（有机化学专业论文）神经蛋白中芳香氨基酸之衍生物的离子识别.pdf

南开大学硕士学位论文中文摘要 中文摘要 蛋白质是生物体内一切功能的执行者。神经退行性疾病发病的关键问题是脑组织中 相关蛋白的聚集，这种聚集的根源是蛋白分子的聚集和化学反应。在对p r i o n 疾病的研 究中人们认识到，2 0 个天然氨基酸中，酪氨酸、色氨酸和组氨酸的侧链取代基团不仅具 有强还原能力，而且是很好的金属离子配体。因而与疾病相关的基因和蛋白分子是认识 神经化学的天然研究探针，同时也是认识遗传病和蛋白质科学的一个有效途径。 近年来，对于分子识别深层次的认识c a t i o n - p ii n t e r a c t i o n 作为一种新发现的 非共价作用力，同时也被认为在分子组装、药物设计和新材料设计等诸多方面都是不可 忽视的重要弱相互作用力。而对于具有重要生物学意义或环境保护意义的金属离子( 前 者如c a 、m g 、f e 、c u 、z n 等离子；后者例如h g 、c d 等离子) 具有高选择性检测能力 的化学探针的设计与研究，由于环境检测、生物化验和医学研究的需要，已日益成为国 内外专家十分重视的课题。工作中设计合成了两种基于氨基酸( 组氨酸和酪氨酸) 的金 属离子探针，即利用e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d ( e d t a ) 作为p c p t i d y lt y r 和p e p t i d y l h i s 的二价模板框架，研究p e p t i d y lt y r 和p c p t i d y l h i s 对金属离子的协同识别能力。利 用圆二色散谱、荧光光谱和质谱等分析手段详细探索了可能包含有n 和。电子参与的阳 离子识别。研究发现，这两种探针对多种具有重要生理学和环境保护意义的金属离子有 着很好的选择性识别作用。 同时，我们的部分工作致力于新犁a l z h e i m e r 蛋白聚集模璎的设计。我们以天然氨 基酸和单链脂肪酸相连接，研究其自组装性能。工作中设计了n - l a u r o y l - l h i s f i d i a n t e 和 n d a l m i t o y l l h i s t i d i a n t e 等建立在单链脂肪酸模板上的芳香性氨基酸衍生物，并成功检 测了其三维结构，详细研究了分子间氢键与疏水作用力在分子聚集中的相对重要性。 关键词：离子识别圆二色散谱荧光光谱质谱分子组装探针模板单链脂肪酸 堕茎查兰堡主兰焦堡壅皇! 窭型 a b s t r a c t p r o t e i n sa r ee x e c u t o r so fa l m o s ta l lf u n c t i o n si n l i v i n gs y s t e m s ac r u c i a l s t e p t o n e u r o d e n e g e r a t i v ed i s e a s e si st h ea s s e m b l a g eo fp r o t e i n si nb r a i n t h ec a u s eo ft h i sa s s e m b l a g e i so x i d a t i v ed a m a g e - a s s o c i a t e dm o l e c u l a ra g g r e g a t i o n i nt h er e s e a r c ho fp r i o nd i s e a s e s ，w e r e a l i z e dt h a tt h es i d ec h a i n so ft y r o s i n e ，t r y p t o p h a na n dh i s t i d i n ea r en o t o n l ys t r o n g l y r e d u c t i v e ，b u ta l s og o o dm e t a l i o nl i g a n d s c m i o n p ii n t e r a c t i o n sb e t w e e na r o m a t i cr i n g sa n dc h a r g e ds p e c i e sa r en e w l yi d e n t i f i e da sa s i g n i f i c a n t f a c t o ri nm o l e c u l a r r e c o g n i t i o n b e c a u s e o ft h en e e do f b i o l o g i c a la s s a y ， e n v i r o n m e n t a lm e a s u r e m e n ta n dm e d i c a lr e s e a r c h ，m u c ha t t e n t i o nh a sb e e nd r a w nt ot h ed e s i g n o fc h e m i c