（生物化学与分子生物学专业论文）家蚕免疫相关基因bmmyd88的功能初探.pdf

m a j o r ： f i e l d ： b i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a rb i o l o g y f u n c t i o n a lg e n o m i c s s u p e r v i s o r ：p r o f x i aq i n g y o u c a n d i d a t e ： w a n gb o c h o n g q i n g ，c h i n a m a y , 2 0 1 1 独创性声明 本人提交的学位论文是在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。论文中引用他人已经发表或出版过的研究成果，文中已加了 特别标注。对本研究及学位论文撰写曾做出贡献的老师、朋友、同仁 学位论文作者：乙燧 签字日期：7 pf 年6 月砂日 学位论文版权使用授权书 。 本学位论文作者完全了解西南大学有关保留、使用学位论文的规 定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允 许论文被查阅和借阅。本人授权西南大学研究生院( 筹) 可以将学位 论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书，本论文：口不保密， 口保密期限至年月止) 。 导师签名：多易勃芝 签- 7 - 日期：年月 日 厶 巷 ： 年 名签 者 细 作 ： 文 期 沦 日 位 字 学 签 摘要 家蚕免疫相关基因b m m y d 8 8 的功能初探 生物化学与分子生物学硕士研究生王博 指导教师夏庆友教授 摘要 家蚕的驯化已有千年历史，在漫长的驯化过程中，家蚕不仅仅作为泌丝织绸 的经济物种，也是一种文化符号影响了千百年来的华夏文明。然而，蚕病所带来 的危害却一直影响着整个蚕桑产业的发展，我国每年约有近百亿左右的经济损失 是由于各种蚕病造成的。近年的研究表明，当家蚕感染微生物后，家蚕体内经过 一系列复杂的信号调控通路产生出多种抗微生物的多肽以应对微生物的入侵。其 中，主要通过t o l l 和i m d 两个重要的信号调控通路来进行微生物入侵危险信号的 传导以及激活抗菌肽表达，从而进行体液免疫防御。我们通过对家蚕免疫相关t o l l 信号通路中关键基因：髓样分化因子8 8 ( m y e l o i dd i f f e r e n t i a t i o nf a c t o r 8 8 ) 的研究， 探索家蚕体液免疫的信号传导的调控机制，并取得以下结果： 1 家蚕b m m y d 8 8 基因的克隆及序列分析 基于家蚕基因组数据库，克隆获得了家蚕b m m y d 8 8 基因的e d n a 序列，基因 全长1 1 8 8 b p ，编码3 9 5 个氨基酸，分子量为4 5 k d ，等电点为6 5 4 。该蛋白结构上 含有两个功能区域：n 端的死亡结构域( d e a t hd o m a i n ) ，以及c 端的t i r 结构域 ( t o l l i l i rd o m a i n ，t m ) 同源性比对表明，家蚕b m m y d 8 8 蛋白与果蝇、埃及伊蚊、 人类等，都具有较高的相似性，尤其是在两个功能结构域内，同源性较高。全基 因组基因芯片表明，b m m y d 8 8 在家蚕的各个组织中表达量均很低，微生物感染后 基因芯片也表明，在受到病原侵袭后，b m m y d 8 8 表达也未受诱导发生变化，维持 较低的水平。通过r t p c r 以及荧光定量p c r 结果也进一步验证了芯片数据。 2 家蚕b m m y d 8 8 基因的原核表达以及多克隆抗体的制备 根据基因e d n a 序列，设计引物分别扩增了全长和t i r 结构域，并且将其分 别克隆到p e g x4 t - l 和p e t 2 8 a 表达载体中，构建重组质粒。将重组后的质粒转 化进入r o s e t t a 菌株中，经过i p t g 诱导，全长蛋白以上清形式表达，t i r 结构域 重组蛋白以包涵体形式表达，经过亲和层析，获得纯化的t i r 结构域蛋白，并将 西南大学硕士毕业论文 蛋白免疫成年公兔，制备多克隆抗体。 3 w e s t e r nb l o t t i n g 检测家蚕b m m y d 8 8 蛋白的表达 利用制备的多克隆抗体，对家蚕微生物诱导2 4 h 的脂肪体、中肠的蛋白进行 检测。结果显示，家蚕脂肪体、中肠中均可以检测到目的蛋白的表达，但微生物 诱导状态与正常状态下相比，除黑胸败血菌诱导下中肠组织中表达量有下调外， 其他菌种诱导均未使蛋白表达量发生明显变化。 