（化学专业论文）有机介质中酶促高效合成阿莫西林及其一锅法研究.pdf

摘要 摘要 阿莫西林具有广谱、高效和毒副作用小的特点，在医药卫生领域中得到了 非常广泛的应用，目前b 内酰胺抗生素普遍采用化学偶联合成方法，其反应 条件苛刻，需要繁琐的基团保护与去保护步骤，消耗大量原料同时产尘许多难 以回收和降解的污染物。酶促合成方法是b 内酰胺抗生素实现温和反应、减 少反应步骤、清洁生产的有效途径。 论文研究合成了d 对羟基苯甘氨酸甲酯( d h p g m ) 作为酰基供体，筛 选了一系列不同极性的有机溶剂，在环己醇介质中产率和s h 比值达到8 3 5 和i 0 效果最佳；并考察了固定化青霉素酰化酶i p a 一7 5 0 的酶浓度、反应时问、 底物浓度与比例和反应温度等因素对酶促反应的影响，成功地实现了完全有机 介质中阿莫西林的酶促高效合成。 论文研究了环己醇与其它有机溶剂的混合体系，结果发现环己醇一共溶剂 k 体系5 0 5 0 ( v v ) 可以显著提高6 a p a 和d h p g m 的转化率，在1 0 0m m 6 - a p a 和2 0 0m md h p g m 的底物浓度条件下，2 5o c 时只需6h 即可实现9 5 的合成产率和1 1 的s h 比值。对体系含水量及酶所处微环境的进一步优化， 在体系含水量为5 时得到了9 7 1 的合成产率和2 2 的高s h 比值。 论文研究建立了青霉素酰化酶催化青霉素g 钾盐与d 对羟基苯甘氨酸甲 酯一锅合成阿莫西林的方法。详细研究了有机介质和水共溶剂体系，反应时问、 底物浓度与比例和反应温度等因素对酶促反应的影响，实现了醇a 和水作为 共溶剂，青霉素g 钾盐起始原料，直接与d 对羟基苯甘氨酸甲酯经水解反应 和缩合反应两步一锅合成，最优条件下阿莫西林产率和s h 比值分别达到了 5 5 2 和0 6 0 。 论文主要成果是探索建立了完全有机介质中酶促合成阿莫西林的方法，研 究了系列有机介质中青霉素g 酰化酶催化的6 - a p a 与d 一对羟基苯甘氨酸甲酯 合成方法，建立了青霉素g 酰化酶催化的青霉素g 钾盐与d 对羟基苯甘氨酸 甲酯一锅合成阿莫西林的新方法；通过混合有机溶剂介质体系显著提高了酶促 合成阿莫西林的合成产率和s h 比值。 关键词：阿莫西林，酶促合成，有机介质，一锅法合成，s h 比值 摘要 a b s t r a c t a m o x i c i l l i ni so n eo ft h em o s tw i d e l yu s e d1 3 - 1 a c t a ma n t i b i o t i c sa n ds u i t a b l e f o rab r o a ds p e c t r u mo fb a c t e r i a li n f e c t i o n s i ti su s u a ll yp r o d u c e dv i at r a d i t i o n a l c h e m i c a l p r o c e d u r e s ，w h i c hn e e du n h y d r o u so r g a n i cs o l v e n t s ，v e r y l o w t e m p e r a t u r e ，m u l t i s t e pp r o t e c t i o na n du n p r o t e c t i o n ，w i t hh e a v yp o l l u t i o n e n z y m a t i cs y n t h e s i s ，w h i c hm a r k e d l yr e d u c e st h ep r o d u c t i o no fw a s t ea n dt h e d e p e n d e n c eo no r g a n i cs o l v e n t s ，i sa ne f f i c i e n ta l t e r n a t i v et ot h ec h e m i c a ls y n t h e s i s f o rt h ep r o d u c t i o no fp - l a c t a ma n t i b i o t i c s t h i st h e s i sf o c u s e so nt h ee n z y m a t i cs y n t h e s i so fa m o x i c i l l i ni nf u l l yo r g a n i c m e d i u m w ea l s or e s e a r c h e d t h ec y c l o h e x a n o l - c o s o l v e n tks y s t e ma n do n e - p o t e n z y m a t i cs y n t h e s i so f a m o x i c i l l i n 。 