a lp r o b e st h a ta r eh i 曲t ys e n s i t i v et ob i o l o g i c a l l yi m p o r t a n tm e t a li o n sm e a n i n g ss u c h a sc a ，m g ，f e ，c u ，z n ，e ta la n dm e t a li o n sw h i c ha r eo f e n v i r o n m e n t a ls i g n i f i c a n c es u c ha sh g ， c d h e r e i nw e r e p o r to n ar a t i o n a ld e s i g no fm e t a l l o r e c e p t o rf r a m e w o r k sf e a t u r i n gd i v a l e n th i s a n dt y ro nm u l t i d e n t a t e a m i n o c a r b o x y l a t es c a f f o l d s w es e l e c t e dr e a d i l ya v a i l a b l em u l t i d e n t a t e a m i n o c a r b o ) 【= y l a t e ，e t h y l e n e d i a m i n e t e t r a a c e t i ca c i d ( e d t a ) ，a sd i v a l e n tt e m p l a t ef o rp r e s e n t i n g p e p t i d y lt y rp h e n o la n dp e p t i d y lh i s i m i d a z o l ea sap o s s i b l e7 c - d o n o ro ro - d o n o rf o rm e t a li o n s a sw e l la sas p e c t r o s c o p i cr e p o r t e r w ef o u n dt h a tt h et w ow e r ee x c e l l e n tm e t a l l o m c e p t o rm o d e l s w i t hh i 啦s e n s i t i v i t ya n dr e m a r k a b l es e l e c t i v i t yf o rb i o l o g i c a l l yo re n v i r o n m e n t a l l yi m p o r t a n t m e t a li o n si nw a t e r p a r to fo u rw o r kw a sf o c u s e do nt h ed e s i g no fam o d e lo fa l z h e i m e rp e p t i d e ，w es e l e c t e d t h es i n g l e - c h a i nl i p i d sa st e m p l a t e sa n dr a m i f i c a t i o n so fs i n g l ec h a i nl i p i d sc o n n e c t e dw i t h n a t u r a la m i n oa c i d sw e r ep r e p a r e d i nt h i st h e s i s ，w ed e s i g n e dn l a u r o y l - l - h i s t i d i a n t ea n d n - p a l m i t o y l - l h i s t i d i a n t e a n di n v e s t i g a t e dt h e i rt h r e ed i m e n s i o n a ls t r u c t u r e si nc i y s t a l w e s t u d i e dt h ei m p o r t a n c eo fa b u n d a n ti n t e r - m o l e c u l a rh y d r o g e nb o n d i n g sa n dh y d r o p h o b i ce f f e c t i nm o l e c u l a ra s s e m b l a g e k e yw o r d s ：n e u r o d e g e n e r a f i v ed i s e a s e ；m o l e c u l a rr e c o g n i z i t i o n ；c a t i o n - p ii n t e r a c t i o n ；p r o b e ； m e t a l l o r e c e p t o r ；d i v a l e n tt e m p l a t e s ；i n t e r - m o l e c u l a ri n t e r a c t i o n s ；s i n g l ec h a i nl i p i d 南开大学硕士学位论文 第一章前言 第一章前言 1 1 神经退行性疾病致病蛋白分子的化学生物学 1 1 1 神经退行性疾病与蛋白质科学 人类基因测序工程的完成，启动了对生命本质的系统化认识，也标志着大规模研究蛋 自质生物学时代的到来。