（生物化学与分子生物学专业论文）三种昆虫多糖的分离纯化与免疫活性研究.pdf

摘要 多糖是生物体内的重要大分子之一，具有调节免疫、抗肿瘤、抗病毒、抗衰老等多 种生理功能，在医药和食品领域显示了很好的应用前景，因而受到人们的广泛关注。但 是目前多糖研究主要以真菌、植物为主。动物多糖相对较少，昆虫多糖极少有人涉及， 研究严重不足。昆虫是自然界种类最多、数量最大的生物类群，也是地球上最大的未被 充分开发的资源。开展昆虫多糖的研究，有利于丰富活性多糖的来源，提高昆虫的附加 值，深化昆虫资源的综合利用，为进一步开发昆虫食品或药物奠定理论和实验基础。 本论文以蚕( b o m b y x m o r i l i n n a e u s ) 蛹、喙尾琵琶甲( b l a p sr h y n c h o p t e r a f a i r m a i r e ) 、 蟑螂( p e r i p l a n e t aa m e r i c a n al i n n a e u s ) 为原料，利用现代分离纯化技术和仪器分析鉴定 手段对这三种昆虫体内的多糖进行了较系统深入的研究，并进行了粗多糖对小鼠免疫系 统的影响及急性毒性实验研究，主要研究内容和结果如下： ( 1 ) 提取方法研究以提取温度、提取时间、碱浓度、酶活力为影响因子作正交 实验设计，分别采用热水浸提、稀碱液提取、酶解提取等不同的方法对昆虫多糖进行提 取，通过比较各种方法对昆虫多糖含量的影响，确定了适合每种昆虫多糖的提取方法： 蚕蛹多糖s p p s 适宜用碱液提取，最佳实验条件是碱液浓度为o 0 2 m o l l ，实验提取温度 8 0 ，提取时间为3 h ；喙尾琵琶甲多糖b f p s 和蟑螂多糖c p s 宣用蛋白酶水解法提取， 最佳实验条件分别是提取温度5 0 c ，酶量2 0 0 鹏，g ，提取时间为1 h 以及提取温度5 0 c ， 酶量2 0 0 娜瞻，提取时间为2 h 。在上述最佳条件下所得三种粗品中多糖含量平均为2 7 9 、 6 o 、8 o 。 ( 2 ) 脱蛋白与脱色研究以蚕蛹多糖为研究对象，比较了s e v a g e 法、酶法结合 s e v a g e 法、三氯乙酸法脱蛋白效果以及活性炭和过氧化氢脱色效率。结果s e v a g e 法、酶 法结合s e v a g e 法蛋白脱出率分别是2 5 4 8 和1 9 4 1 ，而三氯乙酸法处理的多耱蛋白脱 除率高达5 1 2 7 5 ，远远高于其他两种方法；过氧化氢脱色后，蚕蛹多藉溶液由深棕色变 为淡黄色，醇沉后多糖颜色为浅黄色，脱色效果明显好于活性炭。将三氯乙酸和过氧化 氢用于其他两种多糖，效果较好。实验结果表明，三氯乙酸和过氧化氢用来脱除三种昆 虫多糖中的蛋白和色素效果较好。 ( 3 ) 分离纯化研究 利用d e a e s e p h a r o s e 离子交换柱层析和s e p h a d e xg 1 0 0 凝胶柱层析对多糖进行纯化，从蚕蛹粗多糖中分离得到两个组分p s p p s 1 和p s p p s - 2 ， 喙尾琵琶甲一个组分p b f p s 3 ，蜂螂粗多糖一个组分p c p s - 2 。其中p c p s 2 经纯度鉴定， 初步判定为纯品，理化指标检测多糖含量4 5 8 4 ，蛋白含量3 9 1 5 可能是糖一蛋白复 合物。其他组分有待进一步检测。 ( 4 ) 三种粗多糖免疫活性研究和急性毒性对三种粗多糖进行了小鼠免疫调节功 能和急性毒性试验，免疫结果显示，蚕蛹粗多糖能显著提高i c r 种小鼠的脾脏指数、巨 噬细胞吞噬指数、淋巴细胞转化率和血清溶血素o d 值，表明蚕蛹粗多糖具有较好的提高 机体非特异性免疫、细胞免疫、体液免疫的功能；喙尾琵琶甲粗多糖和蟑螂粗多糖能显 著提高i c r 种小鼠的脾脏指数、巨噬细胞吞噬指数和血清溶血素o d 值，但对淋巴细胞转 化率影晌不明显，表明喙尾琵琶甲租多糖和蟑螂粗多糖对小鼠非特异性免疫和体液免疫 功能有调节作用，对细胞免疫功能的调节作用不明显。急性毒性实验结果显示，蚕蛹和 蟑螂粗多糖的最大耐受量( m t d ) 是5 0 0 o i n g k g 体重，喙尾琵琶甲粗多糖的半数致死量 l 0 5 0 为4 9 2 4 3 m g k g 体重。 研究结果表明，蚕蛹多糖适宜采用碱液法提取，喙尾琵琶甲多糖和蟑螂多糖宣用蛋白 酶水解法提取；三氯乙酸法和过氧化氢法脱除三种昆虫多糖的蛋白和色素效果较好： d e a e - s e p h a r o s e 离子交换柱层析和s e p h a d e xg - 1 0 0 凝胶柱层析可以较好地分离三种昆 虫多糖的各组分：蚕蛹粗多糖具有较好的非特异性免疫、细胞免疫、体液免疫功能，喙 尾琵琶甲粗多糖和蟑螂粗多糖对小鼠非特异性免疫和体液免疫功能有调节作用，对细胞 免疫功能的调节作用不明显。 