t h ee f f i c i e n te n z y m a t i cs y n t h e s i so fa m o x i c i l l i ni nf u l l yo r g a n i cm e d i u mw a s s u c c e s s f u l l ya c h i e v e dw i t hd h p g ma st h ea c t i v a t e da c y ld o n o r as e r i e so f o r g a n i cs o l v e n t sw i t hd i f f e r e n tp o l a r i t yw e r es c r e e n e da n di tw a ss h o w nt h a t r e m a r k a b l ec a t a l y t i ca c t i v i t yo ft h ei p aw a sr e t a i n e di nr e l a t i v e l ya p o l a ro r g a n i c s o l v e n t s ，a m o n gw h i c hc y c l o h e x a n o lw a st h eb e s t t h ei n f l u e n c ef a t o r si n c l u d i n g t h er e a c t i o nt i m e ，i n i t i a ls u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o n ，m o l a rr a t i oo fs u b s t r a t e s ，婵a c o n c e n t r a t i o na n dt e m p e r a t u r eo nt h ee n z y m a t i cs y n t h e s i so fa m o x i c i l l i ni np u r e c y c l o h e x a n o lw e r es y s t e m a t i c a l l ye x a m i n e d a sar e s u l t ，h i g hy i e l d ( 8 3 5 ) a n d s hr a t i o ( 1 0 ) w e r es u c c e s s f u l l ya c h i e v e dw i t h10 0m m6 - a p aa n d2 0 0m m d h p g mu n d e rt h eo p t i m u mc o n d i t i o n s t h ec y c l o h e x a n o l - o r g a n i cs o l v e n ts y s t e mw a ss t u d i e d m e d i ac o m p o s e dw i t h d i f f e r e n to r g a n i cs o l v e n t sw e r es c r e e n e da n dc y c l o h e x a n o l c o s o l v e n tks y s t e m ( 5 0 5 0 ，v v ) w a sf o u n dt ob ea b l et or e m a r k a b l yi m p r o v et h ee n z y m ea c t i v i t y t h e c o n v e r s i o no f6 - a p aa n dd h p g mw a sg r e a t l yi m p r o v e d ，a n dt h er e a c t i o nw a s f a s t a f t e r6hr e a c t i o n ，t h ec o n v e r s i o no f6 一a p aw a sn e a r l y10 0 a n ds hr a t i oo f 1 1w e r ea c h i e v e di nr e a c t i o nc a r r i e do u ta t2 5o c w a t e rc o n t e n ti nr e a c t i o nm e d i a w a sa l s oi n v e s t i g a t e da n d h i g hs hr a t i oo f2 2w a sa c h i e v e dw i t h o u tr e d u c i n gt h e s y n t h e s i sy i e l d n 摘要 t h em e t h o do fo n e p o te n z y m a t i cs y n t h e s i so fa m o x i c i l l i nw a sd e v e l o p e d 6 - a p aw a so b t a i n e df r o mt h eh y d r o l y s i so fp e n i c i l l i ngp o t a s s i u ms a l t ( p g k ) c a t a l y z e db yi p a ，a n ds u b s e q u