人类基因组测序工程尚不能在蛋自质分子水平解释和解决疾病的 发痫机制，因而也无法通过灵活主动地发展和有效利用基因技术来治疗遗传性疾病和控制 衰老。最近在脑神经退行性疾病研究中提出的“蛋白质化学病变”之观点，将化学生物学 方法与物理有机化学方法相结合，可能为人类基因组测序工程后的蛋自质组学研究和破译 各种基因功能提供有效的新手段，从而为揭示从基因、蛋白到生命和疾病的关系，提供了 新的研究思路和途径【1 】。 化学融合到生物学盼研究领域带来了生物学的快速发展。w a t s o n - c r i c k d n a 双螺旋结 构的确定，以及k h o r o n a 对寡核苷酸合成的贡献都直接推动了近代生物学的发展，奠定了 现代分子生物学的基础，尤其推动了蛋白质科学的研究。化学生物学主要是使用小分子作 为工具解决生物学的闯题或通过干扰调节正常过程来了解蛋自质和基因的功能。化学家 们相信如果人类有3 5 万个基因相互作用控制了生命过程，那么一定会发现至少3 5 万个 可控制这些基因的化学小分子，也会带来至少3 5 万个诸如这些小分子如何调节基因的化 学问题。 脑神经疾病的研究是脑科学的一个重要内容。受人瞩目的p r i o n 疾病 2 1 、h u n t i n g t o n 病 3 1 、a l z h e i m e i s 病 3 】和p a r k i n s o n 病等神经退行性疾病虽然都与不同的基因和相应的致病 蛋白质分子有关，但是它们却有某些类似的临床特征和致病机制。包括进行性痴呆和脑腔 中抗蛋白水解酶的蛋白沉积等。当前，在世界范围内，关于脑科学的研究中激烈竞争的焦 点之一集中在发现各种脑疾病的病因和探询治疗这种疾病的方法。与疾病有关的基因和蛋 白分子是天然的研究探针，同时也是认识遗传病和蛋白质科学的一个有效途径。 我们的研究课题就是设计合成能模拟生物体内复杂蛋白的化学小分子模犁，通过对这 些结构简单，具有代表性的小分子模型结构和性质的研究来了解生命科学的分子化学基 础。 南开大学硕士学位论文 第一章前言 1 1 2 p r i o n 疾病等神经退行性疾病的研究 p r i o n 疾病是一种广泛存在于人和动物中的脑神经退行性疾病，在动物中包括羊瘙瘁 病( s c r a p i e ) 1 4 j 、传染性疯貂症( t m e ，t r a n s m i s s i b l e m i n k e n c e p h a l o p a t h y ) 和疯牛病( b s e ， b o v i n e s p o n g i f o r me n c e p h a l o p a t h y ) ，在人类中包括k u r u 病和克雅氏病( c j d ， c r e u t z f e l d t - j a c o bd i s e a s e ) 。p r i o n 疾病在病症上表现为病人脑部蛋白聚集，神经传导和铜代 谢紊乱，最后导致机体死亡。 我们知道，蛋白质是长链结构的大分子，长链缠绕成特殊的形状以发挥其功能。正常 状况下，蛋白质的亲水基在外部。而疏水基在内部，蛋白质就易溶子水。如果这种结构遭 到破坏，蛋白质就不能溶解，而在细胞或组织里形成团块，干扰正常生理功能，因此结构 被破坏的蛋白质是有毒性的。蛋白质结构的改变导致了疾病。神经退行性疾病发病的关键 问题是脑组织中异常蛋白的结构破坏和聚集。虽然各种疾病与不同蛋白的结构破坏有关， 但导致结构破坏的分子途径和神经细胞死亡的机制似乎是相似的。p r i o n 蛋白病毒是目前 已知的在自然界中唯一的不含有核酸，但可以传染的亚病毒1 5 】。 关于p r i o r i 疾病的传染过程，其中p r i o n 蛋白氧化损伤的作用已受到越来越多的关注。 众所周知，一切脊椎动物都需要氧气，良性p r i o n 蛋白的病变主要发生于单位体积的供氧 速度超过身体十倍的动物脑腔之中，但动物身体发病的迹象并不明显。大量的实验证据表 明，p r i o n 疾病很有可能是一个由蛋白自由基引发、由含氧自由基推动的蛋白氧化连锁反应 【6 j ，这种蛋白氧化连锁反应的特征表现在病变的不可逆性和自我催化性能、病毒蛋白自由 基的高稳定性和其受抗氧剂的阻碍作用，其中涉及了生物物理和生物化学两个完全不同的 概念。一些具有分子识别能力且序列专一的蛋白质片段，易于受体内或体外因素如辐射、 金属离子或其他一些氧化剂的影响，发生氧化反应而产生自由基，这种自由基会引发相邻 的蛋白质片段发生类似的氧化反应，这种反应连锁进行，从而将这种蛋白质的氧化损伤传 递下去，结果。蛋白质聚集，失去生理活性，机体发生病交，这个过程如f i g1 - 1 所示。 