化生产提供了条 件。利用6 x h i s 标签，n i ”亲和层析，可获得超高纯度的目的蛋白。亲和层折 结果表明，当咪唑浓度达到6 0 m m o l l 时，目的蛋白开始流出，到达1 0 0 m m o l l 时有最大的洗脱峰。纯化后的蛋白经含有精氨酸的变性溶液透析复性后，监 测a 枷的变化，结果表明复性蛋白具有a d h 活性，比活力达到9 5 4u m g 蛋白。 这是我国首次用原核表达载体p p r o e xh t b 获得a d h i b 2 关键词：乙醇脱氢酶；a d h l b 2 ；原核表达；组氨酸标签 浙江大学硕士学位论文 a b s 仃a c t h u m a na l c o h o ld e h y d r o g e n a s e ( a d h , e c1 1 1 1 ) i sac y t o s o l i c , d i m e r i c , z i n c - c o n t a i n i n ga n dn a d - d e p e n d e n te n z y m e i tc a t a l y z e st h er e v e r s i b l eo x i d a t i o n o f a w i d ev a r i e t y o f a l c o h o l s t o t h ec o r r e s p o n d i n ga l d e h y d e sa n dk e t o n e s , a n da c t s a sr a t e l i m i t i n ge n z y m ei ne t h a n o lm e t a b o l i s m t h en e wn o m e n c l a t u r eo r g a n i z e s s e v a , lh u m a na l c o h o l d e h y d r o g e n a s eg e n e s i n t of i v ec l a s s e s i th a st h e c h a r a c t e r i s t i c so fg e n ep o l y m o r p h i s m ，e t h n i cs p e c i f i c i t y , g e n d e rs p e c i f i c i t y , t i s s u e s p e c i f i c i t ya n dt i m es p e c i f i c i t y r e c e n t l yt h e r eh a v eb e e nm a n yr e s e a r c h e so ni t s k i n e t i cp r o p e r t y , s t r u c t u r ea n df u n c t i o n ，b u tt h eo v e r a l lm e c h a n i s mf o rt h ee n t i r e a l c o h o ld e h y d r o g e n a s es y s t e mh a sa sy e tt ob ee s t a b l i s h e d l i t t l ea m o u n to fa l c o h o li s b e n e f i c i a l h o w e v e r , e x c e s s i v ea l c o h o l c o n s u m p t i o nc o u l di n d u c ea l c o h o lt o x i c i t y , s h o w i n gr u b i c u n d i t y , q u i c kh e a r t b e a t , l o wb l o o dp r e s s u r e ，s w i r l ，s u r f e i t , v o m i ta n de ta 1 i tc o u l de v e nc a u s eo r g a n p a t h o l o g i cc h a n g e ss u c ha sl i v e rc i r r h o s i s , d i g e s t i v et r a c tc a n c e r , h e a r td i s e a s ea n d s oo n w i t ht h ei n c r e a s i n gc o n s u m p t i o no f a l c o h 0 1 p e o p l ea 托i n c r e a s i n g l yd e m a n d f o ra n t i a l c o h o la n dl i v e r - p r o t e c t i o nm a t e r i