e n t l ya c y l a t e db yd h p g mw i t hi p a a m o x i c i l l i n w a sd i r e c t lyp r o d u c e df r o mp g kw i t h o u tt h es e p a r a t i o na n d p u r i f ic a t i o no f6 - a p a t h ea m o x i c i l l i ny i e l do fo n e - p o te n z y m a t i cs y n t h e s i si nw a t e r - g l y c o ls y s t e mw a s m u c hh i g h e rt h a nt h a ti nf u l l ya q u e o u sm e d i u m ，w h i l et h eh y d r o l y s i so fd - h p g m w a sr e s t r a i n e d a sar e s u l t t h ey i e l do f 5 5 2 a n ds hr a t i oo f 0 6 0w e r ea c h i e v e d k e y w o r d s ：a m o x i c i l l i n ，1 3 - l a c t a ma n t i b i o t i c s ，e n z y m a t i cs y n t h e s i s ，p e n i c i l l i ng a c y l a s e ，o r g a n i cm e d i u m ，o n e - p o ts y n t h e s i s 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他 人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得迸江盘堂或其他教育机构的 学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已 在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者魏祭芥荔 签字隅劫年多月尹r 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝姿盘堂有关保留、使用学位论文的规定，有 权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借 阅。本人授权逝姿盘堂可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行 检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 降，瑜彰 导师签名：毒知 签字同期：矽蔼年参月7 同 签字同期：年 月同 学位论文作者毕业后去向： 工作单位：上i 而羔亡、刍嘻寺筘岔尕豫么习 电话：f7 弓嬲 通讯地址： 三渤牵i 礴与弓驭j 1 奄汾院少7 刍鼍邮编：矽，够 8 7 li 。_ 。_ _ _ _ _ - _ _ _ _ i _ _ - _ _ _ _ - _ _ _ - _ _ _ _ _ - - _ _ _ _ - _ - _ _ - _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ - _ _ - - _ - _ _ _ - _ _ _ _ _ - i _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ l _ _ _ _ _ - _ _ _ _ - - _ _ _ _ _ _ _ _ _ - - _ _ _ _ - - - 。_ - 一t - ， 知识产权保护声明 本人郑重声明：我所提交答辩的学位论文，是本人在导师 指导下完成的成果，该成果属于浙江大学理学院化学系，受国 家知识产权法保护。在学期间与毕业后以任何形式公开发表论 文或申请专利，均需以导师作为通讯联系人。未经导师的书面 许可，本人不得以任何方式，以任何其它单位作全部和局部署 名公布学位论文成果。本人完全意识到本声明的法律责任由本 人承担。 学位论文作者签名： 签字日期：年月 日 浙江人学硕十学位论文 第一章绪论 青霉素作为最早应用于临床的抗生素药物，具有很好的选择性杀菌作用， 是一类效果好、毒性低的抗感染药物，倍受广大医生与患者的亲睐。p 内酰胺 抗生素通过母核与不同侧链原料组合可以合成系列的抗生素药物，较好克服了 抗生素药物的细菌耐药性问题，主导了世界的抗生素市场。仅2 0 0 5 年，阿莫 西林、氨苄西林和头孢氨苄3 个品种的b 一内酰胺抗生素世界需求量已达1 7 8 0 0 吨，占抗感染药物的7 8 。因此，b 内酰胺抗生素合成技术与方法的探索持续 受到研究者的关注，现在发展和提升酶促催化合成技术已成为新的关注点，有 望实现新的突破。 