2 南开大学硕士学位论文 第一章前言 o h 口一 - p r p cp r p s 。 龋彤 皇 磕睦中 【i 卜 口l 罟 三 。 旦 韶 立 1 r a m ；t 【p r p q 【p r p 5 1 【o h f i g1 - 1 p r i o n 蛋白亚病毒的自由基化学过程 在p r i o n 疾病的研究中人们认识到，2 0 个天然氨摹酸中，酪氨酸、色氨酸和组氨酸的 侧链取代基团不仅具有强还原能力，而且还是很好的亲核配体，分析p r i o n 蛋白、h u n t i n g t o n 蛋白和d 淀粉状蛋白的一级结构，我们发现，在一些重要的片断中，每隔三个较稳定的氨 基酸就有一个不稳定的氨基酸存在，即存在重复的“，i ，i + 4 ”的“还原性碱性亲核性” 拉链片断，人、牛、鼠、羊等的n 端p r i o n 蛋白序列特征片断【7 】为： p q g g g g w s7 g q ( p l 4 g g g w i g q ) ( p h + 4 g g g w g q ) 3 a g a a a a g a 以上序列编号为人类的p r i o n 蛋白序列。类似的“i - 4 ，i ，i + 4 ”的“还原性”拉链片断也存在 于需氧生命体的细胞色素c 氧化酶的活性部位，已知细胞色素c 氧化酶是通过与含氧小分 子之间的电子转移反应来代谢氧气的。因而，这些拉链的存在启示我们与含氧小分子有关 的化学过程在蛋白病变过程中起着重要作用。理论分析也表明“i - 4 ，i ，i + 4 ”的“还原性” 拉链片断易于引发氧化损伤从而产生氨基酸自由基，以p r i o n 蛋白为例，良性的p r i o n 蛋白 是以0 螺旋为主，一个a 螺旋的周期为四个氨基酸，这样这些侧联不稳定的氨基酸并列在 一起，距离很近，它们之间的协同作用使得本来不稳定的氨摹酸更易于遭到氧化破坏，引 发氧化损伤的蛋白自由基过程。同时，这些并列的不稳定氨基酸形成了一个电荷的通道， 氧化损伤很容易由引发部位传递到其它的部位。 1 1 3p r i o n 蛋白与金属离子的络合作用 在p r i o n 疾病的研究中，人们发现了金属离子的参与，这些金属离子包括c u 2 + 。在 3 南开大学硕士学位论文第一章前言 人类p r i o n 蛋白的n 端5 9 9 l 位有四个重复的八肽拉链序列，它是一个进化稳定的区域， 良性状态时，p r i o n 蛋白主要处于螺旋状态，八肽拉链可以选择性的络合金属离子，尤其 是可以选择性的络合铜离子，并能作为铜离子进出细胞的载体，f i g1 - 2 是p r i o n 蛋白与c u 2 + 及细胞膜作用的示意图，a l z h e i m c r s 病的p 淀粉状蛋自邮1 - 4 2 也有类似现象1 8 - t o l 。 f i g 1 - 2 i n t e r a c t i o no f p f i o np r o t e i nw i t hm e m b r a n ea n dc u 2 + 进一步的研究表明，c u 2 + 与p r i o n 蛋白的相互作用能稳定p r i o n 蛋自的致病形式p r p s 。， 在p r i o n 疾病与a l z h e i m c r s 病病人的脑部蛋白聚集部位发现有大量的金属铜离子沉积。 p r p s c 蛋白经胍处理变性后，可以被蛋白酶水解，同时会丧失感染能力，而变性后的p r p “ 蛋白经c u 2 + 处理后可以促进p r p 8 。蛋白的复性】，这表明c u 2 + 与p r i o n 蛋白的相互作用能 稳定p r i o n 蛋白的致病形式。a l z h e i m e r s 病的研究发现，已沉积的1 3 - 淀粉状蛋白在用e g t a 等络合剂除去金属离子后又恢复水可溶性1 1 2 】。基因研究的结果也支持这一观点。切除了 p r i o n 蛋白基因( p r n - p ) 的自鼠脑部铜离子的含量只是普通白鼠含量的2 0 ，并且只有铜 离子的含量明显减少，其它的离子没有这种现象f l3 1 。另外，p r n - p 的自鼠抵抗铜中毒的能 力大大降低，受2o v l c u s 0 4 溶液的作用，p r n - p 的白鼠的神经传导能力明显减弱【l ”，而普 通白鼠则基本不受影响，这说明c u 2 + 与p r i o n 蛋白能发生相互作用，同时也表明c u 2 + 与p r i o n 蛋白在生物体神经系统中的起着重要作用。 铜离子不仅与良性p r i o n 蛋白p r p c 作用，也与病变的p r i o n 蛋白p r p ”作用，铜离子的 存在可以稳定病变的p r i o n 蛋白。虽然p r p ”的精确结构目前无法确定，人们发现铜离子的 存在可以促进良性p r i o n 蛋白的病变。对p r p ”的变性和复性现象进行的研究表明，p r p ” 南开大学硕士学位论文第一章前言 能抑制蛋白酶k ( p k ，p r o t e i n a s ek ) 的降解作用，同时它能诱导良性蛋白病变，具有感染 能力【1 ”。当加入g d n h c l 时，可以使p r p ”变性，变性后的p r p ”可以被蛋白酶降解而失去 感染能力2 1 。