a l s h u m a na d h d r u gi ss u p e r i o rt o o t h e rc o n g e n e rp r o d u c t sd u et oi t ss o u r c ea n ds i d e - c f f e c t s oa p p l y i n go fa l c o h o l d e h y d r o g e n a s eo nd e v e l o p i n ga n t i a l c o h o ld r u g sw i l lb ei t si m p o r t a n ta p p l i c a t i o n a n df u t u r ed e v e l o p m e n tt r e n d b e c a u s ei s o e n z y m ea d h i b 2h a st h eh i g h e s t a c t i v i t y i nh u m a na d hc l a s s , i t ss t u d yo ng e n ee n g i n e e r i n gm a yh a v eg r e a t e c o n o m i ca n ds o c i a lv a l u e s i nt h i sp a p e r , a d h l b 2g e n ew a so b t a i n e db yr t - p c ru s i n gh u m a nl i v e rt o t a l r n aa st e m p l a t ea n dw a sc l o n e di n t op u c m - tv e c t o r t h e na c c o r d i n gt or e s t r i c t s i t eo np r i m e r s ，w ei n s e r ta d h l b 2g e n ei n t op p r o e xh t bv e c t o rt oc o n s t r u c t p l a s m i dp p r o e x a d h l b 2 a d h ! b 2a n d6 x h i sw e r ef u s e d - e x p r e s s i o ni ne c o i l b l 2 1 ( d e 3 ) a f t e rp e r f e c te x p r e s s i o ni n3 t ce n v i r o n m e n ti n d u c t e db yo 5 m m i p t gf o r7 1 1 , h i g h y i e l de x p r e s s i o no fa d h l b 2f u s e dp r o t e i n ，e x i s t i n gi nt h e i n c l u s i o nb o d y ，w a sa c h i e v e d , a n di ti s5 8 o ft o t a lb a c t e r i ap r o t e i n t h i sd a t a 4 晰江太学硕士学位论文 e x c e e d sa n yo t h e rp r o k a r y o t i ce x p r e s s i o ns y s t e mb e f o r e t h ew a s h e di n c l u s i o n b o d ya c h i e v e dh i g hp u r i t ya n dt h i si su s e f u lf o ri n d u s t r i a l i z e dp r o d u c t i o n n i c k e l a f f i n i t yc h r o m a l o g r a p h yw a su s e dt oo b t a i nh i g h e rp u t t yp r o t e i na c c o r d i n gt oi t s6 xh i st a g t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a tt a r g e tp r o t e i nw a s f i r s t l ye l u t e db y6 0m m o l l p y r a z o l ea n dt h e nr e a c h e de l u t i o np e a kb y1 0 0m m o l lp y r a z o l e t h ep u r i f i e d p r o t e i nw a sr e f o l d e db yd i a l y z i n gi nr e f o l d i n gs