（生物化学与分子生物学专业论文）人类锌指转录因子及心脏胚胎发育的研究.pdf

摘要 锌指基因家族是最大的人类基因家族之，其蛋白产物主要通过 与d n a 结合或聚合而起转录因子的重要作用。本文利用k r t l p p e l 型 ( c y s o h i s 。型) 锌指基因顺序上的保守特征，设计简并引物从人类早 期胚胎c d n a 文库中初步筛选克隆出四个k r l l p p l e 型锌指蛋白新基因， 经国际基因命名委员会批准命名为z n f 3 2 3 、z n f 3 6 0 、z n f 3 5 9 和z f p 2 8 0 其中z 7 v t 3 2 3 基因全长3 1 7 9 个碱基，含8 个外显子，定位于6 p 2 2 1 - 2 2 3 ， 在基因组d n a 上长2 9 4 5 k b ，其编码蛋白质全长4 0 6 个氨基酸，含有1 个s c a n 框和6 个k r t l p p l e 型锌指。n o r t h e r nb o l t 分析表明z 胆? 2 j 基 因在人类早期胚胎不同时期( 1 8 2 i 周) 表达水平不同，在肺，1 肾和 肝脏的表达水平较强，其它组织表达较弱。在成体组织的肝和肾脏中 的表达较强，在肺、胰腺、脑、肌肉、心脏等组织中的表达较弱。z y f 3 6 0 基因全长4 0 3 1 个碱基，含8 个外显子，在基因组d n a 上长1 7 3 k b ，其 编码蛋白质全长9 7 7 个氨基酸，含一个k r a b 框、一个s c a n 框、两个 s a l t 框和l o 个k r t l p p l e 型的锌指。n o r t h e r nb 0 1 t 分析表明该基因在 人类早期胚胎( 1 9 2 5 周) 的各个组织中普遍表达，尤其是在肾，心 脏和肺的表达水平最强。z n f 3 5 9 基因长3 2 7 1 个碱基，含6 个外显子，在 基因组d n a 上长1 8 k b 。它编码的蛋白质全长6 4 3 个氨基酸，含一个k r a b 框， 1 6 个c 2 h 2 型的锌指，在两者之间还有一个典型的中间重复序列。n o r t h e r n b o l t 分析表明该基因在人类早期胚胎的各个组织中普遍表达，其在肾，心脏 和肺的表达水平最强。z f p 2 8 基因长4 0 7 6 个碱基，含8 个外显子，在基因组 d n a 上长1 8 k b 。它编码的蛋白质全长8 6 8 个氨基酸，含1 个信号肽，2 个k r a b 框和1 4 个c 2 h 2 型的锌指。n o r t h e r nb o l t 分析表明该基因在人类早期胚胎 的各个组织中普遍表达，在肺和肝中的表达水平最强。综合这些基因的 结构和表达特征，我们可以初步得出一个结论：它们编码的是参与多 种人类胚胎器官发生的锌指转录调控因子。同时我们收集人类药物流 产的早期胚胎，观察发现胚胎畸形占1 7 8 6 ，早期致死占3 2 5 4 ；采 用组织切片技术将胚胎制成一系列石蜡连续切片，染色后显微观察畸 形和正常的早期胚胎内部心脏等器官的发育情况，发现胚胎外部畸形 - b 体内畸形存在一定关联，对此我们将傲进一步的研究。 关键词：k r t l p p l e 型锌指；k r a b ；s c a n ；转录调控因子：基因表达；早 期胚胎发育 a b s t r a c t t h ek r i l p p l e t y p ez i n cf i n g e rm o t i ff o u n di nm a n yt r a n s c r i p t i o n f a c t o r si st h o u g h tt ob ei m p o r t a n tf o rn u c l e i ca c i db i n d i n ga n d o r d i m e r i z a t i o n h e r ew eh a v ei d e n t i f i e da n dc h a r a c t e r i z e dt w on o v e l z i n cf i n g e rg e n e sn a m e dz n f 3 2 3 a n dz n f 3 6 0 u s i n gd e g e n e r a t ep r i m e r sf r o m a ne a r l yh u m a ne m b r y oh e a r tc d n al i b r a r y t h ez n f 3 2 3m r n ai s3 1 7 9b p w i t h8 e x o n s ，w h i c hm a p s t oc h r o m o s o m e 6 p 2 2 卜2 2 3 a n d s p a n s a p p r o x i a t e l y2 9 4 5 k b t h ep r e d i c t e dp r o t e i nc o d e db yz n f 3 2 3g e n e c o n t a i n ss i xd i f f e r e n tk r u p p l et y p ez i n cf i n g