关键词：家蚕，免疫，m y d 8 8 ，原核表达 a b s t r a c t p r e l i m i n a r y f u n c t i o n a n a l y s i so f t h e i m m u n e r e l a t e dg e n eb m m y d 8 8 ，b o m b y x m o r i b i o c h e m i s t r ya n dm o l e c u l a rb i o l o g ym a s t e rc a n d i d a t e ：w a n g b o s u p e r v i s o r ：p r o f x i aq i n g y o u a b s t r a c t s i l k w o r mh a sb e e nd o m e s t i e a t e da n du s e di nc h i n af o ro v e rt h o u s a n d sy e a r s i nt h e l o n gh i s t o r y , b o m b y xm o r in o tj u s ta sae c o n o m i cs p e c i e sf o rs i l ks e c r e t i o n , m o r e i m p o r t a n t l y , i ti sac u l t u r a ls y m b o lo ft h ec h i n e s ec i v i l i z a t i o n h o w e v e r , t h eh a r m c a u s e db ys i l k w o r md i s e a s e sh a sb e e na f f e c t i n gt h ee n t i r ei n d u s t r y , a b o u tn e a r l yb i l l i o n o fa n n u a ll o s s e sc a u s e db yv a r i e t yo fs i l k w o r md i s e a s e si nc h i n a r e c e n ts t u d i e ss h o w t h a tt h es i l k w o r me x p r e s sav a r i e t yo fa n t i m i c r o b i a lp e p t i d e sw h i l ei tw a si n f e c t e db y b i c r o b i a l ，a n dt h i sp r o c e s sr e q u i r e sa s e r i e so fc o m p l e xs i g n a l i n gp a t h w a y st oc o m p l e t e t h et b ua n di m ds i g n a lp a t h w a y sa r et w oi m p o r t a n tr e g u l a t o r yp a t h w a y sf o rs i g n a l t r a n s d u e t i o na n da n t i m i c r o b i a lp e p t i d ee x p r e s s i o n i nt h i ss t u d y , w ea n a l y s i st h ek e y g e n eo ft b us i g n a lp a t h w a y ：m y e l o i dd i f f e r e n t i a t i o nf a c t o r s8 8 。t oe x p l o r et h eh u m o r a l i m m u n er e g u l a t o r ym e c h a n i s m so fs i g n a lt r a n s d u c t i o ni ns i l k w o r m , t h em a i nr e s u l t sa r e a sf o l l o w s ： 1 g e n ec l o n ea n de x p r e s s i o na n a l y s i so fb m m y d 8 8 b a s e do nt h eg e n o m ed a t a b a s eo fb o m b y xm o r i , w ec l o n e dt h ee d n ag e n es e q u e n c eo f b m m y d 8 8i ns i l k w o r m t h ec d n a 触1 1 e