o l u t i o nw i t hl - a r g i n i n e t h er e s u l t s s h o w e dt h a tt h er e f o l d e dp r o t e i nh a sa d ha c t i v i t yt h r o u g hw a c i n ga 3 w ea r e f i r s t t o e x p r e s s a d h l b 2 p r o t e i nu s i n g p r o k a r y o t i c e x p r e s s i o n v e c t o r p p r o e x h t b k e yw o r d s ：a l c o h o ld e h y d r o g e n a s e ；a d h i b 2 ；p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n ；h i st a g 5 浙江大学硕士学位论文 第一篇：论文综述部分 乙醇脱氢酶的研究进展 刖吾 浙江文学硕士学位论文 人乙醇脱氢酶是含锌原子n a d 依赖的胞质二聚体酶能可逆氧化各种醇 为相应的醛酮，是乙醇代谢的关键酶。人乙醇脱氢酶按新命名法可分成五大 类，共七个基因，具有基因多态性、种族特异性、性别特异性、组织特异性 和时问特异性目前对其动力学性质、结构和功能的研究较多，但整个乙醇 脱氢酶体系作用的机制还不清楚。过度饮洒行为能导致人体产生一系列的疾 病，如酒精中毒、营养不良、胎儿酒精综合症、皮肤病变、酒精肝病、消化 道癌症等，但其分子机制还有待于研究。随着酒消耗量的增加，人们对解酒 保肝类物质的需求日益迫切，用乙醇脱氢酶来研制解酒药将会是一项重要的 应用和未来发展的趋势。 1a d h 的分类、命名及其多态性 x a d h 基因簇位于四号染色体长臂上4 i p t g 浓度 时间，即在不同温度下，目的蛋白的表达量差异最显著。其最佳 表达条件为：3 7 ( 2 、0 5m mi p t g 浓度下诱导表达7 小时。 4 2 晰江大学硕士学位论文 图8 不同因囊及水平对蛋白表达量的影响 f i g 8e f f e c to f d i f f e r e n tf a c t o r sa n dl e v e lo np r o t e i ne x p r e s s i o n 1 - 9 ：c o r r e s p o n d i n gt ot a b l e1 0 ；m ：p r o t e i nm a k e r 表l ol ( ，) 正交实验分析表 项目组( 泳道)诱导温度诱导时每ji p t g 浓度蛋白含量( ) l 3 4 5 6 7 8 9 k i k 2 k 3 撅差( r ) 因素主次 最优条件 2 5 2 5 2 5 3 0 3 0 3 0 3 7 3 7 3 7 1 2 7 6 0 4 1 4 6 6 0 8 1 5 6 3 l 2 8 7 0 6 1 3 7 7 h 5 h 3 h 7 l l 5 h 3 h 7 i i 5 h 3 h 1 5 1 9 0 2 1 3 5 0 6 s 1 4 3 5 5 2 1 6 s 3 4 3 7 1 1 o 2n d v l o 5 m m 1 0 m m 0 5 m m 1 0 m m 0 2 m m 1 o m m o 2 m m o 5 m m 1 4 3 6 4 1 5 3 0 1 7 1 3 3 $ 6 5 1 9 1 5 2 2 0 5 m m 4 7 6 3 3 4 3 5 9 7 3 6 3 7 4 5 1 8 7 6 4 5 胂8 4 9 6 3 4 5 2 3 9 3 4 6 3 7 3 5 7 5 4 4 3 7 包涵体的提取和纯化 浙江大学硕士学位论文 本文所选用的融合表达载体p p r o e xh t b 是p p r o e x | r r 原核表达系统中的 一种，具有以下特点：1 ) 可实现蛋白的商效可溶性表达；2 ) 可通过一步纯化获 得较纯的蛋白产物；3 ) 可通过烟草蚀刻病毒蛋白酶将靶蛋白从融合蛋白上切 下，亲和层析去除6 h i s 头尽管p p r o e xh t 原核表达系统具有上述优点， 并成功地应用于许多蛋白的表达，但在实际操作中往往还存在形成包涵体的 问题。这可能与表达所用宿主菌的选择、生长及诱导温度，诱导时的菌体密 度、诱导时间和i p t g 浓度等有关【1 6 m 。 p p r o e xh t b 质粒的特性使得a d h l b 2 融合蛋白能在a d h ! b 2 的n 端带6 h i s 序列。多聚组氨酸能与多种过渡金属和过渡金属螯合物结合，利用这一 特性可将带暴露的6 h i s 的蛋白结合于固化n i 2 + 树脂，用适当缓冲液冲洗除去 杂蛋自后，再用可溶的竞争性螫合剂昧唑洗脱回收靶蛋白由于天然蛋白对 树腊基质的结合力通常不高，因此金属螫合层析的纯化效率非常高。 