本论文首次利用蚕蛹、喙尾琵琶甲和蟑螂为原料，对这三种昆虫体内的多糖进行了 较系统深入的研究，首次发现蟑螂和云南民间药用昆虫喙尾琵琶甲的酶解醇沉物具有非 特异性免疫和体液免疫调节功能，再次验证了昆虫体内也含有丰富多糖物质的观点，发 现昆虫多糖以静脉注射的方式给药具有调节机体免疫功能的生物活性，为昆虫药物的研 究与开发提供理论基础和实验基础 关键词：蚕蛹，喙尾琵琶甲，蟑螂，多糖，免疫，急性毒性 a b s t r a c t p o l y s a c c h a g i d ei so n ek i n do fi m p o r t a n tl a r g em o l e c u l e si no r g a n i s ma n dh a sm a n y p h y s i o l o g i c a lf u n c t i o n s ，s u c h a s i m m u n o m o d u l a t i n ga c t i v i t i e s ，a n t i t u m o r , a n t i v i r u s ， a n t i a g i n ga n ds oo n , w h i c hi n d i c a t e si t sp r o m i s i n ga p p l i c a t i o ni nf o o da n dm e d i c i n ef i e l d s h o w e v e r , m o s to ft h er e s e a r c h e sa b o u tp o l y s a c c h a r i d ea r ef o c u s i n go ne p i p h y t e sa n dp l a n t s ， e s p e c i a l l yt r a d i t i o n a lh e r b a lm e d i c i n e ，o n l yaf e wp o l y s a e c h a r i d e sf r o mt h ea n i m a l sw e r e s t u d i e da n dt h ep o l y s a c c h a r i d eo fi n s e c t si sr a r e t h ei n s e c ti st h eb i g g e s tb i o c e n o s ea n d u n e x p l o i t e dr e s o u r c ei nt h ew o r l d t h es t u d i e so ni n s e c tp o l y s a c c h a r i d ew i l li n c r e a s et h ev a l u e o fi n s e c t sa n dd e e p e nt h ec o m p r e h e n s i v eu t i l i z a t i o no fi n s e c t s ，t h e nl a yt h ef o u n d a t i o nf o r d e v e l o p i n gn e w f o o da n dm e d i c i n ef r o mt h ei n s e c t s t h ee x t r a c t i o na n dp u r i f i c a t i o no f p o l y s a c c h a r i d e sf r o mt h r e ei n s e c t s ，s i l k w o r m ( b o m b y x m o r il i n n a e u s ) p u p a , b l a p sr h y n c h o p t e r af a i r m a i r ea n dc o c k r o a c h ( p e r i p l a n e t aa m e r i c a n a l i n n a e u s ) w e r es y s t e m a t i c a l l ys t u d i e di nt h i sd i s s e r t a t i o n m e a n w h i l e ，i n v e s t i g a t i o nw a sm a d e o nt h ei m m u n o l o g i c a lr e g u l a t i o no f t h r e ee r o d ep o l y s a c c h a g i d e so ui n l l t l u n es y s t e mi nm i c ea n d a c u t et o x i c i t ye x p e r i m e n t m a i nc o n t e n t sa n dr e s u l t sa g el i s t e da sf o l l o w s ： ( 1 ) e x t r a c t i o nm e t h o d t h r e em e t h o d sw e r ee m p l o y e di ne x t r a c t i o np r o c e s so f p o l y s a e c h a r i d e sf r o mt h em a t e r i a l s i no r d e rt os e l e c tt h eb e