（生物化学与分子生物学专业论文）单修饰聚乙二醇化胰岛素的研究.pdf

摘要 摘要 以猪胰岛素为模型药物，研究了p e g 一醛修饰胰岛素的技术，以及不同修饰度和 不同分子量p e g 化胰岛素的物理化学性质和生物活性。 1p e g 的活化 采用d m s o 氧化法与溴代物取代法对单甲氧基聚乙二醇( m p e g 2 0 0 0 与 m p e g 5 0 0 0 ) 进行活化，制备了m p e g 2 0 0 0 醛与m p e g 5 0 0 0 一醛。s c l l i f f 法测定p e g 醛基衍生物的活化率，显示d m s o 氧化法制得的m p e g 5 0 0 0 一醛为4 0 0 o , - - 7 0 ，溴代 物取代法可以使端基活化率达到8 0 。m p e g 5 0 0 0 的红外光谱具有1 6 9 0c n l 1 ( 醛 羰基) 特征峰，核磁共振分析结果也表明m p e g 2 0 0 0 一醛与m p e g 5 0 0 0 醛均具备各 自的特征基团。 2p e g 化胰岛素的制备 采用合成的m p e g 2 0 0 0 一醛和m p e g 5 0 0 0 醛对胰岛素进行修饰。以m p e g 5 0 0 0 - 醛为例，通过三硝基苯磺酸( t n b s ) 比色法分析p e g 化胰岛素混合物的平均修饰 程度，非还原s d s p a g e 鉴别联结不同数目p e g 链的胰岛素组分，以反相液相色 谱( r p h p l c ) 考察p e g 化胰岛素的组分分布情况，分别研究了反应溶剂p h 值、 原料配比和反应时间对胰岛素p h e b l 位点p e g 化合成的影响，确定了本文胰岛素 p h e b l 位点p e g 化的合成工艺：将适量胰岛素溶解于0 0 2 m o l l 。1 含n a c l 0 2 m p h 4 0 的乙酸盐缓冲液，制得浓度为1 0m g m 1 1 的胰岛素溶液。按照胰岛素m p e g - 醛为 1 ：2 ( m o l m 0 1 ) 的配比投入m p e g 醛粉末，室温下搅拌反应8h 。加入相当于 m p e g 5 0 0 0 一醛2 0 倍摩尔量的甘氨酸或6 氨基正己酸终止反应。反应混合液进行彻 底的透析，冷冻干燥，制得p e g 化胰岛素混合物。 比较了c m 与s p 两种s e p h a r o s e 阳离子交换色谱对p e g 化胰岛素的分离效果， 结果显示s p 阳离子交换色谱具有较大的总交换容量和更高的分离度。选择s p s e p h a r o s e 阳离子交换色谱来分离纯化p e g 化胰岛素，得到两种不同修饰度的p e g 化胰岛素。所得m p 逐适坠幽u l i l l 、2 m p e g 2 k - i n s u l i n 、m p e g 5 k - i n s u l i n 和 2 m p e g - i n s u l i n 的纯度经r p - h p l c 检测均在9 0 以上。 3p e g 化胰岛素的表征及生物活性研究 m a l d i t o fm s 测得的四种单、双修饰p e g 化胰岛素的分子量与理论分子量 相符。m a l d i - t o fm s 对肽段的分析证明p e g 一醛修饰所得单p e g 化胰岛素修饰位 点为p h e b l 。 p e g 化胰岛素的圆二色谱分析结果表明，胰岛素的p e g 化不会对胰岛素的高 摘要 级结构造成显著影响。p e g 化胰岛素的自缔合受到一定程度的抑制，而且抑制作用 随p e g 化程度的提高而增强。 采用加速振荡实验研究了胰岛素和四种p e g 化胰岛素的纤维化反应。在3 7 0 c ， 2 0 0r p m 的加速振荡条件下，胰岛素分子发生纤维化反应，在1 2h 内基本沉淀完全。 胰岛素p e g 化后，纤维化反应受到抑制。p h e - p e g 2 k - i n s u l i n 到1 6 h 完全沉淀： p h e - p e g 5 k - i n s u l i n l 0 天时溶液中样品含量还有一半以上； 2 p e g 2 k - i 璐u l i n 和 2 p e g 5 k - i n s u l i n 经过加速振荡1 0 天溶液中样品含量仍保持在初始值的9 5 以上，抗 纤维化作用远大于胰岛素和单p e g 化胰岛素。 胰蛋白酶和糜蛋白酶对胰岛素和四种p e g 化胰岛素的体外酶解试验表明，胰岛 素的p e g 化能够在一定程度上抑制两种蛋白酶对胰岛素的降解，而且抑制的程度随 p e g 的分子量或数目的增加而提高。 比较了正常小鼠皮下注射( o 5u k 9 1 ) 胰岛素和p e g 化胰岛素的降血糖作用。 胰岛素给药后3 0m i l l 左右血糖降至低谷，为初始值的2 6 左右；给药后3h ，血糖 回复到初始值的9 0 0 6 以上。p h e b l 一p e g 2 k - i n s u l i n 给药后0 5 到1 小时间血糖降至低 谷，为初始值的3 5 左右；给药后5 小时左右，血糖回复到初始值的9 0 以上。 p h e b l p e g 5 k - i n s u l i n 给药后9 0m i n 左右血糖降至低谷，为初始值的4 8 左右；4h 左右血糖回复到初始水平的9 0 0 , 6 以上。