（微生物学专业论文）盐藻64光裂合酶基因的功能鉴定及表达研究.pdf

“ 、 f q 四川大学硕士学位论文 四j h 大学硕士学位论文 的修复活性，能使s y 2 的存活率提高约1 1 倍：高强度的紫外线( 0 5 j m 2 ) 造 成的损伤过于严重对生物体是强致死的，菌落存活率都已降到1 0 - 2 以下，c p d 光裂合酶和6 4 光裂合酶难以在短时间内对其加以修复；同时从实验的角度证 明了d s 6 4 p h r 属于6 - 4 光裂合酶基因而非c p d 光裂合酶基因。 2 、完成了d s 6 4 p h r 基因的原核表达、纯化以及条件的优化。构建 p e l 3 0 a - d s 6 4 p h r 表达载体；将其转入ec o l ib l 2 1 ( d e 3 ) 进行融合蛋白的表 达；通过洗涤包涵体的办法纯化d s 6 4 p h r 融合蛋白 实验确立使用t y p g 培养基，在l m m o l l 的i p t g 终浓度下3 7 c 诱导表达 4 h ：通过s d s - - p a g e 分析证实产物大小为7 3 k d ，与耳的蛋白大小相符：目的 蛋白仅仅以不溶性的包涵体形式出现在细胞破碎后的沉淀重悬液中；最终通过 缓冲液洗涤包涵体得到纯净的目的蛋白。 3 、制备了d s 6 4 p h r 的多克隆抗体。采用皮下多点注射方法，用纯化的日 的蛋白做抗原免疫兔子制备目的蛋白特异性的多克隆抗体。 通过双向免疫扩散法实验测定效价为1 ：3 2 ，特异性好；达到w e s t e r n 杂交 实验对多克隆抗体效价及特异性的要求。 4 、研究了d s 6 4 p h r 在不同条件下的m r n a 和蛋白质的表达特性。通过 n o r t h e r n 和w e s t e r n 杂交实验，选择光照培养时间、紫外照射强度、黑暗条件诱 导及商盐环境胁迫为实验条件，以时间的变化为实验参数，研究目的基因在r n a 水平及蛋白质水平上表达量的差异性。 实验结果显示光照条件对r n a 及蛋白的表达量都具有一定的诱导作用，并 都在8 h 时达到最高值；而紫外照射及长时间的黑暗培养对表达的诱导情况不明 显；高盐胁迫环境下，随着诱导时间的变化，基因的表达量差异明显，从2 h 开 始蛋白表达量呈增加趋势，到2 4 h 开始递减，整个过程呈由增到减的变化趋势； 同时发现d s 6 4 p h r 的表达情况及表达水平特性有别于其他物种的光裂合酶基 因。 关键词：盐生杜氏藻紫外线6 - 4 光裂合酶光产物 2 四川大学硕士学位论文 t h ef u n c t i o nc h a r a c t e r i z a t i o na n de x p r e s s i o nr e s e a r c ho ft h e 6 - 4p h o t o l y a s eg e n ed s 6 4 p h rf r o md u n a l i e l l as a l i n a m a j o r m i c r o b i o l o g y g r a d u a t e1 3o i a na d v i s o rc a oy i t h ei r r a d i a r i a no fu l t r a v i o l e tc a l li n d u c eo x i d i z e d - l e s i o n sl i k el e t h a lp y r i m i d i n e d i m e r si no r g a n i s mg e n o m e s o n es i g n i f i c a n tl e s i o ni st h e6 - 4p y r i m i d i n ep y r i m i d o n e p h o t o p r o d u c t ( 6 - 4p p ) i td i r e c t l yc a u s e sa p o p t o s i s ，t h u sar e m a r k a b l e i n d u c e ro f m u t a t i o na n dc e l ld e a t h o nt h eo t h e rh a n d ，c y c l o b u t a n ep y r i m i d i n ed i m m e r ( c p d ) i u s th a sa l le f f e c to fc c l lc y c l ea r r e s t t h e r e f o r e ，t h er e s e a r c ha n du t i l i z a t i o no ft h e6 - 4 p h o t o l y a s eg e n ei so f p r e d o m i n a n ts i g n i f i c a n c e d u n a l i e l l as a l i n ai sas a l t - t o l e r a n tu n i c e l l u l a rg r e e na l g aw h i c hc a ns u r v i v