（分析化学专业论文）分子信标荧光探针用于核酸连接过程的实时监测及病毒rna的检测.pdf

中文摘要 核羧是生命体累中的关键物赝，它承载惹传递遗传信息、编码其它捆关生物 分子的重要任务，在分子生物学并玎生物技术领域受到广泛关注，是发展非常迅速 的研究重点。核酸稠关生命功能的完成需要蛋岛质( 酶) 酶狒蠢参与。对核酸和 甥关蛋自豹樱互 乍爝研究正是以功能綦因组和蛋白艨组的研究为挺志的后基因 组时代所关注的热点之一。 梭酸的转荥、修复和嚣缝是细胞生命周麓审的重黉过程，由棱酸连接簿催纯 约核酸连接反应是这些过穰孛不可或缺的步骤，传统灼核酸连接分析的硪究手段 主要是凝胶电泳技术，无法满足实时监测核酸连接过程的要求，限制了人们对于 这一 乍用过稔更为篡体和报本的梳理的深入了解。有关核酸与连接酶作丽的实辩 过程镀息戆获褥撬不仅毒助手对一些生命过稳援理懿磅究，还将兔瓶药斡设诗提 供新的技术手段，为疾病的治疗找到新的方法。 病毒基因组r n a 的快速检测对于由r n a 病毒感染的疾病诊断与防治其有鬣 要意义。星翦普遍遨蠲豹r t - p c r 方法对于摸缀豹掇缝毒较褒豹蘩菠，于是，敷 展简便、快速而灵敏的技术用于病毒r n a 的检出变得尤为重要。 1 9 9 6 年，t y a g i 和k r a m m c r 研究出一种新挺荧光探针一分子倍标。滚种探针 是在褰聚垓薮羧搽镑熬基穗上发震起象懿一类具毒蒸一环殡构款寡蒙核营酸擎 链探针，具有高灵敏度、高特异性和背景值极低，无需分离未杂交探针等优点， 不仅通用予核酸分析，而髓同样也适用于蛋自质( 酶) 等能与核酸发生相互作用 蕊魏矮分辑，免实瓣整测辫壹矮( 酶) 譬核酸佟援麴避程提供了极磐豹鼓零手段。 本实验室唐志文博士；f j l | 用分子信标核酸探钎，发挥其研究棱酸及相关蛋白旗 ( 酶) 豹优势，剑毅姓地嚣曩黯梭酸连接、核羧磷酸纯以及核黢酶切过稷豹实射 监测研究，本论文作为唐虑文博士论文工作的一部分，从分子信标实时监测核泼 与蛋囱质( 酶) 的作用过稳和分子信标侠捷地检测瘸海r n a 两个角度开展研究， 发袋了基予分子售标夔鬏戆检测技本秘痘甥磷究傣系，可从分子水平上获取生貔 大分子之间相互作用的动态信息： ( i ) 利用分予信标蜜时膝测了1 4d n a 逐接酶催他的d n a 涟接过程，并建 立与蜜嚣反疲体系稿痤鹣动力学模型。 l 建立了一种新的核酸连接实时监测方法，利用分子信标作为核酸连接反应的 d n a 模板和检测分子，在核酸分子连接的同时检测荧光信号。首次实时、准确 地获取核酸连接过程信息，为核酸连接酶分析、核酸连接动力学过程研究提供全 瓶、有效的手段，也为深入研究核酸连接酶与核酸分子间的相互作用提供了新的 思路与技术。与传统的研究方法相比，该方法避免了放射性同位素标记、变性凝 胶电泳、放射性自显影等复杂的操作，为核酸连接过程研究提供一种新的非同位 素分析方法，并建立了该方法的动力学模型，将有助于我们进一步揭示核酸与蛋 白质这两种生命中最关键物质之间的相互作用与关系。在此基础上建立了快速、 准确检测t 4d n a 连接酶的分析方法。其检测下限为2 3 1 0 4u m l 。 ( 2 ) 基于分子信标实时监测大肠杆菌d n a 连接酶催化d n a 连接的活性， 并建立了高灵敏地分析连接酶活性的方法。 核酸连接酶除了一类与t 4d n a 连接酶相似，以a t p 为辅酶的之外，另一 类以n a d + 为辅酶的连接酶也具有同要重要的研究价值。因此，在上一章建立的 研究t 4d n a 连接酶的技术的基础之上，本章进一步发展了对以n a d + 为辅酶的 ec o l id n a 连接酶的活性及其催化的d n a 连接过程的实时监测方法。 该方法灵敏、实时地监测了ec o l id n a 连接酶催化的d n a 连接反应的进 程。建立了快速、准确检测ec o l id n a 连接酶的分析方法，检测下限为4 0 1 0 。4 u m l 。与传统的研究方法相比，该方法既避免了同位素标记、变性凝胶电泳、放 射自显影等复杂的操作，又为深入研究核酸连接酶与核酸的相互作用提供了实 时、丰富的动力学数据，为蛋白质( 酶) 与核酸的相互作用研究提供了新的思路、 方法和有效的手段，对于推动其动力学过程的深入研究具有重要的意义。 ( 3 ) 基于分子信标荧光探针快速检测烟草花叶病毒的新方法研究 根据常见的烟草花叶病毒( t o b a c c om o s a i cv i r ，弧) 的遗传物质r n a 序 列，设计了一种新型分子信标荧光探针，发展了一种直接检测病毒基因组r n a 的新方法，由于分子信标具有高特异性、对病毒r n a 的提取不需要严格的纯化， 就可以用于植物病毒的检测，克服了传统的r t - p c r 过程要求制备高质量核酸模 板的限制，实现了病毒r n a 快速、准确的检测。 