1 1 化学法制备半合成b 内酰胺抗生素 半合成p 内酰胺抗生素的工业生产始于二十世纪六七十年代，传统上采 用化学半合成法( 简称化学法) 合成，工艺比较成熟，合成产率高，通过大规 模生产能够满足市场对抗生素的需求，目前为止仍然是大多数国家和企业普遍 采用的生产工艺。化学法主要包括酰氯法和丹麦酐法，这两种方法均需要活化、 缩合、保护和去保护步骤，反应复杂。整个反应过程需要用到许多有机化学 原料，而且反应条件苛刻。同时还产生大量的三废，以头孢氨苄为例，每生产 l 千克最终产品就要产生3 0 - 4 0 千克的废物，污染严重。另外，出于整个反应 体的组成比较复杂，后期的产物分离提纯难度很大，得到的产品往往含有一定 量的杂质，在实际的应用中受到了一定的限制。 1 2 b 内酰胺抗生素合成酶原的筛选 c o l e ：】于1 9 6 9 年首先设想了用酶法合成取代化学法合成的可能性。研究 发现，有相当多的0 【氨基酸酯水解酶可以催化6 - a p a 和7 - a d c a 的酰化p j 。 但是0 c 氨基酸酯水解酶f 4 】的性能较差，只限于酯类侧链供体，而且适用的p h 值范围太窄【5 j ，只有5 “，s h 比值低，限制了使用，所以仍处于研究阶段。 而来源于e c o l i 茵属的青霉素g 酰化酶( p g a ) 则是相当有效的酰基转移催 化剂，容易得到，还可以通过基因技术改进其酰基转移特性，因此被广泛研究 第一章绪论 和应用。此外，采用合适的固定化技术得到的催化剂能够良好的保持p g a 的 活力，同时也能够克服游离酶分离和回收再利用困难、酶分子结构复杂且相对 柔韧，对环境的变化非常敏感、也容易失活【6 1 等缺点，成为半合成抗尘素生产 中最重要最关键的酶，有力地推动了半合成抗生素的酶促合成研究。 1 3 水相酶促方法合成p 内酰胺抗生素 2 0 世纪7 0 年代，由于酶工程的进步，青霉素g 酰化酶( p e n i c i l l i nga c y l a s e ， p g a ) ，特别是固定化青霉素酰化酶( i m m o b i l i z e dp e n i c i l l i na c y l a s e ，i p a ) 在 水解青霉素g 生产6 a p a 中的应用取代了传统的化学裂解浏7 1 。目前工业裂 解抗生素生产抗生素母核6 - a p a 、7 - a d c a 和7 - a c a 已基本上使用酶法工艺。 1 9 9 0 年以来，许多国家加强了对酶促合成新技术的研究【6 】，丌发酶催化抗 生素母核与d 一氨摹酸类侧链缩合为半合成青霉素和半合成头孢菌素的工艺。 酶法生产的工艺简便清洁，而且能够减少原料的投入与废弃物的产生，受到了 人们的普遍关注。随着环境问题的同益严重和人们环保意识的逐渐提高，使用 绿色清洁的酶半合成法( 简称酶法) 合成已经成为抗生素发展的必然趋势。 9 0 年代中期至今，荷兰d s m 、美国礼来等少数公司将i p a 成功应用于酶 法合成氨苄西林，阿莫西林，头孢氨苄以及其它半合成抗生素生产【7 j 。我国是 生产b 内酰胺抗生素原料的大国，但足半合成抗生素都是通过化学法生产。 丌发酶法绿色合成技术，对于我国抗生素产业的发展具有重大意义。 目前关于酶法制备半合成抗生素的研究主要集中在水相介质当中。主要通 过活性衍生物( 通常为其甲酯盐酸赫或酰胺) 为酰基侧链供体，在青霉素酰化 酶的催化作用下与6 - a p a 发生缩合反应。研究涉及反应底物浓度瞵_ 3 1 、p h 值 【8 h 17 1 、离子强度4 ，1 习和温度【1 5 1 8 】等凶素对酶促缩合反应的影响和条件优化 内容。已经耿得了一定的进展和成果，但是出于缩合反应是在水溶液中进行的， 而且p g a 自身的水解活性较强，因此原料和产物的水解都很严重，导致了反 应产率与合成水解比值不高。 研究发现，将有机溶剂作为助溶剂添加到水相介质中【1 9 - 2 3 ，能够降低水活 度或者改变原料的d k 值，从而达到抑制水解副反应的效果。这样更有利于体 系中产物的累积，因此相比于纯水楣介质中的反应，其产率和合成水解比值 般都会有明显提高。然而，这些体系中水仍然是作为介质的主体，d 氨基酸 2 浙江人学硕十学位论文 类侧链供体和p 一内酰胺产物的水解问题未能得到很好的解决，产率与合成水 解比值的提高受到了较大限制。因此，探索发展新介质和新途径具有重要价值。 1 4 本论文选题目的与研究内容 阿莫西林是青霉素类抗生素的主要品种之一，由于其耐酸的优点得到非常 广泛的应用，关于它的研究具有很大的现实意义。但是目自订关于酶促合成阿莫 西林的研究主要集中在水相介质中，需要投入大大过量的酰基供体而且产物的 产率相对较低。另一方面，在有机介质中的酶促合成存在着一定的问题，如酶 的活性降低、反应物的溶解度不高等。因此，在有机介质中酶促合成阿莫西林 的研究还非常少。本论文选择了“有机介质中酶促高效合成阿莫西林及其一锅 法研究”作为课题研究内容，通过筛选有机溶剂，考察了反应物的溶解度以及 酶的活性变化规律。探索建立了有机介质及混合有机介质体系酶促缩合合成阿 莫西林抗生素方法。此外，目前阿莫西林的生产需要通过两个步骤，先水解青 霉素得到6 一a p a 再与酰基供体缩合生成阿莫西林，过程相对复杂。这两个步 骤都是在青霉素酰化酶的催化下进行的。