2 p e g 2 k i l l s l l l i i l 给药后1h 左右血糖降至低 谷，约为初始值的6 6 ；5h 左右血糖回复到初始水平。2 p e g 5 k - i n s u l i n 给药后2h 左右血糖降至低谷，为初始值的7 0 左右；到6h 血糖回复到初始水平。以胰岛素 为基准，通过比较各给药组降血糖曲线上面积，计算得p h e b l - p _ _ _ e g 2 k - 妣 p h e b l 一p e g 5 k - i n s u l i n ，2 p e g 2 k - i n s u l i n 和2 p e g 5 k - i n s u l i n 的降血糖生物活性分别为 - - h - _ 天然胰岛素的1 5 6 3 ，9 1 7 ，4 0 0 和5 6 9 。 对胰岛素p h e b l 位点的p e g 化修饰在不影响胰岛素生物活性的前提下，能够 抑制胰岛素单体的自缔合，提高胰岛素的物理稳定性和抵抗蛋白酶降解的能力，延 长胰岛素体内降血糖作用的时间，倘若结合新型的口服给药系统有希望开发出胰岛 素的口服制剂。 关键词：胰岛素；聚乙二醇；聚乙二醇的活化；聚乙二醇化；分离纯化；物理稳定 性；纤维化；蛋白酶抑制 中图分类号：q 5 9 5 a b s t r a c t a b s t r a c t i n s u l i nw a sc h o s e na sam o d e ld r u gf o rt h es t u d yo fp e g y l a t i o no fp r o t e i nd r u g s t h e p h y s i c o c h e m i c a l p r o p e r t i e s a n d b i o a c t i v i t y o f p e g y l a t e d i n s u l i n w e r es t u d i e d 1a c t i v a t i o no fp e g m o n o m e t h o x y - p o l y ( e t h y l e n eg l y c 0 1 ) 5 0 0 0a n d2 0 0 0 ( m p e g 5 0 0 0a n dm p e g 2 0 0 0 ) w o r ea c t i v a t e dt op r o d u c em p e g - a l d e h y d eb yt w od i f f e r e n tm e t h o d s t h er e s u l t so f s c h i f f t e s ts h o w e dt h ea c t i v i 哆d e g r e eo f m p e g - a l d e h y d e b y t h ed m s o - a c e t i c a n h y d r i d e o x i d a t i o nm e t h o dr a n g e df r o m4 0 t o7 0 a n dt h a tb yt h eb r o m o a c e t a l d e h y d ed i e t h y l a c e t a lm e t h o dr e a c h e d8 0 t h ec h a r a c t e r i s t i ca b s o r p t i o nb a n da t1 6 9 0c i n - ( a l d e h y d e c a r b o n y l ) o ft h ei n f r a r e ds p e c t r u mo fm p e g 5 0 0 0 - a l d e h y d ei n d i c a t e d e x i s t e n c eo f a l d e h y d eg r o u p t h e1 h - n m ra n a l y s i sd e m o n s t r a t e dt h a te a c hm p e gd e r i v a t i v ew a s s u c c e s s f u l l ys y n t h e s i z e d 2p r e p a r a t i o no fp e g y l a t e di n s u f l n m p e g 2 0 0 0 a l d e h y d ea n dm p e g 5 0 0 0 - a l d e h y d ew e r eu s e dt om o d i f yi n s u l i n t a k e n m p e g 5 0 0 0 一a l d e h y d e a sa l l e x a m p l e ，e f f e c t so fp hv a l u e ，i n i t i a lm o l a rr a t i o o f m p e g - - a l d e h y d et oi n s u l i na n dr e a c t i o nt i m eo ns y n t h e s