n g t ho fb m m y d 8 8 i s1 18 8 b p ，e n c o d i n g3 9 5 a m i n oa c i d s ，m o l e c u l a rw e i g h ti s4 5 k d 如a n di s o e l e e t r i cp o i n ti s6 5 4 1 1 1 es t r u c t u r eo f t h ep r o t e i nc o n t a i n st w of u n c t i o n a la r e a s ：nt e r m i n a ld e a t hd o m a i na n dct e r m i n a l t 0 l l i rd o m a i n , t i rh o m o l g yc o m p a r i s o ns h o w e dt h a tt h eb m m y d 8 8h a sh i g h s i m i l a r i t yc o m p a r e dw i t ht h ed r o s o p h i l am e l a n o g a s t e r , a e d e sa e g y p t i , h o m os a p i e n s , e t c ，e s p e c i a l l yi nt h et w of u n e t i o n sa r e a s ，t h eh o m o l o g yi sh i g h e r 讹o l eg e n o m eg e n e c h i ps h o w e dt h a t t h ee x p r e s s i o nl e v e l so fb m m y d 8 8i nv a r i o u st i s s u e si sv e r yl o w , m i c r o b i a li n f e c t i o ng e n ec h i pa l s os h o w e dt h a ta f t e rt h ei n v a s i o nb yt h ep a t h o g e n , e x p r e s s i o no fb m m y d 8 8r e m a i n sl o w u s i n gt h er r - p c ra n dq u a n t i t a t i v ep c rw e f u r t h e rv a l i d a t et h ec h i p sd a t a 2 p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o na n dp r e p a r a t i o no fa n t i - b m m y d 8 8a n t i b o d y a c c o r d i n gt ot h eg e n ee d n as e q u e n c e ，p r i m e r sw e r ed e s i g n e dt oa m p l i f yf u l l - l e n g t h a n dt i rd o m a i no fb m m y d 8 8 a n dt h e s ew e r ec l o n e di n t op e g x4 t - 1a n dp e t - 2 8 a e x p r e s s i o nv e c t o r t h er e c o m b i n a n tp l a s m i d sw e r et r a n s f o r m e di n t or o s e t t as t r a i n , a f t e r 两南大学硕士毕业论文 t h ei p t gi n d u c t i o n ，f u l l l e n g t hp r o t e i ne x p r e s s e di nt h es u p e m a t a n t ，t i rd o m a i n p r o t e i ne x p r e s s e di nt h ef o r mo fi n c l u s i o nb o d i e s w eu s e da f f i n i t yc h r o m a t o g r a p h yt o o b t a i n t h ep u r i f i e dt i rd o m a i np r o t e i n , a n dt h e n , p r e p a r e dt h e a n t i b m m y d 8 8 a n t i b o d y 3 w e s t e r nb l o t t