基于这一点，论文还研究建立酶促一 锅合成阿莫西林的新途径。 3 第一章绪论 参考文献 1 w e b m n a nma ，j a n s s e nmha ，v a nr a n t w i j kes h e l d o nra t o w a r d sb i o c a t a l y t i c s y n t h e s i so f b e t a - l a c t a ma n t i b i o t i c s a d v s y n t h c a t a l ，2 0 0 1 ，3 4 3 ( 6 7 ) ：5 5 9 5 7 6 2 c o l em h y d r o l y s i so fp e n i c i l l i n sa n dr e l a t e dc o m p o u n d sb yt h ec e l l b o u n dp e n i c i l l i n a c y l a s eo f e s c h e r i c h i ac o l i b i o c h e m j ，1 9 6 9 ，11 5 ：7 3 3 7 3 9 3 b r u g g i n ka ，r o o sec ，d ev r o o me p e n i c i l l i na c y l a s ei nt h ei n d u s t r i a lp r o d u c t i o no f b e t a l a c t a ma n t i b i o t i c s o r g p r o c e s sr e s d e v ，1 9 9 8 ，2 ( 2 ) ：1 2 8 1 3 3 4 t a k a h a s h it ，y a m a z a k iy ，k a t o - 3 0 2 0 1 0 1 ，01 52 o2 5 m o l er a t i oo fh p g mt o6 a p a 圈3 1 l 不同底物胯尔比值对阿莫晴林酶促合成的影响 f i g 3 1 1e f f e c to f m o l er a t i oo f h p g m t o6 - a p ao nt h ee n z y m a t i cs y n t h e s i so f a m o x i c i l l i n 3 3 7 酶用量对阿莫西林酶促合成的影响 由于动力学控制的阿莫西林酶促合成同时存在阿莫西林合成、原料水解 和产物水解这三个反应，整个反应最终的产率和合成水解比值就受到这三个反 应的共同影响。另外，这三个反应都和酶有密切的关系。因此，酶的用量也应 该能够对反应的效果产生较大的影响。所以我们接下来考察了酶用量的影响。 具体反应条件为：1 0 0m m6 - a p a 和2 0 0m mh p g m ，lm l 环己醇，加入不同 量的i p a 7 5 0 ，在2 5o c 下反应2 0 小时。 从图3 1 2 中可以清楚地看到酶的用量确实对反应的产率有较大的影响。 当酶量很低的时候反应的效果很不理想。这主要是由于有机溶剂自身对酶活力 的抑制作用而导致了整个体系初始反应速率很低。随着酶用量的增加阿莫西林 的产率也丌始逐渐提高。然而，当酶用量达到2 5i u m l 的时候，这个反应体 系变得相当粘稠，反应物不能够有效均匀分散，从而反应的产率又丌始降低。 综上所述，该反应的最佳酶用量定为2 0i u m l 。 3 9 第二章有机介质中阿英阿林酶促合成研究 7 0 6 0 5 0 4 0 器 口 垩3 0 2 0 1 0 o 51 01 52 0 a m o u n to fi p au s e di u ，m l 图3 1 2 不同酶苗r 阿荚坩林的酶促合成效果 f i g 3 1 2e f f e c to fe n z y m el o a do nt h es y n t h e s i so f a m o x i c i l l i n 3 3 8 反应温度对阿莫西林酶促合成的影响 人们通过对水相中阿莫西林酶促合成的研究发现温度能够对酶的活力和 反应速率产生较大的影响【1 4 2 4 1 ，从而能够显著影响到阿莫西林的酶促合成。 并且已有的报道中称低温对合成有利【2 6 2 7 1 。 我们考察了反应温度对有机介质中阿莫西林酶促合成的影响。具体反应 条件为：1 0 0m m6 - a p a 和2 0 0m mh p g m ，2 0i ui p a 7 5 0 ，1m l 环己醇，不 同温度下反应2 0 小时。 4 0 浙江人学硕十学位论文 琴 里 尘 i 右 j 勺 2 1 3 t e m p e r a t u r e 。c 图3 1 3 环己醇介质中阿莫婀林酶促合成的产率一温度曲线和6 a p a 转化率一温度曲线 f i g 3 1 3y i e l d - t e m p e r a t u r ec u r v e ( 口) a n d6 - a p ac o n v e r s i o n t e m p e r a t u r ec u r v e ( ) o f a m o x i c i l l i ns y n t h e s i sc a r r i e do u ti nc y c l o h e x a n 0 1 从图3 1 3 中我们看到产率对温度的变化非常敏感，随着温度的升高阿莫 西林的产率迅速降低。