关键词：分子信标，t 4d n a 连接酶，e c o l id n a 连接酶，实时监测，n w r n a i i a b s t r a c t n u c l e i ca c i di so n eo ft h em o s t i m p o r t a n tb i o m o l e c u l e si nl i f et h a ti si nc h a r g eo f t r a n s f e r r i n gg e n e t i ci n f o r m a t i o n a n dc o d i n go t h e rb i o m o l e c u l e s t h ei n v e s t i g a t i o no f n u c l e i ca c i d sh a sb e e no n eo ft h em o s ti m p o r t a n ta r e a sa n dc u r r e n t l yo n eo ft h em o s t r a p i d l yg r o w i n g f i e l d si nc o n t e m p o r a r ym o l e c u l a r b i o l o g ya n db i o t e c h n o l o g y n u c l e i ca c i d sl i g a t i o n c a t a l y z e db y d n a l i g a s ep l a y sa ni n d i s p e n s a b l e r o l ei nc e l l l i f ec y c l e ，w h i c hi n c l u d e sm a n ye s s e n t i a ll i f ep r o c e s s e ss u c ha sr e p l i c a t i o n ，r e p a i ra n d r e c o m b i n a t i o no fn u c l e i c a c i d s u n f o r t u n a t e l y , u p t o n o w , o u rk n o w l e d g e o f i n t e r a c t i o n sb e t w e e nl i g a s ea n dn u c l e i ca c i d sh a sb e e nl i m i t e db e c a u s eo ft h el a c ko f a d e q u a t em e t h o d o l o g i e sf o rr e a l t i m ed e t e c t i o n t h ed e t a i l e da n df u n d a m e n t a ln a t u r e o f t h e s ei n t e r a c t i o n sa sw e l la st h e i rc o n t r i b u t i o nt ot h et o t a lo r g a n i z a t i o no f b i o l c i g i c a l s y s t e m si sy e tt ob ed i s c o v e r e d b e t t e ru n d e r s t a n d i n go f t h e s ei n t e r a c t i o n sn o to n l y w i l lb e n e f i tt h eu n d e r s t a n d i n go f m a n yb i o l o g i c a lm e c h a n i s m s b u ta l s oi se x p e c t e dt o b eo fg r e a tm e d i c a lu s ei n d e s i g n i n gn e wd r u g sa n di nd e v e l o p i n gn e wd i s e a s e t r e a t m e n ts t r a t e g i e s d e t e c t i o no fv i r u sg e n o m er n ai so fg r e a ti m p o r t a n c ef o rd i a g n o s i so fs o m e d i s e a s e s i n f e c t e d b y r n av i r u s r t - p c r ，c o m m o n l yu s e df o rr n av i r u s d e t e r m i n a t i o n ，r e q u i r e st e m p l a t eo fh i g hq u a l i t y , w h i c hh a sr e s t r i c t e d 印p l i c a t i o no f t h em e t h o d t h e r e f o r e ，i ti sn e c e s s a r yt od e v e l o p t e c h n o l o g yf o rq u i c km a ds e n s i t i v e d e t e c t i o no f v i r u sr n a m o l e c u l a rb e a c o n sa r eac l a s so f n o v e lf l