稀释变性试剂，p 又发生复性并恢复感染能力。不同的p r p ”片段的复性 程度是不同的。当加入1 0m l v l 的铜离子时，蛋白质的复性能力被大大增强，苌至一些用稀 释方法无法复性的变性蛋白也被很大程度的复性了，但加入c a “和m 9 2 + 并不能改变变性 p r p ”的复性。对p a m y l o i d 蛋白的研究发现，聚集的1 3 a m y l o i d 蛋白用e g t a ，t p e n ， b c 等络台剂出去铜离子后，聚集的b a m y l o i d 蛋白又能够溶解【1 “。这说明铜离子与p r i o n 蛋白之间存在络合作用，并且这种作用在p r i o n 病变中起着至关重要的作用。 除了c u 2 + 之外，f e 计与z n 2 + 也不同程度的与p r i o n 蛋白及d 淀粉状蛋白片段结合并发生 一些氧化还原反应。 我们预测，每个人的脑细胞表面都有的p r i o r i 蛋白分子内重复八肽中的色氨酸支链残 基这种很有规律的四次重复不太可能是偶然的，很可能在蛋白分子对金属c u 2 + 离子的高选 择性作用中起着重要的识别作用。合成小肽的晶体结构显示，色氨酸支链残基与金属锕离 子( c u 2 + ) 的外围靠得很近【。“i - 4 ，i ，i + 4 ”的拉链片段很可能是p r i o n 蛋白的氧化还原中 心也是与金属离子作用的络合中心。 1 2 弱相互作用- - c a t i o n p ii n t e r a c t i o n 化学键是化学物质中原子之间的结合力，而分子之间的作用力则是超分子体系内分子 或离子之间的结合力。尽管o h o 和n h o 等强氨键是人们研究和使用最广泛的分 子间作用力，然而许多较弱的作用力包括c - - h o 氢键【1 9 - 2 1 、c h n 氢键【2 2 】、n 堆积作用 2 3 - 2 5 1 静电作用、范德华力和疏水作用广泛存在于核酸和蛋白质等多种生命化合 物中。众所周知，共价键能量一般为4 0 0k j l m o l ，而弱相互作用力一般为4 - 4 0 k j m o l 。这 种弱相互作用力很难单独形成稳定的复合物。但若分子在空间的位置取得某种构象，使较 多的g g 相互作用力和较多的结合点相协调，则可以在分子间形成较强的结合力或选择性。 近几年来，对于分子识别更深层次的认识之一c a t i o n - p ii n t e r a c t i o n - - - 作为一种新发现 的非共价作用力，同时也被认为在分子组装、药物设计和新材料设计等诸多方面都是不可 忽视的重要弱作用力。数年前。加州理工学院的d o u g h e r t y 发现生物分子上的c a t i o n - p i i m e r a c t i o n s 【2 6 l 以来，生物分子上的芳香环( 例如色氨酸的支链残基) 对阳离子( 包括季胺 盐离子，金属离子等) 的识别，被认为不但是很多神经受体( 例如n i c o t i n i c a c e t y l c h o l i n e r e c e p i t o r ) 识别阳离子的分子科学基础，并且在金属蛋白和那些依赖于金属离子的酶结构 南开大学硕士学位论文第一章前言 功效中起着关键的作用。对于具有重要生物学意义或环境保护意义的金属离子( 前者如c a 、 m g 、f e 、c u 、z n 等离子；后者例如h g 、c d 等离子) 具有高选择性检测能力的化学探 针的设计，由于环境检测、生物化验和医学研究的需要，该领域的研究已日益成为国内外 专家十分重视的课题。每年都有学者发表大量的研究通讯1 2 7 - 2 8 1 。 o f i g1 - 3 o 与苯环的相互作用示意图【2 8 l 生命体系中大最的蛋白质分子均由2 0 种天然氨基酸组成。这些氨摹酸各带有不同的 有机基团，其中可分为极性与非极性的：在中性介质中带正电和带负电的；疏水的和亲水 的；带芳香基的和不带芳香基的。自然界里组成蛋白的结构单元是2 0 种天然氨基酸以及 基于这2 0 种天然氨基酸而后修饰的一系列非天然氨基酸。其中除脯氨酸及其衍生物外， 这些氨基酸在结构上的共同点是与羧基相连的碳原子上都有一个氨基，因此称为n 一氨摹 酸。连接在a 一碳上的还有一个氢原子和一个可变的侧链，称为r 基团，各种氨基酸的区 别就在于r 基团的不同，这也是天然蛋白的种类和功能多样性的根本原因。在这2 0 种氨 基酸中侧链具有芳香性并不多，只有4 种，它们是苯丙氨酸( p h e ，f ) ，酪氨酸( t y r , y ) ， 色氨酸( t r p 。w ) 以及组氨酸( h i s ，h ) 。 6 南开大学硕士学位论文第一章前言 oo j | | 叱”一i 卜。一叫心“一f 忙。一洲 “ p h e ，ft y r , yt r p ，w o o h 由于这四种氨摹酸的r 蕞团中含有芳香体系，因此这四种氮幕酸在近紫外区( 2 0 0 4 0 0n m ) 有吸收。相关蛋白质由于含有这些氨基酸所以也有紫外吸收的能力，一般最大吸 收在2 8 0r l n l 波长处，因此能利用这点来测定样品中蛋白的含量。