s te x t r a c t i o n t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sf o rt h ee x t r a c t i o nw e f eo b t a i n e d b yu s i n go r t h o g o n a ld e s i g nl 9 ( 3 4 ) a sr e s u l t , a l k a l i n e - s o l u t i o ni st h eb e s tm e t h o df o r e x t r a c t i o no fs i l k w o r mp u p ap o l y s a c c h a g i d e ( s p p s ) t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sa r e ：a l k a l i n e s o l u t i o nc o n c e n t r a t i o n0 0 2 m o l l , t e m p e r a t u r e8 0 c t i m e3h o u r s i nc 黜o fc o c k r o a c h e s p o l y s a e e h a r i d , ( c p s ) ，e n z y m ei st h eb e s tm e t h o d t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sa r e ：p a p a i n2 0 0 腭，g ，t e m p e r a t u r e5 0 ，t i m e 2 h o u r s f o r b l a p s r h y n c h o p t e r a f a i r m a i r e p o l y s a e c h a r i d e ( b f p s ) , e n z y m ei st h eb e s tm e t h o d t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sa r e ：p a p a i n2 0 0 p g g ，t e m p e r a t u r e5 0 c ， t i m elh o u r u n d e rt h e s ec o n d i t i o n s 。t h ea v e r a g ec o n t e n to fp o l y s a c c h a r i d ei nt h r e ee x t r a c t si s 2 7 9 6 o 8 0 r e s p e c t i v e l y ( 2 ) r e m o v a lo f p r o t e i na n dc o l o r s e v a g em e t h o d ，e n z y m ed e c o m p o s i t i o nw t hs e v a g em e t h o d ，u i c h l o r o a c e f i ca c i dc r c a ) s e d i m e n t a t i o nw e r eu s e dt ol i m i n a t et h ep r o t e i nf r o mt h es p p sb e f o r ep u r i f i c a t i o n b a s e do i l e x p e r i m e n t a lr e s u l t s ，i t w f l $ s u i t a b l et oa d o p tt c as e d i m e n t a t i o nt od e p r o t e i n a t i o ma f t e rt h a t , 5 1 2 7 p r o t e i no fs p p sc o u l db er e m o v e d , t h es e v a g em e t h o di s 2 5 4 8 a n de n z y m e d e c o m p o s i t i o nw i t hs e v a g em e t h o d1 9 4 1 i na d d i t i o n , t h ec o l o ro fp o l y s a c c h a r i d es o l u t i o n t u r n e df r o md e e pb r o w nt ol i g h ty e l l o wa f t e ro x y d o lu - e a l m e n t w h i c hs u g g e s t so x y d o lc a nb e m o r ee f f i c i e n tt h a na c t i v ec a r b o na sd e c o l o r a n t t h er e s u l tw a st h es a l v ea f a