e e x t r e m es a l t ye n v i r o n m e n ta n dp o s s e s s e sc o m p a r a t i v et o l e r a n c ea g a i n s tu v w eh a dr e p o r t e dt h a tt h e6 - 4p h o t o l y a s eg e n ed s 6 4 p h ro fd u n a l i e l l as a l i n a h a d b e e ns u c c e s s f u l l yc l o n e df o rt h ef i r s tt i m e o nt h a tg r o u n d w o r k , w ed i das e r i e s o fr e s e a r c ho nt h i sg e n ef o c u s i n go np r o p e r t i e so fl e s i o n - r e p a i rp e r f o r m e db yt h e g e n ep r o d u c t6 - 4p h o t o l y 鹌ca n dg e n ee x p r e s s i o na t t h el e v e lo fn u c l e i ca c i da n d p r o t e i n 1 、t h ef u n c t i o no ft h eg e n ed s 6 4 p h rw a si d e n t i f i e d 访v i v at h r o u g h c o m p l e m e n t a r ye x p e r i m e n t t os t u d y i t sa n t i u vp r o p e r t i e s 。d s 6 4 p h rw a s t r a n s f o r m e di n t ot h ec p d - d e f e c t i v es t r a i ns y 2 t h eg e n eo fc p dp h o t o l y a s ew a s 3 四川大学硕士学位论文 t r a n s f o r m e di n t os y 2c o n s t r u c t i n gas t r a i na sp o s i t i v ec o n t r o lc o m p a r e dw i t ht h e s t r a i nc o n t a i n i n gd s 6 4 p h r ；s y 2c o n t a i n i n go n l yp e t 3 2 aa s n e g a t i v ec o n t r o l r e f l e c t i n gt h ee x c l u s i v ee f f e c to fd s 6 4 p h r a c c o r d i n gt ot h ed a t aa c q u i r e d , w e c o n c l u d e dt h a p h o t o r e a c t i v a t i o ns h o u l da c c o u n tf o rt h er a i s eo fs u r v i v a lr a t eo ft h e p h o t o l y a s e - e x p r e s s i n gs t r a i n ；t h e6 - 4p h o t o l y a s ec o u l dr e p a i rt h eu v - s c a t h e dc e l l ， r a i s i n gt h es u r v i v a lr a t ea b o u to n et i m e ；ec o l i p h o t o l y a s ep o s s e s sg r e a t e ra c t i v i t i e s i n r e p a i r i n gu v - i n d u c e d l e s i o n sc o m p a r e dw i t h6 - 4p h o t o l y a s ed e r i v e df r o m d s 6 4 p h rw i t hw h i c ht h es u r v i v a lr a t eo fs y 2w e r ea p p r o x i m a t e l y l lt i m e so ft h e p e t 3 2 as t r a i n ；s e v e r el e s i o n si n d u c e db yi n t e n s eu vl i g h t ( o 5 j m 2 ) c o u l dn o tb e r e v e r s e db yb o t he n z y m e sa tt h em o m e n ta st h es u r v i v a lr a t ed e c l i n e dt ob e l o w1 