i n ga n a l y s i so ft h ep r o t e i ne x p r e s s i o no fb m m y d 8 8 w - eu s et h ew - e s t e mb l o t t i n gt od e t e c tt h ep r o t e i ne x p r e s s i o no fb m m y d 8 8i nf a tb o d v a n dm i d g u t , w h i c hw e r ei n f e c t e db ym i c r o b i a la f t e r2 4 h t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h e b m m y d 8 8p r o t e i nc a nb ed e t e c t e di nt h ef a tb o d va n dm i d g u t , h o w e v e r , p r o t e i n e x p r e s s i o nl e v e l sd i dn o tc h a n g es i g n i f i c a n t l yi nt h ei n d u c e ds t a t ec o m p a r e dw i t ht h e n o r m a ls t a t e e x c e p tm i d g u ts a m p l ew h i c hw a si n f e c t e db y 丑b o m b y s e p t i c u s , i t s e x p r e s s i o no fb m m y d 8 8 w a sr e d u c e d k e yw o r d s ：b o m b y xm o r i ；i m m u n i t y ；m y d 8 8 ；p r o k a r y o t i ce x p r e s s i o n i v 1 3家蚕免疫相关研究进展9 1 3 1 家蚕的免疫系统概况9 1 3 2 家蚕的抗微生物肽的相关研究1 0 1 3 2 基于家蚕全基因组数据的免疫研究。1 l 第二章引言1 3 2 1研究背景和意义1 3 2 2 研究的主要内容1 3 2 3 技术路线1 4 第三章 b m m y d 8 8 基因的克隆、序列分析和表达特征分析1 5 3 1 材料与试剂1 5 3 1 1 实验材料1 5 3 1 2 实验试剂15 3 1 3 实验仪器1 6 3 1 4 主要溶液配制。1 6 3 2方法与步骤。1 7 3 2 1 家蚕b m _ 岣：d 8 8 基因的信息分析1 7 3 2 2 免疫诱导1 7 3 2 3r n a 的提取以及反转录c d n a 18 西南大学硕士毕业论文 3 2 4 目的基因克隆。1 9 3 3结果与分析2 1 3 3 1 b m m y d 8 8 基因克隆2 1 3 3 2 b m m y d 8 8 基因的序列分析2 1 3 3 3 b m m y d 8 8 基因的多序列比对分析2 3 3 3 4 基于芯片数据的基因表达分析2 4 3 4 讨论2 5 第四章 b m m y d 8 8 蛋白的原核表达2 7 4 1 材料与试剂2 7 4 1 1 表达载体与表达菌株。2 7 4 1 2 实验试剂2 7 4 1 3 实验仪器2 8 4 1 4 主要试剂配制2 8 4 2 方法与步骤3 2 4 2 1 重组表达载体的构建。3 2 4 2 2 原核表达及纯化检测。3 3 4 3 结果与分析3 6 4 3 1 重组质粒的构建。3 6 4 3 2 原核表达目的蛋白。3 7 4 3 3 目的蛋白纯化3 8 4 3 4 w e s t e r nb l o t t i n g 检测表达蛋白3 9 4 4 讨论z 1 0 第五章多克隆抗体的制备、w e s t e r nb l o t t i n g 检测4 l 5 1 材料与试剂4 l 5 1 1 实验材料4 l 5 1 2 主要实验试剂配制。4 l 5 2 方法与步骤4 l 5 2 1 多克隆抗体的制备4 1 5 2 2 纯化抗体4 l 5 2 3 w e s t e r nb l o t t i n g 检测4 2 目录 5 3 结果与分析4 2 5 3 1抗体效价检测4 2 5 3 2w e s t e r nb l o t t i n g 检测蛋白表达4 3 5 4 讨论4 3 第六章结论。4 5 参考文献4 7 在读期间发表论文及参加课题5 l 致谢5 3 两南大学硕士毕业论文 第一章文献综述 第一章文献综述 1 1概述 生物多样性造就了地球上种类繁多的生物类别，而昆虫靠着庞杂的群体，占 据了生态系统中的重要地位，其种类推测可能达1 , 0 0 0 多万种。