在包涵体抽提过程中，分别收集超声后的上清l ，细胞裂解缓冲液l i 洗涤 后的上清2 ，洗涤缓冲液洗涤后的上清3 以及包涵体溶液进行s d s p a g e 电 泳，其结果如图9 所示。与诱导过的全菌蛋白相比( 泳道1 ) ，上清1 ( 泳道2 ) 中无目的蛋白条带，上清2 ( 泳道3 ) 和上清3 ( 泳道4 ) 也无目的条带，并 且蛋白量明显减少。抽提得到的包涵体溶液( 泳道5 ) 有5 0 k d 左右的目的条 带，但蛋白不纯，有杂带。 为了进一步纯化目的蛋白，将上述包涵体溶液进行n i 计柱亲和层析，分别 用5 个柱体积的g u n t a - 0 g u n t a 5 0 0 缓冲液洗脱结合的蛋白，每份3 m 1 分 步收集，监测a 2 ，不同浓度味唑洗脱所搜集的洗脱液及其在2 8 0 n m 的光吸收 值如表1 1 所示。从表中可以看出，当咪唑浓度达到6 0m m o f l 左右时，蛋白 开始流出，当眯唑浓度达到1 0 0m m o l l 左右，有最大的洗脱峰，当咪唑浓度 达5 0 0m m o l l 时，蛋白基本全部洗出。将表l l 的洗脱数据及相应a 。值作一 洗脱曲线( 图1 0 ) 结果显示，在8 m o l l 尿素存在下，包涵体溶液通过n i 2 + 金 属蝥合柱后有一个明显的洗脱峰( 第3 3 和3 4 管收集液) 分别取2 0 此的3 3 和3 4 号收集液，混以2xs d s 上样缓冲液，进行 s d s - p a g e 分析( 见图9 ) 。可以看出，洗脱峰蛋白的分子量在5 0 k d 左右， 浙缸土学硕士学位论文 与a d h l b 2 融台蛋白的分子量一致，并且条带单一，获得了较好的纯化效果 ( 泳道6 、7 ) 图9 蛋白纯化的s d s - p a g e 电泳分析 f 嘻9s d s - p a g ea n a l y s i so f p r o t e i nd u r i n g t h ep u r i f i c a t i o n 1 ：t o t a lp r o t e i nf r o mi n d u c e dc e l l ；2 ：s u p e r l t a r t tl ；3 ：s u p e m a t a n t2 ；4 ：s u p e r n a t a n t3 ；5 ： s o l u t i o no fi n c l u s i o nb o d i e s ；6 ：t h e3 4 t hs a m p l ec o l l e c t e db yc l u t e dw i t hi m i d a z o l eb u f f e r ；, 7 ： n i e3 3 t hs a m p l ec o l l e c t e db ye l u t e dw i t hi m i d a z o l eb u f f e r ；m ：p r o t e i nm a r k e r 表l l 咪唑洗脱收集液的a 值 冼脱体积l 23456 7 s 91 0 a 2 8 0 0 3 9 4 0 , 1 2 50 0 5 40 0 2 90 0 2 7 0 0 1 00 0 0 90 0 1 20 0 1 6 o n l s 洗脱体积 i i1 21 31 41 51 6 1 71 01 9 2 0 a 2 s o0 0 1 90 0 1 70 , 1 0 00 0 4 40 0 5 8 0 0 6 50 0 5 90 0 5 40 0 5 0 0 0 4 4 洗脱体积 2 12 22 3 2 42 52 62 7 2 82 93 0 a 2 8 00 , 0 5 80 0 7 20 1 0 50 1 8 0 0 2 0 40 2 7 10 0 7 50 0 9 5 0 1 5 60 , 1 7 2 洗脱体积3 13 23 3 3 43 53 63 73 839柏 5 l 晰讧文学硕士学位论文 图l o 咪唑洗脱峰 f i g 1 0e | u t i o np e a kw i l hi m i d a z o l eb u f f e r 3 8 蛋白复性及活性检测 将第3 3 和3 4 管的洗脱液用包涵体溶解缓冲液稀释至o 。0 1 5 m g m l 后，装 入透析袋中，用含2 m o l l 脲的复性缓冲液4 c 透析4 8 h ，然后于透析液中透析 3 0 h ，每隔5 h 换透析液，复性液的最终体积为2 0 m l 。然后用考马斯亮蓝法测 定复性目的蛋白的浓度【1 引9 1 。表1 2 为不同浓度的标准蛋白在a 5 9 5 的吸光值。 以表1 2 的测定结果标准曲线( 图1 1 ) ，得方程y = 0 0 1 1 l x + 0 0 1 6 ，r 2 = 0 9 9 8 3 。 取5 0m 的复性蛋白液进行测定，其a 5 9 5 值为0 4 5 2 2 。