（微生物学专业论文）绿僵菌固体培养基的微波灭菌研究.pdf

摘要 固体培养基灭菌通常采用高压蒸汽灭菌方法，存在灭菌时间长、不能实现生产线连续生产等 问题。本研究以枯草杆菌黑色变种芽胞( a t c c 9 3 7 2 ) 为指示菌，利用家用8 0 0 w 微波炉对固体培 养基进行微波及微波一过氧化氢联合灭菌试验，研究微波灭菌的工艺参数，评价灭菌效果，进行 金龟子绿僵菌培养试验来探讨微波灭菌对固体培养的影响，为t 业化微波灭菌提供参考。 ( 1 ) 固体培养基微波灭菌 微波灭菌设负载、水分和浸润三个冈素，结果表明：随负载量的增加，杀菌速度降低；含水 量和浸润显著影响灭菌效果。微波灭菌的最佳条件为：1 0 0 9 固体培养基加6 0 9 水，浸润3 h ，微 波处理1 5 0 s 。 ( 2 ) 固体培养基微波一过氧化氢联合灭菌 微波一过氧化氢联合灭菌，设浸润时间、过氧化氢浓度、料水比例、微波处理时间4 个因素， 选用k ( 27 ) 正交实验表安排实验。结果表明最佳灭菌参数为：1 0 0 9 固体培养基加6 0 9 水，过氧 化氢质量分数为1 o ，浸润3 h ，微波处理9 0 s 。 ( 3 ) 微波灭菌对固体培养的影响 在微波灭菌后的固体培养基上接种培养金龟子绿僵菌，以单位质量固体培养基中金龟子绿僵 菌的产孢量作为检测指标，探讨微波灭菌对固体培养的影响。结果表明：最佳处理工艺微波灭菌 对固体培养无影响，绿僵菌产孢量与高压蒸汽灭菌培养基上的产孢量无显著差异。微波处理固体 培养基1 2 0 s 或过氧化氢质量分数1 o ，微波处理9 0 s ，接种培养绿僵菌能够止常生长和产孢。 关键词：金龟子绿僵菌，微波灭菌，过氧化氢，固体培养基 a b s t r a c t a tp r e s e n t ，m e t h o do fs t e r m z a t i o ni sh i g hp r e s s u r es t e r i h z a t i o nw h i c hi sc i m e c o n s u m i n ga n d c a n tb eo p e r a t e dc o n t i n u o u s l y ，i nt h j sp a p e l 曰口d z f 淞j h 6 l j 船v 口n g p r ( 罔r c c 9 3 7 2 ) s p o r e sw e r c u s e da sb i o i n d i c a t o r s s o l i dm e d i u mw e r es t c l i z e db y 商c r o w a v eg e n e r a t c db yh o u s e b o l d 墒c r o w a v e o v e nw h o s e h eo u t p u ti s8 0 0 wo fi nc o m p a n yw 曲h y d r o g e np e r o x i d e 础溉tf a c t o r sa n ds t e r i l i z 撕o n r e s u l t sw e r er e s e a r c h e d t h i sp a p e ri n v e 蚶g a 把dt h eq u a l i t yo f 也es o l i dm e m u mt r e a t e dw j t h1 1 1 i c r o w a v e o ri nc o m p a n yw i t hh y d r o g e np e x i d eb yt h em e a n so fi n o c u l a t i n ga n dc u l d v 撕n g 肘p 衄而赴f 删 d n 打印池f t h i sp a p e ri st 1 1 e 叫c r e n c e 【om ei n d u 洲a l i z e do p e f a t i o no f 商c r o w a v es t e r i l i z a t i o n n 1m i c m w a v es t e r i h 孤t i o nf o r t h es o l i di n e 出啪 d i 恐r e n t1 0 a dc o n d j t j o n s ，m o i s t u f ej e v e l sa n ds o a 】( a g ew e r ei n v e s t i g a t e d t h er e s u n si n d i c a l e dt h a t w h e n 俩c r o w a v es t e r i l i z a t j o nf o r t h es 0 1 i dm e d i u mo f 肘e 埘m f z j “m 口n 函印矗口p ，s t e r i l i z a t i o nr a t c d e c r e a s e dw i t h 血ei n c r c a s e o fl o a d ；m o i s t u r el e v e la n ds o a 】c a