0 - 2 ； a n dd s 6 4 p h rw a se x p e r i m e n t a l l yp r o v e dt ob ea6 4p h o t o l y a s eg e n er a t h e rt h a na c p d p h o t o l y a s eg e n e 2 、t h ep r o k a r y o t i ce x p r e 豁i o no fd s 6 4 p h ra n dt h ep u r i f i c a t i o no ft h ef u s i o n p r o t e i ni n c l u d i n gc o n d i t i o no p t i m i z a t i o n w e r e a c c o m p l i s h e d v e c t o rp e t 3 0 a d s 6 4 p h r w a s c o n s t r u c t e d a n d t r a n s f o r m e d i n t o ec o l i b l 2 1 ( d e 3 ) t o o v e r e x p r e s s t h e f u s i o np r o t e i nd e f t v e df r o md s 6 4 p h r ；i n c l u s i o n b o d i e sw e r ew a s h e dt h e nt h e f u s i o np r o t e i n sa c q u i r e d t y _ p gm e d i u mw a su t i l i z e d c e l l sw e r ei n c u b a t e dw i t h 口t gf o r4 ha t3 7 。ct os u f f i c i e n t l ye x p r e s st h ep r o t e i n t h e ns d s p a g ea n a l y s i s w a sp e r f o r m e da n dt h eo u t c o m ei n d i c a t e dt h a tt h ep r o t e i nw a s7 3 k d w h i c hw a s c o n s i s t e n tw i t ha n t i c i p a t i o n h o w e v e r , p r o t e i n se x p r e s s e dr e m a i n e di nt h ef o r mo f i n c l u s i o n b o d i e si nt h er e - s u s p e n d e ds o l u t i o na f t e ru l t r a s o n i cd i s r u p t i o n w ew a s h e d t h ei n c l n s i o n b o d i e sw i t hr e l e v a n tb u f f e rt h e na c q u i r e dt h ef u s i o n p r o t e i nw i t h r e q u i r e dp u r i t y 3 、t h ep o l y c l o n a la n t i b o d i e s ( p c a b ) a g a i n s tt h ep r o t e i nd e r i v e df r o md s 6 4 p h r w c r ea c q u i r e d r a b b i t sw e r em u l t i s u b c u t a n e o u l yi n j e c t e dt op r o d u c et h ef u s i o n p r o t e i n - s p e c i f i ca n t i b o d i e s p r o t e i n sa c q u i r e dt h r o u g hp u r i f i c a t i o nw e r eu t i l i z e da s a n t i g e n s t h et i t e ro fp c a bd e t e c t e db yd o u b l ei m m u n o d i f f u s i o nt e s tw a s1 ：3 2t h u s c o u l db eu t i l i z e di nw e s t e r n b l o t t i n g 4 、c o n c e r n i n ga b o u t t h i sg e n e ( d s 6 4 p h r ) ，t h ec h a r a c t e r i s t i c so fm r n a 4 四川大学硕士学位论文 p r o d u c ea n dp r o t e i ne x p r e s s i o nu n d e rd i f f e r e n tc o n d i t