根据标准曲线，计算获 得复性后的收集液中，蛋白浓度约为o 7 8 6 m g m l 。 表1 2l i s a 标准品浓度 试管编号o l2 3 4 56 i m g m l 标准蛋白溶液( m 1 ) oo o lo 0 2 o 0 30 0 4o 0 5o 0 6 0 1 5 m o l l n a c i ( m 1 ) o 1 0o 0 9o 0 80 0 7o 0 60 0 50 0 4 考马斯亮蓝试剂( m 1 )5 m l a 5 9 5o o o o o0 1 4 2 20 2 4 1 8o _ 3 5 6 90 4 5 9 10 5 6 1 40 6 8 2 2 浙江文学硕士学位论文 图1 0 b s a 标准曲线 f i g 1 0s t a n d e r c u r v eo f b s a 我们通过测定光吸收值在3 4 0 r i m 处的变化，来定量测定反应中的酶活性。 将3 m l 酶活测定体系( 2 0 p , i 酶液) 迅速倒入比色皿中，于2 5 1 33 4 0 n m 处测定 光吸收值的变化，每i m i n 读取一次，以a 撕对反应时间作图( 图1 1 ) 。将o d 3 柏 在2 5 l m i n 内发生o 0 0 1 的数量变化定义为一个活力单位( u ) 。取反应曲线 的最初三分钟，计算得每毫升酶液的a d h 活力为7 5 0 u ，2 0 m l 酶液的总活力为 1 5 0 0 0 u ，比活力为9 5 4 u m g 。可能是由于复性不完全，其活力不及天然a d h 。 图1 4 酶活力分析 f i g 1 4 a n a l y s i s o f e n z y m e a c t i v i t y 4 讨论 4 1 降落p c r 的设计方案 浙讧大学硕士学位论文 预实验发现，常规p c r 从人肝脏总r n a 中扩增目的片段效果不佳。为了 优化p c r 反应条件，本实验采用了降落p c r ( t e m p e r a t u r e - d e s c e n d i n gp o l y m e r a s e c h a i n e dr e a c t i o n t d - p c r ) 法。t d - p c r 代表了一种完全不同p c r 优化方法【捌， 它不是用许多反应管和每管用不同的试剂浓度和( 或) 循环参数，而是用一 个反应管或一小组反应管，在适合于扩增目的产物而得不到目的产物的条件 下使用设计多循环反应的程序以使相连循环得退火温度越来越低。由于开 始时得退火温度选择为高于估计于t m 值，随着循环循环的进行。退火温度逐 渐降到t m 值，并最终低于这个水平。这个策略有利于确保第一个引物模板杂 交事件发生在最互补的反应物之闻，即那些产生目的扩增产物的反应物之间。 尽管退火温度最终会降低到非特异性杂交的t m 值，但此时目的产物已经开始 呈几何数扩增，在剩下的反应中处于超过任何非特异p c r 产物的地位。由于目 标是在较早的循环中避免低t m 值配对，在t d - p c r 中必需应用热启动技术【2 1 r 2 2 , “。本实验以p 1 和p 2 为引物，以人肝脏总r n a 为模板，3 7 ，3 0 r a i n 开始合 成c d n a ，然后进行t d - p c r 。第一循环9 5 c 变性5 0 s ，6 5 退火3 0 s ，7 2 延 伸1 5 m i n ，以后每轮循环退火温度降低1 ，直至退火温度降至5 5 ，共1 1 个循环。因为引物p 1 和p 2 的t m 都为6 0 ，所以第一个循环退火温度我们设 置为高于1 m5 ，直至降落到退火为5 5 ，从实验结果可以看出，扩增所得 a d h l b 2 片度条带清晰，并且无非特异性扩增条带，证明t d p c r 很好保持p c r 反应的特异性，且利于p c r 扩增的进行。 4 2p c r 产物的酶切 添加有酶切位点的p c r 产物直接酶切牵涉到前面保护碱基，本实验根据 1 钛锄产品手册上说明的保护碱基添加原则对引物进行保护碱基的添加，虽 然理论酶切达到一定的效率，但我们的实验证实，其酶切效率很低，无法得 到阳性克隆。如果将p c r 产物先连接到p u c m - t 载体中，转化大肠杆菌d h 5 a 然后进行酶切，效率要高得多，因为从p u c m t 载体酶切时，载体骨架就充 浙江文学硕士学位论文 当了保护碱基虽然p u c m t 载体自身带有多克隆位点，有些酶切位点正好 是设计引物时添加的位点，那样就有两个一样的酶切位点存在，但是本实验 中所使用的p u c m - t 载体含有b a m h i 、x h oi 位点，丽引物中也引入这两个 酶切位点，那么理论上会产生四种酶切片段。事实上，实验中我们发现，这 中担心是没有必要的，因为各位点的酶切都很完全，只能得到一种酶切片段。 虽然酶切保护碱基没有起到酶结合位点的作用，但它是必须添加的。