rt h eo t h e rt w o c r u d ep o l y s a c c h a r i d e sw e r et r e a t e dw i t ht c aa n do x y d 0 1 ( 3 ) i m l a t i o na n dp u r i f i c a t i o n t h e d e a e - s e p h a r o s e i o n e x c h a n g ec h r o m a t o g r a p h y a n d s e p h a d e x g - 1 0 0g e l c h r o m a t o g r a p h yw e t ea p p l i e dt of u r t h e rp u r i f yt h ec r u d cp o l y s a c c h a r i d e s t w of r a c t i o n sw e r e g m n e df r o ms p p s ，n a m e d a sp s p p s - l a n dp s p p s 一2 ，o n ef r o mb f p s ，p b f p s - 4 ，o n ef r o mc p s ， p c p s - 2 t h ep u r i t yd e t e r m i n a t i o ns h o w e dp c p s - 2w a sap u r ep r o d u c t i th a s4 5 8 4 p o l y s a c c h a r i d ea n d3 9 1 5 p r o t e i n , w h i c hi n d i c a t e dp c p s 一2 i sp o l y s a c c h a r i d e - p r o t e i n c o m p l e x t h eo t h e rf r a c t i o n sn e e dt ob ed e t e r m i n e da n da n a l y s e d ( 4 ) i m m u n o m o d u l a t i n ga c t i v i t i e sa n da c u t et o c i t ye x p e r i m e n t t h ei m m u n o m o d u l a t i n ga c t i v i t i e so ft h r e ec r u d ep o l y s a c c h a r i d e si nm i c ei n d i c a t e dt h a t s p p sh a se v i d e n tn o n s p c c i f i c , c e l l u l a ra n d h u m o r a li m m u n i t y , t h a tb f p sa n dc p sc a na l h a i c e n o n s p e c i f i ca n d h u m o m li m m u n i t y , b u th a v en or e m a r k a b l ee f f e c to nc e l l u l a ri m m u n i t y a c u t e t o x i c i t yt e s ts h o w e dt h em a x i m a lt o l e r a n c ed o s e ( m t d ) o fs p p sa n dc p si s t h es 跚e 5 0 0 m g k g t h em e d i a nl e t h a ld o s ec l d s o ) o f b f p si s4 9 2 4 3m g k g k e yw o r d s ：b o m b y xm o r il i n n a e u s ，b l a p sr h y n c h o p t e r af a i r m a i r e ，p e r i p l a n e t aa m e r i c a n a l i n n a e u s ，p o l y s a c c h a r i d e ，i m m u n e ，a c u t et o x i c i t y 表目录 表2 一l 蚕蛹多糖碱液提取的因素和水平1 7 表2 2 蚕蛹多糖酶解提取的因素和水平1 7 表2 3 蚕蛹多糖稀碱液提取条件及结果2 0 表2 4 蚕蛹多糖蛋白酶水解提取条件及结果2 1 表2 5 喙尾琵琶甲多糖稀碱液提取条件及结果2 2 表2 - 6 喙尾琵琶甲多糖蛋白酶水解提取条件及结果2 3 表2 7 蟑螂多糖稀碱液提取条件及结果2 5 表2 8 蟑螂多糖蛋白酶水解提取条件及结果2 6 表2 - 9 三种粗多糖的初步测定2 7 表2 1 0 三种昆虫粗多糖的氨基酸分析( ) 2 8 表3 - i 蚕蛹多糖不同脱蛋白方法的比较3 5 表3 2 三种昆虫多糖脱蛋白、脱色处理前后多糖与蛋白含量变化3 6 表4 - 1 