i so fm o n o - p e g y l a t e di n s u l i n w e r ei n v e s t i g a t e d 砸t ht n b s ( 2 ，4 ，6 - t r i n i t r o b e n z e n e s u l f o n i ca c i d ) s p e c t r o m e t r y , s d s p a g ea n dr p h p l ca n a l y s i s t h eo p t i m i z e dc o n d i t i o nf o rm o n o p e g y l a t i o nw a s p h4 0 ，m o l a rr a t i oo f2 ：1 ( m p e g - a l d e h y d e ：i n s u l i n ) a n dr e a c t i o nt i m eo f8h o u r s t h e c o n t e n to fm o n o p e g y l a t e di n s u l i ni nt h ep r o d u c tr e a c h e da p p r o x i m a t e l y9 0 m o n o - a n dd i - p e g y l a t e di n s u l i nw e r es e p a r a t e db yc ma n ds ps e p h a r o s ec a t i o ne x c h a n g e c h r o m a t o g r a p h y t h ec o n t e n to fe a c hc o m p o n e n tw a sa n a l y z e db yr p h p l c s p s e p h a r o s ec a t i o ne x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h yw a sc h o s e nf o rs e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o no f p e g y l a t e di n s u l i na si ts h o w e dl a r g ev o l u m ec a p a c i t ya n dg o o dr e s o l u t i o n 3c h a r a c t e r i z a t i o no fp e g y l a t e di n s u f l na n di nv i v os t u d y m a t r i xa s s i s t a n tl a s e r d e s o r p t i o n i o n i z a t i o n - t i m eo f f l i g h t m a s s s p e c t r a ( m a l d i - t o fm s ) d e m o n s t r a t e dt h a tt h em o l e c u l a rw h e i g h t so f a l lc o n j u g a t e sc o i n c i d e d w i t ht h e i rt h e o r e t i c a lv o l u m e s t h em o d i f i c a t i o ns i t eo fm o n o - p e g y l a t e di n s u l i nw a s c o n f i r m e dt ob ep h e b lt h r o u g ha n a l y s i so f p e p t i d ef r a c t i o n c i r c u l a rd i c h r o i s m ( c d ) s p e c t r aa n a l y s i so f p e g y l a t e di n s u l i nd e m o n s t r a t e dt h a tt h e a t t a c h m e n to f p e gt oi n s u l i nd i dn o ta l t e rt h et e r t i a r ys t r u c t u r eo f c o n j u g a t e sa sc o m p a r e d a b r e a c t t on a t i v ei n s u l i n t h es e l f - a s s o c i a t i o no fi n s u l i nw a si n h i b i t e da f t e rb e i n gp e g y l a t e da n d t h ei n h i b i t i o nc o r r e l a t e dw i t ht h ed e g r e eo fp e g y l a t i o n t h ep h y s i c a ls t a b i l i t yo fi n s u l i