（动物营养与饲料科学专业论文）定向酶法制备活性肽分析系统的研究.pdf

摘要 本课题首先利用a c c e s s x p 数据库软件建立了蛋白质数据库、活性肽数据库、蛋白质水解酶数据库， 利用v b 编写“定向酶解制备活性肽分析系统”程序。蛋白质数据库中包含常见的食物蛋白质的一级序 列、链长、分子量等信息；活性肽数据库包含活性肽的功能、氨基酸序列、p i 参考文献等信息；蛋白 质水解酶数据库包含蛋白质水解酶的酶切位点、参考文献等信息。数据库与“定向酶法制备活性肤分 析系统”程序配合，实现活性肽在蛋白质中搜寻并给出活性肽在蛋白质中的含量，实现蛋白质用单酶或 者复酶的模拟水解等功能 本课题在利用“定向酶解制备话性肽分析系统”分析常见食物蛋白中a c e 抑制肽含量的基础上， 选定小麦蛋白质作为a c e 抑制肽的蛋白源。通过分析活性肽数据库中a c e 抑制肽的结构特点并结合蛋 白质水解酶的作用位点，模拟水解小麦蛋白质模拟水解结果显示，碱性蛋白质水解酶更适合制备a c e 抑制肽，实验同时选用胰蛋白质水解酶作为比较。 通过分析致据库以及正交试验筛选出碱性蛋白质水解酶作为小麦蛋白质的水解酶，并确定优化条 件：酶用量2 2 5 i i i g ，p h 值9 5 ，温度6 0 。 实验以样品浓度：2 0 0 m g m l ；上样量：2m l ；流速：o 2 5 m l m i n ；洗脱剂：o 0 1m o l l h a c - n a a c 缓冲液( p h4 o ) 通过s e p h a d e xo 1 5 分离所得的最高活性组分经半制各r p h p l c 分离后得到 了高纯度的单一活性组分。经氨基酸组成分析和l c m s 鉴定，从小麦蛋白质a l c a l a s e 水解物中 分别鉴定出一种新的a c e 抑制肽p l y ，其i c 5 0 值为1 5 3 9 m ，小麦蛋白中有3 5 4 条一级序列包 含p l y 片断，p l y 符合a c e 抑制肽的规德。 论文通过实验初步验证了“定向酶法制备活性肽分析系统”可行性。 关键词：数据库生物活性肽，蛋自质序列，活性肤序列，蛋白质水解酶，血管紧张素转化酶抑制肽， a l c a l a s e 蛋白质水解酶 摘要 a b s t r a c t f i r s t l y , t h ep a p e rm a k e s l j s co fm sa c c e s st os e tu pp r o t e i nd a t a b a s e , a c t i v ep e p t i d e sd a t a b a s ea n d p r o t e o l y t i ce b z y m ed a t a b a s e a n da l s om a k e s 嗽o f m sv bt oc o m p i l e r “a i l a i y 雠a ls y s t e mf o ra c t i v ep e p t i d e s p r e p a r e dw i t hd i r e c t i d e se j i l l c ：h y d r o l y z j n gm e t h o d ”p r o g r a n lt h ep r o t e i nd a t a b a s e c o n t a i n sp r o t e i n s e q u e n c e s , t h el e n g t ho f p r o t e i ns e q u e n c e ，m o l e c u l a rw e i g h t ，a n ds oo n t h ea o t l v ep e # c l e - sd a t a b a s ec o n t a i n s t h e , a j 3 j j l oa c i ds e q u 即c e p i , r e f e r e n c ea n ds o ，t h ee l l z y m ed a t a b a s ec o n t a i n sh y d r o l y z a t i o nl o c a t i o na n d r e f e r e n c e t h ed a l a b a s e ，c o n n e c t i n gw i t ht h ep r o g r a m ，e n a b l ey o ut os e a r c hp e p t i d c si nt h es e l e c t e df o o dp r o t e i n d a t a b a s e sa n dg e tt h ep e p t i d e s p e r c e n t a g eo ft h es e l e c t e df o o dp r o t e i n a n da l s oh y d r o l y z et h es e l e c t e df o o d p r o t e i nw i t ho n ek i n do fp r o t e o l y t i ce n z y m eo rm m o ft h i sk i n d 。