i o n sw e r ed i s c u s s e d g e n e e x p r e s s i o nw a si 略p c c 把da tt h el e v e l so fm r n a a n dp r o t e i na f t e rd i f f e r e n tt i m eb y n o r t h e r nb l o t t i n ga n dw e s t e r nb l o t t i n g l r i a b i 妫i n c l u d e dl i g h t - i n c u b a t i n gt i m e u vi r r a d i a t i o ni n t e n s i t y , d a r k - i n c u b a t i o na n ds e v e r es a l t - s t r e s s t h er e s u l t si n d i c a t e d t h a tl i g h ti n c u b a t i o ne x e r t e da l l i n d u c i n ge f f e c to nt h ep r o d u c t i o no fm r n a a n d p r o t e i n , b o t h o fw h i c hr e a c h e dt h e i rc u l m i n a t i o na f t e r8 h ；n e v e r t h e l e s s u v i r r a d i a t i o na n dd a r k - i n c u b a t i o nh a dn oa p p a r e n te f f e c to nt h a t ；u n d e re n v i r o n m e n t o f s e v e r es a l t s t r e s s ，t h ee x p r e s s i o no fg e n ev a r i e dal o ta st h ei n d u c i n gt i m ew a s c h a n g i n g , s a y , t h eq u a n t i t yo fp r o t e i n sb e g a nt or i s ea f t e r2 h ，a n dg r a d u a l l yd e c l i n e d a f t e r2 4 h ；s o m ed i f f e r e n c e si ne x p r e s s i o nb e t w e e nd s 6 4 p h ra n dp h o t o l y a s eg e n e f r o mo t h e rs p e c i e sh a da l s ob e e nf o u n d k e y w o r d ：d u n a l i e l l a 阳砌口，u l t r a v i o l e tr a d i a t i o n ，6 - 4p h o t o l y a s e ，p h o t o p r o d u c t 5 四川大学硕士学位论文 目光中的紫外线( i r e ，2 0 0 3 0 0 n m ) 是环境中一个主要的诱变剂和致癌物， 由它引发的d n a 光损伤与许多疾病相关，如：癌症、着色性干皮病，毛发硫营 养不良、科凯恩氏综合征。 生物细胞受紫外光照射会导致基因的严重损伤。其中最主要的两种损伤产 物分别为环丁烷嘧啶二聚体( c y c l o b u t a n ep y r i m i d i n ed i m m e r ，c p d ) 和6 _ 4 光产 物( 6 4p y r i m i d i n ed i m m e r 或6 - 4p h o t o p r o d u c t ) 。这两种损伤分别构成u v 光产 物的7 0 8 0 和2 0 3 0 。它们分别由两种光裂合酶进行修复：c p d 特异性的 c p d 光裂合酶和6 - 4 光产物特异性的6 - 4 光裂合酶。 现有大量文献报道c p d 光裂合酶对c p d 光产物的修复，但是关于6 4 光裂 合酶修复过程的解释仍然处于假说阶段1 1 8 】，大家各抒己见，未能得到统一的答 案。6 - 4 光产物虽然只占整个细胞d n a 紫外损伤的2 0 - - 3 0 ，但它比c p d 光产 物更具有致突变性，并且它的存在很多时候对细胞是致死性的，因为它能引起 细胞的凋亡，而c p d 光产物仅仅造成细胞周期暂时或短期的停滞现象。 在很多有机体包括人和ec o i l 中，由于缺乏6 - 4 光裂合酶，光复活光线并 不能消除d n a 中的6 - 4 光产物。现在已有文献报道【2 】，将6 - 4 光裂合酶转入小 鼠细胞核，使其表达6 4 光裂合酶基因的抗紫外修复能力，能够明显的降低小 鼠细胞癌变几率，减少小鼠个体在紫外环境下的病变可能性。因此，可以大力 开发研究6 4 光裂合酶基因产物，尝试进行基因治疗人类由于紫外损伤造成的 皮肤疾病；甚至将其运用到化妆品领域，增强人类抗紫外损伤的能力。 