na n df o u rs p e c i e so fp e g y l a t e di n s u l i nw e r es t u d i e d w i t ha c c e l e r a t e ds h a k et e s ta tt h es h a k i n gs p e e do f2 0 0r p ma n da t3 7o c 1 1 ”f i b r i l l a t i o n o fi n s u l i nw a si n h i b i t e da f t e r b e i n gp e g y l a t e d i t t o o k4m o r eh o u r sf o r p h e - p e g 2 k - i n s u l i nt op r e c i p i t a t et o t a l l yt h a ni n s u l i na n dt h ep h y s i c a ls t a b i l i t yo f p h e p e g 5 k i 璐l l l i na n dd i p e g y l a t e di n s u l i nw e r eg r e a t l ye n h a n c e d 皿ei nv i t r oe n z y m o l y s i se x p e r i m e n ts h o w e dt h a tt h ed e g r a d a t i o no fi n s u l i nb y t r y p s i na n dc h y m o t r y p s i nc o u l db ei n h i b i t e dt h r o u g hp e g y l a t i o n , a n dt h ei n h i b i t i o n c o r r e l a t e dw i mt h ed e g r e eo f p e g y l a t i o n t h eb i o a c t i v i t yo fp e g y l a t e di n s u l i nw a sc o m p a r e dw i t hi n s u l i na f t e rs u b c u t a n e o u s i n j e c t i o n ( o 5u k 9 1 ) i nn o r m a lm i c e t h em i c ea d m i n i s t e r e dp e g y l a t e di n s u l i n d e m o n s t r a t e dp r o l o n g e dt i m eo fb l o o dg l u c o s ed e p r e s s i o n u s i n gi n s u l i na sas t a n d a r d , t h eg l y c a e m i ce f f e c t so fp h e p e g 2 k - i n s u l i n , p h e - p e g 5 k - i n s u l i n , 2 p e g 2 k - i 船u l i na n d 2 p e g 5 k - i n s u l i nw e r ec a l c u l a t e db yc o m p a r i n gt h ea a co fs e l b i ng l u c o s el e v e l - t i m e c o n l l d ec u r v eo f5h w h i c hw e r e1 5 6 3 ，9 1 7 ，4 0 o a n d5 6 9 o fn a t i v ei n s u l i n r e s p e c t i v e l y p h e b l p e g - - i n s u l i ns h e w e dr e d u c e dt e n d e n c yo fs e l f - a s s o c i a t i o n , i n c r e a s e dp h y s i c a l s t a b i l i t y , e n h a n c e dr e s i s t a n c et op r o t e o l y s i st h a nn a t i v ei n s u l i n ，a n dh i g h e rb i o a c t i v i t y t h a nd i - p e g y l a t e di n s u l i n t h ep r o n o u n c e dp r o p e r t i e ss h o w e di t sp o t e n t i a lf o ro r a l a d m i n i s t r a t i o n k e y w o r d s ：i n s u l i n ；p o l y ( e t h y l e n eg l y c 0 1 ) ( p e g ) ；a c t i v a t i o no fp e g ；p e g y l a t i o n ； s e p a r a t i o na n dp u r i f i c a t i o n ；p h y s i c a ls t a b i l i t y ；f i b r i l l a t i o n ；即z y m ei n h i b i t i o n c l cn u m b e r ：q 5 9 s 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究i 作及取得的研究成果。