e r sa n das c a nb o x t h e e x p r e s s i o nl e v e l sw e r ed i f f e r e n td u r i n gd i f f e r e n td e v e l o p m e n ts t a g e s o fh u m a ne m b r y ob e t w e e n1 8w e e k sa n d2 5w e e k s n o r t h e r nb l o ta n a l y s i s s h o w st h a ta3 2k bt r a n s c r i p ts p e c i f i cf o rz y f 3 2 3w a se x p r e s s e da t h i g hl e v e l si nt h el u n g ，1 i v e r ，a n dk i d n e y ，w h i l ew e a k l ye x p r e s s e di n i n t e s t i n e ，b r a i n ，m u s c l e ，c h o l e c y s t ，h e a r t ，a n dp a n c r e a s i na d u l t t i s s u e s ，z v f 3 2 3i se x p r e s s e da th i g hl e v e li n1 i v e ra n dk i d n e y ，w e a k l y i nl u n g ，p a n c r e a s ，b r a i n ，p l a n e e n t a ，m u s c l e ，a n dh e a r t t h ez n f 3 6 0 m r n n ai s4 0 3 lb d ，w h i o hs p a n s1 7 3k ba n di so r g a n i z e di n t oe i g h t e x o n s t h ep r e d u c e dp r o t e i nc o d e db yz v f 3 6 0g e n ec o n t a i n s9 7 7a m i n oa c i d s ， i n c l u d i n gak r a bm o t i f ，as c a nm o t i f ，t w os a n tm o t i f sa n dt e nk r t l p p l e t y p ezi n ef i n g e r s t h ez f 3 6 0g e n ei sw il d l ye x p r e s s e di n t h ev a r i o u s t i s s u e so fh u m a ne m b r y o s ，e s p e c i a l t yi nk i d n e y ，h e a r ta n dl u n g t h e c o m d l e t eh u m a nz , v f 3 5 9c d n as e q u e n c ei s3 2 7 0b pa n dc o n t a i n sa1 9 3 2b p o p e nr e a d i n gf r a m e ( o r f ) t h a te n c o d e sa6 4 3a m i n o a c i dp r o t e i nw i t h a nn - t e r m i n a lk r a bd o m a i na n d1 6c - t e r m i n u sz i n cf i n g e rc 2 h 2m o t i f s t h ez f p 2 8c d n as e q u e n c ei s4 1 0 4b pa n dc o n t a i n sa2 0 7 6b po r ft h a t e n c o d e sa n d8 6 8a m i n oa ci d sp r o t e i nw i t ha nn - t e r m i n a ls i g n a lp e p t i d e ， t w ok r a bd o m a i n ，a n d1 4c - t e r m i a n a lc 2 h 2z i n cf i n g e rm o t i f s n o r t h e r n b l o ta n a l y s e ss h o w e das t r o n ge x p r e s s i o no fz n f 3 5 9a n dz f p 2 8i nv a r i o u s t i s s u e so fa d u l th u m a n af u r t h e ra n a l y s i su s i n g h u m a ne m b r y o n i c t i s s u e s ( 1 8 2 3w e e k s ) s h o w e da d e v e l o p m e n t s p e c i f i ce x p r e s s i