目前世界上已经成功克隆得到的完整的6 - 4 光裂合酶基因不超过l o 条，并 且基本上都是从动物或高等植物中得到的，具体的物种为拟南芥1 1 6 1 、响尾蛇、 鲐类、果蝇和非洲爪蟾【”j 盐生杜氏藻( d u n a l i e l l as a l i n a ) 作为一种耐盐性极强的真核单细胞绿藻， 隶属绿藻纲、团藻目，杜氏藻科。它广泛的分布在各种极端恶劣的环境中，能 在高盐溶液中生存【3 l 并能耐受外界盐浓度的剧烈变化，它还能适应大幅度的温 度变化，高静水压，高强光照射及某些杀虫剂和重金属【4 1 。盐藻明显的耐强光 6 四川大学硕士学位论文 性，推测它具有一定的抗紫外能力。 2 0 0 3 年，本实验室成功的克隆到盐藻6 - 4 光裂合酶( 历鲥尸团) 的全长基 因，并对其作了全面的生物信息学分析d s 6 4 p h r 是目前为止人类从单细胞真 核生物中克隆得到的第一条6 _ 4 光裂合酶基因，而盐藻作为实验材料以研究6 _ 4 光裂合酶光修复分子机制具有明显的优势性 普通的大肠杆菌含有c p d 光裂合酶基因，在受到外界紫外损伤后，可通过 光诱导进行损伤后的修复。实验室由日本京都大学p r o f s h i n j iy a s u h i r a 赠予获 得了ec o l ic p d 缺陷型菌株s y 2 。使用s y 2 作为宿主菌，光修复效应只能来自 转入载体所表达的外源基因，实验过程有效的去除了c p d 光裂合酶基因作用的 干扰，是独立研究6 - 4 光裂合酶基因性质的理想材料。 在之前的研究工作中，还没有人将6 _ 4 光裂合酶基因的修复特性做得很细 致，更没有做过表达情况及表达水平的详尽探究，d s 6 4 p h r 的来源更不同于之 前克隆得到的几条6 4 光裂合酶基因。综上所述，本论文的具体实验设计如下： 1 、构建载体将d s 6 4 p h r 转入ec o l is y 2 中进行功能互补实验，鉴定 d s 6 4 p h r 的抗紫外功能； 2 、将ec o l ic p d 光裂合酶基因和不含光裂合酶基因的空载体p e t 3 2 分别 转入s y 2 中作为实验对照，比较d s 6 4 p h r 及大肠杆菌c p d 光裂合酶的修复活 性并研究d s 6 4 p h r 的修复特性； 3 、进行目的基因的ec o l i 原核表达，确立诱导培养的最适条件，并纯化得 到d s 自 p 职目的蛋白； 4 、利用纯化蛋白制备特异性多克隆抗体； 5 、通过n o r t h e r n 和w e s t e r n 杂交实验研究基因的表达情况，以鉴定d s 6 4 p h r 在表达情况及表达水平上与其他光裂合酶基因的差异。 本论文工作的开展为我们更好的认识d s 6 4 p h r ，对整个6 _ 4 光裂合酶修复 机理的研究与分析、对阐明6 4 光裂合酶自身特性起到了相当重要的辅助作用， 甚至对整个光裂合酶蓝光受体家族来说都具有很深远的意义。同时还为更加全 面的了解盐藻这一单细胞模式生物开辟了新的道路和研究方向。 7 四川大学硕士学位论文 论文 第一章应用大肠杆菌c p d 缺陷株s y 2 验证d $ 6 4 p h r 基因功能 盐生杜氏藻( d u n a l m l as a l i n a ) 昏4 光裂合酶基因d s 6 4 p h r ，是人类目前 从单细胞生物中克隆得到的第条的6 - 4 光裂合酶基因，填补了g e n b a n k 光裂 合酶注册基因在藻类方面的空白。 本章实验设计利用p e t 3 2 a 载体将d s 6 4 p h r 转入ec o l i ，诱导表达6 4 光 裂合酶，进行该基因的体内功能验证。野生型的ec o l i 含有c p d 光裂合酶基因， 如果选取普通的野生型ec o l i 作为宿主菌进行功能鉴定实验，势必对6 4 光裂 合酶基因的修复效果产生干扰。故实验选取了ec o l i c t d 光裂合酶缺陷型菌株 s y 2 作为6 4 光裂合酶基因的宿主菌，s y 2 是ec o l ij m l 0 7 的突变株，在基因 组d n a 上人为的缺失了c p d 光裂合酶基因。作为独立研究6 - 4 光裂合酶基因 的紫外损伤修复功能，s y 2 是理想的实验材料。 实验过程中，分别将p e t 3 2 a 空载和携带ec o l ic p d 光裂合酶基因的 p e t 3 2 a 载体转入s y 2 ，作为对照样本，对d s 6 4 p h r 的修复特性进行更深层次 的研究与分析功能验证实验具体分为三大部分，第一部分固定紫外照射强度， 选用可见光修复与否作为变量；第二部分改变紫外照射强度，研究存活率变化 情况；第三部分选用可见光修复时间作为变量，分析其对菌落存活率的影响。 1 材料和方法 1 1 材料 1 1 1 菌种、载体 ec o l ic p d 光裂合酶缺陷型菌株s y 2 由日本京都大学p r o f s h i n j iy a s u h i r a 赠予1 5 】： 表达载体p e l 3 2 a 由本实验室保存。 8 四川大学硬士学位论文 l _ - _ _ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ - _ 。