凼为其 除了作为酶结合位以外，还能防止引物合成中因合成效率和纯化问题而导致 酶切位点的残缺。 4 3 包涵体的复性 本实验获得的复性蛋白虽然具有一定的活性，但较天然a d h 低，这可能 是对包涵体复性还不完全所致 包涵体的复性一直被称为一个世界性的难题，目前基因克隆最常使用的 以大肠杆菌为宿主细胞的原核表达体系，具有操作简单、生长时间快、成本 低，产量高的优点。然而，此表达体系最大的问题在于表达产物往往为不可 溶、无生物活性的包涵体，需要经过变性、复性及进一步的纯化才能获得高 纯度的活性蛋白。包涵体是细胞内聚集成的具有膜结构的非结晶性蛋白质固 体颗粒聚集体，其中除了无活性的重组蛋白外，还含有一些d n a 、r n a 及其 他菌体蛋白，直径约0 1 0 0i l l l l 。包涵体的形成可避免细胞中蛋白酶对蛋白的 降解，对于一些有毒性的蛋白产物可保护宿主细胞，同时便于分离蛋白。包 涵体中蛋白的一级结构( 即氨基酸序列) 是正确的，但是其立体结构是错误 的，所以没有生物活性。为获得天然状态具有活性的目的蛋白产物，必须在 分离回收包涵体后，溶解包涵体并使其中的目的蛋白恢复天然构象和活性i 川。 经研究分析，包涵体形成的原因如下，蚓：( 1 ) 本实验的表达载体p p r o e x h t b ，使用的是t r c 启动子。它是卸启动子和l 启动子的拼合体，转录效率比 卸高的，并受l a c l 阻遏蛋白调控。目的蛋白能被i p t g 高效诱导表达，外源蛋白 总量可达到全细菌蛋白的3 0 以上i n , 2 8 1 ( 本实验中，在最佳表达条件下 a d h i b 2 占全菌蛋白的5 8 ) 。这就导致蛋白表达的速率过快、浓度过高，生 成的蛋白质没有足够的时间和空间折叠形成正确结构。虽然有报道称，降低 浙江文学硕士学位论文 诱导表达温度可以实现目的蛋白的可溶性表达或分泌表达，但是在实验中我 们发现。该工程菌在2 5 条件下也难于实现分泌表达，是否进一步降低温度 就能够促使目的蛋白进行分泌表达，有待于后续实验进行证实。( 2 ) 蛋白在 折叠过程中疏水区暴露于溶液中，分子间的相互作用形成错误折叠导致凝集； ( 3 ) 大肠杆菌表达环境的还原性过高，使蛋白质中二硫键稳定性下降，出现 错配或多余的二硫键。理论上蛋白结构中二硫键越多，就越可能形成更多的 不同组合。目前最常用的方法是在透析液中加入氧化还原体系，其中又以本 实验加入氧化，还原谷胱甘肽最多，二者的浓度比通常为l ：l l ：1 0 不等。此外， 还可以使用氧化，还原二硫苏糖醇、胱胺半胱胺、2 - 1 3 羟乙基二硫化物肛巯基 乙醇等，这些氧化还原试剂的效果还有待于后续实验的证实。( 4 ) 培养温度、 p h 值、某些金属离子等因素也会影响包涵体动力学的稳定性。复性过程中多 采用4 8 、生理情况稍偏碱的p h 值( 8 o ) 和1 2 2 4 h 换一次透析液另外， 利用去污剂如n 十二烷基肌氨酸、十二烷基麦芽糖苷，氨基酸如l 精氨酸， 甘氨酸，还有使用高浓度的t r i s ，蔗糖、甘油，以金属离子和配基作为修复基 团也能够抑制聚集，促进天然构象形成洲。( 5 ) 原核系统缺乏真核系统对真 核生物蛋白的加工和修饰功能，我们在后续实验中可以用酵母做真核表达， 以得到高活性的蛋白。 蛋白质复性的常用手段有稀释复性、透析复性、固相复性等。1 ) 稀释复 性：通过用缓冲液和低浓度的变性液稀释包涵体蛋白液，降低变性剂的浓度， 促进蛋白分子的重新折叠稀释后扩大蛋白体积不利于后续工作，目前使用 较少2 ) 透析复性：用变性液将蛋白稀释至较低浓度( o o l o 2m g m 1 ) 后 装入透析袋中，用含低浓度变性剂复性液低温透析，如果蛋白结构中含有二 硫键，则在复性液中加入适当比例的还原剂，是目前使用较多的方法。3 ) 固 相复性：又称凝胶过滤柱上复性，主要是根据不同的分子大小分离，使蛋白 脱盐和分级分离。各种凝胶的分子筛作用可防止变性蛋白质问的接触和凝 聚，辅助其正确折叠。固相复性可以同时起到分离和复性一步完成的作用， 凝乳酶原、水母发光蛋白等已经通过此方法获得了较好的复性效果3 1 , 3 2 1 。 本实验用的是透析复性的方法，最终得到的a d h l b 2 的比活力为9 5 4 u m g 蛋 白我们在后续实验中还要尝试其他的复性手段，以得到高活性的蛋白。 5 总结 浙江大学硕士学位论文 本实验以人肝脏总r n a 为模板，r t - p c r 扩增得到a d h l b 2 基因，克隆到 p u c m - t 载体，构建p u c m - a d h i b 2 质粒。再利用引物上的b a m hi 和脚ml 酶 切位点，把a d h l b 2 基因重组到原核表达载体p p r o e xh t b 中，构建成 p p r o e x - a d h ! b 2 质粒，转化大肠杆菌b l 2 1 形成工程菌。