g ee f f e c t c dt h es t e r i l i z a o nr e s u n s o b s e r v a b l y t h eb e s tt e c h n i c sw e r e1 0 0 9s o n dm e d i u ma n d6 0 9w a t e rw e r et r e a t e dw 油r n j c r o w a v e1 5 0 s a n ds t e l i z e de n 石r e l ya f e r3h o u r ss o a k a g eb e f o r ei i l i c r o w a v es t e f i l i z a t i o n ( 2 ) m k m w a v es t e r i l i z a t i 蛐f o r 恤es o h dm e d i 啪i nc o m p a n y 州t hh y d m g 如p e r 砌d e s o a k a g e t 1 1 ec o c e n 仃a n o no fh y 出o g e np e m x i d e ，t 1 1 ep r o p o r t i o no fs t l l f ! ft 0w a t e ra i l dd t n e o f n 五c r o w a v em d i a t i o nw e r er e s e a r c h e dw h e n 删c r o w a v es t e r i l i z a o ni n c o m p a n yw i t t lh y d r o g e n p e m x i d e a r r a n g e dm ee x p e r i i n e n c su s i n gt l l el 8 ( 2 ) o n b o g o n a le x p e r 砷c n t n er e s u l t si n d i c a t e dt h a t t h eb e s tt e c h n i c sw e r e1 0 0 9s o l j dm e d i u mw i t h6 0 9w a t e l1 0 ( w ，w ) h y d r o g e np e r o x i d e ，3h o u r s s o a k a g ea n d 拓e a t e d9 ( ) sb yj i l i c r o w a v e ( 3 ) e 胍c t so ft h e i c m w 盯es t e r j l i 柚t i 蛐f 缸s o h d 伽l t u n 1 1 1 0 c u l a t i n ga i l dc u l t i v a t i n g 胁翮也砭f h 小鲫打印f 抽fo nt h es o l i dr n e d i u ma 舱rs t e 咖z a n o n ，t l l e q u a n n t yo f 肘p 缸施赴f 黼黜妇印“卯c o n i d i ap e rg r 绷s 0 1 i dm e d i u mw a su s e da st h ei n d e xa n d r e s e a r c h e dt h ee f i c t so f 山em i c r o w a v es 把r i l i z a t i o no nt h es o i i dr r l c d i u m t h er e s u l t si n d i c a t e dt h a t c u l 廿v a t i n gm p f 口砌 z f h m n 括d p f f 卵0 dt h es 0 1 i dl 仳d j u mm 盯s t e 删i z a t l o n ，t h e r ew a sn o 蚵f e r c ei n t | l eq u a n t i t yo f 肘尊船柄赴f “，l 期扫叩z 缸pc o i l i d i ab e t w e e nt l l eb e s t t e c h n i c sa i l dl l i g hp r e s s u r es t e i i z a t i o n 肘p 纽巾垃缸m 伽妇印f 缸ec o u l dg r o ww e uo nt h es o l i dm e d i u mw h e n 船a t e dw i t h 栅c r o w a v e1 2 0 s e c o n 出o r9 0s e c o d si nc o m p a l l yw 曲1 0 h y d r d g e np e r o x i d e yw o r d ：肘咖m f z f “m 础打印妇ps o r o k i n m i c r o w a v es t 甜z a c i o n h y d r o g e np e r o x i d e s o h dn 硷d i u m 英文缩略表 英文缩写 p d a b 5 p b s c f u 英文全称 p o t a t od e x t r o s ea g a r b m h ss h b t l t 话 p h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o n c o l o “yf o r m i n gu n i t s v 中文名称 马铃薯葡萄糖培养基 枯草芽胞杆菌 磷酸盐缓冲液 菌落计数单位 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了 明确的说明并表示了谢意。 