_ _ _ - _ 。_ _ - o o 。o 。_ 。1 。- 。_ _ - _ 。- _ 。_ _ - _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ _ i - _ _ _ _ _ _ _ - _ _ - _ _ _ - 一 1 1 2 基因 盐藻6 - 4 光裂合酶基因d s 6 4 p h r 由本实验室从盐生杜氏藻( d u n a l i e l l a s a l i n a ) 中克隆得到【6 j 1 1 3 试剂 1 0 0 m m o l l i f r g 溶液、1 0 m g 砌r n a 酶溶液、1 0 0 m g m l 氨苄青霉素( a m p ) 溶液- - 2 0 * ( ：下贮存，试剂配方参见分子克隆实验指南第三版附录门； 质粒提取试剂嘲 1 、溶液i 葡萄糖5 0 m m o l i t r i s h c i ( p h 8 0 ) 2 5 m m o l l 星旦坠fp h 8 ：q 2! 虹现q ! 凰 1 2 1 c 灭菌1 5 r a i n ，4 。c 贮存 2 、溶液 n a o h 0 2 m o l l s 旦s! 绥 用前新鲜配制 3 、溶液 k a c ( s t o o l l )6 0 r a l 冰乙酸1 1 5 m l 去离王盔 至! q 陋1 4 ，酚氯仿抽提液 酚与氯仿以i - 1 体积混匀，静置分层，4 0 c 下贮存，使用时取下层液体 5 、t e 缓冲液( p h 8 o ) i r i s h c i ( p h 8 o ) 1 0 m m o l i 垦q 互| 地丛：91 也也q 坦 1 2 1 c 灭菌2 0 r a i n ，4 c 贮存 9 四川大学硕士学位论文 核酸电泳试剂 1 、5 t b b t r i s 5 4 9 硼酸 2 7 5 9 e d t a ( 0 5 m o l l )2 0 m l ( p h ：8 m 去富王丞盐至l l 2 、0 7 琼脂糖凝胶 0 1 4 9 琼脂糖，加入2 0 m l0 5 x t b e 缓冲液，加热至完全熔化， 稍冷加入1 陬ll m g m le b ( 终浓度为0 5 x g m 1 ) ，振荡混匀。 1 1 4 酶制剂、试剂盒 b a m h i ，h i n d ，t 4 连接酶，购自宝生物( t a k a r a ) 工程有限公司； e x t a q t mp c rk i t ，t a 克隆试剂盒购自宝生物( t a k a r a ) 工程有限公司： 胶回收试剂盒购自美国o m e g a b i o - t e k 公司。 1 1 5 引物及测序 引物的合成及测序工作由上海i n v i t r o g e n 公司完成。 1 i 6 培养基 1 、l b 培养基 胰化蛋白胨 1 0 9 酵母提取物 5 9 n a a l o g 去直王丞笾q 璎l 调节p h 到7 o ，高水定容至1 l ，1 2 1 c 湿热灭菌2 0 r a i n 湿热灭菌f 筘每l 液体培养基中加入1 5 9 琼脂粉制成固体l b 培养基； 2 、s o b 培养基 胰化蛋白胨 2 0 9 酵母提取物 5 9 四川大学硬士学位论文 n a a 0 5 9 k a ( 2 5 0 m m o l l ) 1 0 m l 去离王丞 2 5 q 堡l 调p h 至7 o ，高水定容至1 l ，1 2 1 。c 湿热灭菌2 0 m i n 使用前加入5 m l2 m o f l m g c l 2 灭菌溶液： 3 、s o c 培养基 在灭菌待用的s o b 培养基中加入葡萄糖( 0 2 跏m 滤膜过滤除菌) ，终浓度 达到2 0 m m o l l 。 1 1 7 实验仪器设备 紫外光源：超净台用2 0 w2 5 3 7 n m 紫外灭菌灯，照射强度为0 0 5 j ( m 2 。s 1 ； 可见光源：超净台用日光灯4 0 w ： 血球计数板( o 1 m m ，1 4 0 0 r a m 2 ) ，精确秒表。 1 2 方法 1 2 1 最c o l ic p d 光裂舍酶基因的克隆 p c r 反应 1 、根据g e n b a n k 公布的ec o l ic p d 光裂合酶基因序列设计p c r 引物 a n t i s e n s e ：5 一c c a a g ( 1 tg g c g t g t a i ：a g g a c r g g t - 3 s f n s e ：5 一c gg g a t c c 肖t g a c l a c c c a t c i g g l b 3 2 、使用菌液p c r 法，ec o l i j m l 0 9 为模板进行基因克隆 反应体系： 双水3 3 缸l p c rb u f f e r 0 0 x ) 5 l m g c l 2 ( 2 5 r e t o o l l ) 3 “l d m p ( 2 5 m m o f l ) 4 “l 5 ，弓j 物( 2 毗m )m i 3 引物( 2 印m )耻l e xt a q ( 5 m u 0o 5 “l l l 四川大学硕士学位论文 苴遗丛! t 0 t a i 5 毗l 反应条件： 9 4 c 预变性5 m i n 9 4 c 变性3 0 s e c1 5 6 c 退火6 0 s e c - 3 0 个循环 7 2 c 延伸1 5 0 s e c j 7 2 c 延伸1 0 r a i n 3 、p c r 产物使用1 的琼脂糖凝胶电泳，电泳完毕进行胶回收以得到ec o l i c p d 光裂合酶基因。 