在漫长的地球进化 的历史当中，昆虫受到了来自环境和其他周围物种的生存压力。在这种定向的选 择压力之下，昆虫进化出适合自己的一套免疫防御体系，通过物理机械、化学屏 障等方式，抵御外来危险生物的侵害，从而保护种群的生存和繁衍。 免疫系统分为先天免疫和获得性免疫。天然免疫即固有免疫( i n n a t ei l 】o m u m t y ) ， 是物种长期进化过程中逐渐形成并遗传下来的。其特点为：个体出生即有，抗菌 作用范围广泛，并且并非针对特定的抗原而起免疫反应，故又称之为非特异性免 疫( n o n s p e c i f i ci m m u n i t y ) 。此类免疫主要通过皮肤、黏膜及其分泌的杀菌效应分子 来行使生物学功能。获得性免疫也被称作适应性免疫( a d a p t i v ei m m u n i t y ) ，该免疫 反应需个体接触特定的抗原而产生，并且仅针对特定的抗原而发生反应，故亦称 其为特异性免疫( s p e c i f i ci m m u n i t y ) 。此类免疫通过能够特异性识别抗原的免疫细胞 ( 即t 淋巴细胞和b 淋巴细胞) 来发挥免疫作用【l - 2 。在机体中特异性免疫应答的基 本过程为：t 淋巴细胞和b 淋巴细胞特异性识别抗原，激活并活化成效应细胞， 通过一系列的应答机制，最终介导机体细胞完成细胞免疫或者体液免疫【3 】。 在种系发生上，一般认为低等动物只具有天然免疫功能，直到脊椎动物才进 化出获得性免疫，而先天免疫广泛的存在于脊椎和无脊椎动物中。在脊椎动物中， 先天免疫系统包括参与免疫的效应分子， 子、溶菌酶等；和参与免疫的效应细胞， 如防御素( d e f e n s i n ) 、补体系统、细胞因 如吞噬细胞、n k 细胞、b 1 细胞、肥大 细胞等。在无脊椎动物中，先天免疫主要包括细胞免疫和体液免疫。细胞免疫是 由血细胞介导的细胞噬菌、囊包作用和血细胞凝结作用；体液免疫主要包括细胞 识别受体、胞内信号因子、抗微生物肽( h m p s ) 、蛋白酶等【4 j 。 先天免疫不仅是无脊椎动物个体防御的重要屏障，同时在脊椎动物免疫系统 中也扮演了重要的角色。近年来对于昆虫抗菌肽的研究表明，许多昆虫抗茵肽的 表达调控以及信号传导途径与脊椎动物非常相似【5 j 。先天免疫不仅具有广泛的防御 功能，同时其发生及效应也涉及复杂的识别机制。目前已经证实，先天免疫的识 别机制通常仅针对微生物特定组分中的特定分子结构产生应答，而并不对一般的 机体结构发生自身免疫。在这个意义上，先天免疫比获得性免疫更能有效的识别 “自己 和“非己 。由此可见，动物免疫是一个完整的防御系统，先天免疫和获 得性免疫没有孰轻孰重，而是一脉相承的。 西南大学硕士毕业论文 1 2体液免疫的研究进展 1 2 1 病原相关分子 病原相关分子模式f p a m p s ) 是一类不以蛋白为主要组分的生物大分子，其并 不存在于宿主体内，它们代表的是一种分子模式，故称为病原体相关分子模式 ( p a t h o g e n a s s o e i a t e dm o l e c u l a r p a t t e m s ，p a m p s ) 。其主要包括脂多糖 ( 1 i p o p o l y s a c c h a r i d e s ，l p s ) 、肽聚糖( p e p t i d o g l y c a n , p g n ) 、脂磷壁( 1 i p o t e i c h o i ca c i d ) 、 葡聚糖和甘露聚糖( m a n n a n s ) 等。这些大分子对微生物的存活是必需的，因此微生 物不能通过改变病原相关分子模式( p a m p s ) 来避免被先天免疫系统识别。 肽聚糖( p e p t i d o g l y e a n , p g n ) 是由若干肽聚糖单体组成的一种网络状杂多糖。每 个p g n 单体由肽和聚糖两部分组成，其中的肽包括四肽链和肽间桥两部分，而聚 糖是由n 乙酰葡糖胺和n 乙酰胞壁酸两种单糖通过p 1 ，4 糖苷键相互间隔连接成 的长链。肽聚糖( p g n ) 为所有细菌所具有，特别是革兰氏阳性菌含量较高，约占细 胞干重的5 0 9 0 ；革兰氏阴性茵含量较低，约占细胞干重的1 0 ；真核生物不具 有该物质。肽桥的交互改变可以形成两种不同形式的肽聚糖，主要是根据肽链中 第三位氨基酸的不同组成，可将p g n 为两类：l 赖氨酸型和二氨基庚二酸型，前 者主要存在于革兰氏阳性菌中，后者主要存在于革兰氏阴性菌中。两种形式的肽 聚糖对果蝇的免疫激活是不同的，g 细菌中的二氨基庚二酸型p g n 能分别以聚合 体或单体的形式激活果蝇的i m d 途径( i m dp a t h w a y ) ；g 十细菌中l 赖氨酸型p g n 被果 蝇的识别受体识别，从而激活果蝇的t o l l 途径( t o l lp a t h w a y ) 。 