蚕蛹粗多糖对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响( 膏+ s d ，) 5 l 表4 2 蚕蛹粗多糖对小鼠免疫脏器重量的影响( i + s d ，) 5 2 表4 3 蚕蛹粗多糖对p 姒刺激小鼠淋巴细胞转化的影响( i s d ，) 5 3 表4 4 蚕蛹粗多糖对小鼠溶血素o d 值的影响( 孑s d ) 5 4 表4 5 喙尾琵琶甲粗多糖对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响( i s d ，) 5 6 表4 - 6 喙尾琵琶甲粗多糖对小鼠免疫脏器重量的影响( 膏+ s d ，) 5 7 表4 7 喙尾琵琶甲粗多糖对p h a 刺激小鼠淋巴细胞转化的影响( 孑+ s d ，) 5 8 表4 8 喙尾琵琶甲粗多糖对小鼠溶血素0 d 值的影响( 孑s d ) 5 9 表4 - 9 喙尾琵琶甲粗多糖毒性试验结果6 0 表4 - 1 0 嫜螂粗多籍对小鼠腹腔巨噬细胞吞噬功能的影响( i4 - s d ，) 6 l 表4 - 1 1 蟑螂粗多糖对小鼠免疫脏器重量的影响( i + s d ，9 6 ) 6 2 表4 1 2 蟑螂粗多糖对p h a 刺激小鼠淋巴细胞转化的影响( i + s d ，) 6 3 表4 - 1 3 蟑螂粗多糖对小鼠溶血素0 d 值的影响( i + s d ，) 6 4 i 图目录 图卜1 昆虫多糖研究技术路线1 3 图2 - 1 葡萄糖标准曲线1 8 图2 2 牛血清白蛋白标准曲线1 9 图2 3 蚕蛹多糖不同提取方法多糖含量比较2 2 图2 - 4 喙尾琵琶甲多糖不同提取方法多糖含量比较2 4 图2 5 蟑螂多糖不同提取方法多糖含量比较2 7 图2 - 6 三种昆虫多糖的多糖和蛋白含量2 8 图3 1 蚕蛹多糖不同脱蛋白方法的比较3 5 图3 2 处理前后多糖含量比较3 7 图3 - 3 处理前后蛋自含量比较3 7 图3 4 蚕蛹多糖的d e a e s e p h a r o s e 柱洗脱曲线3 8 图3 5s p p s l 组分的s e p h a d e xg 一1 0 0 凝胶柱洗脱曲线3 9 图3 - 6 喙尾琵琶甲多糖的d e a e s e p h a r o s e 柱洗脱曲线4 0 图3 7b f p s 一3 组分的s e p h a d e xg - 1 0 0 凝胶柱洗脱曲线4 l 图3 8 蟑螂多糖的d e a e - s e p h a r o s e 柱洗脱曲线4 l 图3 - 9c p s 一2 组分的s e p h a d e xg 一1 0 0 凝胶柱洗脱曲线4 2 图3 1 0 蟑螂多糖p c p s - 2 组分的纯度鉴定4 3 图4 一l 免疫调节作用的评价方法4 6 图4 2 吞噬百分率、吞噬指数与蚕蛹多糖剂量的关系5 1 图4 3 胸腺指数、脾脏指数与蚕蛹多糖剂量的关系5 2 图4 4 淋巴细胞转化率与蚕蛹多糖剂量的关系5 3 图4 5 溶血素o d 值与蚕蛹多糖剂量的关系5 4 图4 6 吞噬百分率、吞噬指数与喙尾琵琶甲粗多糖剂量的关系5 6 图4 7 胸腺指数、脾脏指数与喙尾琵琶甲多糖剂量的关系5 7 图4 8 淋巴细胞转化率与喙尾琵琶甲多糖剂量的关系5 8 图4 9 溶血素0 d 值与喙尾琵琶甲多糖剂量的关系5 9 图4 1 0 吞噬百分率、吞噬指数与蟑螂粗多糖剂量的关系6 l 图4 1 1 胸腺指数、脾脏指数与蟑螂粗多糖剂量的关系6 2 图4 一1 2 淋巴细胞转化率与蟑螂多糖剂量的关系6 3 图4 一1 3 溶血素0 d 值与蟑螂多糖剂量的关系。6 4 i v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。尽我所 知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也 不包含为获得本研究生培养单位或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同_ 作的同志 对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：瑚、力乞 眺。垆多月秒日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解中国林业科学研究院有关保留、使用学位论文的规定，中国林业科学研 究院有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权 中国林业科学研究院可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索。可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名：可i j 、 。