核酸胶回收 1 、切下凝胶放入1 5 m le p 管，加入等体积的b i n d i n gb u f f e r ，5 5 6 0 。c 温 浴7 r a i n ，每隔2 3 m i n 轻摇1 次，直至凝胶完全溶解； 2 、取7 0 0 a 到提纯柱，1 0 0 0 0 9 离心l o m i n ，再加3 0 0 ”1b i n d i n gb u f f e r 洗 柱，1 0 0 0 0 9 离心l m i n ： 3 、取s p w 和酒精的混合液7 0 0 u l ( s p w ：酒精= l ：4 ) 加入提纯柱，放置2 3 m i n ，1 0 0 0 0 9 离心1 m i l l ： 4 、重复步骤3 ； 5 、去废液，空管1 0 0 0 0 9 离心l m i n ； 6 、将提纯柱转移到1 5 m le p 管上，加入3 0 5 0 , ld n a 沈脱液，1 0 0 0 0 9 离心i m i n ，分2 次离心 含有目的核酸的离心管底部洗脱液，用于之后的t a 克隆反应。 t a 克隆 p m d1 8 一tv e c t o r s o l u t i o ni d n a ( 7 0 n g 肛1 )萎) 1 6 c 她3 0 r a i n 两it o t a l 四川大学硕士学位论文 t a 克隆反应得到的产物经转化后，进行测序。 ， 将所得序列进行b l a s t 比对分析，以确定克隆基因的正确性。 1 2 2s y 2 系列工程茵的制备 $ y 2 感受态细胞的制备 1 、将冷冻保藏的s y 22 m l 接种于2 m ll b 液体培养基中，3 7 c 摇床培养过 夜； 2 、取5 0 0 d 过夜的培养液转接于5 0 m ll b 液体培养基中，3 7 c 摇床培养 2 h ： 3 、转接液置于冰浴中1 0 r a i n ，4 。c4 0 0 0 r p l n 离心沉淀1 2 r a i n ： 4 、将沉淀重悬于1 5 m l 冰冷的t bb u f f e r ，冰浴1 0 r a i n ，4 c4 0 0 0 r p m 离心 沉淀1 2 r a i n ： 5 、将沉淀重悬于4 m l 冰冷的t bb u f f e r ，加入2 8 叽ld m s o ，冰浴至少1 0 m i n ； 6 、分装感受态细胞于0 5 m le p 管中( 每管2 0 ( 0 1 ) ，液氮速冻至少5 m i n ， 后于- - 8 0 。c 冰箱保存。 质粒的提取与电泳 1 、取冷冻保藏的菌液2 叽l 接种于2 m ll b 液体培养基中( a m p 终浓度 5 陬咖1 ) ，3 7 c 摇床培养过夜； 2 、将1 5 1 1 1 1 培养液倒入e p 管，1 2 0 0 0 r p r a 离心3 0 s ： 3 、取细胞沉淀，加入1 0 0 d 冰预冷的溶液i ，剧烈振荡； 4 、加2 0 0 9 l 新鲜配制的溶液i i 于细菌悬液中，盖紧管1 ：2 ，快速颠倒5 次混 合内容物，将e p 管置于冰上； 5 、加入预冷的溶液m1 5 吼l ，盖紧管1 ：3 ，温和振荡1 0 次使溶液在粘 稠的细菌中分散混匀，之后置于冰上3 5 m i n ，1 2 0 0 0 r p m 离心5 m i n ： 6 、取上清，加入等体积的酚，氯仿( 约4 5 叽i ) ，反复混匀，1 2 0 0 0 r p m 离心 2 r a i n 7 、取上清，加入2 3 倍体积无水乙醇( 约8 0 0 # 1 ) ，混匀后，室温放置5 1 0 r a i n ，1 2 0 0 0 r p m 离心5 r a i n 收集沉淀的双链d n a ； 四川大学硕士学位论文 8 、吸干上清，加i m l7 0 乙醇洗涤质粒，振荡混合，1 2 0 0 0 r m p 离心2 m i n ， 弃上清，空气中干燥沉淀； 9 、加3 0 5 即lt e 缓冲液和m lr n a 酶( 2 叽g h a ) ，3 7 。c 温浴3 0 m i n ； l o 、将质粒d n a 样品却l 与适量l o a d i n gb u f f e r 混匀，连同d n am a r k e r 斯l ，进行琼脂糖凝胶( o 7 ) 电泳： 1 1 、电泳后的凝胶在紫外光下照相，得到电泳图谱。 表达载体的构建 1 、分别以b a m hi ，h i n dh i 为作用位点对盐藻6 4 光裂合酶基因片段 ( d s 6 4 p h r ) 、ec o l ic p d 光裂合酶基因片段、表达载体p e t 3 2 a 进行双酶切； 2 、d s 6 4 p h r 和c p d 基因片段分别与p e t 3 2 a 载体片段在t 4 连接酶的作用 下，1 6 0 c 连接过夜； 表达载体的构建过程如图i i 所示。 