t h ep a p e r , b a s e do nu s i n gt h ep r o g r a m , a n a l y s e st h ep e r c e n t a g eo f a c ei n h i b i t o r yp c p t i d e so f t h ec o m m o nf o o dp r o t e i n s , c h o o s e st h ew h e a tp r o t e i nt o h y d r o l y z et og a i na c ei n h i b i t o r yp e p t i d e s b yt h ea n a l y s i s0 1 1t h er u l eo f ；w h i c h 雠c o n m i n e di nt h ea c t i v e p e p t i d ed a t a b a s ea n dp r o t e o l y t i c z y m e sc k m l c t e rt h ec o m p u t e rh # r o l y z e st h ew h e a tp r o t e i n t h er e s u l t s h o w su st h a ta l c a l a s ei sm 瓣s u i t a b l et oh y d r o l y z et h ew h e a tp r o t e i nf o rm a k i n ga c ei n h i b i t o r yp e p t i d e s , c o m p a r e dw i t ht h et r y p s i n t h er e s u l to ft h ee x p e r t m e m ；w h i c ha l c a l a s ei sm o s u i t a b l et oh y d r o l y z et h ew h e a tp r o t e i nf o rm a k i n g a c ei n h i b i t o r yp e p t i d e s , i sc o n s i s t e n tw i t ht h ea n a l y s i s t h eo p t i m u mh y d r o l y s i sc o n d i t i o n sw md e t e r m i n e d ： d o s a g e so f e n z y m e2 2 5 i i p h9 5 ，6 0 a c c o r d i n gt ot h em o l e c u l a rw e i g h to f t h eh y d r o l y z a t e w em a u o f g - 1 5t os c 4 v a r a et h eh y d r o l y z a t ea n d g e ts i xe l e m e n t su n d e rt h eb e s ts e p a r a t ec o n d i t i o n t h es i x t he l e m e n t , w h o s em o l e c u l a rw e i g h ti st h es m a l l e s t , i st h eb e s tt oi n h i b i ta c e a n dt h e nw cr e s e p a r a t et h es i x t he l e m e n tw i t ht h er p - h p l c , g e t t i n gf o u r t e e n e l e m e n t s t h ee i g h t ho mi st h eb e s tt oi n h i b i ta c e a n di t si c s oi s1 5 3 山订t h ep e p t i d e s a m i b oa c i di s v m - l e u - t y r ( p l y ) ，a n dt h ep l y , w h i c hs u i t st h er u l eo f t h ea c ei n h i b i t o r yp e p f i d e si nt h ea c t i v ed a t a b a s e , i sa n e w a c ei n h i b i w r yp e p t i d e s t h e r ea ”3 5 4w h e a tp r o t e i ns e q u e n c e s , w h i c hc o n t a i nt h ep e p t i d e sp l y b yt h ee x p e r i m e n t , t h ep a p e rp r o v e st h e a n a l y t i c a ls y s t e mf o ra c t i v ep e p t i d o sp r e p a r e dw i t hd i r e c t i d