脂多糖( 1 i p o p o l y s a c c h a r i d c s ，l p s ) ，具有复杂的分子结构，大小约i o k d a ，其能 激活多种先天免疫反应。脂多糖( l p s ) 的毒性与其l i p i d a 结构相关，其免疫原性由 p o l y s a c c h a r i d e 结构决定。 真核微生物的细胞壁中不含肽聚糖和脂多糖，其细胞壁的主要成分为葡聚糖 和甘露聚糖，其余则是蛋白质、氨基葡萄糖、磷酸、类脂和几丁质( n 乙酰氨基 葡萄糖聚合物) 。其中半知茵类丛梗霉科白僵菌属的白僵菌是自然界较为常见的真 菌，也是目前农业害虫防治上大量使用一种真菌。如家蚕白僵菌既是家蚕的主要 病原物，同时又可以感染多种昆虫。当白僵菌的分生孢子附着于宿主体壁时，在 适宜的温度湿度下发出数根芽管，并分泌几丁质酶等生物酶分解寄生部位的碳水 化合物和蛋白质，并借助芽管伸长时产生的机械压力，进入宿主体内，大量吸收 营养物质，快速生长产生芽生孢子。芽生孢子为单细胞结构，具有吸收和储藏营 养的作用，能自行生长形成新的营养茵丝。家蚕白僵菌具有隔膜能分支生长，其 上生有单生或簇生的分生孢子梗，孢子成熟后脱落、分散，寻找合适的宿主进行 二次寄生感染。 2 第一苹文献综述 皇量皇曼曼曼曼曼量曼量皇曼m mm m皇舅曼量 因为不同的病原体带有不同的病原模式分子( p a m p s ) ，先天免疫系统的进化也 向着识别病原模式分子的保守结构进行，产生了一套先天免疫识别受体分子来识 别姗s ，如肽聚糖识别蛋白、革兰氏阴性菌结合蛋白、葡聚糖结合蛋白、凝集 素、含硫脂蛋白和脊椎动物中的t o l l 样受体蛋白。只要这些病原模式分子具有相同 的保守性分子模式，通过这些模式识别分子，先天免疫系统能识别不同的病原模 式分子。另一方面，病原相关模式分子o ，a m p s ) 通常位于病原体生存所必需的保守 结构域中，它们逐步进化，成为一类或几类微生物所共有；而先天免疫系统的模 式识别受体( p a t t e r nr e c o g n i t i o nr e c e p t o r , p 砒u 则向着识别病原体的保守结构域进 化，以致病原模式分子( p a m p s ) 便成为了模式识别受体( p r r ) 的靶标。先天免疫系 统的这种进化策略和识别的模式机制，使得宿主有限的模式识别分子拥有了识别 不同病原体的病原模式分子( p a m p s ) 。不同病原体的病原模式分子( p a m p s ) - - g 被 先天免疫系统识别，相应的免疫信号通路便被激活，如l p s 、l t a 、脂阿拉伯甘聚 糖、葡聚糖分别代表革兰氏阴性菌、革兰氏阳性菌、分支杆菌和真菌的免疫激活 信号，从而激活各种先天免疫应答，如节结形成、细胞解毒作用、被囊的形成、 直接杀菌和吞噬作用等；同时还能激活各种不同的胞内信号传导途径，如i m d 、t o l l 和j n k - s t a t 途径，使免疫基因活化产生各种效应功能，产生抗微生物肽、活性氧、 活性氮直接杀死入侵物和诱导产生细胞因子、黏附分子参与早期防御应答反应。 1 2 2 模式识别受体 模式识别受体( p a t t e r n - r e c o g n i t i o nr e c e p t o r s ，p r r ) 是一类表达于先天免疫细胞 表面的可识别一种或者多种病原相关分子模式( p a t h o g e na s s o e i a t e dm o l e c u l a r p a t t e r n s ，雕山口s ) 的识别分子【叫。其主要生物学功能为：诱导吞噬作用，启动细胞 活化和炎症信号的传导。果蝇作为重要的实验模式生物，其先天性免疫相关研究 开展的较早，为其他昆虫的先天免疫研究奠定了基础。研究表明，果蝇具有以抗 微生物肽、抗病毒因子为主的多种抗菌活性因子，配合其血细胞的吞噬、凝结、 囊包等多种作用建立起一个开放的、完整的先天免疫防御体系 s l 。在果蝇天然免疫 系统中，体液免疫和细胞免疫都起始于对外源微生物特定组分中特定分子的识别， 因此模式识别受体( p r p s ) 在识别反应中发挥关键作用【9 1 2 1 。目前在哺乳类动物中发 现了多类模式识别受体，主要包括甘露聚糖结合凝集素( m b l ) ，巨噬细胞表面p r r ， 以及t o l l 样受体( t o l l 1 i k er e c e p t o r , t l r ) t 3 1 。而在果蝇相关研究中，以t o l l 样受体为 基础，研究表明了肽聚糖识别蛋白( p g r p ) 和革兰氏阴性细菌结合蛋i 刍( g n b p ) 为果 蝇的两类主要的模式识别受体【1 3 。1 4 】。 