论文中除 ，特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或其它机构已经发表或撰写过的 研究成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中作了明确的声明 并表示了谢意。 作者签名 论文使用授权声明 h 期 本人完全了解复旦大学有关保斟、使用学位论文的规定，即：学校有权保留 送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内 容，可以采罔影印、缩印或其它复制手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 作者签名导师签名日期： 前言 丽茜 蛋白质与多肽娄药物应用辟存在以千何题一生物活性易被酶解破坏；体内停留 时间短；易引发免疫反应；稳定性差不能长期贮存。为解决这些问题国内外学者作 出了一些尝试，如将蛋白质包裹在不溶性基质、纳米粒或脂质体中l l - 6 】，也有将生 物大分子或聚合物连接到蛋白质上【7 ，8 】。目前较为成功的是在蛋白质上共价结合水溶 性聚乙二醇，也就是“p e g 化! 。 将高聚物分子接枝到蛋白质分子上的技术是在五十年代通过定向化学修饰研究 蛋白质结构与功能的基础上发展起来的，这些研究导致被称为 g e n t l ec h e m i s t r y 的 蛋白质操控技术的产生。7 0 年代另一重大发现就是酶可以共价结合到不溶性的基质 上用于生物催化应用。诸如此类的研究使人们知道复杂的蛋白质分子在合适的条件 下可以像普通化学物质一样加工。一些大分子量物质，如多聚糖和白蛋白，被共价 接枝到蛋白质上，主要用来稳定蛋白质以抵抗水解并且延长在体内的停留时间。2 0 世纪7 0 年代末r u t g e r s 大学的f r a n kd a v i s 教授【9 ，1 0 】最先研究了蛋白质的p e g 化， 从而在改善蛋白质和多肽的药物动力学性质上有了突破。 p e g 具有一系歹试点，包括无毒、无免疫原性和抗原性，生物相容性好，可溶 于水和多种有机溶剂，因此在多种不同药物制剂包括注射用、局部外用、直肠用和 鼻腔内给药的产品以及在食品和化妆品中用做载体或基质。蛋白质或多肽在适当的 位点连接p e g 后可以改善其药学和生物学性质1 1 1 ”】：( 1 ) 降低或消除毒性、免疫性 和抗原性；( 2 ) 提高溶解度；( 3 ) 降低。肾脏清除速率；( 4 ) 增强抗酶解能力；( 5 ) 提高物理稳定性；( 6 ) 改善药物体内分布和动力学行为。蛋白质或多肽连接的p e g 链数目，p e g 的分子量及分子结构，p e g 化的修饰位点和连接所采用的化学方法【1 6 】 都是影响p e g 化蛋白质或多肽活性及理化性质的因素。目前已经有p e g 化蛋白质 和多肽类药物被美国食品和药品管理局( f d a ) 批准上市( 见表1 ) 。 1 p e g 的性质 将p e g 连接到蛋白质或多肽上，两者必须具备可以相互反应的基团。蛋白质或 多肽上可以反应的基团通常有巯基、q 氨基、一氨基、羧基和羟基。p e g 末端的 醇羟基化学性质不活泼，需要用具有反应活性的基团取代后才能与蛋白质多肽上的 活性基团反应【1 5 m 】。一些蛋白质多肽的巯基和羧基涉及活性位点而羟基反应活性较 低都不适合连接p e g ，因此常见的p e g 末端活性基团都是针对d 氨基或氨基设 计的1 1 8 - 2 2 。为了避免在修饰过程中发生交联反应，通常采用单甲氧基聚乙二醇 ( m p e g ) 作为修饰剂。 前言 a d a g e n o n c a s p a r p e g 巧汀r o n n e u l a s t a p e g a s y s p e g v i s o m a n t 腺苷酸脱氨酸( a d a ) 左旋门冬酰胺酶( l - a s p a r a g i n a s e ) a 干扰素2 b ( a i f n 2 b ) 粒细胞刺激因子( g - c s f ) a 干扰素2 a ( a i f n - 2 a ) 人生长激素拮抗剂h g ha n t a g o n i s t 腺苷酸脱氨酸缺乏- 严重联合免 疫缺陷症( a d a s c ) 白血病( a i 工) 丙型肝炎( h c v ) 癌症治疗中白细胞降低时使用 升血药物 丙型肝炎、慢性乙肝 肢端肥大症( a c r o m e g a l y ) m a n g e n 血管内皮生长因子拮抗剂a 埘- g f 视网膜老年黄斑病变( a m d ) a p t a m e r 利用阴离子亲核攻击引发环氧乙烷( e 0 ) 进行开环聚合可以得到p e g 。