研究生签名：声风卡 时间枷z 年。月房p 日 关于论文使用授权的声明 本人完全亍解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科 学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不 同媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 时间：加5 年月加日 时间：秒彩年舌月7 巾日 第一章绪论 1 1 绿僵菌的生物防治 绿儡黼m g 幼也f z f “m ( m c 【h ) s o r o k i n 是一种世界性分布的杀虫真菌。金龟子绿僵菌是最早用 丁- 生物防治的 】= 虫病原真菌，利川它来防治害虫的研究已愈白年( 樊美珍，1 9 9 3 ) 。近2 0 年来， 巴两和澳人利、蚴泛使片；j 金龟子绿僵菌防治甘蔗和牧草害虫。1 f 洲用黄绿绿僵茵防、榆蝗虫的试验 取得_ 初步成功。中国农业科学院生防所( 现在已改名为中国农业科学院植物保护研究所) 利用 金龟子绿假街防治草原害虫，取得了可喜的成绩。到2 0 0 3 年为止，其防治而积已逾2 0 0 万亩。 2 0 0 5 年，海南椰心叶甲人爆发。农科院植物保护研究所绿僵菌实验室利用绿僵菌防治椰心叶甲， 防效显著。 绿僵菌的特性：1 寄主范闱1 。，它能在8 个目3 0 个科2 0 0 多种害虫上寄生，且有些菌株对林 水食叶性害虫马尾松毛虫也表现出较强的毒力( 朱漳，2 0 0 】) 。2 它致病力强，对人、茸、作物无 毒害。绿僵茵杀死害虫后，其孢子还可以在害虫体内萌发去侵染别的害虫，引起流行病的发生， 呵持续有效传播来控制害虫种群密度在危害水平以f ，对环境无污染。所以利用它对害虫进行微 生物生物防治具有广。阔的前景，已被联合国粮农组织( f a o ) 推荐为环保产品推j 、应用( b a t e “l a ， 1 9 9 7 1 。 1 2 微波灭菌研究进展 微波是波长介r l m m 至l 0 0 0 m m 的电磁波，频率在数百兆赫至3 0 0 0 兆赫之间。在美国，在丁业、 科学研究和医学领域，微波频率的使月j 是受联邦通信委员会( c ) 管理，通常使用的微波频率有 9 1 5 、2 4 5 0 、5 8 ( ) o 和2 2 1 2 5 m h z 。禽品和药品管理局( f i ) a ) 允许在商业和家i 【：i j 微波炉中使朋9 1 5 m h z 和2 4 5 0m h z 的频率。 微波在介质中通过时，微波明硅地被介质吸收而产生热，陔类介质被称为微波的吸收介质， 如水就是微波的强吸收介质之+ ；而当微波能在介质中通过。不易被介质吸收时，该类介质为微 波的良导体，在这种介质中产生的热效应很低。微波处理时，物质分子以每秒几十亿次振动、摩 擦而产生热能，从而达剑高热灭菌的作用：同时微波还具有电磁场效麻、域子效应、超电导作用 等影响微生物生长j ，代谢的闲索。一般含水的物质对微波有明矬的吸收，升湍迅速，灭菌效果好。 中国农业科学院瑚十学位论文 第一章绪论 果。h j o r y 和c - j o r y 指山曲霉矾印p 厂g l f f 淞) 和青霉( 尸e n f c 肌“m 印) 的热致死点为6 8 7 l 范围内 保持2 0 m i n ，微波处理丽包5i i l i n 最高温度达6 8 左右，可以在相当长的保存期内不长霉，保存 效果极好，但微波处理过程中是从环境温度逐步卜升的，不可能将面包在6 8 保持5 1 0m i n 。 所咀，这种灭菌效果可能1 i 只是热作用。r ) d e 阁2 7 1 2 m h z 高频处理接种有酵母的啤洒和洒类， 加热到4 6 2 4 8 8 就见灭菌效果，而普通的巴氏灭菌法须在6 0 处理3 0 l i l i n 才有相同作用。 o l s e n 刚微波照射十壤霉菌与细菌繁殖体时，发现全部被杀灭时盼温度较其死亡点低1 0 ，因 此，认为微波灭菌有1 f 热效应。 吴晖等( 1 9 9 6 ) 以微波炉( n 8 t o n a l ，n n k 6 5 2 ) 处理接种量为l x l 0 6 的6 0 珊枯草蒡胞轩菌悬液， 维持菌液温度6 0 、8 0 和1 0 0 ，对照组为巴氏灭菌法。测定残存细菌数与处理时间的关系。 结果发现，微波灭菌法d 1 0 0 = o 6 5 ，而巴氏法d l0 【】= 5 5 0 。按照食品热力灭菌理论，腐败菌及其芽胞 的耐热性规律可以用d 值来表征。