一年彭月z p 日 学位论文作者毕业联系方式 导师签名： 堋每易勇 巧彩 印日 工作单位：中国林业科学研究院资源昆虫研究所 联系电话：0 8 7 1 - 6 9 5 9 7 9 0 电子邮件：s u n l o n g l 8 1 8 1 2 6 t o m 通讯地址、邮编：云南省昆明市白龙寺中国林业科学研究院资源昆虫研究所，6 5 0 2 2 4 1 1 引言 1 1 1 研究背景 第一章绪论 糖是地球上数量最多的有机物，是和核酸、蛋白一起构成生物体的重要生物大分子 之一，具有重要的生物学功能。糖根据结构可分为单糖、多糖、糖衍生物等。多糖是各 种单糖的缩聚物，一般由l o 个以上的单糖基组成。仅含一种单糖或单糖衍生物的多糖称 为同多糖，杂多糖是由一种以上的单糖或单糖衍生物组成。糖类与蛋白质或脂质结合形 成的复合物称复合糖。多糖在自然界分布极为广泛，高等植物、动物、微生物、海藻、 真菌等体内均有存在。糖类起初仅仅作为一种能源物质来看待，并未受到更多的关注。 上世纪以来，随着现代分离、分析技术的发展，对糖的重要性和作用有了新的认识，人 们已经认识到糖是生命体内的重要信息物质，在多种生命过程中起着关键作用。多糖生 物活性的研究表明，多糖类物质在生物体内具有调节免疫、抗肿瘤、抗病毒、抗衰老、 降血压、降血糖、活血抗栓、抗衰老、增强骨髓造血机能、保肝护肾等功效，且基本无 毒副作用，在医药和食品领域显示了很好的应用前景，因而受到人们的广泛关注，成为 继核酸、蛋白之后生命科学研究的又一热点。但是目前多糖研究主要以真菌、植物和传 统中草药为主，动物多糖相对较少，昆虫多糖极少有人涉及，研究严重不足。 昆虫是自然界种类最多、数量最大的生物类群。据统计，在已经记载的2 4 0 多万种 生物中，昆虫大约有1 8 0 多万种，占生物总数的7 0 以上，而且每年还不断有新种发现 【l 】。昆虫自古以来就是人类食品的重要来源之一，在许多国家和地区得到普遍重视。我 国食用昆虫的记载最早见于距今3 0 0 0 多年前的周礼天官和礼记内则l z j 。据 专家估算，昆虫是仅次于微生物菌体和单细胞生物的第三大蛋白质来源。大量的营养分 析结果表明，昆虫体内粗蛋白含量极高，多在2 0 7 0 之间，远大于鸡、鱼、猪肉，而 且富含人体必需氨基酸、维生素和微量元素，所含脂肪多为软脂肪和不饱和酸，消化性 能良好。目前通过营养分析全世界已确定出3 6 5 0 余种昆虫可供食用团。 我国对药用昆虫的利用历史十分悠久。“药食同源”、寓医于食”，昆虫既是食品又是 滋补和保健良药。我国人民在长期的生产、生活中对昆虫的药用价值有着深刻的了解。 第一章绪论 医药巨著本草纲目、神农本草等著作上记载了许多昆虫药；列入中华人民共和 国药典的药用昆虫及其产品有1 0 种，另外还有5 种参与2 0 种中成药的配方。据中 国中药大辞典、药用动物志等记载，我国的药用昆虫的种类有2 5 0 多种，在实际中 常用的有4 0 多种。这还不是所有的记载，因为中国民间传统中药中还有许多药用昆虫没 有得到系统的总结和记载。药用昆虫及其产品具有清热泻火、散风解表、活血化淤、理 气补益、祛风湿等效用，如蝉蜕具有镇静作用；僵蚕具有一定的退热、化痰止咳、消肿 的功效；九香虫用于治疗脾胃气痛，等等【4 】。特别是近年来研究表明某些昆虫在抗肿瘤 以及治疗某些疑难杂症方而的独到作用，引起了广大医药工作者和昆虫学者的极大兴趣， 药用昆虫的研究有了长足进展。但是，到目前为止，药用昆虫多以整体入药或以虫的相 关物质( 分泌物、排泄物及其他物质) 入药，或与其他中草药构成复方制剂，对昆虫药 的有效成分和活性成分研究较少，作用机理不是很了解，严重影响了昆虫药物的迅速发 展。 随着现代科学技术的发展，昆虫作为药物资源的价值逐渐被接受，药用昆虫的利用 和研究逐渐从经验型走向科学性，研究人员开始逐渐对一些昆虫的有效成分和药理进行 研究。作为地球上最大的生物药物资源库，昆虫药的研究和开发越来越受到重视。与植 物和微生物相比，昆虫具有种类多，资源巨大，昆虫体内活性物质丰富，易规模培养， 生活周期短等特点。可以预见，在2 1 世纪，昆虫药物的研究将会脱颖而出，成为人类医 药中的主要组成部分，成为最具潜力与活力的药物资源。 1 1 2 研究的目的和意义 本论文实验所用的材料为蚕蛹、蟑螂和喙尾琵琶甲三种昆虫。 蚕蛹为家蚕科昆虫家蚕蛾b o m b y xm o r il i n n a e u s 的蛹，营养丰富，药用价值高，早 在木草纲目等典籍中就有其药用的记载。现代医学证明，蚕蛹具有降低血胆固醇、 治疗冠状动脉供血不足等效果【5 。我国的蚕丝产量居世界之首，在制造生丝的同时，最 大宗的副产品即为蚕蛹。根据有关资料报道，每制造1 吨生丝就可获得卜1 5 吨蚕蛹， 我国每年可副产鲜蛹三十万吨以上，由此可见蚕蛹的年产量相当可观。蚕蛹在云南省也 有较丰富的资源，仅陆良丝绸工业公司每年就有1 0 0 0 多吨蚕蛹产生【7 1 。然而，由于缺少 深入开发和研究，大部分蚕蛹被用来做动物饲料和肥料，资源利用率和附加值极低。 蟑螂，学名是蜚蠊( p e r i p l a n e t a a m e r i c a n a l i n n a e u s ) ，属于蜚蠊目，由于其极强的适 2 第一章绪论 应性而广泛地分布于世界各地。蟑螂作为药用最早载于神农本草经以蜚蠊名列为中 品，在历代重要本草典籍如新修本草、本草纲目、本草纲目拾遗中均有收载， 近代许多药学专著中也有记述【8 】。