e s e l l z y m eh y d r o l y z i n gm e t h o d ”i sp r a c t i c a l k e yw o r d s ：d a t a b a s e ，b i o a c f i v ep e p t i d e s ，p r o t e i ns e q 咖c 岛b i o a c t i v ep e p t i d e ss e q u e n c e , p r o t e o l y t i c e n z y m e ，a n g i o t e n s i n - c o n v e r t i n ge n z y m ei n h i b i t o r yp e p t i d e s ，a l c a l a s e 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工 作及取得的研究成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地 方外，论文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含 本人为获得江南大学或其它教育机构的学位或证书而使用过的材料。 与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 签名： 关于论文使用授权的说明 本学位论文作者完全了解江南大学有关保留、使用学位论文的规 定：江南大学有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和 磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以将学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、 汇编学位论文，并且本人电子文档的内容和纸质论文的内容相一致。 保密的学位论文在解密后也遵守此规定。 签名：匦缝笙导师签名： 日期：妒多月俨日 第一章序论 第一章绪论 食物蛋白质是生物活性肽的重要来源，适宜的酶解能使蕴藏于蛋白质之中的生物活性肽释 放出来目前，已从不同食物蛋白质酶解产物中分离鉴定出大量的具有各种生物活性的肽，如具有抗 高血压活性的血管紧张素转化酶( a c e ) 抑制肽”j 、阿片抑制肽【2 ”、免疫调节肽1 4 棚、抗氧化肽【6 7 】、 抗菌肽l s 川、抗血栓肽l lo ，“l 、降脂肽【t 2 , 1 3 1 等。随着人们对食品蛋白源活性肽功能研究的不断深入， 活性肽将成为预防和治疗慢性疾病的手段之。同时，酶解食物蛋白生产活性肽可提高粮油等 食品的附加值，提高农民收入，促进我国保健食品行业的健康发展。 1 1 酶法制备活性肽研究现状 迄今，获得生物活性肽的大量研究主要集中在蛋白履水解酶和蛋白质的筛选以及酶解条件的优化 上，研究者往往是随机的选择蛋白质与蛋白质水解酶。研究者研究话性肽般有两种出发点：一是为得 到特定功能的活性肽筛选合适的蛋白，如为获得降血压肽选择不同的蛋白确定适宜的蛋白；二是为开发 某种蛋白功能而研究该蛋白中能制备出哪些活性肽，如为开发绿豆蛋白的功能，水解后检测水解物中具 有何种生理功能的活性肽。 目前，酶法制各生物活性肽一般步骤如图1 1 所示。从图1 一l 可以看出为开发某种蛋白质功能， 酶法水解该蛋白质获取生物活性肽需要做如下工作：由于是开发固定蛋白质的功能，制备活性肽的筛选 图卜一1 酶法制备活性肽的流程图 工作从蛋白质水解酶开始。以开发玉米醇溶蛋白质为例，玉米醇溶蛋白质在水相中蛋白质会变成具有弹 性独立小球状，蛋白质水解酶无法接触内部蛋白质使水解无法顺利进行，反馈的信息确定是否更换蛋白 质水解酶或者寻找其他解决办法。例如先对玉米醇溶蛋白质改性使玉米醇溶蛋白质能融解在水相：条件 优化水解顺利进行后进入下一个实验环节分离纯化，分离纯化是实验中最不确定的步骤，在水解物 中活性肽未知以及活性肽性质未知情况下，分离方法只能尝试现有的分离方法( 离子交换、凝胶分离、 高效液相色谱等) ；分离纯化完成后，实验进入活性检测环节。以花生蛋白质碱性蛋白质水解酶水解物 分离a c e 抑制肽为例，当研究者采用凝胶方法分离水解物，可能最终未能检测出活性，但并不代表产 物中不含有a c e 抑制肽，可能是分离方法不当未能把a c e 抑制肽分离出来。反馈信息使研究者作出更 改分离方法或者更换蛋白质水解酶，再重新进行一次实验；分离纯化工作完成后进入下一个实验环节一 一活性检测，对分离纯化得到相对纯度高的组分进行活性检测，如果成分不具有活性肽，重新选择以上 步骤中的条件。如果组分具有活性，实验进入下一个环节，结构鉴定时如果分离纯化出的不是单物质。 当几种活性肽在使用分离方法中性质相近，结构鉴定时同时有几种物质，研究者或者重新分离( 可能没 有足够的量进行再分离) 或者对鉴定出的物质化学合成后检测活性以确定哪种物质在发挥作用。从以 上的实验步骤分析可以看出，实验存在盲目和不确定的因素太多。如果是为获得某种生理功能的活性肽， 实验需要同时筛选蛋白质和蛋白质水解酶，工作量、不确定程度增加一倍。 