在相同菌种、浓度和温度情况卜i 所得d 值的芹异，只能从它们 分别所受处理方法的不同来解释。可见，微波能对微生物的致死过程中确实存在非热效应。这种 效应加强了微波对枯草芽胞杆菌的致死教果。 王鲁嘉( 1 9 9 8 ) 研究比较微波处理和巴氏灭菌法对啤酒酵母踟c c 蛔r d m ，c e sc e ，w 埔n eh s p n 的影响，经透射电镜放大后拍摄细胞结构照片，试验结果显示经微波处理后的细胞各部分结构基 本清晰，但在许多细胞中出现小的裂纹。蠢阅了所有能找到的电镜图谱和照片，均未发现这种现 象，所以他假设是微波灭菌所产生的特殊作用的结果。 y a 曲m a c e 等( 2 0 0 5 ) 在真空条件f ，使实验环境保持在4 9 6 4 ，并使水浴加热和微波 灭菌温度保持致，以e c o “为对象，测量并比较了三个参数：d 镶、z 值和活化能( e a ) 。与 水浴加热相比，微波灭菌的三个参数的洌4 景结果和结论为：1 、低 j | ；lfd 值较大，而在高温下， d 值较小，表明环境培养基中存在除了温度的因素外，还有和微波有关的因素，该因素使e c d “ 在低温下延缓了破坏作用，而在高温下加速了破坏作_ f ；i j 。2 、z 值较小。水浴加热的z 值是9 1 ， 而在5 1 0 w 和7 1 1 w 的微波f 分别是6 2 和5 9 ，表明在微波条件f ，e “对温度变化更加敏 感。3 、e a 较大。水浴加热的e a 是2 3 2 k j ，d ，而在5 l o w 和7 1 1 w 的微波下分别是3 3 8 和3 7 2 u ，m o l ， 表明微波处理和承浴加热有不同的反应机制。 1 2 2 微波灭菌设备 继美国人s p e n c e r p l 在1 9 4 5 年申请了微波加热技术的第一个专利后十年，1 9 5 5 年，美 i 蛩泰潘p p a n ) 公司推出了第一台微波炉。至此之后，微波设备得到了长足的发展。 除利用家用微波炉灭菌外，为了适应工、眦化生产的需要，研制出了连续灭菌设备。1 9 7 4 年， j o h n 等( 1 9 7 4 ) 在研究牛肉的微波灭菌时就使用连续灭菌设备。“n d a 介绍了完全的微波灭菌系统 ( 1 wk u e r so m a cs y s t e m ) 。该微波灭菌系统有六个功能：压缩，加热，平德，保温，冷却，解 压缩。由丁微波加热时，袋中的水分蒸发出现胀袋 x 中国农业科学院硕士学位论文第一章绪论 1 3 研究内容与方法 1 3 1 研究内容与方法 1 3 1 1 微波灭菌试验 ( 1 ) 指示菌的培养及芽胞悬渡的制番 本课题试验以枯草杆菌黑色变种芽胞作为指示蒲，阻营养琼脂平板培养法培养枯草杆菌。参 考杨华明( 2 0 0 2 ) 芽胞悬液的制备方法制备芽胞悬液。 ( 2 ) 同体培养基背景菌的测定 由活菌计数方法测定了固体培养基备原料的细茁总数和芽胞总数。 ( 3 ) 微波炉功率的测定 参考b u ”1 e ( 1 9 9 1 ) 的吸收测量法测定本试验所用微波炉的功率。 ( 4 ) 微波场不均匀性试验 a 水平位置不均匀性试验 将含有l o m i 枯草杆菌芽胞悬液的三角瓶放_ ： ；二微波炉的不同位置( 事先用中性笔将微波炉炉底 平均分成2 5 份) 微波处理1 m i n ，活黼计数计篼存活率，利用新复极著测验得到该微波炉的冷点。 b 最育位置不均匀性试验 将园体培养鞑染蒲后放在塑料烧杯中，微波处理1 i l l i n 后。分别取不同高度的固体培养基，滟 合均匀后进行活菌计数，得到爿i 同高度的灭菌效果。 ( 5 ) 负载麓对微波灭菌效果的影响 料水比为2 ：1 ，负载量为5 0 叭1 0 0 9 、1 5 0 9 、2 0 0 9 、2 5 0 9 ，在微波中处理0 s 、3 0 s 、6 0 s 、 9 0 8 、1 2 0 s 、1 8 0 s 由活随计数法得到枯草杆龋的残馥。以微波处理时间为x ，以枯草杆菌残菌 对数值为y ，得到回归方程，算得d 值。根据d 值进行新复极差分析研究负载量对微波灭菌效果 的影响。 ( 6 ) 含水量对微波灭菌散果的影响 1 0 0 9 固体培养基中加入不同质量的蒸馏水( 2 0 9 、6 0 9 、1 0 0 9 、1 4 0 9 ) ，微波处理o 、3 d s 、 6 0 s 、9 0 s 、1 2 0 s 、1 8 0 s 、2 4 0 s ，以枯尊杆菌的残菌作为检测指标，研究水分含量对微波灭菌效 果的影响。 ( 7 ) 浸润对微波灭菌效果的影响 为了提高灭菌效果，降低能耗，采取浸润处理，使芽胞萌发为易被灭活的繁殖体。研究料水 比例、水温、浸润时间、放置温度4 个闵素。在微波炉中照射3 0 s ，以枯草杆菌残菌对数值为指 标，选用l 1 6 ( 4 5 ) 正交实验表安排实验。 9 中国农业科学院硕上学位论文 第一章绪论 1 3 1 2 微波一过氧化氢联合灭菌 ( 1 ) 中和剂鉴定试验 参考杨华明( 2 0 0 2 ) 息液法进行过氧化氢的中和剂鉴定试验。 ( 2 ) 过氧化氢单独灭随试验 在固体培养基中加入枯草杆菌芽胞悬液，同时加入一定体积的质量分数为1 0 的过氧化氢， 使过氧化氢质量分数分别为0 5 和1 o 。