现实生活中人们认为蜚蠊不仅取食各种食品和非食物 性材料，造成直接经济损失，而且其体内外可以携带痢疾杆菌、沙门氏杆菌、大肠杆菌、 绿脓杆菌、变形杆菌、空肠弯曲菌、耶尔森氏菌、黄曲霉素、腺病毒和脊髓灰质炎病毒 等多种致病原，还检出乙型肝炎表面抗原( h b s a g ) 、蠕虫卵、阿米巴和蓝氏贾第鞭毛虫包 囊，是人类多种疾病的传播媒介，被认为是最难治理的一类重要害虫【9 1 。自上世纪7 0 年 代以来，我国科学工作者开始对蜚蠊展开抗癌、治疗肝炎、肝损伤方面的研究，并己取 得一定成果，但是目前的产品多以蟑螂的醇提取物为主，系统研究不足。 喙尾琵琶甲( b l a p sr h y n c h o p t e r af a i r m a i r e ) 属于鞘翅目拟步甲虫科琵琶甲属，是云 南省彝族长期广泛使用的抗菌消炎药物，民间用于治疗发烧、咳嗽、胃炎、疥疮、肿瘤 等疑难杂症，具有重大研究价值和经济价值。目前，国内学者重点研究了云南琵琶甲的 抗菌化学成分，但对其它非抗菌成分研究还未见文献报道 1 0 - 1 4 l 。 本论文将以这三种昆虫为研究对象，系统地研究三种昆虫体内多糖的提取、分离、 纯化技术，通过动物实验科学评价多糖的活性，以期获得具有生理功能的活性多糖。通 过研究，建立和优化昆虫多糖分离纯化体系，深入了解昆虫多糖的化学组成和结构特点， 科学评价昆虫多糖的活性。本论文不仅为探讨昆虫多糖的生物活性及作用机理、阐明功 能与结构的关系、加强昆虫多糖的应用奠定一定的理论基础和实验依据，而且有助于变 废为宝，提高药用昆虫的科学综合利用，增加社会经济效益，对进一步挖掘药用昆虫的 价值及持续利用药用昆虫资源有着重要的现实意义。 1 1 3 项目来源与经费支持 论文研究内容为“十一五”国家科技支撑计划重点项目“特产资源高效利用关键技 术研究与示范”项目、国家林业局引进国外先进农业技术项目“昆虫体内活性物质诱 导及提取技术引进”、国家林业局重点项耳“喙尾琵琶甲养殖及活性物质提取技术 研究”，中国林业科学研究院基金项目“昆虫水溶性多糖的分离纯化及生物活 性研究”项目的部分研究内容。 第一章绪论 1 2 国内外研究现状及评述 1 2 1 多糖概述 多糖是由1 0 个以上单糖基通过苷键连接而成的聚糖，在自然界分布极为广泛，高等 植物、动物、微生物、海藻、真菌等体内均有存在。根据多糖中单糖组成成分的不同， 将多糖分为同多糖( 或均一多糖) 和杂多糖( 或不均一多糖) 。由一种单糖缩合而成的 称为同多糖，如葡聚糖、木糖胶；由不同类型的单糖缩合而成的称为杂多糖，如结缔组 织中的透明质酸。研究表明，多糖具有多方面的药学活性，主要包括：抗肿瘤、增强免 疫、降血压、降血脂、降血糖、活血抗栓、抗衰老、增强骨髓造血机能、保肝护肾等作 用，因而受到人们的广泛关注，在医药和食品领域极具应用前景l i5 1 。 1 2 2 多糖国内外研究现状 目前多糖的研究主要集中在两个领域：即药用多糖的研究和作为信息分子多糖的研 究。药用多糖的研究始于上世纪4 0 年代真菌多糖抗癌效果的发现【1 6 】。1 9 6 0 年前后，多糖 作为广谱免疫促进剂引起了人们极大的兴趣，它具有治疗多种因免疫力缺损所引起的疾 病，如：慢性病毒肝炎和某些耐药细菌或病毒引起的疾病，还能治疗诸如风湿病之类的 自身免疫病，特别是对机体免疫系统受到严重损伤的癌症，而且多糖作为药物其毒副作 用小，对人体危害程度较小。1 9 8 0 年以来，研究者又发现多糖分子能够控制细胞分裂和 分化，调节细胞的生长和衰亡，降血脂、降血糖、抗血栓等功能的报道也很多。现已从 天然产物中分离出多达3 0 0 余种多糖类化合物。多糖的研究已经是化学、药学、分子生物 学等领域的热点之一【1 7 。1 9 1 。 日本一贯重视多糖研究，在该领域优势明显。1 9 8 9 年日本创刊了糖科学与糖工程 动态杂志，1 9 9 1 年实施“糖工程前沿计划”。短短几十年里，日本研究人员已经获得 批准的有关多糖提取纯化技术的发明专利就有上百个，已有数种多糖应用于临床，如香 菇多糖、裂褶多糖、云芝多糖、猪苓多糖等【2 0 1 。近年来，日本学者在常规化学方法的基 础上，大量引进现代分子生物学技术与手段，加强了对中药多糖活性决定簇等的化学结 构与功能关系的研究，并在柴胡、当归等中药的研究方面有了一定的突破 2 1 - 2 3 】。 美国、欧盟等也不甘落后，相继开展多糖研究。美国能源部1 9 8 6 年创建了复合糖类 研究中心，建立复合糖类数据库，到1 9 9 6 年已收集了4 20 0 0 个糖结构数据。欧盟于上世 4 第一章绪论 纪9 0 年代末启动“欧洲糖类研究开发网络计划”，其目的是带动欧洲各国的糖类研究和 开发，以强化欧洲在糖类基础研究以及将研究成果转化为商品方面与日本、美国的竞争 能力。 我国对多糖的研究起步较晚，由于紧密与中医药理论相结合，近年来发展很快，形 成了空前迅速发展的趋势，研究的对象包括植物、动物、真菌、细菌、地衣、藻类等， 研究的方法涉及各种化学方法和仪器分析方法，研究的范围涉及多糖的提取纯化和分级、 理化性质、结构分析、化学改性、免疫学、药理学、保健食品及药膳等。