这主要是因为在较高的温度下原料和产物的水解速率都 急剧提高。另外，当反应温度超过3 5o c 以后，6 a p a 的转化率和阿莫西林的 产率之| 日j 的差距也迅速增大，这表明在较高的反应温度f 整个体系中的变得复 杂化，可能发生类似6 a p a 的丌环等副反应。因此，该反应的最佳温度确定 为l5o c 。 3 3 9 酶的回收利用 最后我们考察了坏己醇介质中酶的回收利用情况。反应条件为：1 0 0 m m 6 - a p a 和2 0 0m mh p g m ，2 0i u m li p a 7 5 0 ，2 5o c 反应2 0 小时。每一次反 应完成以后先过滤分离出酶，接着用水浸泡和洗涤3 5 次。然后将酶放置在 环己醇浸泡3 0m i n ，最后除去环己醇即完成酶的回收。实验结果如图3 1 4 所 示。所使用的i p a 7 5 0 经过5 次的回收利用以后反应产率并没有很明显的下降。 这也充分证明了在有机介质中酶促合成阿莫西林的可行性。 4 l 第三章有机介质中阿莫似林酶促合成研究 012 345 b e 舡ndm m t o t m 图3 “酶的同收利川 f i g 3 1 4r e p e a t e du t i l i z a t i o no fi p a 4 2 浙江人学硕十学位论文 3 4 本章小结 本章使用d h p g m 作为活化酰基供体，改善了反应物在有机溶剂中的溶 解性能，探索建立了有机介质中酶促合成阿莫西林的方法。通过对2 0 种不同 种类和极性的有机溶剂的筛选研究，探索了有机溶剂极性对青霉素酰化酶活力 的影响规律。研究发现强极性溶剂( 如d m s o ) 和环状结构的溶剂( 如t h f ) 能够导致酶的失活，因此在这些溶剂当中酶促合成阿莫西林无法发生。醇类溶 剂，特别是中等极性的醇对保持酶的催化活性较为有利，其中环己醇介质中酶 促合成阿莫西林的效果最好，产率达到4 8 。 在此基础上，本章考察了反应时间、底物摩尔比例、酶浓度和反应温度 对纯坏己醇介质中酶促合成阿莫强林的影响。研究发现在环己醇介质中酶促合 成阿莫西林的反应速率比水相介质中低，需要2 0h 左右才能达到最大产率。 当h p g m 和6 a p a 摩尔比例从o 5 增加到2 时阿莫西林的产率从11 9 提高 到6 9 4 。增大酶用量能够提高原料的转化率，酶浓度从5i u m l 提高到2 0 i u m l 时产率相应从1 6 9 提高到6 5 8 。最后，论文考察了环己醇介质中酶 的回收利用情况，发现在5 次重复利用过程中青霉素酰化酶的活力得到较好地 保持。从而为有机介质中酶促合成p 一内酰胺抗生素提供了一个成功的范例。 4 3 第二章有机介质中阿莫i 婀林酶促合成研究 参考文献 1 d e n gl ，t a ntw w a n gf x uxb e n z y m a t i cp r o d u c t i o no ff a t t ya c i da l k y le s t e r s w i t hal i p a s ep r e p a r a t i o nf r o mc a n d i d as p 9 9 1 2 5 e u r j l i p i ds c i t e c h n 0 1 2 0 0 3 ，1 0 5 ： 7 2 7 - 7 3 4 2 s k o u r i d o uvs t a m a t i sh ，k o l i s i sfn ，u s eo fe s s e n t i a lo i l sa sm e d i af o r t h e e n a n t i o s e l e c t i v es t e r i f i c a t i o no ft h em o n o t e r p e n ep e r i l l y la l c o h o lc a t a l y z e db yl i p a s e e u r j l i p i ds c i t e c h n 0 1 2 0 0 3 1 0 5 ：l1 5 1 2 0 3 y a n gk w a n gyj l i p a s e c a t a l y z e dc e ll u l o s ea c e t y l a t i o ni na q u e o u sa n do r g a n i cm e d i a b i o t e c h n 0 1 p r o g 2 0 0 3 ，19 ：16 6 4 一t6 71 4 f r e r ejm ，g h u y s e njm ，p e r k i n shr ，n i e t om b i o c h e m j ，e f f e c to fm o d u l a t i o no f e n z y m e i n a c t i v a t i o n o nt e m p e r a t u r e o p t i m i z a t i o n f o rr e a c t