作用到规定时间j 亓，进行活菌计数。 ( 3 ) 微波一过氧化氢联合灭菌 研究载体浸润、过氧化氢浓度、料水比例、微波处理时间4 个因素，以枯草杆菌残菌值为指 标，选用k ( 27 ) 正交实验表安排实验。 1 3 1 3 微波灭菌对固体培养的影响 ( 1 ) 微波灭菌对同体培养的影响 直接在微波灭菌后的固体培养基上接种培养金龟子绿僵菌，以绿僵菌的产孢量作为检测指标， 探讨微波灭菌对固体培养的影响。 ( 2 ) 微波一过氧化氢联合灭菌对l 刮体培养的影响 采用正交实验法，研究载体浸润、过氧化氢浓度、料水比例、微波处理时间以及在绿僵菌一 级种子中添加硫代硫酸钠5 个因素。以单位质量培养基绿僵菌的产孢最为检测指标，选用l 8 ( 2 7 ) 正交实验表安排实验。 1 3 2 技术路线 1 0 中国农业科学院硕上学位论文 第一章绪论 7 ) ，在牛肉浸出液中加入1 d ，核糖形成m 一2 ( f e a t h e r 等，1 9 8 1 ) 。其中m 一2 适用于高 温短时灭黼过程( 如在l2 7 r 加热1 5 m i n ) ，而m l 适合更氏时问的加热过群( l a u 等，2 0 0 3 ) 。 自1993年以来，利翊乳清蛋白凝胶体来研究微波加热的不均匀性( 蜀m 等，1 9 9 3 ) 。即以乳清 蛋白凝胶体为材料作为食品模型，蛋白质中的氨基酸与所加入的葡萄糖或者核糖，在高温f 发生 美拉德反应，产生ml或m 一2 。凝胶体可被切割成任意大小的小块，放在微波炉腔的不同位置。 微波处理后，凝胶体经溶解、离心过滤后，过色谱柱，然后比色得到指示剂的量，从雨确定冷点 利灭菌时的能晕分布。hu 等( 2 0 0 2 ) 在对通心面、干酪、炒蛋的微波灭菌和传统的灭菌方式进 中国农业科学院硕士学位论文第二章金龟子绿僵荫同体培养基的微波火菌 表24 液体灭菌均匀性试验d u c a n 新复极差测验分析结果 ! ：! ! ! ! ! ：! ! ! ! ! ! ：! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ：! ! ：翌! ! ! ! ：2 1 1 1 竺! ! ! ! ! i ! ! 翌! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! ! i ! ! i ! ! ! g 兰! ! 存活率( ) 差异显著件 位置编号 6 1 图23 微波蒿篓囊鬻删囊霉 ：j i ；? i ；基 分子2 间频 繁振动而产生大最的摩擦热，从而使样品在短删内达到高温灭菌的目的。也就是说只要微波能达 2 2 4 负载量对微波灭菌效果的影响 蚓 辐 捉 = 【匾 餐 时间( s ) t i m e 图25 不同负载星微波灭菌枯草芽胞的存活曲线 f i g u r e 25s u r v j v a lc l l r v eo f 丑5 m 扫“如8 p o r e st f e a t e dw i t hr 1 1 i c r o w a v ef o rd i r e n tm a s s1 0 a d 表2 ，6 不同负载量微波对枯草杆菌芽胞的杀菌d 值 t a b l e2 6dv a l u e0 f 口js p o r e s 廿a t e d 埘吐l c r o w a v e f o rd i 日谤r e n t m 聃s l o a d 结果表明( 圈25 ) ，随着微波处理时间的延k ，灭菌效累越好。其中，负载量为5 魄，微波 处理2 1 1 1 i n 时，保鲜膜袋子就出现部分熔化变形，到4 i i 】j n 时，同体培养基出现部分变黑，糊化。 图中可以看出，随着负载蟹的增大，杀菌速度降低。负载量低于2 5 0 9 时，微波处理3 t n i n ，就能 达到完全灭菌的目的。负载量为2 5 0 9 时，灭菌效果显著下降。微波照射4 m j n 时，还有1 0 0 c f u 幢 残余。 以微波处理时间为x ，以不同的负载条件下枯草芽胞杆菌的存活对数值为y 。求得各负载条件 下的d 值如表2 ，6 。从表中可知，随着负载量的增加，d 值增加，负载量为5 0 9 时，d 值为2 9 1 7 s ， 负载量为2 5 0 9 时d 值为5 2 4 l s 。表明达到相同的杀菌效果所用的时间延长。这是由于负载量增 加使得负载吸收微波能龄密度降低，能量聚集速度减慢，造成杀菌速度变慢。d u c a n 分析结果表 明：在n = o 0 5 和在一o 0 1 水平，试验结果一样。除了负载量为2 5 0 9 处理与其它处理有显著差 异外，其它处理都没有显著差异。负载为2 5 0 9 时，微波处理4 r n i n 也不能达到完全灭菌的目的， 负载为5 0 9 时虽然灭菌效果很好，但由于量少，不利于大批量操作。综合考虑灭菌效果和提高工 作效率，选取1 0 0 2 0 0 9 为微波灭菌最佳负载量。 