o n p a t t e r ni nh e a r t ，s k e f e t a l m u s c l e ，l i v e r ，l u n g ，k i d n e y ，a n db r a i n t a k e nt o g e t h e r ，t h e s er e s u l t si n d i c a t et h a tt h e s e g e n e sa r em e m b e r s o fz i n cf i n g e rt r a n s c r i p t i o nf a c t o rf a m i l ya n dm a yb ei n v o l v e di nt h e d e v e l o p m e n to fm u l t i p l ee m b r y o n i co r g a n s w ec o l l e c t e dd r u ga b o r t i v e e a j t l ye m b r y o s ，t h er a t eo fm a l f o r m a t i o nw a s1 7 8 6 a n dt h er a t eo fe a r l v e m b r y o n i cl e t h a l it yw a s3 2 5 4 t h e e a r l ye m b r y ow e r em a d ei n t oa s e t i e so fc o n t i n u o u ss e c t i o ns l i d e sb yt i s s u ec u t t i n g t h es e c t i o n s w e r es t a i n e d b yh e m a t o x y l i na n de o s i n ( h e ) s t a i n i n ga n dt h e nt h e d e v e l o p m e n to fi n t e r n a lo r g a n ss u c ha sh e a r ti ne a r l ye m b r y o sw a s o b s e r v e db ym i c r o s c o p e w ef o u n dt h a tt h e r ei sc e r t a i nr e l a t i o n s h i p b e t w e e ne x t e r n a la n di n t e r n a lm a l f o r m a t i o n f u r t h e r s t u d yo nt h i s p o i n tw a su n d e rw a y k e yw o r d s ：k r i l p p l e t y p ez i n cf i n g e r ，s c n ab o x ，k r a bb o x ，h o v e l t r a n s c r i p t i o nf a c t o r ，g e n ee x p r e s s i o n ，e a r l yh e a r t d e v e l o p m e n t m t n k r a b e d t a d e p c e b e s t s t s r a c e n c b i 缩写表 y 6 63 6 6 6 多组织n o r t h e r n 膜( m u l t i p l e t i s s u e sn o r t h e r nm e m b r a n e ) k r t i p p l e 型环指结构域( k r f i p p l er i n g a s s o i c a t e db o x ) 乙二胺四乙酸二钠( e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i c a c i d ) 二乙基焦磷酸盐( d i e t h y lp y r o c a r b o n a t e ) 溴化乙锭( e t h i d i u mb r o m i d e ) 表达靶序列( e x p r e s s e ds e q u e n c et a g g e d ) 序列靶位点( s e q u e n c e t a g g e d s i t e ) c d n a 末端快速扩增( r a p i da m p l i f i c a t i o no f c d n ae n d s ) 生物技术信息中一t l , ( n a t i o n a lc e n t e rf o rb i o t e c h n o l o g yi n f o r m a t i o n ) s m a r t 单元件结构研究工具( s i m p l e m o d u l a r a r c h i t e c t u r er e s e a r c ht 0 0 1 ) 论文撰写依据 本学位论文主要是根据如下四篇论文撰写： 1 p ih l ，l iy q ，z h uc b ，z h o u l ，l