o r o p e r a t i o n w i t h c h i t i n i m m o b i l i z e dl a c t a s e jm 0 1 c a t a l b ：e n z1 9 7 3 1 3 5 ：4 8 3 - 4 9 2 5 g o l o b o l o vby b o r i s o vil ，b e l i k o vvm ，s v e d a svk p e n i c i l l i na c y l a s e c a t a l y z e d s y n t h e s i so fb e t a 1 a c t a ma n t i b i o t i c si nh i g h l yc o n d e n s e da q u e o u ss y s t e m s ：b e n e f i c i a l i m p a c to f k i n e t i cs u b s t r a t es u p e r s a t u r a t i o n b i o t e c h n 0 1 b i o e n g ，19 8 7 ，3 2 ：8 6 6 8 7 2 6 y o u s h k omi ，v a nl a n g e nlm ，d ev r o o me ，m o o d yhm ，v a nr a n t w i j kf s h e l d o nra ， s v e d a svk p e n i c i l l i n a c y l a s e c a t a l y z e ds y n t h e s i s o f a m p i c i l l i ni n ”a q u e o u s s o l u t i o n - p r e c i p i t a t e “s y s t e m s h i g hs u b s t r a t ec o n c e n t r a t i o na n ds u p e r s a t u r a t i o ne f f e c t j m 0 1 c a t a l b ：e n z y m ，2 0 0 0 ，1o ( 5 ) ：5 0 9 515 7 y o u s h k om i ，s v e d a svk k i n e t i c so fa m p i c i l l i ns y n t h e s i sc a t a l y z e db yp e n i c i l l i na c y l a s e f r o me - c o l ii nh o m o g e n e o u sa n dh e t e r o g e n e o u ss y s t e m s q u a n t i t a t i v ec h a r a c t e r i z a t i o no f n u c l e o p h i l er e a c t i v i t ya n dm a t h e m a t i c a lm o d e l i n go ft h ep r o c e s s b i o c h e m i s t r y m o s c o w , 2 0 0 0 ，6 5 ( 1 2 ) ：1 3 6 7 1 3 7 5 8 y o u s h k omi ，v a nl a n g e nlm ，d ev r o o me ，v a nr a n t w i j kf s h e l d o nra ，s v e d a svk h i g h l ye f f i c i e n ts y n t h e s i so fa m p i c i l l i ni na n ”a q u e o u ss o l u t i o n - p r e c i p i t a t e ”s y s t e m ： r e p e t i t i v ea d d i t i o no fs u b s t r a t e si nas e m i c o n t i n u o u sp r o c e s s b i o t e c h n 0 1 b i o e n g ，2 0 0 1 ， 7 3 ( 5 ) ：4 2 6 4 3 0 9 y o u s h k om i ，m o o d yhm ，b u k h a n o val ，b o o s t e nw hj ，s v e d a svk p e n i c i l l i n a c y l a s e c a t a l y z e ds y n t h e s i s o fb e t a l a c t a ma n t i b i o t i c si n h i g h l y c o n d e n s e da q u e o u s s y s t e m s ：b e n e f i c i a li m p a c to f k i n e t i cs u b s t r a t es u p e r s a t u r a t i o n b i o t e c h n 0 