1q 作用时间( s ) 图26 不同负载量微波灭菌枯草芽胞的存活曲线 f i g l l r e 2 6s u r v i v a ic u r v eo f 丑5 m 寺爵妇s p o 糟st r e a t e dw i t h c w a v ef o r d i 腩糟n tm a s s1 0 a d 2 2 5 含水量对微波灭菌效果的影响 0 3 06 09 01 2 0 1 8 02 4 0 时间( s ) t i m e 图27 不同含水量微波灭菌枯草芽胞的存活曲线 f i g 27s u r v i v a lo f 丑跗6 “如s p o r e st r e a 州惭血r 1 1 i 盯o w a v eu n d e rd i 脑e n tm o i s t i l 陀c o n d i d o n s 表27 不同含水量微波对枯草杆菌芽胞的杀菌d 值及d u c a n 新复极差测验结果 j 垡坐三u l 坚坦巳塑生堕翌! ! 墨堡! 旦! ! ! ! ! 墨：! ! e 2 1 1 1 塑墅鲤塑尘鲤! 罂! ! ! ! ! 鲤曼垒! 丝塑! 坚翌i 堂! ! 翌垒堑i ! 竺 鱼查量堕l 一 凹望查壁塑羞垂塑 ! 堕! ! ! 墅差墨里茎丝 2 0 y 2 5 9 7 3 i o 0 1 7 1 x09 4 5 65 8 5 5 8 6 0 y 2 6 5 9 2 0 一o 0 3 5 3 x0 9 6 9 8 2 8 3 5o 1 0 0 y 2 6 5 6 4 9 0 0 2 8 5 x0 9 6 6 43 5 0 5h j 丝j = 三旦= 型! 二! ：塑! ! ! ：! 丝!堕：塑 1 1 0 0 9 的问体培养基加2 0 9 水，微波处理3 m i n 时，就出现保鲜膜袋子熔化变形，部分阎体培 养基变黑糊化。由于枯草杆菌芽胞的抗干热性能，该曲线出现托尾现象。所以该条件不能满足完 2 0 7 6 5 4 3 2 l 0 _dh3o_ 遥漆苠粗僚 中国农业科学院硕士学位论文第二章金龟子绿僵菌固体培养基的微波灭菌 全灭菌的要求。实验结果见图2 7 。其他水分条件微波处理3 4 f n i n ，都能达到灭菌的目的。 以微波处理时间为x ，以不同水分含量条件下枯草芽胞杆菌的存活对数值为y ，求得d 值如 表2 7 。1 0 0 9 的固体培养基，分别加水2 0 9 、6 0 9 、1 0 0 9 和1 4 0 9 。其中含水2 0 9 的处理，d 值最 大，达到5 8 ，5 5 s 。其它处理随着含水量的增加，d 值增大。加6 0 9 水的处理，d 值最大，只有2 8 3 5 s ， 是含水为2 0 9 的一、卜。经d u n c a n 新复极差测验分析，1 4 魄和1 0 0 9 水这两个处理之间没有显著 芳异，但与6 0 9 水有显著差异。这是由于随着含水量的增加，水吸收微波能量也增加。使得能量 分布降低，从睡使微波杀菌效果降低。 在1 0 0 9 司体培养摹灭菌时，加6 0 9 水，灭菌1 8 0 s 就能达到灭菌目的。 2 2 6 浸润对微波灭菌效果的影响 表28 浸润对微波灭菌效果的影响试验设计及结果 ! 些! ! ! ：! 里! 坠鲤垫璺翌! 坚! ! 12 1 望堂翌型! ：! ! ! 型! 垒型! 翌璺墼! ! ! 些型 abcd 空白列枯草残菌对数值 5 2 9 5 4 6 9 l 4 1 8 8 38 6 3 4 0 6 5 4 8 1 5 4 5 9 1 4 4 6 6 3 2 0 8 2 8 0 4 4 6 2 4 9 4 5 4 7 5 8 4 9 1 4 3 9 9 1 5 3 2 t = 7 0 5 3 3 。o o o o o o。o o o o。o瑚埘瑚 璩 埔 ，。o o。o。o。o，。o。罔瑚毫邑 ，。4。：。舶瑚m埘加 埔坩 2 3 4 ，2 3 4 1 2 3 4 l 2 3 4 七一巧 培 4 4 8 8。加舶 社。：o o o o ，o o m n 他坞h 坫m n k b h 中国农业科学院硕士学位论文 第二章金龟子绿僵菌周体培养幕的微波灭菌 表29 浸润对微波灭菌效果的影响试验方差分析结果 ! ! ! 鎏；：! 垒! q 坠堕! ! ! 尘型! ! ! 型! 堡! i 塑! i ! 型! ! 型! ! ! ! ! 坐篁! 立董鲞塑 ! ，鱼! ! 垒里 里董丝 a 0 7 2 730 2 4 23 5 6 4 bo 1 1 7 30 0 3 9 c2 9 2 430 9 7 5 1 4 3 3 3 女 d0 9 3 63o 3 1 24 5 8 8 e 0 2 8 930 0 9 6 e “o 4 0 6 60 0 6 8 实验结果( 见表2 8 ) ，从表中可以得出最佳条件及影响因素的主次顺序为c 4 d 扯3 8 2 ，即在3 7 条件下。料水比为l ：1 ，所加入水的水温为5 0 ，浸润4 5 小时。经方差分析( 见表2 9 ) ，由于 f o ( 3 ，6 ) = 4 7 6 ，f 0 0 1 ( 3 ，6 ) = 9 7 8 ，故因素a 、b 、d 作用不显著，因素c 即浸润时间作用极显著。 即考虑浸润对微波灭菌的影响时，不需考虑i 刮水比例、水温以及放置温度，只需考虑浸润时间。 