3 西南大学硕十毕业论文 1 2 3t o l l 样受体以及t o l l 传导途径 t o l l 样受体( t o l 卜1 i l r e c e p t o r ，t l r ) 是一类新近发现的p r r ，在天然免疫反 应中发挥着极其重要的作用。早在1 9 8 8 年就有学者发现果蝇的体内存在一种t o l l 蛋白，该蛋白不仅能够促进果蝇背腹极性的形成外，还可以被外源微生物诱导， 产生免疫相关应答【1 5 - 1 6 1 。随后，又在其他动物当中利用同样的方法发现了类似t o l l 样蛋白的受体，即命名为t l r s 。 1 2 3 1t l r 的分子生物学特征 在哺乳动物中，从1 9 9 7 年发现的第一个t l r s 以来，至今为止已经发现了l o 多 种不同的t l r s 和一系列的t l r 配体。t l r 主要表达于免疫细胞、淋巴细胞、巨噬 细胞等，这些t l 黜属于i 型跨膜受体，分为胞外区和胞内斟1 7 1 。胞外区富含一段亮 氨酸的重复序列，与保守的p a m p 配体结合。胞内区域同i l 1 受体相似，参与信号 传导途径。几乎所有的t l r s 均可单独或者共同识别多种配体，某些t l r 贝j j 需要依 赖辅助蛋白才能识别相应的配体【l 引。在果蝇中，目前已经鉴定出9 个编码t o l l 蛋白 的基n t l 9 1 ，研究也指出，其各自均有不同的功能。 t 0 l l 样蛋白在进化过程中相当保守，至今为止从昆虫、植物和哺乳动物中共 鉴定出约3 0 多种t o l l 样蛋白，其蛋白序列与果蝇t o l l 蛋白高度同源。结构域分析表 明，t o l l 样蛋白均含有保守的t o l l i l 1 r 胞内结构域，介导宿主免疫防御和炎症反 应【2 0 】。 1 2 3 2t l r 的生物学功能 t l r 最为重要的生物学功能即为激活宿主的天然免疫。t l r 识别外源微生物 及其特定的p a m p ，与其相应的配体结合后，即启动其胞内的信号传导途径，激活 n f r , b 转录因子，从而促进信号的传导以及下游多种生物学反应。在哺乳动物当 中，t o l l 样受体介导由革兰氏阴性或革兰氏阳性细菌壁的脂壁酸、肽聚糖、细菌 脂蛋白等引起的信号转导，并且激发免疫应答和炎症反应。例如t l r 4 ，在哺乳动 物中t l r 4 是最早被发现的一类t l r ，其在c d l 4 和m d 2 的协同作用下，与脂多 糖( l p s ) 相结合，随后募集下游蛋白m y d 8 8 作为连接蛋白与t l r 4 的t i r 结构域 结合，再由m y d 8 8 蛋白的死亡结构域( d e a t hd o m a i n ) 募集i l 1 r 相关激酶( i r a k ) ， 催化i r a k 磷酸化( 图1 1 ) ，经由信号分子肿瘤坏死因子受体相关因子6 ( t r a f 6 ) 、 p 转化生长因子激活的蛋白激酶( t a k l ) 、t a k l 结合蛋白l 和2 ( t a b l ，t a b 2 ) 进入 下游信号转导，随后经i - r b 激酶i k k 磷酸化激活n f 1 出，并启动n f r b 依赖的先 天免疫基因的表达。或经j n k s a p k 、p 3 8 等诱导炎症细胞因子、干扰素( i n t e r f e r o n ， i v n ) 等基因的表达刚( 图1 2 ) 。 4 第一章文献综述 鼍量置曹量量一 懈 图i 1 t 吞噬细胞表面l p s 识别过程 r i s1 1 黜团i 妇o f l p s 加i h es u r f a c eo f p h a g o c y 虹 在果蝇中，与脊椎类动物t l r s 不同，t 0 n 蛋白并不直接行使模式识别受体 ( e r r s ) 相关功能，而是通过肽聚糖识别蛋o ( e o r p ) 和革兰氏阴性菌结合蛋白 ( g n b p ) 等进行外源微生物p a m p s 的识别网。在识别到p a m p 后激活丝氨酸蛋白 酶( s p ) 的活性，剪切s p a t z l e 蛋白前体形成成熟s p t t z l e 蛋白( 结构上类似于神经生长 因子，n e r v eg r o w t hf a c t o r ) 2 3 彩】。成熟的s p a ( a l e 蛋白为果蝇t o l l 蛋白的特异性配 基，其与t o l l 蛋白结合后激活t o l l 蛋白并且通过t o l l 蛋白的t i r 结构域募集下游 d m y d 8 8 2 6 。随后在细胞膜内d m y d 8 8 蛋白通过死亡结构域( d d ) 与t u b e 、p e u e 相 互结合，形成复合物，并激活p e l l e 蛋白【2 7 2 羽。