u o r e s c e n c ep r o b e s ，s i n c ef i r s td e v e l o p e d i n 1 9 9 6 t h e y h a v eb e e nw i d e l yu s e di nd n a r n am a ds o m ep r o t e i ns t u d i e s m o l e c u l a rb e a c o nh a ss h o w nt ob eau s e f u lt o o li nm o n i t o r i n gi n t e r a c t i o n sb e t w e e n n u c l e i ca c i d sa n dp r o t e i n s ( e n z y m e s ) ，w h i c hn l a k e $ i ta p r e t t yg o o d t o o lf o r m o n i t o r i n g i n t e r a c t i o n sb d h 嗍l p r o t e i n sm a d n u c l e i ca c i d si nr e a lt i m e f u r t h e r m o r e s i n c em o l e c u l a rb e a c o ni sak i n do f p r o b e 淅t l ll l i g hs e n s i t i v i t y , h i g h s e l e c t i v i t y , l o wb a c k g r o u n dm a d n on e e do fr e m o v ef r o mt h er e d u n d a n tp r o b e sf r o m d e t e c t i n gm i x t u r e ，i tc o u l db eu s e dt od e t e r m i n em r n a m a dg e n o m er n ao fs o m e 1 1 1 v i r u sw i t h o u t a m p l i f i c a t i o nb y p c r b a s e do nm o l e c u l a rb e a c o np r o b e s ，d r z h i w e nt a n gi no u rl a bh a sd e v e l o p e d n o v e lm e t h o d st or e s e a r c ho nl i g a t i o n ，p h o s p h o r y l a t i o na n de n z y m a t i cc l e a v a g eo f n u c l e i ca c i d s a sa p a r t o fh i s s y s t e m a t i cr e s e a r c h ，t h e t h e s i sh a s d e v e l o p e d a p p l i c a t i o ns y s t e m sb a s e do nm o l e c u l a rb e a c o nf o rt w og o a l s ：o n e i st om o n i t o r r e a c t i o n sb e t w e e nn u c l e i ca c i d sa n dp r o t e i n s ( e n z y m e s ) i nr e a l t i m e ，t h eo t h e ri st o d e t e c tv i r u sr n a q u i c k l ya n dd i r e c t l y t h et h e s i si sc o m p o s e d o f t h r e e m a j o rp r o j e c t s ： ( 1 ) r e a lt i m em o n i t o r i n go f n u c l e i ca c i d sl i g a t i o nc a t a l y z e db yt 4d n a l i g a s e a n df o u n d a t i o no fk i n e t i c sm o d e lo ft h em e t h o d an e wa p p r o a c hh a sb e e nd e v e l o p e df o rm o n i t o r i n g d n a l i g a t i o nu s i n g m o l e c u l a rb e a c o n ( m b ) d n ap r o b e s m o l e c u l a r b e a c o ni sa h a i r p i n s h a p e d o l i g o n u c l e o t i d ep r o b e w i t hh i g hs e n s i t i v i t ya n ds p e c i f i c i t y