芳香氨基酸在紫外区呈 现比较弱的荧光近来还证明了色氨酸呈现磷光( 一种寿命较长的发射光) 。这些荧光和 磷光性质在研究蛋白质、多肽以及仿肽的结构和动力学中有着特别的作用。 凡机体内不能自己合成的氨基酸被称为必须氨基酸( e s s e n t i a la m i n oa c i d s ) 。研究表明 人体内的必须和半必须氨基酸共1 0 种，其中就包括苯丙氨酸、色氨酸和组氨酸。可见， 芳香氨基酸对于正常的生理功能和代谢调控都有重要的意义。 1 3 金属离子对于生命体的意义 1 3 1 金属离子催化和结构调控 在酶催化中广泛地存在着阳离子与芳香体系的相互作用。几乎三分之一的酶催化活性 需要金属离子。 根据金属离子一蛋白质相互作用强度，可将需要金属离子的酶分为两类：( 1 ) 金属酶， 含紧密结合的金属离子，多属于过渡金属离子，如f e 2 + f e 3 + 、c u + c u 2 + 、z n 2 + 、m n 2 + 和c 0 2 + 等，这种金属离子通常以配价键的形式与氨基酸残基的侧链基团相连，有时也与酶蛋白 中的辅基，如血红素的卟啉环相连。金属酶中的金属离子，作为酶的辅助因子，在酶促反 应中传递电子、原子或官能团。( 2 ) 金属激活酶金属激酶中的金属离子与酶的结合一 般比较松散，在溶液中，酶与这类离子结合而被激活，这类金属离子主要是指碱金属离子 和碱土金属离子，如n a 十、k + 、m 矿+ 和c a 2 + 等。 南开大学硕士学位论文第一章前言 t a b l e1 - 1 金属酶中的金属离子与配体 l 金属离子 配体酶或蛋白 f m n 2 + 咪唑丙酮酸脱氢酶 f e 2 + ，f e 3 +卟啉环、咪唑、含硫配体血红素氧化还原酶、过氧化氢酶 c u + c u 2 +咪唑、酰胺细胞色素氧化酶 c 0 2 +卟啉环变位酶 z n 2 + 一+ n h 3 。咪唑( - r s h碳酸酐酶，醇脱氢酶 p b 2 +一s h 6 一氨基一y 一酮戊二酸脱水酶 n i 2 +一s h脲酶 金属离子以三种主要的途径参加反应过程，一是通过结合反应底物为反应定向，二是 通过可逆地改变金属离子的氧化态调节氧化还原反应，三是通过静电稳定和屏蔽负电荷。 但无论是哪种类型，都存在着显著的阳离子与芳香体系的相互作用。这种弱相互作用的影 响是深远的，甚至可以对酶或其它蛋白起到结构调控的作用。 1 3 2 离子通道和第二信使 在生命科学中，金属离予与芳香体系的弱相互作用在离子通道和第二信使( 信号通路) 中主要是通过受体和金属离子之间的相互作用来体现的。 受体( r e c e p t o r ) 是一种能够识别和选择性结合某种配体( 信号分子) 的大分子物质t 多为糖蛋白，一般至少包括两个功能区域，与配体结合的区域和产生效应的区域，当受体 与配体结合后，构象改变而产生活性，启动一系列过程，最终表现为生物学效应。受体与 配体间的作用具有三个主要特征：特异性；饱和性；高度的亲和力。 根据靶细胞上受体存在的部位，可将受体分为细胞内受体( i n t r a c e l l u l a rr e c e p t o r ) 和细 胞表面受体( c e l ls u r f a c er e c e p t o r ) 。细胞内受体介导亲脂性信号分子的信息传递，细胞表 面受体介导亲水性信号分子的信息传递。 南开大学硕士学位论文第一章前言 7 e a 3 0 1 6 a f i g1 - 3 n a c h r 作为阳离子受体，其中阳离子一芳香体系的作用相当显著 膜蛋白的研究更是联系到很多受体和离子通道的功能，这些蛋白在维持人体的正常生 理过程以及药物治疗中都有着熏要意义。rm a c k i n n o n 研究了膜的钾离子通道，得到了钾 离子通道蛋白的x 一衍射晶体结构。如f i g1 - 4 所示，该蛋白由四个亚单位组成，每个亚单 位有二个跨膜的a 螺旋结构。离子通道开口处的氨基酸决定什么离子通过，氨基酸侧链围 绕着离子通道的开口处形成一个屏障，以氨键或v a n d e r w a l l 力驱动离子通道口的打开或 关闭，这些离子通道是如何识别不同的离子的? 又如何保持着一定的离子浓度维持一个平 衡? 受哪些因素的影响来调节通道的开关? 金属离子和芳香体系的相互作用将是一个重 要的因素。 f i g1 - 4 钾离子通道三维结构 9 南开大学硕士学位论文第一章前言 在细胞信号的传递过程中，金属离子与芳香体系的弱相互作用对于信号的正确识别 有着决定性的意义。 觚以上的研究能够看出。阳离子和芳香体系的相互作用在生命现象中扮演着重婺的角 色。事实上，阳离子与芳香体系的弱相互作用作为生命科学领域中的基本作用之一有着它 的普遍性，其中金属离子与芳香体系的作用更是具有代表性。从金属酶的催化到蛋白中的 协同效应以及构效关系，从各种离子通道的工作机理到基于c a 离子第二信使的生物膜信 号传递，生命体中许多重大的问题都与阳离子和芳香体系的作用有关。在水溶液里强度 低于配位键与共价键的、水合阳离子与色氮酸支链芳香环一n 体系的弱作用力，很难被 n m r 检测到。