目前报 道的引发剂有烷氧基类、碱金属盐、萘基碱金属盐以及丙烯酰胺碱金属等 2 3 - 2 7 1 。用 甲氧基引发e o 聚合可得到单甲氧基p e g ，聚合时若不除尽水会产生大量p e g 二醇。 解决二元醇杂质的方法有：将含二元醇的粗制苄氧基一p e g 甲基化后再水解除去苄 基b z ( 二元醇p e g 转化为惰性的二甲基p e g ) ；或将p e g 羧化后用离子交换柱提 纯单羧酸p e g ”j 。 p e g 可以溶于水和多种有机溶剂，其末端活化和与蛋白质的接枝反应可在较温 和的条件下进行。由于p e g 链骨架柔韧并结合大量水( 每个烷氧基单元可以结合2 3 个水分子) ，p e g 体积可达到同等质量蛋白质的l o 僻，因此可以在其被修饰蛋 白质或多肽分子表面形成保护，降低免疫原性和抗原性，抑制细胞和酶的降解作用。 文献f 2 8 】报道了通过p e g 的代谢途径研究p e g 的安全性。分子量低于4 0 0 的p e g 在 体内依次经乙醇脱氢酶和乙醛脱氢酶氧化形成有毒的二酸或过氧化氢代谢物，随 p e g 分子量上升，氧化率下降。分子量较大的p e g ( 1 0 0 0d a 以上) 不通过该途径 代谢，其安全性经过了多年的应用得以检验。大分子量p e g 被完整的排出体外，其 体内清除速率取决于分子量的大j 、 2 9 , 姗，低于2 0 0 0 0d a 的p e g 经过尿液排出而高 于2 0 0 0 0d a 的p e g 较慢地通过尿液和粪便排出。 2 p e g 化学 经过几十年研究应用，p e g 修饰剂从第一代发展到了第二代【”。第一代p e g 修饰剂的缺点是：接枝的分子量较低( 高分子量m p e g 中二醇含量高，约1 5 ) ；双 官能团p e g 杂质引起交联和团聚；连接键的水解稳定性差；低选择性和副反应的存 在。m p e g 琥珀酸基琥珀酯( m p e g - s s ) ，m p e g 琥珀酸基碳酸酯( m p e g s o ) ，m p e g 2 前言 三氟乙基磺酸酯，m p e g 二氯三嗪等都属于第一代修饰剂。m p e g s s 与蛋白质多肽 的连接骨架上存在酯键使修饰产物容易水解，并在蛋白质上残留额外基团( h e a d g r o u p ) 造成免疫原性；m p e g s c 会与组氨酸残基上的咪唑环结合产生水解不稳定 的尿烷；m p e g 三氟乙基磺酸酯在与小分子胺反应时生成的副产物具有可降解的磺 酰胺键；m p e g 二氯三嗪选择性差可以与众多氨基酸残基如赖氨酸、丝氨酸、酪氨 酸、半胱氨酸和组氨酸反应，末端活性基团的两个氯原子若同时发生取代反应会造 成蛋白质交联。 第二代p e g 修饰剂解决了第一代存在的问题，避免了二元醇的干扰，出现较大 分子量的p e g 并且具有较高的均一性，通过温和的反应条件获得较稳定的连接键， 副反应减少而对修饰位点有较高的选择性。第二代p e g 修饰剂中常见的m p e g 一丙 醛在酸性条件下对n 端n 氨基有高度选择性 3 1 - 3 5 。研究者也设计出针对巯基修饰的 p e g 修饰剂【1 6 ，2 1 ，排3 7 】：p e g m a l ( 马来酰亚胺) ，p e g v s ( 乙烯基砜) ，p e g i a ( 碘 代乙醛胺) ，i i l p e g 旬p s s ( 二硫正吡啶) 。糖残基、n 端s e r 或t h r 可用如葡萄糖 氧化酶、高碘酸钠等氧化，产生大量可反应的醛基与p e g 肼生成腙键或与p e g - 胺 生成可逆的s c h i f f 碱，再由氰基硼氢化钠使腙键还原成稳定的肼键，s c h i f f 碱还原 成亚胺。 随着p e g 化技术的发展，p e g 不仅被用来修饰蛋白质和多肽，p e g 化已经扩 展到小分子药物、水凝胶、脂质体和纳米粒等诸多方向f 3 8 - 4 t 。出现了新型p e g 修饰 剂，如连接键可降解的p e g f 4 3 1 ，新型多功能聚合物【8 , 4 4 和分支型p e g 4 3 , 4 5 - 4 6 等。 p e g 化反应也出现了利用酶催化提高反应效率增加修饰选择性的方法【4 ”。目前除了 已经成功上市的p e g 化药物，对a 肿瘤坏死因子、红细胞生成素、紫杉醇等多种药 物的p e g 化正在研究之中。 3 胰岛素的p e g 化 胰岛素用于治疗i 型糖尿病已经有8 0 多年历史，但是还存在以下问题：消化道 酶屏障和上皮屏障使得胰岛素口服给药吸收差：肾脏的快速清除和体内蛋白酶的作 用导致糖尿病人需要频繁注射胰岛素，而长期反复注射会引起体内产生抗体，甚至 引起过敏和胰岛素抵抗嗍；外源的胰岛素会引起免疫反应；胰岛素六聚体化会导致 起效滞后；纤维化作用【4 8 】使胰岛素制剂缺乏稳定性并降低其活性。 一些方法被尝试用来解决以上问题，如m y e r s 等p 悯脂肪酸对胰岛素进行修饰， k i m 等 4 8 4 0 用m p e g 对胰岛素进行修饰，c a l e e t i 等【5 l 】利用p e g 化胰岛素结合聚丙 烯酸半胱氨酸材料制成具有粘膜粘附性的片剂，而m o r i s h i t a 等人 5 2 j 开发出基于水 凝胶的胰岛素给药系统。