u ok m ，y u a nw z ，y iz f ，w a n gy q ，w u x s ，a n d l i um yan o v e lh u m a n s c a n ( c y s ) 2 ( h i s ) 2 z i n c f i n g e r t r a n s c r i p t i o n f a c t o rz n f 3 2 3i n e a r l y h u m a n e m b r y o n i c d e v e l o p m e n t ， b i o c h e m b i o p h y s r e sc o m m u n 2 0 0 2 ，2 9 6 ( 1 ) ：2 0 6 2 1 3 2 p ih l ，l iy q ，z h uc b ，z h o ul ，w a n gy q ，y u a nw z ，l i um y ，a n dw ux s s t u d i e so nc l o n i n ga n de x p r e s s i o no fah u m a nn o v e lz i n cf i n g e rp r o t e i n z n f 3 6 0 ( m a n u s c r i p t ) 3 z h o ul ，z h uc b ，l u ok m ，l iy q ，p ih l ，y u a nw z ，w a n gy q ，h u a n gc x ， l i um yw ux s i d e n t i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no ft w on o v e lz i n cf i n g e r g e n e s ，z n f 3 5 9a n dz f p 2 8 ，i nh u m a nd e v e l o p m e n t b i o c h e mb i o p h y sr e s c o m m u n 2 0 0 2 ，2 9 5 ( 4 ) ：8 6 2 - 8 6 8 4 p ih l ，l iy q ，y iz f , y u a nw z ，z h uc b ，w a n gy e ，l i um y ，w ux s e m b r y o l o g y s t u d i e so nh u m a na b o r t i v e e m b r y o s a t e a r l ys t a g e s ( m a n u s c r i p t ) 1引 言 1 1 锌指家族的研究概况 1 1 1 d n a 结合功能域 随着人类基因组计划的进行，大量基因被发现和定位，基因的功 能问题将成为今后研究的热点。大多数基因的最终产物是相应的蛋白 质，因此要认识基因的功能，必然要研究基因所表达的蛋白质。在细 胞和生物体生长、分泌、细胞系定向等过程中，基因表达的转录水平 调控是非常重要的一个环节。转录因子有一个共同的特性，即由不同 的功能结构域组成可调变的蛋白质结构，域是蛋白结构和功能的基本 单位，而这些功能结构域从蛋白总体分离出来后，无论是单独作用还 是同其它来源的蛋白连接后，仍保持原有的功能( 如d n a 结合活性和 转录激活活性) 。转录激活区通常富含酸性氨基酸，也可富含脯氨酸 和或谷氨酰胺。同样，结构域的排列方式( 数目和次序) 是保守的， 一些不同的d n a 结合功能域如碱性拉链( b z i p ) 、锌指、螺旋环螺旋 ( h l h ) 和螺旋转角螺旋( h t h ) 也各有特点，事实上各种不同的转录 因子是依据它们所具有的特殊的d n a 结合模式而分成各大家族。蛋白 质的功能往往体现在与其他蛋白质及或核酸的相互作用之中。细胞各 种重要的生量过程，包括信号的转导，细胞以外界环境及内环境变化 的反应等，都是以蛋白质问相互作用为纽带，并形成网络。因许多转 录因子可以形成同二聚体和异二聚体，所以各大家族据此可进一步细 分成亚家族，且与d n a 结合的转录因子大多以二聚体形式起作用。 1 1 1 ，1 碱性一亮氨酸拉链( h a s ic io u o in ez ip p e r ，b z ip ) 该结构是亲脂性( a m p h i p a t h i c ) 的q 螺旋，其特点是蛋白质分 子的肽链上每隔6 个氨基酸就有一个亮氨酸残基，结果就导致这些亮 氨酸残基都在q 螺旋的同一个方向出现。b z i p 通常被定义为一行4 7 1 个周期重复的亮氨酸残基( 图1 b ) ，其距离大约跨越8 个螺旋转弯， 通式为l - x ( 6 ) 一l - x ( 6 ) 一l - x ( 6 ) 一l ，有时典型的亮氨酸残基会被异亮氨 酸或缬氨酸所代替。两个相同结构的两排亮氨酸残基就能以疏水键结 合成二聚体，这二聚体的另一端的肽段富含碱性氨基酸残基，借其正 电荷与d n a 双螺旋链上带负电荷的磷酸基团结合( 图l a ) 。若不形成 二聚体则对d n a 的亲和结合力明显降低。在肝脏、小肠上皮、脂肪细 胞和某些脑细胞中有称为c e b p 家族的一大类蛋白质能够与c a a t 盒和 病毒增强子结合，其特征就是能形成b z i p 二聚体结构。 