本研究以目前研究比较热门的a c e 抑制肽为例，利用分析系统分析蛋白一级序列中3 5 1 种a c e 抑制肽的百分含量，并结合a c e 抑制肽的特点以及蛋白质水解酶的酶解位点特性指导实验。 望塑查塑圭竺丝苎 1 2 a c e 抑制肽 a c e 抑制肽是属于a c e 抑制剂的一种，a c e 抑制肽通过抑制a c e 从而达到降低人体血压的作 用。a c e 抑制肽不能称为降血压肢，只有经动物实验或人体实验证明具有抗高血压作用的肽类物 质称为降血压肽，而经体外活性检测方法证明的称为a c e 抑制肽。降血压肽和a c e 抑制肽其实并 不完全一致，降血压肽强调对人体的作用，能够使高血压患者血压降低，而a c e 抑制肽只是在体外对 a c e 有抑制作用，它并不一定能保证经口服或其它方式进入人体后一定具有降压作用。一些在体外实 验中a c e 抑制活性并不太高的肽，却能显著降压，许多学者认为这是由于这些肽类物质经过人体消化 道时会被体内的蛋白质水解酶水解，一些具有较高a c e 抑制活性的肽会被水解成抑制活性较低或几乎 没有活性的小片断，也可能被水解成抑制活性较高的片断。a c e 抑制肽与其它a c e 抑制剂比较有一个 很大的优点，a c e 抑制肽不会有副作用，当人体服用a c e 抑制肽后血压降低到正常水平后血压不会因 继续服用a c e 抑制肽继续降低，而是把血压维持在正常水平 a c e 抑制肽结构与活性关系研究表明，底物或抑制剂的c 末端三肽强烈影响其与a c e 的结合，这 也进一步被这一事实所证实：当在二肽抑制剂n 末端以适当氨基酸延长时，所得的相应三肽活性比二 肽高。a c e 倾向于c 末端三肽的每个位置含有疏水性氨基酸( 如芳香族氨基酸和支链氮基酸) 的底物 或抑制剂。大量研究表明，c 末端为t r p 、p h e 、l y r 和p r o 而n 末端为支链氨基酸的二肽或三肽具有强 的a c e 抑制活性“o ” u ”j 。a c e 对c 末端为二羧基氨基酸如g l u 的底物或抑制剂具有较小的亲和 力。但也有的抑制肽并不符合以上规律。研究表明，肽c 末端氨基酸a r g 和l y s 的侧链胍基或一氨基 对其活性有很大的贡献”4 l 4 “。计算机辅助分子建模对肽结构的理论研究结果表明，抑制剂能与不 被底物所占有的亚活性位点或不同于a c e 催化部位的阴离子抑制剂结合位点相互作用。a c e 抑制肽的 分子静电势模式不同于无活性分子：即a c e 抑制肽中相似的正电势几乎位于c 末端的相同区域。a c e 对底物或抑制肽的c 末端第三位氨基酸具有很高的立体专一性，该位的氨基酸必须是l 构型，但对第 四位氨基酸的立体专一性不严格，如d - v a l - a l a - p r o 的活性很低，其i c 为5 5 0 9 m ，但v a l - a l a - p r o 和 d - p h e - v a l - a l a - p r o 的i c s o 分别为2 o p m 和1 7 p m 唧j 。肽的豌水性也是影响其活性的重要因素1 2 “。高亲 水性无法使肽接近a c e 活性部位而导致弱或无活性。a c e 抑制肽的活性强度也受c 端p r o 残基临近氨 基酸的影响，对于高活性的肽，临近氨基酸应该是疏水性氨基酸。 1 3a c e 抑制肽的蛋白源 人们最初从蛇毒液中发现a c e 抑制肽1 1 4 4 。这些a c e 抑制肽长度一般由5 1 3 个氨基酸组成， 大多数肽的c 端为a l a - p r o 和p r o - p r o ，其中p y r - t r p - p r o - a r g - p r o - g l n - i l e - p r o - p r o 对高血压动物的降压效 应最强，并曾经用于体外注射治疗人高血压l “。0 s h h a 等1 9 7 9 年报道了用细菌胶原酶水解明胶获 得了6 种活性较强的a c e 抑制肽，并解析了其氨基酸组成l l ”，这是首次用蛋白质水解酶体外水解食物 蛋白质获得a c e 抑制肽。随后，大量的a c e 抑制肽从不同食物蛋白质水解物中被分离鉴定出来，这些 食物蛋白质包括酪蛋白“】、乳清蛋白【2 7 。”，鱼蛋白【3 0 4 ”、猪鸡肌肉【”3 ”、鸡蛋蛋白n 4 , 3 8 、血红蛋 白【3 ”、血浆蛋白胁“l 、胶原蛋白1 4 5 ”】、养麦蛋白【4 8 l 、小麦蛋i 刍 4 9 ：0 1 、玉米蛋白渺”】、大豆蛋白i ”56 1 、 肾豆蛋白【”l 、小红豆蛋白、菜籽蛋白1 5 9 1 、酒糟蛋 6 0 , 6 1 1 、大蒜1 6 2 】蛋白以及藻类蛋白1 6 4 - 6 叼等。 大多数流行病学研究结果表明，蛋白质摄入量与血压水平呈负相关。r e e d 等在h o n o l u l uh e a r ts t u d y 6 4 9 6 名旦本移民中证明随膳食总蛋白质摄取量的增加，收缩压及舒张压均降低”1 9 8 9 年我国1 0 组 人群生态学研究表明，人群的血压值与人群每天平均动物蛋白质摄入量呈显著负相关一”。最突出的是 浙江舟山渔民食盐及酒精摄入量都很高，但鱼类蛋白质摄入量居1 0 组人群首位，人群血压值在1 0 组人 群中最低。