1 b i o e n g ，2 0 0 4 ， 8 5 ( 3 ) ：3 2 3 - 3 2 9 10 k a s c h ev g a l u n s k yb p e n i c i l l i na c y l a s e c a t a l y z e ds y n t h e s i so fa m p i c i l l i ni n ”a q u e o u s s o l u t i o n p r e c i p i t a t e ”s y s t e m s b i o c h e m b i o p h y s r e s c o m m u n ，1 9 8 2 ，8 0 ：1 2 1 5 一1 2 2 2 11 s c h w a r t za s t e i n k ed ，k u l am r ，w a n d r e yc s i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i so ft h ep r o t e i n s u r f a c et oi n c r e a s em u l t i p o i n tc o v a l e n ta t t a c h m e n t b i o t e c h n 0 1 a p p l b i o c h e m ，19 9 0 ， 1 2 ：1 8 8 1 9 5 12 o s p i n as ，b a r z a n ae ，r a m i r e zot l o p e z m u n g u i aa e f f e c to fp hi nt h es y n t h e s i so f a m p i c i l l i nb yp e n i c i l l i na c y l a s e e n z y m em i c r o b t e c l m 0 1 ，19 9 6 ，19 ：4 6 2 - 4 6 9 13 y o u s h k omi ，v a nl a n g e nlm ，d ev r o o me ，v a nr a n t w i j kf s h e l d o nra ，s v e d a svk p e n i c i l l i na c y l a s e - c a t a l y z e da m p i c i l l i ns y n t h e s i su s i n gap hg r a d i e n t ：an e wa p p r o a c ht o o p t i m i z a t i o n b i o t e c h n 0 1 b i o e n g ，2 0 0 2 ，7 8 ( 5 ) ：5 8 9 - 5 9 3 14 v a nl a n g e nlm ，d ev r o o me ，v a nr a n t w i j kf s h e l d o nra e n z y m a t i cs y n t h e s i so f 1 3 - 1 a e t a ma n t i b i o t i c su s i n gp e n i c i l l i n ga c y l a s ei nf r o z e nm e d i a f e b sl e t t ，19 9 9 ，4 5 6 ： 浙江人学硕十学位论文 8 9 9 2 15 w a n gjg z h a n gq ，h u a n gh ，y u a nzy d i n gdf y a n gs i n c r e a s i n gs y n t h e t i c p e r f o r m a n c e o f p e n i c i l l i n ga c y l a s ef r o mb a c i l l u sm e g a t e r i u mb ys i t e - d i r e c t e d m u t a g e n e s i s a p p l m i c r o b i 0 1 b i o t e c h n 0 1 2 0 0 7 7 4 ：l0 2 3 - l0 3 0 16 a b i a no ，g r f l z uv h e r m o s oj ，g o n z a l e zr ，g a r c i ajl ，g u i s a njm s t a b i l i z a t i o no f p e n i c i l l i nga c y l a s ef r o me s c h e r i c h i ac o l i ：s i t e d i r e c t e dm u t a g e n e s i so ft h ep r o t e i n s u r f a c et oi n c r e a s em u l t i p o i n tc o v a l e n ta t t a c h m e n t a p p l e n v i r o n m i c r o b i 0 1 ，2 0 0 4 ，7 0 ： 1 2 4 9 1 2 5 1 17 o s