a b 圈1a ) 碱性一亮氨酸拉链的结构示意图； b ) c e b p 、j u n 、f o s 和g c n 4 基因d n a 结合域和亮氨酸拉链结构域的序列比较图。 b z i p 家族的蛋白进一步分为a p 一1 、c f l e b p 和a t f c r e b 亚家族。a p l 是一个经典的具有亮氨酸拉链结构的蛋白质家族，其成员j u n 和f o s 可以形成同源或异源二聚体，同是j u n 还可以利用羧基端的亮氨酸拉 链和r b 蛋白发生相互作用，从而影响细胞的生长和分化“。k l y b 蛋白 是一种转录因子，其氨基端具有d n a 结合结构域，中央是反式激活结 构域( t r a n s a c t i v a t i o nd o m a i n ) ，羧基端是一个亮氨酸拉链结构域。 1 1 1 2 螺旋一转角一螺旋( h e iix - t 1 i r n h e iix ，h t h ) 螺旋一转角一螺旋是最早发现于原核生物中的一个关键因子，如图4 所示，该结构域长约2 0 个氨基酸，主要是两个q 一螺旋区和将其隔开 的b 转角。其中的一个被称为识别螺旋区，因为它常常带有数个直接 与d n a 序列相识别的氨基酸。这类结构至少有两个c i 螺旋，其间由短 肽段形成的转角连接，两个这样的m o t i f 结构以二聚体形式相连，距 离正好相当于d n a 一个螺距( 3 4 n m ) ，两个a 螺旋刚好分别嵌入d n a 的深沟( 图2 ) 。 1 1 1 3 螺旋一环一螺旋( h e iix io o p h e iix ，h l h ) 如图3 所示，该结构域长约5 0 个氨基酸残基，同时具有d n a 结合 和形成蛋白质二聚体的功能，其主要特点是可形成两个亲脂性c i 一螺 旋，两个螺旋之间由环状结构相连，其d n a 结合功能是由一个较短的 富碱性氨基酸区所决定的。肌肉特异性的转录因子m y o d 就属于h l h 蛋 白家族成员，这种肌源性的调控因子只在骨骼肌中表达，并且在各种 培养细胞的以为表达可以导致这些细胞间肌细胞分化。 图2h t h 的结构及其与d n a 的结合 圈3h l h 的结构及其与d n a 的结合 1 1 1 4 锌指( z ；n cf in g e r ) 锌指结构家族蛋白大体可分为锌指、锌纽( t w i s t ) 和锌簇 ( c l u s t e r ) 结构，其特有的半胱氨酸和组氨酸残基之间氨基酸残基数 基本恒定，有锌参与时才具备转录调控活性。重复的锌指样结构都是 以锌将一个a 螺旋与一个反向平行b 片层的基部以锌原子为中心，通 过与一对半胱氨酸和一对组氨酸之间形成配位健相连接，锌指环上突 出的赖氨酸、精氨酸参与d n a 的结合。由于结合在大沟中重复出现的a 螺旋几乎联成一线，这类蛋白质与d n a 的结合很牢固，特异性也很高。 类固醇激素受体家族含有连续的两个锌指结构，其中两个锌原子将两 个a 螺旋装配成类似h t h 的结构，再以同源和异源性二聚体的方式将 两个a 螺旋结合在相邻的两个大沟中。 每个重复的“指”状结构约含2 3 个氨基酸残基，其特征是由4 个 氨基酸残基与1 个锌离子结合( 图4 ) ，通过金属离子的参与形成稳定 的空间结构，通过q 螺旋与d n a 双螺旋结构的大沟结合，从而识别特 定的d n a 序列，也就因此而被命名为锌指模体。2 1 ( z i n cf i n g e rm o t i f ) 。 整个蛋白质分子可有多个锌指重复单位。 锌指模体结构是蛋白质与d n a 双螺旋结构之间结合的一种形式， 锌指模体的序列、数量和排列方式对于其蛋白质的生物学功能具有非 常重要意义。在细胞分化和发育过程中，转录因子的锌指模体还参与 转录因子与其耦联d n a 的识别位点之间的结合，而且这将特异地激活 或者抑制基因的表达。 圈4 蛋白质的锌指结构示意图，灰色球体代表可能与d n a 结合的侧链 1 1 2 锌指蛋白的类型 锌指蛋白( z i n cf i n g e rp r o t e i l l ) 是8 0 年代中期发现的一类d n a 结合蛋白，含有通过结合z n ”稳定的短的可以自我折叠形成”手指”结 构。自从在果蝇中鉴定出第一个锌指转录因子嘞以来，已发现有 6 0 0 到7 0 0 个锌指蛋白n 13 。据报道人基因组中约有1 的部分都编码锌 指蛋白，该蛋白基因家族是人类最大的基因家族之一，其蛋白产物主 要通过与d n a 相互作用而起转录因子作用，调节靶基因的表达以适应 生物体发育、分化、成熟过程的需要。已有一些证据表明锌指蛋白是 一类重要的转录调控因子，在人类的一些疾病和癌症中，经常发现有 锌指蛋白家族的基因发生突变。 根据蛋白质与锌离子结合的方式不同，锌指蛋白基因家族被分为 许多亚族，比如：c 2 h 2 型、c 2 h c 型、谷氨酸受体、环型锌指、g a t a 一1 型、g a l 4 型和l i m 家族”。7 。 