我们通过对疯牛病化学损伤的研究看到这种反应了生物分子层次上普遍的 弱相互作用的奥妙，并进面对这种弱相互作用进行了较系统的小分子模型研究。 1 , 4 研究思路及主要工作 本工作基于化学工作者在化学和生命科学的交叉领域研究中的特殊位置，积极发挥创 造性思维，从疯牛病的化学损伤致病机理的角度出发，经过深层次探索，已建立和正在建 立一系列小分子金属离子探针和化学探针库，期望能够较为系统地研究一系列阳离子与芳 j 香体系之间的弱相互作用以及它们在生命过程中的作用和意义。 1 4 1 基于脂肪酸的a l z h e i m e r 多肽聚集模型的结构分析 a l z h e i m e r sd i s e a s e ( a d ) ，是一种与老化有关的慢性进行性脑神经退行性疾病。老年 性痴呆病人脑腔中都具有淀粉状沉积物1 3 多肽4 2 和4 0 29 1 。大量的实验证据说明，此1 3 - 多肽通过尚不清楚的自由基机理诱导更多的淀粉样b 多肽在脑腔中的沉积，并能与金属离 子作用。ab 的这种聚集作用产生的细胞毒性可能是a h h e i m e r sd i s e a s e 的重要致病因素。 a1 5 是淀粉状前驱蛋白( a p p ) 水解后含有将近4 0 个氨基酸残基的多肽删。 a 8 ( 1 - 4 0 ) d 6 7 2 a e f r 尽i - 4 d s g y ie v h h i + 4 q k l v f fa e d v gs n l a g l mv g g w a b f l - 4 2 ) d 6 7 2 a e f rni - 4 d s g y ie v i - i h i + 4 q k l v f fa e d v gs n k g ai i g l mv g g wi a 在正常的新陈代谢中产生的单一ab 分子并不具有毒性【3 l ，3 2 l ，一旦a0 分子聚集起来， 形成非共价相连的纤维状结构，就会对神经元细胞产生很大的毒性1 n - 3 5 】。a1 3 是如何聚集 的还是个未知数。从结构上分析，a 1 3 ( 1 4 0 ) 和a b ( 1 4 2 ) 都是一端疏水，一端亲水的链状 1 0 南开大学硕士学位论文第一章前言 结构。我们的部分工作致力于新犁a l z h e i m e r 蛋白聚集模型的设计。我们以天然氨慕酸和 单链脂肪酸相连接，研究此类简单模型的自组装性能。工作中设计了n - l a u m y l l - h i s t i d i a n t e 和n p a l m i t o y l - l h i s t i d i a n t e 等建立在单链脂肪酸模板上的芳香性氨基酸衍生物，并成功检 测了其三维结构，详细研究了氢键与疏水作用力在分子聚集中的相对重要性。 1 4 2 金属离子的化学探针设计 有人将受体对底物的选择性结合，即分子识别，比作钥匙和锁的关系，两者之间的构 型、尺寸大小、亲水性和疏水性都必须匹配。因而，选择性是分子识别的核心。 阳离子和芳香体系的相互作用在生命现象中扮演着重要的角色。这种弱相互作用作为 生命科学领域中的基本作用之一有着它的普遍性，其中金属离子与芳香体系的作用更是具 有代表性。从另一方面来说，氨基酸和多肽链的离子识别和氧化化学等性能是一个同样值 得重视的问题一以解开基因所编码的蛋白质分子中所蕴藏着的决定老化和疾病的蛋白科 学之谜。我们把本实验室所发展出来的实验研究方法应用到以r x x x r x x x r 序列为模板 的离子识别和分子识别研究中去，这里选r = 色氨酸、酪氨酸和组氨酸，其中酪氨酸和色 氨酸不但提供了天然的芳香环体系，而且在荧光光谱上有很多的特征吸收，尤其是色氨酸 上吲哚环被认为具有蛋白大分子中最强的p i 电子给予能力 翊，因而对其研究具有多方面的 意义和较大的实用价值。 本文中我们将m u l t i d e n t a t ea m i n o c a r b o x y l a t e s 分别与酪氨酸和组氨酸以酰胺键相连接， 设计合成了离子探针，从而简单地从侧面解决了在水溶液中检测金属离子同时与多个组氨 酸( h ) 或酪氨酸( y ) 支链残基之间之可能协同作用的难题，由于酪氨酸( y ) 既有荧光， 又有特征c d 吸收峰，而组氨酸( h ) 与金属离子络合作用很强，因而检测非常顺利，效 果很好。通过一系列测试，我们证实：常见的金属离子中( 碱金属、碱土金属和过渡金属) ， 很多都与组氨酸( h ) 或酪氨酸( y ) 支链芳香残基有很强的作用。 意义在于； 1 提供了用于检测水溶液中，天然酪氨酸p h e n o l 杂环和天然组氨酸的咪唑杂环与金属离 子作用的化学探针； 2 提供了利用荧光技术检测对阳离子的非共价识别； 3 检测到在水溶液相中( 强极性条件下) ，单个过渡金属离子与两个酪氨酸杂环的协同非 共价作用力，最强可达5 6k c a l m o l 之间。同时，我们设计合成的基于组氨酸的金属 离子探针，由于咪唑是很强的o d o n o r ，与金属的配位能力很强，单个过渡金属离子与 南开大学硕士学位论文第一章前言 两个组氨酸杂环的协同非共价作用力，最强可达6 5 8k c a l m o l 之间，因此用圆二色 谱就能进行检测。 