1 9 9 4 年发表的对其中3 组人群( 山西农民、广西农民、舟山渔民) 共7 0 5 人的深入研究进 一步显示：在人群内个体的血压水平不但和动物蛋白质的摄入量显著负相关，而且和2 4 小时尿中硫酸 盐及尿中的与动物蛋白质代谢有关的氨基酸如牛磺酸、赖氨酸、半胱氨酸、l ，甲基组氨酸分别呈显著负 相关”】。1 9 9 6 年该项研究扩大到1 3 组人群，其中渔民血压水平仍然居最低，生态学分析表明，不仅 动物蛋白质摄入量，而且总蛋白质摄入量与人群收缩压及舒张压值呈显著负相关，人群摄入的蛋白质热 量百分比每增高2 k c a l ，收缩压和舒张压均值分别降低2 3m m h g 及1 7m m h g ”i 。1 9 9 6 年s t a m l a r 等1 的研究结果表明，个体每天膳食蛋白摄入量从4 4g 增加到8 0 9 ，收缩压及舒张压分别降低3 0 m m h g 和2 5 m m h g 。 第一章序论 1 4 课题立题意义和主要内容 我们知道活性肽的功能与其氨基酸组成及其排列直接相关，不同蛋白质的一级结构潜在含有不同功 能的活性肽片断。因此，在酶法水解蛋白质制各功能性活性肤的过程中，蛋自质原料的选择是生产相应 功能活性肽的物质基础，而具有不同酶解位点的蛋白质水解酶的选择是制各活性肽的关键。随着生物信 息学的发展及生物活性肽研究的不断深入，越来越多的蛋白质一级结构及活性肽的氨基酸序列得到阐 明，蛋白质水解酶的酶切位点也越来越明确，这为从原料蛋白质中寻找已知氨基酸组成序列的生物活性 肚提供了基础研究表明，具有特定生物活性的肽具有相似的结构特征，而其活性与肽的理化性 质相关。因此，根据活性肽的氨基酸组成结构信息和不同蛋白质水解酶的水解位点特异性可以 利用计算机模拟定向的释放活性肽，使用特定酶定向释放活性肽 部分研究者意识到酶法制备活性肽存在的问题，以及现代生物信息的发展，并在结合生物信息技术 方面做了一些尝试。黎观红、乐国伟、施用晖等1 7 副2 0 0 3 建立活性肽数据库，数据库中包括a c e 抑制肽、 免疫调节肽、阿片肽等常见的部分活性肽，由于没有蛋白质数据库、蛋白质水解酶数据库以及软件，活 性肽数据库无法单独使用无法解决实验中存在的问题。v a n e s s a v e r m e i r s s e n 等f 7 3 1 2 0 0 4 ，建立豌豆蛋白质、 乳清蛋白质数据库以及a c e 抑制肽数据库，并在d ( ) s 下编写软件分析豌豆蛋白质、乳清蛋白质中的a c e 抑制肽含量并进行了验证，实验取得了初步成果。 本研究在前人研究的基础上，建立蛋白质数据库、蛋白质水解酶数据库并编写“定向酶法制各活性 肽分析系统”，探讨目前实验存在问题的解决办法。 本课题利用m sa c c e s s 软件分别建立蛋自质数据库、活性放数据库、蛋自质水解酶数据库作为系统 的后端数据库，蛋白质数据库中存储常见食物蛋白质氨基酸的一级序列、分子量、链长等信息，活性肽 数据库存储活性肽的功能、氨基酸序列、p i 、参考文献等信息，蛋白质水解酶数据库存储蛋白质水解酶 的酶切位点等信息。利用m sv b 软件编写“定向酶法制各活性肽分析系统”程序，使程序具有调用后 台的三个数据库，实现活性肽搜寻、蛋白质模拟水解等功能。 利用“定向酶法制备活性肽分析系统5 分析常见的食物蛋自质中的3 5 1 种a c e 抑制肽，如小麦蛋 白质、大米蛋白质、绿豆蛋白质、花生蛋白质、绿豆蛋白质、玉米蛋白质、燕麦蛋白质、养麦蛋白质等 常见的食物蛋白质，通过计算机统计食物蛋白中a c e 抑制肽百分含量，再根据食物蛋白质的含量、获 取的难易程度，确定适合酶解获取a c e 抑制肽的蛋白质以及蛋白质水解酶。 课题主要内容 l 建立蛋白质数据库、活性肽数据库、蛋白质水解酶数据库； 2 编写定向酶法制备活性肽分析系统软件； 3 计算机筛选适合制各a c e 抑制肽的蛋白质及蛋白质水解酶筛选； 3 分离纯化方出单一的a c e 抑制肽，并通过氨基酸分析和质谱鉴定确定a c e 抑制肽的氨基酸序列， 验证分析系统的可行性。 3 江南大学硕士学位论文 参考文献 【1 m a t o b a ，u s u i a1 t ，f u j i t a ahe ta 1 an o v e la n t i h y p e r t e n s i v ep e p t i d ed e r i v e df r o m o v a l b u m i ni n d u c e sn i t r i co x i d e m e d i a t e dv a s o r e l a x a t i o ni na ni s o l a t e ds h rm e s e n t e r i c a r t e r yj f e b sl e t t ，1 9 9 9 。4 5 2 ：1 8 1 - 1 8 4 2 g a r r e a ui 。p e j o a nc 。