1 1 2 1 经典的锌指结构 由2 个半胱氨酸和2 个组氨酸( 或3 个半胱氨酸与1 个组氨酸) 以 四面体的形式与一个锌离子结合，形成一个由两段反平行的b 一折叠和 一段一螺旋组成的稳定结构，d 一螺旋的氨基端可以识别特定的d n a 序列，每个锌指和5 个甚至更多的碱基结合，这类锌指结构可以表示 为c x x c x l 0 1 2 t f x 2 5 c h ，即c 2 h 2 或c 2 h c 。据估计有三分之一的锌 指蛋白家族成员是k r i l p p l e 型( 即c 2 h 2 型) 锌指蛋白，k r t l p p l e 型锌指 由2 5 3 0 个氨基酸残基组成，其中包含两个保守的c y s 和h is ，其结 构模式为c 2 一c x h 一3 一h 。而且k r u p p l e 型锌指蛋白的一个典型特征是 在前一个锌指的最后一个组氨酸和后一个锌指的第一个赖氨酸之间存 在一段高度保守的连接序列“t g e k p y x ”，又称之为h c 连接83 。很多 的证据表明k r l l p p l e 型锌指基因作为转录调控因子在许多的生理学过 程中起重要作用1 。例如z ，i v f 2 6 8 只在早期人胚胎中表达，可能与胚 胎发育相关，大鼠k z f l 只在睾丸中的生殖细胞中表达，参与精子的发 生，人z f d 2 5 在血清依赖的细胞活性中发挥作用，如细胞的增殖和生 长。 1 12 2g a l 4 型 g a l 4 型( 即c 6 型) 锌指结构最先在g a l 4 与d n a 结合的部位发现， 是半乳糖诱导基因表达的负调控因子，许多真菌转录调控蛋白的n 端 都包含有这种锌指结构，其结构模式为c x 。c x 。c x 。c x 。c x 。c 。g a l 4 型锌指 结构通过6 个半胱氨酸与2 个锌离子结合，中间的2 个半胱氨酸是2 个锌离子共用的，也通过螺旋与d n a 结合。参与精氨酸、脯氨酸、 酪氨酸、麦芽糖和半乳糖等的新陈代谢，g a b a 分解代谢和亮氨酸的生 物合成等过程的蛋白大都具有g a l 4 型锌指结构。如如j 和是编码半乳 糖代谢酶基因的表达的转录激活因子，其d n a 结合区、激活区和半乳 糖调控区都有了详尽的描述，但其功能还有待研究。研究发现紧接着 c 6 型锌指结构的羧基端有一个短的螺旋聚合体结构，与如和的聚合 有关。 1 1 2 3l lm 型 l i m ( l i n 1 1 ，i s 卜l 和m e c 一3 基因) 结构域由6 0 个富含半胱氨酸 的氨基酸残基构成，进化上相对保守，其保守组分为7 个半胱氨酸残 基和 1个组氨酸残基，结构域通式为： c x ( 2 ) 一c x ( 1 5 ，2 1 ) 一 f y w h 一h x ( 2 ) 一 c h 一x ( 2 ) 一c x ( 2 ) 一c - x ( 3 ) l i v m f 。l i m 结构域可结合两个锌离子，这两个锌离子随机安置，但l i m 结 构域不能结合d n a 分子。 对含有l i m 结构域的c r p ( c y s t e i n ea n d9 1 y c i n e r i c hp r o t e i n ， 丝氨酸和甘氨酸富集蛋白) 的研究发现，其疏水核心对l i m 结构域的立 体折叠十分重要，而每一个锌离子结合区的氢键对维持锌指的几何结 构是必需的。现在发现的含有l i m 结构域的蛋白质较多，一般可分为 三组：第一组，含有成对l i m 结构域，分为a 型和b 型，靠近氨基末 端常常但不总是含有一个同源结构域。l m o ( l i m o n l y ) 蛋白，常有不多 于两个的l i m 结构域，它还包含一段不属于成对的l i m 结构域一个小 序列，也被分在这一组。第二组含有一或两个单一序列型l i m 结构域 拷贝( c 型) 。第三组是一些不同来源的l i m 结构域的集合，这些l i m 结构域大多靠近羧基末端，常和些附加结构域相连，其中一些可能 具有和细胞骨架结合的能力“1 “。来自第二组及第三组的l i m 结构域可 以形成单独的或不同的配体，从立体构型分析l i m 结构域可能有不止 一个的结合界面。l i m 结构域转录因子家族成员大多在氨基端含有两个 l i m 结构域，在羧基端含有一个能与d n a 结合的同源结构域。两个l i m 结构域转录因子家族成员要建立联系，必需通过各自的l i m 结构域分 别和n l i ( n u c l e a rl i m d o m a i ni n t e r a c t o r ，胞核l i m 结构域作用子，是 一种核蛋白) 单体的l i m 结合结构域相互作用，这样就形成一个四聚体 结构，从而促进远距离的增强子和启动子的相互作用。l i m 结构域为以 上转录因子的联系提供了纽带。l i m 结构域结合蛋白( l i m d o m a i n - b i n d i n g p r o t e i n ) ，也可以通过其羧基端和含有l i m 结构域的蛋白质相互作用， 形成复合体作为传递激活造血信号的桥梁“。 1 。1 。2 4 环指型 环指结构域也称为c 。h c 。锌指结构域，是l o v e r i n g 等于1 9 9 4 定义 的一种蛋白结构域，首先发现于人r i n g l 蛋白，富含半胱氨酸，由4 0 一6 0 个氨基酸残基构成。