酶切反应体系： 质粒d n a 4 3 d 1 0 x k b u f f e r5 “l b a m h ih l 麴d 班 ! 丛l t o t a l 5 0 u l 充分混合均匀，3 t c 温浴6 8 h ，电泳回收核酸片段； 连接反应体系： 基因片段缸l 载体片段m i 1 0 x t 4b u f f e r1 l t 4 连接酶批l 瑟丞驰l t o t a l1 0 比i 1 4 四川大擘硕士学位论文 充分混合，1 6 c 反应过夜，连接液直接转化ec o i ls y 2 。 h i 。缸i r b k 双酶切 j _ 蠢曩豳瞄曩墨奠圈_ d s 昏i p 腿 h i n d m 也舡艘酶切 小 首 图1 1 工程菌转化载体的构建 s y 2 的高效转化 l 、取出感受态细胞室温溶解，在3 个各装有2 0 叽l 感受态细胞的e p 管中 分别加入l 毗lp e t 3 2 a 、p e t 3 2 a - d s 6 4 p h r 和p e t 3 2 a - c p d ，轻轻旋转以混匀内 容物，冰浴3 0 m i r l ； 2 、将冰浴后的感受态细胞置于4 2 。c 水浴中，热激9 0 1 2 0 s ( 秒表计时) ； 3 、快速将e p 管转移至冰浴，冷却3 5 m i n ； 4 ，每个e p 管中加入8 0 0 , 1 的s o c 培养基，用循环水浴将培养基加热1 5 m i n 至3 7 等温； 5 、将e p 管转移至3 7 c 摇床，孵育4 5 r a i n 使细菌复苏并表达p e t 3 2 a 质粒 编码的a m p 抗性基因； 6 、温育后的细胞培养液5 0 0 0 r p m 离心5 r a i n ： 7 、弃上清，留约1 0 0 u 1 重悬沉淀，充分混合均匀后涂平板( 培养基含5 0 t g m l 四川大学硕士学位论文 a m p ) ，3 7 。c 培养箱培养过夜，平板待检。 s y 2 系列工程菌的验证 1 、对分别转入了p e t 3 2 a 、p e t 3 2 a - d s 6 4 p h r 和p e t 3 2 a - c p d 的s y 2s e 程 菌挑取单菌落，进行液体培养，提取质粒； 2 、所得质粒连同1 5 ，0 0 0 b p 的d n am a r k e r ，o 7 琼脂糖凝胶，7 5 v 电泳 4 0 m i l l ； 3 、电泳完毕的凝胶在紫外光下照相，得到电泳图。 s y 2 系列工程菌l b 固体平板的准备 1 、在3 支装有2 m ll b 液体培养基( a m p 终浓度为5 毗咖1 ) 的试管中， 分别接种s y 2p e t 3 2 a 、s y 2p e t 3 2 a - d s 6 4 p h r 、s y 2p e t 3 2 a - c p d 各2 0 “l ，3 7 0 c 摇床培养过夜； 2 、次日，取出培养菌液，各取l r n l 于1 5 m le p 管内，分别加入衄li p t g ( 终浓度为i m m o l l ) ，2 8 c 摇床诱导培养4 h ： 3 、诱导后的菌液取s y 2p e t 3 2 a 、s y 2p e t 3 2 a - d s 6 4 p h r 、s y 2p e t 3 2 a c p d 各5 叽i 于1 5 m l e p 管内，分别加入灭菌双水，稀释1 0 倍； 4 、稀释l o 倍的菌液在4 0 倍显微镜下用血球计数板计数； 5 、按照各自的计数结果，计算确定涂布平板时相应的菌液用量( 菌液用量= 1 0 0 0 ( 计数均值俗) ，也即涂布到平扳上的总菌数约为2 1 0 8 ； 6 、按照计算结果各取相应的菌液于新的1 5 r n le p 管，1 0 0 0 0 r p m 离心5 r a i n ， 留约5 0 a l 上清重悬菌体，备涂平板； 7 、将准备好的菌液涂布在含a i n p5 0 z e c r n l 的l b 固体培养基上，涂好的平 扳光下静置2 0 m i n 。 1 2 3d s 6 4 p h r 在s y 2 中的功能鉴定 1 、d s 6 4 p h r 在s y 2 中光修复功能的初步验证： 涂布s y 2p e t 3 2 a 、s y 2p e t 3 2 a - d s 6 4 p h r 、s y 2p e t 3 2 a - c p d 的平板各2 个进行实验，实验重复5 次。 四川大学硕士学位论文 6 个平板采用0 2 5 j m 2 的紫外线进行开盖照射； 照射完毕立即盖上盖子，每个样品各取1 个用报纸包严( 不透光) ，3 7 。c 培养箱培养4 0 h ，另3 个平板在可见光源下放置3 0 m i n 进行光复活，再用报纸 包严( 不透光) ，3 7 。c 培养箱培养4 0 h ； 统计菌落数，绘制曲线图并对数据加以分析 2 、紫外线强度梯度实验： 涂布s y 2p e t 3 2 a 、s y 2p e t 3 2 a - d s 6 4 p h r 、s y 2p e t 3 2 a - c p d 的平板各6 个进行实验。 平板采