b r e s s o l l i e rpe ta 1 p u r i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no f e n k e p h a l i n - r e l a t e dp e p t i d e sr e l e a s e db yi nv i t r op e p t i cd i g e s t i o no fb o v i n ep l a s m a p r o t e i n sj p e p t i d e s ，1 9 9 4 ，1 5 ：11 9 5 - 2 0 4 3 f u k u d o m es ，j i n s m a ay ，m a t s u k a w ate ta 1 r e l e a s eo fo p i o i dp e p t i d e s 。g l u t e ne x o r p h i n s b yt h ea c t i o no fp a n c r e a t i ce l a s t a s ej f e b sl e t t ，1 9 9 7 ，4 1 2 ：4 7 5 4 7 9 4 p a r k e rf ，m i g l l o r e s a m o u rd ，f l o c hfe ta 1 i m m u n o s t i m u l a t i n gh e x a p e p t i d ef r o mh u m a n c a s e i n ：a m i n oa c i ds e q u e n c e ，s y n t h e s i sa n db i o l o g i c a lp r o p e r t i e sj e u rjb i o c h e m ， 1 9 8 4 。1 4 5 ：0 7 7 6 8 2 5 t a k a h a s h im ，m o r i g u c h is ，y o s h i k a w ame ta 1 i s o l a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no f o r y z a t e n s i n ：an o v e lb i o a c t i v ep e p t i d ew i t hi l e u m c o n t r a c t i n ga n di m m u n o m o d u l a t i n g a c t i v i t i e sd e r i v e df r o mr i c ea l b u m i nj b i o c h e mw o lb i o li n t ，1 9 9 4 ，3 3 ：1 1 5 1 - 1 1 5 8 6 s u e t s u n ak ，u k e d ah ，o c h ih i s o l a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no f f r e er a d i c a l s c a v e n g i n ga c t i v i t i e sp e p t i d e sd e r i v e df r o mc a s e i nj n u t rb i o c h e m ，2 0 0 0 ， 1 1 ：1 2 8 一1 3 1 7 k i ms k ，k i my t 。b y u nh ge ta 1 i s o l a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no fa n t i o x i d a t i v e p e p t i d e sf r o mg e l a t i nh y d r o l y s a t eo fa l a s k ap o l l a c ks k i n j g r i cf o o dc h e m ，2 0 0 1 ， 4 9 ：1 9 8 4 - 1 9 8 9 8 t o m i t am ，b e l l a m y ，t a k a s eme ta 1 p o t e n ta n t i b a c t e r i a lp e p t i d e sg e n e r a t e db yp e p s i n d i g e s t i o no fb o v i n el a c t o f e r r i n jd a i r ys c i ，1 9 9 1 ，7 4 ：4 1 3 7 4 1 4 2 9 c h o i s n a r dl ，f r o i d e v a u xr ，n e d j a r a r r o u m ene ta 1 k i n e t i cs t u d yo ft h ea p p e a r a n c e o fa na n t i b a c t e r i a lp e p t i d ei nt h ec o u r s eo fb o v i n eh a e m o g l o b i np e p t i ch y d r o l y s i s jb i o t e c h n o la p p lb i o c h e m ，2 0 0 2 ，3 6 ：1 8 7 1 9 4 1 0 n o n a k ai ，k a t s u d as ，o h m o r ite ta 1 i nv i t r