经d u c a i l 新复极差进一步分析( 表2 1 0 ) ，在= o 0 5 ，除了3 h 和4 5 h 处理之间没有显著差异外， 其它处理之间都有显著差异。且随着浸润时间的延长，芽胞随之萌发，枯草杆菌芽胞的残菌率显 著下降。为了节省时间，提高效率，选取3 小时为最佳浸润时间。 另外作了浸润厉的微波灭菌试验，试验结果表明经过3 小时浸润后，再进行微波处理，1 5 0 s 就可达到完全灭菌的目的。 表21 0 浸润时间的d u c a n 分析结果 ! ! ! ! ! ：! ：! 竺望旦! 呈翌! ! ! 竺! ! ! ! ! ! ! ! 墨量! ! ! 翌! 浸润时间( h )枯草残菌对数平均值5 差异显著性 2 3 讨论 由活菌计数方法测定了固体培养基各原料的细菌总数和芽胞总数，实验结果表明稻党的含菌 量最高，达到3 3 1 0 6 c 兀垤，芽胞达到3 7 1 0 5c f l 垤，和麦麸、玉米粉混和后细菌总数是1 1 1 0 6 c f u 恒，芽胞达到1 3 x 1 0 c f u 儋，为了达到对培养基的完全灭菌，确定固体培养基灭菌时枯草杆 菌芽胞的添加量为1 o x l o 。c f u ，g 。这样能保证枯草杆菌芽胞杀灭时，已经达到了对固体培养基 完全灭菌的目的。 微波灭菌器谐振腔内由于设计制造上的原因，存在能量死角。在灭菌时表现出加热不均匀， 存在“冷点”，在这个位置的物品不能接受像其余位置的微波辐射。由水平位置的均匀性试验，确 定，mt 、f 为该微波炉的冷点，所以进行微波灭菌实验时，应避开这儿个位置。将灭菌对象置 丁微波炉的中央位置，即可避开冷点位置。 垂直位置的均匀性试验表明，随着培养基高度的增加，灭菌效果降低。3 c m 高度和6 c m 高度 并没有差异，所以进行灭菌试验时，培养基的高度不能超过6 c m 。 检索国内外有关微波灭菌的文献，主要集中在机理( w o o ，2 0 0 2 ；c e l a n d r o i l i ，2 0 0 4 ) 、介电 2 2 中国农业科学院硕上学位论文 第一二章金龟子绿僵菌固体培养基的微波灭菌 特性( b o l d o f ，2 0 0 4 ；t r a b e l s i ，2 0 0 4 ) 等研究，利用微波进行生物灭菌的文献较少，试验存在的 主要问题是随着微波处理时间的延长，外包装容易变形甚至烧焦( 王国强等，1 9 9 7 ) t 致死率趋 缓，死亡率曲线出现拖尾现象( 葛新峰等，2 0 0 4 ) 。为了消除上述现象，我们对试验设计进行了 改进，在灭菌前采取浸润处理，使芽胞萌发为易被杀灭的繁殖体，结果证明起到了较好的效果。 实验结果表明，对金龟子绿僵菌固体培养基的微波灭菌，随负载量的增加，杀菌速度降低。 含水量显著影响灭菌效果。经过浸润处理，能显著提高灭菌效果。微波灭菌的最佳工艺参数为： 1 0 0 9 固体培养基加6 0 9 水，3 h 的浸润，在微波炉中处理1 5 0 s 。 金龟子绿僵茵固体培养基传统的灭菌方法是高压蒸汽灭菌，灭菌时间长，要经过3 5 皿n ，温 度才能达到1 2 1 ，经过2 0 3 0 的灭菌，再经过约3 0 i i l i n 才能打开灭菌锅。存在历时长，耗能大， 不能流水作业等缺点。而微波灭菌就能克服以上缺点，其设备成本低、灭菌时问短、使用方便， 值得推广。 2 3 中国农业科学院硕士学位论文 第三章金龟子绿僵菌同体培养基微波一过氧化氢联合灭菌 第三章金龟子绿僵菌固体培养基微波一过氧化氢联合灭菌 化台物和微波的协同作州可以缩短灭菌州间，据报导，j l 微波有协嗣作用的化合物有：过氧 化氢( k o u 劬m a 等，2 ( ) o o ) 、水、过氧乙酸、环氧乙烷、氯胺t 、甲醛、碘伏氯己定、苯扎溴铵( 新 沽尔灭) 、乙醇、硼酸、山梨酸、柠檬酸、e d t a n a 2 、有机硅等。徐燕( 】9 9 4 ) 发现苯甲酸、山 梨酸、e d l a 、e d l a n a 2 对微波的协同作用较好。 本实验所川的载体是仓龟子绿僵菌的例体培养基，灭菌后耍接种培养金龟子绿僵菌，为了避 免残留的消毒剂对绿僵蒲的毒害作用，本文选择易分解的过氧化氢进行试验。 过氧化氯俗称双氧水，它足一种较强的氧化剂，属商效消毒剂。具有杀菌作i j 快速、杀菌能 力强、杀灏谱j 、。；同时具有其它低温消毒弃u 所不具备的特点如刺激性小、腐蚀性低、容易气化、 不残留有毒性等；本试验观察r 过氧化氧以及微波过氧化氢对嘲体培养基的灭菌作片| ，现将结 果报告如r 。 3 1 材料和方法 3 1 1 微波炉 s a n y o 微波炉，型号为e m 一3 ( ) 8 e b l ，额定微波频率2 4 5 0 m h z ，额定输入功率1 2 5 0 w ，最 人输出功率8 0 0 w 。 3 1 2 菌种及其芽胞制备 枯草芽胞杆卣黑色变种砒f 池5j “6 删sv 口f 嘲妒r ( a i c c 9 3 7 2 ) ，购自中i 目科学院微生物所微生 物菌种保藏中心。芽胞制各见附录。 