i th a sb e e ne m p l o y e da sa d n a p r o b e t om o n i t o rt h el i g a t i o np r o c e s s t h es e q u e n c eo ft h em bw a sd e s i g n e dt o b ec o m p l i m e n t a r yw i t ht h ep r o d u c to ft h el i g a t i o n ，t h e r e f o r e ，t h el i g a t i o np r o c e s sc a n b em o n i t o r e di nah o m o g e n e o u ss o l u t i o ni nr e a l - t i m e i tc o u l db er e a l i z e db a s e do n t h i sm e t h o dt os t u d yn u c l e i ca c i d sl i g a t i o nk i n e t i c sw i t hc o n v e n i e n c ea n d t od e t e r m i n e t h e a c t i v i t yo f d n a l i g a s ea c c u r a t e l y t h e r e s u l to fk i n e t i c se x p e r i m e n ti n d i c a t e st h a t i n t e r a c t i o ni nt h ed e t e c t i n gs y s t e mi sas i n g l e - s u b s t r a t ee n z y m e c a t a l y z e dr e a c t i o na n d m o l e c u l a rb e a c o na c t sa sn o to n l yt h ep r o b ef o rm o n i t o r i n gl i g a t i o nb u ta l s ot h e t e m p l a t ef o rd n a s u b s 仃a t ef o r m a t i o n e f f e c t so fs o m ee x t e r n a lf a c t o r sa n db a s e m i s m a t c h e sa tt h en i c ko nd n a l i g a t i o nh a v eb e e n s t u d i e du s i n gt h en o v e la p p r o a c h b a s e do nt h i sp r i n c i p l e ，as e n s i t i v e ，p r e c i s ea n dq u i c ka n a l y t i c a lm e t h o dt od e t e r m i n e t h ea c t i v i t yo f t 4d n a l i g a s eh a s a l s ob e e nd e v e l o p e d t h em a j o r a d v a n t a g e so f o u rm e t h o da r ei t su l t r a s e n s i t i v i t y , e x c e l l e n ts p e c i f i c i t y , c o n v e n i e n c e ，r e a l - t i m em o n i t o r i n g o f h o m o g e n e o u s s o l u t i o n t h en o we a s i l y o b t a i n a b l em b sw o u l df o u n dw i d ea p p l i c a t i o ni nt h ei n v e s t i g a t i o no fn u c l e i ca c i d s l i g a t i o np r o c e s s c o m p a r e d t ot r a d i t i o n a lm e t h o d , t h i sn o v e ln o n i s o t o p em e t h o dc a n p r o v i d ea b u n d a n td y n a m i c d a t af o ri n - d e p t hr e s e a r c ho ni n t e r a c t i o n sb e t w e e nn u c l e i c a c i d sa n d l i g a s e w i t h o u tn e e do fi s o t o p e l a b e l ，d e n a t u r i n ge l e c t r o p h o r e s i s a n d a u t o r a d i