oa n di nv i v oa n t i p l a t e l e te f f e c t s o fe n z y m a t i ch y d r o l y s a t e so fc o l l a g e na n dc o l l a g e n - r e l a t e dp e p t i d e s3 b i o s c i b i o t e c h n 0 1b i o c h e m 1 9 9 7 ，6 1 ：7 7 2 - 7 7 5 1 1 m a n s om a ，e s c u d e r oc ，a 1 i j ome ta 1 p l a t e l e ta g g r e g a t i o ni n h i b i t o r ya c t i v i t yo f b o v i n e ，o v i n e ，a n dc a p r i n ek a p p a c a s e i nm a c r o p e p t i d e sa n dt h e i rt r y p t i ch y d r 0 1 y s a t e s jf o o dp r o t ，2 0 0 2 ，6 5 ：1 9 9 2 1 9 9 6 1 2 n a g a o k as ，f u t a m u r ay ，m i w ake ta 1 i d e n t i f i c a t i o no fn o v e lh y p o c h o l e s t e r o l e m i c p e p ti d e sd e r i v e df r o mb o v i n em ii kb e t a l a c t o g l o b u li n jb i o c h e mb i o p h y sr e sc o m m u n ， 2 0 0 1 2 8 1 ：1 1 一1 7 1 3 o hs w ，l e ej s ，y a n gh je ta 1 a m i n oa c i ds u b s t i t u t i o no fh y p o c h o l e s t e r 0 1 e m i cp e p t i d e o r i g i n a t e df r o mg l y c i n i nh y d r o l y z a t e jf o o ds c ib i o t e c h n o l ，2 0 0 2 ，1 l ：5 5 6 1 1 4 f e r r e i r as h ，b a r t e l td c ，g r e e n el j i s o l a t i o no fb r a d y k i n i n p o t e n t i a t i n gp e p t i d e s f r o mb o t h r o p sj a r a r a c av e n o m jb i o c h e m i s t r y ，1 9 7 0 ，9 ：2 5 8 3 2 5 9 3 1 5 o n d e t t im a 。w i l l i a m sn j ，s a b oe fe ta 1 a n g i o t e n s i n c o n v e r t i n ge n z y m ei n h i b i t o r s f r o mt h ev e n o mo f8 0 t h r o p sj a r a r a c a ：i s o l a t i o n ，e l u c i d a t i o no fs t r u c t u r ea n d s y n t h e s i s jb i o c h e m i s t r y ，1 9 7 1 ，1 0 ：4 0 3 3 4 0 3 9 1 6 k a t oh ，s u z u k it b r a d y k i n i n p o t e n t i a t i n gp e p t i d e sf r o mt h ev e n o mo fa k i s t r o d o n h a l y sb l o m h o f f ii ：i s o f a t i o no f f i v eb r a d y k i n i np o t e n t i a t o r sa n d t h ea m i n oa c i d s e q u e n c e so ft w oo ft h e m ，p o t e n t i a t o r sba n dc jb i o c h e m i s t r y ，1 9 7 i ，1 0 ：9 7 2 - 9 8 0 1 7 e n g e ls l ，s c h a e f f e rt r ，w a u g hm he ta 1 e f f e c t so ft h en o n a p e p t i d es o2 0 ，8 8 1o n b l o o dp r e s s u r eo fr a t sw i t he x p e r i m e n t a lr e n o v a s c u l