因而，我们的工作是在离子受体模型设计和离子探针设计上具有现实意义的综合基础 科学探索。 堕堑盔堂堡圭兰堡丝苎苎二兰蔓堑 直 参考文献 1 t 杨池明，高等学校化学学报2 0 0 2 ，2 3 例，2 4 3 - - 2 5 0 2 c h e s e b r o ，b s c i e n c e1 9 9 8 ，2 7 9 ，4 2 3 h a r d y , j ，e ta 1 s c i e n c e1 9 9 8 ，2 8 2 ，1 0 7 5 4 b o l t o n ，d c ；m c k i n l e y , m p ；p r u s i n e r , s b s c i e n c e1 9 8 2 ，2 1 8 ，1 3 0 9 - 1 3 1 1 5 p r u s i n e r , s b p r d c n a t l a c a ds c i u a 1 9 9 8 ，9 5 ，1 3 3 6 3 6 ( a ) y a n g ，c m c h i n e s e s c i e n c eb u l l i t i n 2 0 0 0 ，4 5 ，1 5 4 6 - 1 5 5 4 ( b ) 杨池明，陈义，纪学滔 扳，2 0 0 0 ，6 0 - - 6 2 ( c ) l a u r e n t ，m f e b s l e t t 1 9 9 7 ，4 0 7 , 1 - 6 7 m a r c o t t e ，e m ，e ta 1 b i o c h e m i s t r y1 9 9 8 ，3 8 ，6 6 7 8 r u i z ，eh ；s i l v a ，e ；i n e s t r o s a ，n c b i o p h y s r e s c o m m u n 2 0 0 0 ，2 6 9 ，4 9 1 - 4 9 5 9 h u a n g ，x ；c u a j u n g c o ，m p ；a t w o o d ，c s ，b i o lc h e n t1 9 9 9 ，2 7 4 ，3 7 1 1 1 1 0 c a u g h e y , b t r e n d s i nb i o c h e m i c a ls c i e n c e 2 0 0 1 ，2 6 ，2 3 5 2 4 2 1 1 m c k e n z i e ，d ：b a r t z , j ；m i r w a l d ，j d o ；m a r s h ，r ；a i k e n ，j zb i 0 1 c h e m 1 9 9 8 ，2 砧， 2 5 5 4 5 - 2 5 5 4 7 1 2 c h e m y , r a ：l e g g ，j t ；m c l e a n ，c a ；f a i r l i e ，d p ；h u a n g ，x zb i o lc h e m 1 9 9 9 ， 2 7 4 ，2 3 2 2 3 - 2 3 2 2 8 1 3 b r a n d n e r , s ；r a e b e g a p r o c n a t la c a d s c i u s a 1 9 9 6 ，9 3 ，1 3 1 4 8 1 3 1 5 1 1 4 b r o w n ，d r ；q i n ，k ；h e n n s ，j w ；m a d l u n g ，a ；m a n s o n ，j ：s t r o m e ，r ：f r a s e r , pe n a t u r e1 9 9 7 ，3 9 0 ，6 8 4 - 6 8 7 1 5 d i r i n g e r , h ；g e l d e r b l o m ，h ；h i l m e r t ，h ；o z e l ，m ；e d e l b l u t h ，c ：k i m b e r l i n ，r h n a t u r e1 9 8 3 ，3 0 6 ，4 7 6 - 4 7 8 1 6 ( a ) s a f a r , j ；r o l l e r , rp ；g 旬d u s e k ，d c ；g i b b s ，c j z b i o l c h e m 1 9 9 3 ，2 6 8 ， 2 0 2 7 6 - 2 0 2 8 4 ( b ) k o c i s k o ，d a ；c o m e ，j h ；p r i o l a ，s a ；c h e s e b r o ，b ；l a n s b u r y , rt ； c a u g h e y b n a t u r e1 9 9 4 ，3 7 0 ，4 7 1 - 4 7 4 1 7 m i l l h a u s e r , gl a c c c h e m r e s 2 0 0 4 ，3 7 ( 2 ) ，7 9 - 8 5 18 j e f f r e y , ga ：s a e n g e r , wh y d r o g e nb o n d i n gi nb i o l o g i c a ls