o g r a p h y t h i s n o v e l a p p r o a c h w o u l d p r o m o t e t h e u n d e r s t a n d i n g o f i v i n t c r a c t l o n 3a n dr e l a t i o n g h i pb e t w e e np r o t e i n sa n dn u d o i ca c i d s ，t w oi n o s i ”p o r t ” m a c r o m o l e c u l e sf o rl i f e ( 2 ) m o n i t o r i n ga c t i v i t yo f ec o l id n a l i g a s ec a t a l y z i n gn u c l e i ca c i d sl i g a t i o n u s i n g m o l e c u l a rb e a c o n 。 p o l y n u c l e o t i d el i g a s e se a r lb ed i v i d e di n t o t w ob r o a dc l a s s e s ，t h o s er e q u i r i n g n a d + a sc o f a c t o ra n dt h o s er e q u i r i n ga t et h ef i r s tp r o j e c th a st a r g e t e dt od e v e l o p t e c h n i q u e b a s e do nm o l e c u l a rb e a c o nf o rr e a lt i m em o n i t o r i n go f d n al i g a t i o nb y t 4 d n al i g a s e ，a 1 1a t p - d e p e n d e n tl i g a s e n a d + 一d e p e n d e n tl i g a s e i sa l s oo fg r e a t i n t e r e s t ss i n c ei t sp a r t i c u l a r i t yr e l a t i v et oa t p - d e p e n d e n tl i g a s e ，s oa c t i v i t yo f e c o l i d n a l i g a s ec a t a l y z i n gd n al i g a t i o nw a sf i r s tm o n i t o r e di nr e a l t i m ef o r 南r t h e r r e s e a r c h o n m e c h a n i s m o f c a t a l y s i s b y l i g a s ea n d p r o c e s s k i n e t i c s o f d n a l i g a t i o n a ni n n o v a t i v ea p p r o a c hw a sd e v e l o p e df o rm o n i t o r i n gt h ea c t i v i t yo fec o l i d n a l i g a s ec a t a l y z i n gn u c l e i ca c i dl i g a t i o ni nr e a lt i m e 。m o l e c u l a r b e a c o n h y b r i d i z e d w i t ht w os i n g l e - s t r a n d e d ( s s d n a ) s e g m e n t st ob e l i g a t e a t of o r ma h y b r i d w i t han i c k , w h i c hc o u l db er e c o g n i z e db yt h ee n z y m e l i g a t i o no ft h et w os s d n as e g m e n t s w o u l dc a u s ec o n f o r m a t i o nc h a n g e so fm o l e c u l a rb e a c o nl e a d i n gt os i g n i f i c a n t f l u o r e s c e n c e e n h a n c e m e n t ，c o m p a r e dw i t hg e le l e c t r o p h o r e s i su s u a l l y u s e df o r r e s e a r c ho nl i g a s e s ，w h i c hi s d i s c o n t i n u o u s ，t i m e - c o m u m i n ga n dl a b o r i o u s ，t h i s a p p r o a c hc a np r o v i d e r e a lt i m e p r o c e s s i n f o r m a t i o no f l i g a t i o na n di se a s i e rt oo p e r a t e a sw e l la st i m e s a v i n g s e n s i t i v ea s s a yo f 最c o l id n a l i g a s ec a nb ea c c o m p l i s h e d b a s e do nt h et e c h n o l o g yw i t had e t e c t i o nl i m i to f 4 0 x 1 0 - 4w 蕊勰u n i t m l e f f e c t so f e x t e t n 越f a c t o r so n c a t a l y s i so f t h e l i g a s ea n df i d e l i t yo f s t r a n dj o i n i n gb yt h el i g a s e w e l ea l s oe x a m i n e db a s e do nt h e a p p r o a c h w i t hc o n v e n i e n c e ， ( 3 ) an o v e lc o n v e n i e n ta n df a s tm e t h o df o rd e t e c t i o no ft m v - r n ab a s e do n m o l e c u l a rb e a c o n an e w a p p r o a c hf o rt h ed e t e c t i o no fp l a n tv i r u si sd e v e l o p e dw i t ht h eu s eo f a n o v e ln u c l e i cp r o b e - m o l e c u l a rb e a c o n 国妫) a na n t i s m s em o l e c u l a rb e a c o n ( m s l ) w a sd e s i g n e df o rt h ed e t e r m i n a t i o no f t h eg e n o m er n ao ft o b a c c om o s a i c v v i r u s ( t m v - r n a ) w i t hn on e e do fs t r i n g e n ti s o l a t i o na n dp u r i f i c a t i o no f t h ev i r u s p a r t i c l e s a n dr n aa s w e l l ，w h i c hb e n e f i t sf r o mt h ep r o m i n e n ts p e c i f i c i t ya n d s e l e c t i v i t yo fm o l e c u l a rb e a c o n a n o t h e r s y n t h e s i z e df o rc o n t r o le x p e r i m e n t s t h e s e n s em o l e c u l a rb e a c o n ( m b 2 ) w a sa l s o r e s u l ts h o w e dt h a tt h em o l e c u l a rb e a c o n d e s i g n e d w j t l ls e q u e n c ei nc o n s i s t e n t 、v i n lt h ec o m p l e m e n t a r y s e q u e n c e o fas e c t i o no f t h ec o n s e r v a t i v e r e g i o n s o ft m v - r n aw a ss u i t a b l ef o rt h ed i r e c t a s s a y o f t m v r n a a n o t h e rc o n t r o le x p e r i m e n tw a sp e r f o r m e dt ot e s t i f yt h ee x p e r i m e n tr e s u l tm o r e s u f f i c i e n t l ya n da c h i e v ep r e c i s eq u a n t i f i c a t i o no ft m v r n a u n i n f e c t e dt o b a c c o l e a v e sw e r et r e a t e d 、i mt h es a l t l ep r o c e s sa st h a tf o ri n f e c t e dl e