i p t g 诱导表达表明， a d h l b 2 融合蛋白实现了高水平表达，在最佳表达条件3 t c 、o 5 m mi p t g 浓 度、诱导表达7 小时后，其外源基因表达量占全菌蛋白的5 8 ，刷新了原核 表达a d h l b 2 的新记录。实验表明，产物主要以包涵体的形式出现。二次洗 涤包涵体，可以获得纯度较高的目的蛋白，这为工业化生产提供了条件。由 于融合蛋白带有6 x h i s 标签，使用n i 2 + 亲和层析纯化，可以获得超高纯度的 目的蛋自。亲和层析结果表明，当咪唑浓度达到6 0m m o f l 左右时，开始有目 的蛋白洗出，当昧唑浓度达到1 0 0 m m o l l 左右时，目的蛋白有最大的洗脱峰。 纯化后的目的蛋白经含有精氨酸的变性溶液透析复性后，监测a 3 4 0 值。结果表 明，该复性蛋白具有a d h 活性，比活力为9 5 4 u m g 。本文是首次利用原核表 达载体p p r o e xh t b 表j 盘a d h l b 2 。 目前人们对基因的表达规律尚不是很了解。人们还不能预测一段特定的 基因在给定的表达载体中的表达结果会是如何。即使阅读框正确，所克隆的 基因也不一定得到表达或得到高表达。因此，a d h ib 2 与何种表达载体连接或 者是表达载体于何种宿主菌中表达才最有效? 有待于后续者的进一步摸索和 研究。 目前对a d h 的动力学性质、结构和功能的研究较多，但整个乙醇脱氢酶 体系作用的机制还不清楚。过度饮酒行为能导致人体产生一系列的疾病，如 酒精中毒，营养不良、胎儿酒精综合症、皮肤病变、酒精肝病、消化道癌症 等，但其分子机制还有待于研究。随着酒销售量的增加，人们对解酒保肝类 物质的需求日益迫切。人a d h 制成的保健品在来源上比同类产品更具优势， 基本没有副作用，用它来研制解酒药将会是一项重要的应用和未来发展的趋 势。因此，人乙醇脱氢酶( 特别是a d h i b 2 同工酶) 的基因工程研究有重要 的经济和社会价值。 浙江大学硕士学位论文 本文的主要创新点： 1 这是我国首次用原核表达载体p p r o e xh t b 获得a d h i b 2 蛋白； 2 目的蛋白的表达量占全菌蛋白的5 8 ，刷新了原核表达a d h l b 2 高产的 新记录。 参考文献 【1 1 1 h a r tc l ，l i a oc s ，w uc me ta 1 c o n t r i b u t i o nt of i r s t p a s sm e t a b o l i s mo f e t l l a n o la n di n h i b i t i o nb ye t h a n o lf o rr e t i n o lo x i d a t i o ni nh u m a na l c o h o l d e h y d r o g e n a s ef a m i l y i m p l i c a t i o n sf o re t i o l o g yo ff e t a la l c o h o ls y n d r o m ea n d a l c o h o l - r e l a t e dd i s e a s e s 【j 】e u rjb i o c h e m1 9 9 8 ，2 5 4 ：2 5 - 3 1 【2 】s t a m a t o y a n n o p o l o sgc h e r ts f u k u im l i v e ra l c o h o l - d e h y & o g e n a s ei n j a p 棚麟：h i g hp o p u l a t i o nf r e q u e n c yo fa t y p i c a lf o r ma n di t sp o s s i b l er o l ei n a l c o h o ls e n s i t i v i t yp 】a mjh u mg e n e t1 9 7 5 ，2 7 ：7 8 9 - 7 9 6 【3 】g i b b o n sb j , h u r l e yt d s t r u c t u r eo ft h r e e c l a s sih u m a na l c o h o l d e h y d r o g e n a s e sc o m p l e x e dw i t hi s o e n z y m es p e c i f i cf o r m a m i d ei n h i b i t o r s 【j 】 b i o c h e m i s t r y2 0 0 4 ，4 3 ：1 2 5 5 5 - 1 2 5 6 2 【4 】d u g s t e tgf a r r e sj ，f e l d e rm ，e ta i r e c o m m e n d e dn o m e n c l a t u r