p e g 化可以提高胰岛素稳定性，增加其抵抗酶解的能力， 前言 消除其免疫原性和抗原性，并降低肾脏清除速率、延长体循环时间。图l 为人胰岛 素基本结构，猪和牛胰岛素结构与人胰岛素基本一致，仅有一到两个氨基酸的差异。 胰岛素单体相对分子量约5 8 0 0 ，具有三个游离氨基，分别为a l 位g l y ，b i 位p h e ， b 2 9 位l y s 。当a l 位和b 2 9 位被修饰后，胰岛索活性会部分丧失或者不能显著改 善胰岛素的物理化学性质，而用较大分子修饰胰岛素也会因为空间位阻效应降低其 作用效果【4 ”0 1 。因此k i m 等f 5 0 】研究了胰岛素的定位修饰技术，但其方法比较复杂， 其中多步反应要在有机溶剂中进行，且原材料成本也较高，这些缺陷都制约了该方 法的实际应用。 嚣嚆訾 。鼬k ：州 甲文腻n11eoe-k翌ofhaln 州 引 5 嬲墨嗽 ”醺觎酱 嘲抽：矿”b 2 嗲州 图1 人胰岛素基本结构 ( k e n n e t h d h a n dk i msw ，a d v d r u gd e l i v e r r e v ，2 0 0 2 ，5 4 ：5 0 5 - 5 3 0 ) h a r r i s 等1 ，3 1 , 5 3 - 5 4 开发出以醛基和丙醛基为活性基团的m p e g ，为简化p e g 化蛋 白质的制备流程以及提高p e g 化蛋白质的稳定性提供了可能。文献【5 ”7 】报道了利用 p e g 醛基衍生物进行p e g 化的研究，其中包括k i n s t l e r 等【3 2 - 3 5 提出利用m p e g 醛对 p k a 较低的蛋白质n 端氨基具有选择性的特点，进行定位修饰并成功制备了n 末端单 修饰p e g 化r h g c s f 。因此考虑利用m p e g 醛选择性修饰胰岛素n 端，可以避免对b 2 9 位l y s 的修饰，但胰岛素具有a ，b 两条肽链，要获得仅修饰b 1 位的p e g 化胰岛素就 要限* 0 m p e g 醛对a 1 位的修饰。 本文以猪胰岛素为模型药物，尝试通过选择合适的反应条件，用p e g 醛修饰胰 岛素，再对所得产物进行分离纯化得到具有较好物理化学性质及较高生物活性的单 修饰聚乙二醇化胰岛素。为此，采用合成的m p e g 2 0 0 0 醛与m p e g 5 0 0 0 醛来修饰 胰岛素，并对反应条件进行优化，由此获得了以单修饰为主的p e g 化胰岛素混合物。 采用离子交换层析将p e g 化胰岛素混合物分离得到单、双修饰的p e g 化胰岛素单 4 前言 组分。对四种p e g 化胰岛素的分子量、光谱学性质，体外稳定性进行了研究，并比 较了小鼠皮下注射四种p e g 化胰岛素溶液的降血糖作用。 5 第一部分聚乙二醇的醛化 第一部分聚乙二醇的醛化 第一代p e g 修饰剂主要有：m p e g 琥珀酸基琥珀酯( m p e g s s ) ，n l p e g 琥珀 酸基碳酸酯( m p e g s c ) ，m p e g 三氟乙基磺酸酯，m p e g 三氯三嗪等。这类p e g 修饰剂在应用中存在诸多缺点，如：接枝的分子量较低，高分子量r n p e g 中二酵含 量高；双官能团p e g 杂质引起交联和团聚：连接键的水解稳定性差；低选择性和副 反应的存在；p e g 与蛋白质多以酰胺键连接，但修饰剂骨架上酯键的存在使修饰剂 容易水解，水解后在蛋白质上留下小分子基团易造成免疫原性。 第二代p e g 修饰剂较好的解决了第一代存在的问题，其中常用的是m p e g 醛 类衍生物。在接近p h5 的酸性条件下，醛类对n 端n 氨基有高度选择性。因为对 比于其他亲核试剂n 氨基有较低p k a ，亲电的p e g 连接到蛋白质上取决于各氨基 酸的亲核性，亲核攻击只在溶液p h 值接近或高于残基p k a 值时发生，由此醛基通 过s c h i f f 碱还原形成稳定的仲氨键将p e g 接枝到蛋白质上【1 6 ”l 。乙醛基在浓缩时易 发生羟醛缩合生成二聚体，而m p e g - 乙缩醛具有较好的稳定性并可获得较高的纯 度。本研究选择m p e g 醛作为p e g 化试剂，通过d m s o 氧化法和溴代物取代法【5 ”1 制各了两种分子量的1 1 1 p e g 一醛，并对产物的理化性质进行了分析。 1 材料与仪器 试剂： 单甲氧基聚乙二醇( 平均分子量2 0 0 0 或5 0 0 0 ，m p e g 2 0 0 0 或m p e g 5 0 0 0 ，s i g m a ， 美国) ；溴代乙醛缩二乙醇( 分子量1 9 7 0 8 ，f l u k a ，美国) ；二甲基亚砜( d m s o ， a r ，上海凌峰化学试剂有限公司) ：醋酸酐( a r ，国药集团化学试剂有限公司) ； n a h ( 分散在矿物油中，含量6 0 ，r o h m & h a s s ，美国) ；n a b h 3 c n ( r o h m h a s s ) 甲苯( a r ，上海菲达工贸有限公司) ；正己烷( a r ，上海菲达工贸有限公司) ；四 氢呋喃( t h f ，a r ，上海凌峰化学试剂有限公司) ；二氯甲烷( d c m ，a