3 1 3 培养基 ( 1 ) 金龟子绿僵菌固体培养基 麦麸、玉米粉和稻壳，质疑比为l ：l ：1 ( 2 ) 普通营养琼脂培养基 蛋白胨1 0 9 ，氯化钠5 9 ，牛肉粉1 5 9 ，琼脂2 魄，蒸馏水1 0 0 0 m l 2 4 中国农业科学院硕士学位论文 第三章金龟子绿僵菌固体培养基微波一过氧化氢联合灭菌 3 1 4 染菌载体制作 从冰箱取出保存有芽胞的离心管，待其恢复至室温利，在漩涡振荡器j 二振荡均匀。将绿僵菌 同体培养基混合，加入芽胞息液和灭菌蒸馏水( 使含涛达到1 1 0 6 c 兀j 儋) ，过氧化氢灭菌时，则 同时添加定体积的过氧化氯溶液，快速搅拌均匀。 3 1 5 活菌计数方法 3 1 5 1 过氧化氢灭菌后载体的活菌计数 此疗法适川于过氧化氢单独灭菌或过氧化氢一微波联合灭菌。 用灭菌钢勺取约1 0 9 左右的崮体培养基于灭菌三角瓶中，加入含中和剂的p b s 洗脱液4 0 r n l ， 中和1 0 m i n 后，在漩涡振荡器上振荡3 f n i n ，经十倍梯度稀释后，取后面三个浓度梯度的稀释液， 接种到普通营养琼脂平板卜，用灭菌l 棒均匀涂布。将平业倒转，置。】二3 7 培养箱中培养2 4 4 8 h ，选墩菌落数为3 0 3 0 0 的平丑进行计数。其中p b s 洗脱液既是0 0 3 m o l n 的磷酸盐缓冲溶液， p h = 7 2 ，处方为无水磷酸氢：= 钠2 8 3 9 ，磷酸二氢钾1 3 吨，加蒸馏水定释至1 l ( 杨华明，2 0 0 2 ) 。 3 1 5 2 未加过氧化氲的载体的活菌计数 f 【 = | 灭菌钢勺取约l 魄左zr 的同体培养基于灭菌三角瓶中，加入p b s 洗脱液4 0 r n l ，在漩涡振 荡器上振荡3 谢n ，经十倍梯度稀释后，取后面三个浓度梯度的稀释液，接种到酱通营养琼脂平板 上，用灭菹l 棒均匀涂布。将平皿倒转，置于3 7 培养箱中培养2 4 4 8 h ，选取菌落数为3 0 3 0 0 的平皿进行计数。 3 1 6 中和剂鉴定试验 悬液法中和实验鉴定山合适的中和剂之后，原则上也可用丁载体消毒实验( 薛广波，2 0 0 2 ) 。 本试验参考杨华明( 2 0 0 2 ) 的悬液法进行过氧化氢中和剂鉴定试验。试验细菌均用枯草杆菌黑色 变种芽胞，设平行8 组，试验设计见表3 1 。 表31 过氧化氢中和剂效果鉴定实验组设计 = 一旦皂蔓兰：! ! 婪i 曼璺2 11 盟墼垡竖翌璺坚型i ! 塑坠趔巴! 坐坠垒坦翌艘匿巴：i 堂 组 呈塑! 操作步骤 l 过氧化氧+ 细菌悬液 2 过氧化氧+ 细菌悬液+ 中和剂 3 中和剂+ 菌悬液 4 过氧化氢+ 中和剂+ 菌悬液 在4 9 m l 过氧化氢试管内加入o 1 l 菌悬液混匀。作用规定时间后作活 菌计数。 吸取o 1 m l 菌悬液加到4 9 m l 过氧化氢试管内立即混匀，作用到规定时 间取0 5 m l 加到4 5 m l 中和剂试管内混匀，中和1 0 皿i n 后作活菌计数。 吸取0 1 l 菌悬液加到4 9 m l 中和剂试管内混匀，作用l o m i n ，吸取0 5 m l 加到4 5 l 中和剂试管内混匀，稀释接种。 取0 1 l 过氧化氯加到4 8 口1 中和剂试管内混匀，中和1 0 i n 后，加入 o 1 m l 菌悬液混匀，作用1 0 m i n 后，再用中和剂进行活菌计数。 吸取0 1 l 菌悬液加到4 9 l p b s 试管内混匀，作用1 0 m i n 后，用p b s 进 5 p b s + 菌悬液 行活菌计数。 6 本次所用p b s 吸取0 1 m l p b s 直接在营养琼脂平板上接种培养。 7 奉次所用中和剂 吸取0 1 1 中和剂直接布营养琼脂平板上接种培养。 8 本次所用普通营养琼脂培养基 直接将营养琼脂平板在3 7 下培养。 3 2 2 过氧化氢单独灭菌试验结果 p 2 v 辅 七 坦 妲 困 缨 作用时间队p o s u r et i m e ( m l n ) 图31 过氧化氧对枯草杆菌芽胞的存活曲线 f i g u r e31s u r v i v a lo f 丑j 岫“妇s p o r e st r e a c a lw j t t lh y d r o 鲫p c m x i d e 试验结果表明( 图3 1 ) 。随着处理时间的延长，灭菌效果较好。其中，质量分数为o 5 的 过氧化氢对枯草杆菌芽胞的灭菌曲线接近直线。以作用时间为x ，以该处理时间下枯草芽胞杆菌 的存活对数值为y ，得到回归方程为y = 一0 ，0 0 9 1 6 x + 6 0 1 1 7 ，r _ 0 9 9 6 6 。即0 。5 的过氧化氢 与枯草杆萄芽胞存活对数值之间呈直线负相关，算得d值=1092111in(试验温度为20+1)。 质罱分数1o的过氧化氢对枯草杆菌芽胞的灭菌曲线，在前101i】in，比较陡，10血n后趋于 平缓。做实验时发现，当在固体培养基中加入过氧化氢溶液时，立即产生大量的泡沫，质量分数 为05的过氧化氢其产生的泡沫就没有10的多。产生泡沫是过氧化氢分解产生氧气所致。过 氧化氢分解。其杀菌效能也随之降低。过氧化氢在较低浓度时分解速率较慢，但随着浓度的升高 分解速率逐渐增大(许志忠等，2006)，所以质量分数为1o的过氧化氢对枯草杆菌芽胞的灭菌曲线由于分解较多，没有呈现显著的直线关系。 3 2 3 微波一过氧化氢联合