ef o rt h e v e r t e b r a t ea l c o h o ld e h y d r o g e n a s eg e n ef a m i l y 叫b i o c h o np h a r m a c o l1 9 9 9 ，5 8 ： 3 8 9 - 3 9 5 【5 】r a n k h a n d a n iv a , b o s t o nw f , l it k r e s e a r c ha d v a n c e si n e t h a n o l m e t a b o l i s m 【j 】p a t h o lb i o l2 0 0 1 ，4 9 ：6 7 6 - 6 8 2 【6 】m c c a r v e td g a d h 2a n dc y p 2 e ig e n e t i cp o l y m o r p h i s m s ：r i s kf a c t o r sf o r a l c o h o l - r e l a t e db i r t hd a f c c t s 川d r u gm e t a bd i s p o s2 0 0 1 ，2 9 ：5 6 2 5 6 5 忉d i e f f e n b a c hc w , b v e k s l e rg s p c rp r i m e r al a b o r a t o r ym a n u a l ( p c r 技术 实验指南，黄培堂等译) 2 0 0 3 ，科学出版社 【8 j 李爱丽，姜涛，马峙英等提高p c r 产物的几种有效方法【j 】生物技术通 报2 0 0 3 ，2 ：3 3 - 3 5 【9 】王友如c a c l 2 浓度对感受态细胞转化效率的影响【j 】湖北师范学院学 报：自然科学版2 0 0 6 ，3 ：3 0 - 3 2 5 9 浙江太学硕士学位论文 【1o 】涂知明，陈明洁，何光源等。三种大肠杆菌高效感受态的制备及转化【j 】 华中科技大学学报：自然科学版2 0 0 6 ，4 ：1 1 2 1 1 5 【l l 】吴海燕，谢应桂，何雄斌等快速准确制备大肠杆菌高效感受态细胞中有 关o d 6 0 0 值的探讨仞湘南学院学报：医学版2 0 0 6 , 3 ：1 3 1 5 【1 2 s a mb ，r o o kj ，r u s s e l ld w m o l e c u l a rc l o n i n g ：al a b o r a t o r ym a n u a l 2 0 0 3 ， c o l ds p r i n gh a b o rl a b ( c s h l ) p r e s s , 【1 3 】李建武，余瑞元，袁明秀等生物化学实验原理与方法，2 0 0 0 ，北京大学 出版社 f 1 4 罗元明，罗规民等单链抗体2 f 3 表达条件的优化及其提纯和性质研究 【j 】生物工程学报2 0 0 2 ，1 8 ( 1 ) ：7 4 - 7 8 【1 5 】l e ek h ，k i mh s ，j e o n gh s ，e ca 1 c h a p c r o n i ng r o e s lm e d i a t e st h ep r o t e i n f o l d i n go fh u m a nl i v e rm i t o c h o n d f i a la l d e h y d ed e b y d r o g c n a s ei ne s c h e d c h i ac o l i 【j 1 。b i o c h e mb i o p b y sr e s2 0 0 2 ，2 9 8 ( 2 ) ：21 6 - 2 2 4 【1 6 】s t r a n d b e r gl ，e n f o r ss0 f a c t o r si n f l u e n c i n gi n c l u s i o nb o d yf o r m a t i o ni nt h e p r o d u c t i o no f af u s e dp r o t e i ni ne s c h e r i c h i ac o l i 【j 】a p p le n v i r o nm i c r o b i o l19 9 1 ， 5 7 ( 6 ) ：1 6 6 9 - 1 6 7 4 【1 7 】徐祥，吕凤林，胡承香等人过敏毒素c 5 a 反义c d n a 的克隆、表达和拈 抗作用田中国生物化学与分子生物学报2 0 0 3 ，1 9 ( 1 ) ：5 3 5 9 f l8 】冯小黎重组包涵体蛋白质的折叠复性p 】生物化学与生物物理进展 2 0 0 1 ，2 8 ( 4 ) ：4 8 2 - 4 8 5 【1 9 】高永贵，关怡新等包涵体蛋白的变复性研究们科技通报2 0 0 3 ，1 9 ( 1 ) ： l o