它能结合两个锌离子，锌离子被4 个半胱氨酸或3 个半胱氨酸及1 个组氨酸四分子螫合。它的通式为： c x h x 一 l i v m f y 一c - x ( 2 ) 一c - l i v m y a ，可表示为c 3 h c 4 。其中的半胱 氨酸和组氨酸高度保守，c 3 h 和c 4 分别结合一个锌离子，形成对称的 空间结构，在环指结构中两个锌离子结合域之间的距离很近，空间上 不能形成两个独立的锌指结构，而是以一个整体与d n a 或其它蛋白质 结合。环指有两种变异，一种是出现于t r a f 4 和t r a f 5 的c 3 h c 3 d 序列， 即基序的最后一个半胱氨酸由天门冬氨酸代替。由于天门冬氨酸也可 以与锌离子结合，所以这种替换不影响环指空间结构的形成。另外一 种变异c 2 t h c 4 出现在p 5 3 相关癌蛋白m d m 2 。环指家族的成员现在已经 超过7 0 个，主要是一些核内调节蛋白，参与基因转录调控、d n a 修复 和重组、细胞转化、肿瘤抑制。t r a f 蛋白的环指结构参与它们的信号 转导过程，截去这一区域的t r a f 蛋白发挥相反的作用，成为信号转导 抑制蛋白。环指的三维结构因蛋白质而异，i e e h v ( i m m e d f a t ec a r l y e q u i n eh e r p e sv i r u s ) 蛋白的环指中有口一口一q b 折叠构象，而在 p m l 中其结构为b b d 一环一a3 。一t 3 。尽管有这些不同，环指还是有 相对保守的构象区域，包括保持分子基本构象的口链，锌离子连接系 统，以及保守残基包裹形式，该形式构成了疏水的核心“。c c b l 蛋白 是信号转导途径中的一种接头蛋白，c - c b l 蛋白环指结构域可以和人类 泛素结合酶7 ( u b c h 7 ) 结合，对细胞中配体诱导的表皮发生因子受体 泛素化起关键作用，c c b l 蛋白还可以通过其环指结构域结合泛素结合 酶( e 2 ) ，使磷酸化的底物泛素化，进而从蛋白体途径降解“。 1 1 3 与c 2 h 2 型锌指相关的结构域 一些k r a p p l e 型锌指蛋白的氨基端包含有多种高度保守的结构域， 这些结构域通过调控转录因子与转录因子之间或者与其他的细胞成分 相互作用从而调控亚细胞定位、d n a 结合和基因表达。如p o z ( p o x v i r u s a n dz i n cf i n g e r ) “，又称为b t b ( b r o a d c o m p l e x ，t r a m t r a c k ，a n d b r i c a b r a c ) 、k r a b ( k r u p p e l - a s s o c i a t e db o x ) “、f a x 和s c a n ( 或 l e r ) “，这些结构域在转录调控过程中起不同的作用。 1 1 3 1p o z 结构域 p o z 结构域由1 2 0 个氨基酸组成，是进化上保守的蛋白质一蛋白质 相互作用结构域。在含有c 。h 。锌指的蛋白质的氨基端，大约5 一1 0 含 有该结构域h 1 ，拥有p o z 结构域的蛋白质分子多数为转录因子，这些转 录因子可通过p o z 结构域形成高度紧密扭曲结合的同源二聚体，这个 同源二聚体有一个较大的疏水表面，每个单体有1 4 的表面用于二聚 体的分子间作用，这种构象特别适合于同源二聚体的形成，二聚体的 表面是由保守氨基酸残基构成的沟，用于和其它蛋白质分子作用“”驯。 在p l z f ( p r o m y e l o c y t i cl e u k e m i az i n cf i n g e r ) 蛋白中，p l z f 可通过 该结构域形成同源二聚体，其中心架构是一组a 螺旋，而分子的头尾 由短的9 折叠封住瞳“。p o z 结构域可以和组蛋白去乙酰化酶复合体作 用从而发挥转录抑制活性，在急性早幼粒细胞a 血病( a p l ) 中由 t ( 1 1 ：1 7 ) 染色体易位引起的p l z f - r a rd 蛋白，不但形成同源二聚体， 还可以通过p o z 结构域与p m l ( p r o m y e l o c y t i cl e u k e m i a ) 蛋白形成异源 二聚体，影响p m l 的正常亚细胞定位【2 2 1 。在b c l 一6 蛋白中，其氨基端 的p o z 结构域可以和共抑制因子n - c o r ( n u c l e a rr e c e p t o rc o r e p r e s s o t ) 或s m r t ( s i l e n c i n gm e d i a l o to fr e t i n o i da n dt h y r o i dr e c e pl o t 、 作用，体外研究发现来自不同蛋白质的p o z 结构域，包括p l z f 以及一 种疫荫病毒蛋白，均可以和n - c o r 及s m r t 发生亲和力不同的作用心4 。2 “。 1 1 3 2k r a b 结构域 k r a b 框大约由7 5 个氨基酸残基构成，真核生物中，i 分之一左右 的k r u p p l e 型锌指蛋白氨基端有k r a b 框。