a v e st og e tt m v 琢n a n 地o b t a i n e ds u b s t a n c ew a su s e dt or e a c tw i t ht h et w o m si nt h es a m es i t u a t i o na s t h a tf o rt m v - r n a a sar e s u l t ，t h e r ew e r es i g n i f i c a n td i f f e r e n c e sb e t w e e nt h e e n h a n c e m e n te f f i c i e n c i e so f f l u o r e s c e n c e i n t e n s i t yc a u s e db y t h er e a c t i o no f m b la n d t h es u b s t a n c e se x t r a c t e df r o mi n f e c t e dt o b a c c ol e a v e sa n du u l n f c c t c dt o b a c c ol e a v e s o nt h ec o n t r d e y , t h e r e sa l m o s tn od i f f e r e n c ef o rm b 2 t h er e s u l ti n d i c a t e st h a tt h e d e t e c t i o nr e s u l to b t a i n e dw i t h0 1 1 1 m e t h o di sr e l i a b l e k e y w o r d s ：m o l e c u l a rb e a c o n ( m b ) ，t 4d n al i g a s e ，ec o l id n al i g a s e ，r e a l t i m em o n i t o r i n g ，t m v - r n a v i 本文所用英文缩写词表 i x 第一章绪论 2 0 整纪5 0 年代w a t s o n 翻c r i c k 提基豹d n a 双螺凝模板学说，6 0 年代 m o n o d 和j a c o b 提出的关于基因调节控制的操纵子学说，7 0 年代初期d n a 限制 性内切酶的发现和整套d n a 体外重组技术基因工程技术的发展，推动了分 子生物学在广“凄窝深凄琵方瑟的瘫速蓬勃发袋。鼓菜释意义上谨，技零冬方法瓣 发展、进步_ j f 口创新是推动生物化学与分子生物学理论飞速发展的直接动力。融 2 0 世纪5 0 年代分予生物学创立以来，新的实验技术和方法层出不穷，特别是i 疆 2 0 3 0 年柬，分子竞隆投零毯薪月吴，豫按羧势予杂交、聚合酶链反黩( p c r ) 等技术已经趟来越广泛并鬻规地用于基础医学研究和临床诊断治疗的各个领域， 并不断得到新的充实与发展。分子生物学技术在肿瘸诊断、预后和治疗中的应篇 薯取褥了一窥翡遴装，在基霾表达魏梭灞、骜强突交豹捡灏、瓣瘫镁里鬃不稳定 性分毒哼、肿瘪的易感性预测、病因检测、早期渗断、肿瘤疗效的监测及预后判断 等方面已发挥了重疆作用。从细胞水平、分予水平等不同屡次深入探索嫩命与自 然豹爽秘，成为分子生物学磷衮瓣热煮掰在。 瓯于核酸分子杂交的蕊度特异性及检测方法的灵敏性，它已成为分子生物学 中最常用的基本技术之一，被广泛应用于基因克隆的筛选，酶切阁谱的制作，艇 因净弼静定凝和定往分辑发基因突交静裣灞等。其蘩本琢臻是美蠢一定箍滚毪瀚 两条核酸单链在一定的条 孛下( 适宜的温度及离子强度等) 可按碱基互孙原则杂 交成双链。杂交的双方是待测核酸序列及探针( p r o b e ) ， 寺测核黢序列可以是克 隧韵蕊因特链段，穗可隘蹩来克隆亿静基因缀d n a 茅鞋细藤总r n a 。核羧探锋楚 掺瘸放射性核素、生物素簸其他活性物质标识的，能与特定的核酸序列发生特异 性互补的已知d n a 或r n a 片段。 分子信标是一种新鍪寡核替鼗荧光探铮，其特殊发夹缡构健之其寄离度的杂 交特努性，筑援测攀碱基突变，这一特性使荑优于其它一然传统的核酸深针。因 此，自从分予信标在1 9 9 6 年被首次合成出来以后【”，已经在活体细胞和溶液中 关于d n a r n a p r o t e i n 的相互作用研究中发挥了重嫠作用。 零章扶分缓菝酸援钻这一势子生物学戆基零技本入手，系统讲述了毅型孩酸 探针分子信标的设计原理、合成方法和应用实例。并进一步提出了本论文在发展 分予信标的应用体系方面的主要构想。 核黢分子探针概述 在化学及生物学意义上的探针( p r o b e ) ，是指能与特定的靶分予发生特异性相 互作用的分子，并可以通过一定的检测手段对其进行分析。倒如抗体一抗原、外 源凝集素族东纯合物、生物綮一摭生耱素蛋垂、生长因子一受镩等懿糖互终 用以及互补核酸间的杂交都可以看作燎探针与靶分子的相互作用。蛋白质探针 ( 如抗体) 与特异靶分子烧通过混合力( 疏水离子和氢键) 的作用在少数特异位 点上韵结合，蠢棱酸探镑与互静链豹爱应剿是缀据杂交莽豹长短不露，逶过氢键 几十、几百甚至上干个位点上的结合。