激活的p e l l e 蛋白催化h b 样蛋白 c a c t u s 磷酸化并降解，使下游n f r , b 样蛋白d o r s a l 和d i f 解除抑制，从而启动免 疫相关基因的转录，如抗菌肽( a n t i m i c r o b i a lp e p t i d e s , a m p s ) 基因的转录( 图 1 2 ) 【删。 5 两南大学硕卜毕业论文 v e r t e b r a t e s d r o s o p h i l a 1硼-i瞅e嘣mo曙toe 1 8 w h - 叮 塞 _u 一一 一一 一一 一 一 茎 一一 一 一一 一一 一一 一 一一 m e m b r a n e 墓 一 一 一一 芒 巴 m i l l j l l l i i i i j l i i i l j i l i i i j i ；i 五l l ，l j ：l i l l l l l | l i l i l l l l l j ! il i a i i i i i i i i i i 1 1 rd o m a i n 目鼠一面日 口口 l 芝毋瑚一r ： 一l i i夕l 书m i e k a e e e e 墨京言 点镏点彳一一 图1 2 脊推动物和果蝇中由t l r s 介导的信号通路 f i g1 2s i g n d l i n gp a t h w a y sa c t i v a t c db yt l r si nv e r t e b r a t e sa n dd r o s o p h i l a 1 2 3 3 m y d 8 8 是t l r 传导通路中重要的接头分子 髓样分化因子8 8 ( m y e l o i dd i f f e r e n t i a t i o nf a c t o r8 8 ，m y d 8 8 ) 依赖性信号转导途 径是t l r 信号传导的共同通路 3 1 - 3 3 j ，现有资料表明，t l r 2 ，4 ，5 ，7 ，9 的信号 传导过程均依赖m y d s 8 蛋白( 除t l r 3 外) 聊l 。在m y d 8 8 基因敲除鼠实验中，敲除 鼠几乎不受到l p s 的诱导，腹腔注射l p s 后，血清中的i l 6 ，t n f - a 均未上调， 而野生型的老鼠则受到l p s 的诱导，并且在9 6 小时内死亡。由此推证，m y d 8 8 在l p s 活化通路中起到了重要的作用【3 5 讲】。 人类的m y d 8 8 蛋白含有3 个区域：n 端的死亡结构域( d d ) ，c 端的t i r 结构 域，以及中间部分区域。相对分子量大小为3 5 k d a 。d d 区 其结构域是细胞凋亡信号传导途径上接头分子的特征结构， 6 第一荦文献综述 _ ii i p li iii i 下游同样含有d d 的丝氨酸苏氨酸蛋白激酶( s e r i n et h r e o n i n ep r o t e i nl d r 删s c ) l r a k ， 招募过程导致i r a k 自身磷酸化并且与下游肿瘤坏死因子受体相关因子6 ( t u m o r n e c r o s i sf a c t o rr o c e p t o r - a s s o c i a t e df a c t o r , t r a f 6 ) 相结合，从而完成信号的向下传递 【3 8 1 。t i r 结构域约有1 3 0 个氨基酸，m y d 8 8 通过t i r s 结构域被活化的t o l l 或i l i r s 招募，完成信号向胞内的传递 3 9 - 4 。 果蝇与人类的m y d 8 8 有很显著的保守性，在功能结构区域上，果蝇d m y d 8 8 也含有死亡结构域和t i r 结构域。略有不同的是，果蝇d m y d 8 8 的死亡结构域有 8 1 个氨基酸，而t i r 结构域含有1 6 2 个氨基酸。实验表明，通过转染d m y d 8 8 至 昆虫s 2 细胞系，检测下游抗菌肽基因的诱导表达，证明d m y d 8 8 是t o l l 通路上的 关键点。并且通过构建片段缺失转染载体，检测下游报告基因的表达，证明d m y d 8 8 位于t o l l 蛋白的下游，p e l l e 的上方 2 9 1 。因此在果蝇免疫信号传导过程中，活化的 t o l l 受体同样利用t i r 结构域完成了与接头分子d m y d 8 8 连接，而d m y d 8 8 又通 过d d - d d 的结合方式，形成了d m y d 8 8 t u b e p e l l e 三聚体的形式，完成了信号由 模式识别受体到胞内传导的过程。 进一步的通过晶体解析等技术手段，推测出在三聚体形成的过程中，d m y d 8 8 通过d d 只与t u b e 发生结合，而不存在d m y d