但是，我国对 药用多糖的研究和国外相比仍有一定的差距，目前尚未形成多糖生物学、化学及多糖药 用专门的研究机构和研究战略，从事相关研究的单位及学者相对较少，学科间渗透较差， 特别是研究基础和方法手段落后于日、美、欧洲等发达国家，积累的临床资料缺乏，大 部分多糖产品尚处于试验阶段或仅用于滋补品和饮料，糖生物学及工程学还没有得到应 有的重视等【2 5 - 2 s 】。 1 2 3 多糖的生物活性 多糖对机体的免疫系统有重要的调节作用，不仅能激活巨噬细胞( m m ) ，t 淋巴细胞、 b 淋巴细胞、自然杀伤细胞( n k ) 、细胞毒t 细胞( c t l ) 、淋巴因子激活的杀伤细胞( ( l a k ) 等 免疫细胞，还能促进细胞因子白介素、干扰素等生成，活化补体，从而在抗肿瘤、抗病 毒以及抗衰老等的防治上具有独特的功效，且基本无毒副作用。目前的活性多糖绝大多 数来自真菌、植物、微生物，极少部分来自动物( 不含昆虫) ，现主要概括如下： 抗肿瘤癌症从诞生的那一天起，就给整个人类带来了极大的灾难。据世界卫生组 织最新报告，目前全球5 2 亿人口中，每年新增癌症患者数约9 0 0 万人，因癌症死亡者达7 0 0 万人年，占总死亡人数的近2 0 。我国卫生部的统计资料也表明，我国现在每年新增癌 症患者数约1 6 0 万人，年死亡1 3 0 万人。由此可见，癌症实是一种常见病和多发病，对人 类生命的危害非常严重。多糖的抗肿瘤活性首先由日本的研究者千原吴郎在香菇中发现。 后来研究发现，香菇多糖除对移植癌的生长有抑制效果外，对原发性自体癌的生长也有 强的抑制作用，对化学致癌及病毒致癌具有预防效果。于是香菇多糖于1 9 8 5 年在日本批 准上市，成为治疗恶性肿瘤的新药 2 9 一o 】。从这以后，有关多糖抗肿瘤活性的研究相继开 展起来，范围涉及其他真菌、植物、藻类等。k o d o m a 等发现从6 r i f o l af r o n d o s a 中提取 的多糖具有抗肿瘤活性口1 l ；酵母聚糖对小鼠硬肉瘤和兔子肉瘤m 一1 有活性；酵母氢化葡聚 5 第一章绪论 糖对小鼠肉瘤3 7 和肉瘤1 8 0 具有活性，而啤酒酵母水溶性葡聚糖对小鼠硬肉瘤和e c h r i c h 肿瘤有抑制作用；猪苓菌水溶性多糖能抑制小鼠肉瘤1 8 0 瘤体积抑制率5 0 7 0 ，瘤重抑制 率达3 0 以上。茯苓异多糖对肉瘤1 8 0 的抑制率可达9 6 8 f 3 2 】。银耳孢子多糖对小鼠肉瘤1 8 0 的生长有一定的抑制作用【3 玉3 4 1 。金针菇多糖具有抑制肿瘤s 1 8 0 的作用，其抑制率达 4 6 7 3 5 1 ；短裙竹荪多糖对小鼠的s 1 8 0 抑制率达3 1 3 p 6 1 。此外，灵芝多糖、灰树花多糖、 热凝多糖、针裂蹄多糖、壳菌多糖等都具有明显的抗肿瘤活性口2 2 7 1 ；赵国华等发现山药 多糖r d p s - - i 对移植性黑色素b 1 6 和l e w i s 肺癌有很强的抑制作用【3 引。唐莉莉等发现竹叶多 糖具有良好的抗肿瘤作用，对s 1 8 0 的抑制率可达5 0 ，竹叶多糖对四氯化碳致小鼠肝损伤 有不同的抑制作用，并对艾滋病病毒有明显的抑制作用 3 9 1 ；银杏外皮多糖可较好的抑制 s 1 8 0 细胞的增殖，并能抑$ f j s l 8 0 实体瘤的生长 4 0 4 2 1 ；人参多糖对s 1 8 0 和共氏腹水瘤的瘤 重抑制率可达4 0 6 0 9 6 1 4 3 1 ；防风多糖j b o - 6 对s 1 8 0 移植瘤有明显的抑制作用【删；波叶大黄多 糖对小目1 s 1 8 0 肿瘤有明显的抑制作用【4 5 】。这样的例子不胜枚举。 目前的研究认为中药多糖主要是通过增强机体的免疫功能间接达到抑制或杀伤肿瘤 细胞的目的，即抗癌作用经过宿主中介作用，增强机体的非特异性和特异性免疫作用， 而非直接杀伤肿瘤细胞。已证明黄芪多糖是通过免疫功能而起作用，可以提高血浆中环 磷酸腺苷水平，使环磷酸腺苷环磷酸鸟苷保持稳定，从而防止变异细胞的无节制增殖， 起到预防肿瘤继续扩散、转移的作用 4 6 4 9 。 免疫调节增强机体免疫功能是大多数活性多糖的共同特性，如香菇多糖即是一种 很好的免疫促进剂，具有高度特异性免疫增强功能，一方面它能激活腹腔巨噬细胞的杀 伤还原能力，另一方面，能恢复已降低的免疫功能，特别是能恢复t 协助细胞的活性，同 时近百倍的提高抗胸腺依赖性抗原的体液性抗体。羊栖菜多糖对内毒素不致敏c 3 h h e j d 、 鼠脾脏细胞的增殖有促进作用。而且，多糖部分的活性比非多糖部分高得多。多糖部分 对脾脏细胞增殖的促进作用与b 细胞的数量有关，而与t 细胞的数量无关1 5 川；猪苓菌核中 的一种水溶性多糖能显著提高小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬活力，促进抗体形成，是一种良 好的免疫调节剂f 5 i 5 3 l ；灵芝子实体多糖能增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬活力，诱导细胞 色素p 一4 5 0 的形成，有利于增强机体的防御功能，提高机体保持稳态的能力；银耳多糖能 促进淋巴细胞的转化，增强小鼠腹腔巨噬细胞的吞噬功能，明显促