k r a b 框富含带电残基，一般 由两个外显子编码向成，分为a 和b 两个亚框，可形成两个a 一螺旋。 k r a b 框的a 框和b 框被不同长度的片断分隔开，很多的k r a b 蛋白只有 a 框1 。 k r a b 框通过d n a 结合结构域与模板d n a 结合时，它起着转录抑制 的作用陋”。a 框由4 5 个残基构成，是抑制转录所必需的。而b 框本 身没有抑制作用，但可通过a 框间接地发挥抑制作用口”“1 。基因失活 ( s i le n c i n g ) 需要k r a b 框结合到k a p 一1 t i f l 一d 抑制子的r b c c 框上， 在k a p 一1 结合到异染色质蛋白h p l 上时，与k r a b 型锌指蛋白结合的靶 基因可能失活并进入异染色质。在人类基因组中，k r a b 型锌指蛋白很 可能是最大的转录因子基因家族之口。尽管k r a b 型锌指蛋白的功能 还不很了解，但它们在细胞分化和发育中起重要作用。 1 13 3s o a r 结构域 s c a n 框来源于最先发现具有这个结构域的四个蛋白：s r e z b p 、 c t 一n 一5 1 、a w 一1 和n u m b e r1 8e d n a ，其命名也由此得来”。目前已 鉴定出很多的这类蛋i i 。s c a n 框由9 6 个残基构成，富含亮氨酸，氨基 酸序列分析预测整个结构域分成三段，每段都预示着将形成一个一 螺旋”1 ，而c 1 一螺旋可能参与蛋白与蛋白之间的相可- 作用。且s c a n 框 富含氢键，在其核心的l ( x 6 ) i 结构有多个负电残基，核心的侧面围绕 有a 、e 、i 、m 、h 和c 等残摹，这些残基经常在q 一螺旋中发现，s c a n 框还包含较多的谷氨酸残基，表明它足一个带负电的酸性结构，这往 往是转录因子的1 个共同特点。s c a n c 2 h 2 型锌指蛋白以同聚体或异聚体 的形式结合d n a 并进行转录调控。“0 1 ，例如z n f 2 0 2 基因的s c a n 框能够选择 性地调节蛋白之问以及锌指结构和d n a 元件之间的结合。许多的证据表明 9 s c a n 框对s c a n c 2 h 2 型转录调控因子的功能起着非常重要的作用。 1 2 心脏早期发育的基因调控机理 先天性心脏病( 简称先心病) 是先天性畸形中最常见的一种，由 于胎儿的心脏在母体内发育缺陷或部分停顿所造成。患儿出生后即可 发现心血管病变，为儿科的常见疾病。许多年以来，先心病一直对人 类健康构成较严重的威胁，据资料记载，先天性心脏病的发病率高达 8 1 0 ，中国每年有1 5 万名患有各类先天性心脏病的患儿出生h “。先 心病的分子机理是儿科心脏病学家研究的主题，科学家利用动物模型 在阐述心脏发育的遗传学途径方面已经取得了许多进展。近4 0 年来， 人类基因组解密和基因定位技术的应用使我们进一步了解常见心脏疾 病的发病机制，在心血管药物治疗技术上取得了较大的进步，同时让 人们认识到心血管病理学实质上是一系列相互关联而又相互区别的基 因群作用的结果“。 然而，目前世界上对控制人类心脏早期发育的基因及其调控途径 知之甚少，特别是从心脏前体细胞到心管形成阶段的基因控制研究尚 是一片空白心。由于研究对象的特殊性，人类心脏早期发育的分子机 理研究在人体上很难进行，最常用的方法是利用动物模型进行研究， 在各种模式动物中，果蝇以其超过一百年的研究历史、完善的基础研 究、简易的饲育条件和较短的生命周期等优势成为遗传学研究上的一 种经典模式动物。近年来，果蝇心脏特化的遗传机制已初步研究清楚。 因为调控果蝇和脊椎动物早期心脏细胞命运定型的途径具有保守性 心“，以及果蝇动物模型具有在短期内大规模筛选突变基因，研究出基 因信号调控途径的无比优越性，果蝇是一种探讨人类心脏早期发育的 分子机理的理想动物模式。 胚胎比较生物学的研究表明，不同生物的早期个体胚胎发育具有 惊人的相似性。将果蝇和脊椎动物心脏的早期发育进行比较发现：果 蝇和脊椎动物的心脏发育在早期具有惊人的相似性。两者均从两侧心 肌中胚层分化出心脏前体细胞，再在胚胎的中部形成一个管状结构。 实验结果充分表明：果蝇心脏发育基因控制模式是代替人体心脏发育 研究的一个理想模式n5 ，“1 。近年来，果蝇心脏特化的遗传机制已初步研 1 n 究清楚。控制果蝇心脏早期发育的同源异形盒基因t ir l 与小鼠同源异 形盒基因c s x m k n x 2 i 均具有相同的表达模式，更为主要的是两者均 具有相似的功能：t i n 基因突变导致整个心脏的消失，c s x m n k x 2 5 基 因的突变导致心脏发育的部分缺陷。因此可以通过果蝇模型来研究脊 椎动物早期心脏发育的分子机制。在线性心管形成以前果蝇和脊椎动 物心脏的起源和功能的相似性使果蝇成为研究脊椎动物心脏发育的理 想模型。 1 2 1 杲蝇心脏发育的基因调控 对基因调控方式目前认识得比较深入而且认识得比较早的是果蝇胚胎 发育基因的研究。果蝇的心脏是由单一的循环脉管系统组成的，这在一 定程度上掩饰了果蝇心脏组织的复杂性，实际上，与脊椎动物一样， 果蝇的心脏也是由许多沿着前后轴重复排列