r ，) ；无水 乙醚( a r ，上海马陆制药厂) ；无水硫酸钠( 上海文曼生化科技有限公司) ；磷酸( a r ， 上海善普化工科技有限公司) ；盐酸( a r ，太仓直塘化工有限公司) ；氢化钙( c a h ， 中国医药集团上海化学试剂公司) ；金属钠( 化学纯，上海华东师范大学化工厂) ； 五氧化二磷( a r ，上海凌峰化学试剂有限公司) ；副品红( 生物染色剂，上海三爱 思试剂有限公司) ；亚硫酸氢钠( n a h s 0 3 ，上海试四赫维化工有限公司) ；戊二醛 2 5 水溶液( 含量2 5 2 8 ，分子量1 0 0 1 2 ，上海化学试剂采购供应五联化工厂) ； 聚乙二醇( 平均分子量4 0 0 ，p e g 4 0 0 ，上海浦东高南化工厂) ；无水氯化钙( a r ， 6 第一部分聚乙二醇的醛化 上海美兴化工有限公司) ；4 a 分子筛( 中国医药集团上海化学试剂有限公司) 使用 前先用双重蒸馏水洗净，并于马福炉中加热到5 0 0 。c 烘4h ，冷却备用。 仪器： 8 1 - 2 型恒温磁力搅拌器( 上海司乐仪器有限公司) ：r e 一5 2 型旋转蒸发器( 上 海青浦沪西仪器厂) ；8 7 6 1 型真空干燥箱( 上海浦东跃欣科学仪器厂) ；u - 3 0 0 0 紫外可见分光光度计( h i t a c h i ，日本) ；n e x u s4 7 0 型傅立叶变换红外光谱仪 ( n i e o l e t ，美国) ；a v a n c ed m x s 0 0 型核磁共振仪( b r u k e r ，德国) 。 2 实验方法 2 1 试剂的无水处理 甲苯和二甲苯中加入适量金属钠，以除去水分。溴代乙醛缩二乙醇、正己烷和 d c m 经4 a 分子筛干燥过夜。d m s o 加氧化铝粉和氢化钙静置过夜。t h f 中加入 适量固体氢氧化钾，静置过夜；再与适量氢化钙于6 0o c 、隔绝潮气条件下加热搅拌、 回流反应2h ，继而蒸馏收集6 6 6 8o c 馏分，加入细小金属钠块，静置，待液体内 不再产生气泡才能使用。 2 2d m s o 氧化法制各m p e g 醛 参考h a r r i s 等【1 ，5 3 l 报道的方法，通过一步反应获得m p e g 一醛( 图1 1 ) 。称取 m p e g 5 0 0 07 0g ( 1 am m 0 1 ) 溶于4 0m ld m s o ，加入3 0m l 醋酸酐，室温搅拌反 应2 8h 后加入l om ld c m ，将混合溶液逐滴加入4 倍体积的冰浴乙醚中，高速搅拌。 过滤得到白色沉淀，用少量二氯甲烷溶解后，滴加入冰浴的乙醚中，此过程重复2 到3 次。所得产物真空干燥，即得m p e g 5 0 0 0 - - 醛。 2 3 溴代乙醛缩二乙醇取代法制备m p e g - - 醛 对b e n t l e y 掣划的专利方法加以改进，合成途径如图1 1 所示。称取m p e g 5 0 0 0 2 5g 溶于4 0 蛐甲苯中共沸蒸馏除水至体积剩余约l oi n l ，转入滴液漏斗，将其滴 入3 0l i l l 经氮气饱和的无水t i - i f 中，并同时通入干燥的氮气。称取0 1 2gn a i l 用 正己烷洗涤去除矿物油后加入烧瓶，在3 0 ，通氮气条件下高速搅拌反应8 小时， 体系呈棕黄色悬浊液。再滴加入4m m o l 溴代乙醛缩二乙醇，降低搅拌速度，继续 反应2 0 小时，反应装置见图1 2 。反应混合物用滤纸过滤，d c m 洗涤残渣和容器 并过滤，合并所得滤液，减压旋蒸至约1 0l i l l ，冰浴乙醚沉淀，所得固体用d c m 溶 解后再用冰浴乙醚沉淀，重复2 次，得到淡黄色固体，真空干燥过夜。干燥固体溶 解于4 0m lp h1 0 的磷酸溶液中，通入氮气，4 0 恒温搅拌4 5 分钟后，用等体积 第一部分聚乙二醇的醛化 d c m 萃取三次，合并萃取液并浓缩，加入适量无水硫酸钠静置，间歇振荡至无水 滴后过滤。在冰浴条件下将滤液滴加入乙醚中，高速搅拌，过滤得白色固体即 m p e g 5 0 0 0 - - 醛，用乙醚沉淀2 - - 3 次后，真空干燥。m p e g 2 0 0 0 通过取代法活化的 步骤与各反应物摩尔比同m p e g 5 0 0 0 。 c h 3 - 0 - ( c h 2 c h 2 0 ) n c h 2 c h o c h 3 - o ( c h 2 c h 2 0 ) n - c h 2 c h 2 - - o hc h 3 - o - ( c h 2 c h 2 0 ) n + l - c h 2 c h o 1 n a h 广r h f 2 b r c h 2 c h ( c h 3 - o 一( c h 2 c h 2 0 ) n + l c h 2 c h 2 一( o c 2 h 5 ) 2 图l - ld m s o 氧化法与溴代乙醛缩二乙醇取代法制备m p e g 一醛 2 4s c h i f f 法i 鲫l 测定活化率 2 4 1 戊二醛标准曲线制备 分别称取o 2 0g 副品红与2 0g 亚硫酸氢钠，溶于适量水中，加入2m l 浓盐酸， 稀释至2 0 0m i ，密封静置至溶液呈透明无色( 或略黄) 即s c h i 仃试剂，过滤