这就决定它的特异性。 核酸分子探针根据标记方法不同可粗分为放射住探针和非放射性探针两大 类，裰据棱酸分子搽赞鹁来源及其牲爱又霹叛分舞蘩嚣缀d n a 掇锌、c d n a 搽 针、r n a 探针及人工合成的寡核苷酸探针等几类。根据目的要求的不同，可以 采用不同类型的核酸探钟。d n a 探针还有单链和双链之分。下面分别介绍这几 稀探钟。 ( 1 ) d n a 探针 d n a 探钟是最常雳静核酸搽锌，露长度程足吾碱基对骧上静双链d n a 或擎 链d n a 探针。现融获豹d n a 搽针种类很多，有细菌、病毒、原虫、真菌、动 物和人类细胞d n a 探针，这类探针多为某一基因的全部或部分序列，戚某一非 编码窿碉。这些d n a 片段须是特异鹣，如细蘩盼毒力嚣予萋霞搽锌鞠久类a l u 探豺，这些d n a 揉针的获褥有赖于分子克隆技术的发展和应用。以细精为例， 目前分子杂交技术用于细菌的分类和菌种鉴定比用c r + c 酉分比值要准确得多， 蹩细菌分类掌辩一个发展方向，黼之分子杂交菝术酌高度敏感往，分子臻菠在糯 凑诊凝上具窍广泛的兹景。 d n a 探针( 包括e d n a 探针) 有三大优点：第一，这类探针多克隆在质粒 载体中，可以无限繁殖，取之脊鬈，蒂备方法简便。其次，d n a 探锌不荔降解 ( 稳慰r n a 瑟言) ，一般糍毒效挣刳d n a 戆潘蛙。第三，d n a 摄针的标记方 法较成熟，有多种方法可供选择，如缺口平移法、随机引物法、p c r 标记法等， 2 能用于同位素和非同位素标记。 ( 2 ) c d n a 探针 e d n a 是指互补于m r n a 的d n a 分子( c o m p l e m e n t a r yd n a ) 。e d n a 是由 r n a 经一种称为逆转录酶的d n a 聚合酶催化产生的。携带逆转录酶的病毒侵入 宿主细胞后，病毒r n a 在逆转录酶的催化下转化成双链e d n a ，并进而整合入 宿主细胞染色体d n a 分子，随宿主细胞d n a 复制同时复制，这种整合的病毒 基因组称为原病毒。在静止状态下，可被复制多代，但不被表达，故无毒性，一 旦因某种因素刺激而被活化，则该病毒大量复制。如其带有癌基因，还可能诱发 细胞癌变。 逆转录现在己成为一项重要的分子生物学技术，广泛用于基因的克隆和表 达。从逆转录病毒中提取的逆转录酶也已商品化。最常用的有a m v 逆转录酶。 利用真核m r n a 3 味端存在一段聚腺苷酸尾，可以合成一段寡聚胸苷酸用作引 物，在逆转录酶催化下合成互补于m r n a 的e d n a 链，然后再用r n a s eh 将 m r n a 消化掉，再加入大肠杆菌d n a 聚合酶i 催化合成另一条d n a 链，即完 成了从m r n a 到双链d n a 的逆转录过程。 所得到的双链e d n a 分子经s 1 核酸酶切平两端后接一个有限制酶切点的接 头( a d a p t e r ) ，再经特定限制酶消化产生粘性末端，即可与含互补末端的载体进行 连接。常用的克隆载体是九噬菌体d n a ，如x g t 、e m b l 和c h a r o n 系列等。用 这类载体可以得到包含1 0 5 以上转化子文库，再经前面介绍的筛选方法筛选特定 基因克隆。用这种技术获得的d n a 探针不含有内含子序列。因此尤其适用于基 因表达的检测。 ( 3 ) r n a 探针 r n a 探针是一类很有前途的核酸探针，由于r n a 是单链分子，所以它与靶 序列的杂交反应效率极高。早期采用的r n a 探针是细胞m r n a 探针和病毒r n a 探针，这些r n a 是在细胞基因转录或病毒复制过程中得到标记的，标记效率往 往不高，且受多种因素的制约。这类r n a 探针主要用于研究目的，而不是用于 检测。例如，在筛选逆转录病毒人类免疫缺陷病毒( h i v ) 的基i 圈组d n a 克隆 时，因无d n a 探针可利用，获得h 1 v 的全套标记m r n a 作为探针，成功地筛 选到多株h t v 基因组d n a 克隆。 随着体外逆转录技术不断完善，已成功的建立了单向和双向体外转录系统。 该系统主要基于一类新型载体p s p 和p g e m ，这类载体在多克隆位点两侧分别 带有s p 6 启动子和t 7 启动子，在s p 6 r n a 聚合酶或t 7r n a 聚合酶作用下可进 行r n a 转录。如果在多克隆位点接头中插入了外源d n a 片段，则可以以d n a 两条链中的一条为模板转录生成r n a 。这种体外转录反应效率很高，在1 小时 内可合成近l o n g 的r n a 产物。只要在底物中加入适量的放射性或生物素标记 的d u t p ，则所合成的r n a 可得高效标记。该方法能有效地控制探针的长度并 可提高标记分子的利用率。 r n a 探针和e d n a 探针具有d n a 探针所不能比拟的高杂交效率，但r n a 探针也存在易于降解和标记方法复杂等缺点。 ( 4 ) 寡核苷酸探针 前述三种探针均是可克隆的，但是，较长的克隆探针对于靶序列变异的识别 能力又有所降低。对于仅是单个碱基或少数碱基不配的两个序列，克隆探针不能 区分，往往杂交信号相当