a rh y p e r t e n s i o n jp r o cs o ce x p b i o lm e d ， 1 9 7 3 ， 1 4 3 ：4 8 3 4 8 7 1 8 m u i r h e a de e b r o o k sb ， r o r ak k p r e v e n t i o no fm a l i g n a n th y p e r t e n s i o nb yt h e s y n t h e t i cp e p t i d es q2 0 ，8 8 1 jl a bi n v e s t ，1 9 7 4 ，3 0 ：1 2 9 1 3 5 1 9 o s h i m ag s h i m a b u k u r oh ，n a g a s a w ak p e p t i d ei n h i b i t o r so fa n g i o t e n s i ni c o n v e r t i n g 第一章序论 e n z y m ei nd i g e s t so fg e l a t i nb yb a c t e r i a lc o l l a g e n a s e jb i o c h i mb i o p h y sa c t a , 1 9 7 9 ， 5 6 6 ：1 2 8 1 3 7 2 0 w u r u y a m as 。m i t a c h ih ，t a n a k ahe ta 1 s t u d i e so nt h ea c t i v es i t ea n d a n t i h y p e r t e n s i v ea c t i v i t yo fa n g i o t e n s i ni c o n v e r t i n ge n z y m ei n h i b i t o r sd e r i v e d f r o mc a s e i n ja g r i cb i o lc h e m 。1 9 8 7 5 1 ：1 5 8 1 1 5 8 6 2 1 k o h m u r am ，n i on ，k u b oke ta 1 i n h i b i t i o no fa n g i o t e n s i n c o n v e r t i n ge n z y m eb y s y n t h e t i cp e p t i d e so fh u m a nb c a s e i n ja g r i cb i o lc h e m ，1 9 8 9 ，5 3 ：2 1 0 7 2 1 1 4 2 2 n a k a m u r ay ，y a m a m o t ov 。s a k a ixe ta 1 p u r i f i c a t i o na n dc h a r a c t e r i z a t i o no f a n g i o t e n s i ni c o n v e r t i n ge n z y m ei n h i b i t o r sf r o mas o u rm i l k jd a i r ys c i1 9 9 5 ，7 8 ， 7 7 7 - 7 8 3 2 3 m a e n om ，y a m a m o t on ，t a k a n ot i d e n t i f i c a t i o no fa na n t i h y p e r t e n s i v ep e p t i d ef r o m c a s e i nh y d r o l y s a s t ep r o d u c e db yap r o t e i n a s ef r o ml a c t o b a c i i l u sh e l v e t i c u sc p 7 9 0 jd a i r y8 c i1 9 9 6 ，7 9 ：1 3 1 6 1 3 2 1 2 4 k i my kc h u n gb h an o v e la n g i o t e n s i n - i c o n v e r t i n ge n z y m ei n h i b i t o r yp e p t i d ef r o m h u m a n 口s l c a s e i n jb i o t e c h n o ll e t t ，1 9 9 9 。2 1 ：5 7 5 5 7 8 2 5 k i m y k ，y o o ns ，y ud ye ta 1 n o v e la n g i o t e n s i n i c o n v e r t i n ge n z y m ei n h i b i t o r y p e p t i d e sd e r i v e df r o mr e c o m b i n a n th u m a na l p h as l - c a s e i ne x p r e s s e di ne s c h e r i c h i a c o i i jd a i r yr e s ，1 9 9 9 ，6 6 ：4 3 1 - 4 3 9 2 6 t