（动物学专业论文）镰形扇头蜱igg结合蛋白基因的克隆及表达.pdf

摘要 蜱是一类专性吸血的体外寄生虫，分布广泛，是许多人和动物重要疾病的传播媒介。经蜱传 播的病原体有细菌、病毒、真菌、立克次体、螺旋体以及原虫，不仅给畜牧业造成很大的经济损 失，同时还影响人类健康。目前世界上约有8 2 0 多种蜱，我国发现的蜱有1 1 0 多种，镰形扇头蜱 是我国南方的优势蜱种，主要传播牛巴贝斯虫病、马巴贝斯虫病和吉氏巴贝斯虫病。蜱及蜱传播 疾病引起的经济损失十分巨大，到目前为止。免疫防治被认为是最有潜力的防治策略，而寻找敏 感、长效、安全的抗原基因是免疫防治的前提条件。i g g 结合蛋白( i g gb i n d i n gp r o t e i n ，i g b p ) 是蜱体内的一种重要蛋白质，主要存在于蜱的血淋巴和唾液腺中，可以结合进入蜱血淋巴中的宿 主免疫球蛋白，避免了宿主免疫球蛋白对蜱内部嚣官的损害，有些种类的i g b p 具有雄性特异性， 是雄蜱协助雌蜱顺利完成吸血所必不可少的i g b p 是蜱体内一种具有疫苗潜力的功能分子。 本实验以镰形扇头蜱吸血前后雄蜱唾液腺的抑制消减杂交e d n a 文库中的f _ s t 数据为基础， 应用r a c e 方法从镰形扇头蜱体内克隆出一个i g b p 基因的全长序列，该基因全长6 8 3 b p ，编码 1 7 8 个氨基酸，预测分子量为1 9 5 k d a ，经同源性比较该基因与具尾扇头蜱的i g b p m b 基因序列 的同源性高达9 2 。用r t - p c r 方法分析了该基因表达的性别特异性、各个器官、各个发育阶段 的表达情况，结果表明，该基因表达没有性别特异性；i g b p 基因在唾液腺、壳这两个器官有所 表达，但在肠中却没有表达；在蜱的各个发育阶段均有表达。成功构建了重组表达载体，并转化 到表达菌b 1 2 1 中，经i p t g 诱导，结果表明i g b p 可以在原核表达系统中高效表达，应用g s t 融合蛋白纯化系统，可获得纯化的目的蛋白：探讨了e l l s a 方法检测重组蛋白结合宿主l g g 活 性的试验， 综上所述，本研究首次克隆、表达了镰形扇头蜱i g c 结合蛋白基因，分析它的表达特 i 寸 点，并对其功能进行了初步研究，为该基因的进一步研究打卜基础。 关键词：镰形扇头蜱；i g g 结合蛋白；克隆；表达 a b s t r a c t t i c k sa r eo b l i g a t eh a e m a t o p h a g o u se c t o p a r a s i t e s ，t h e yd i s t r i b u t ew i d e l ya n da r e t h es i g n i f i c a n tv e c t o r st r a n s m i t t i n gag r e a tn u m b e ro fp a t h o g e n so fh u m a na n d a n i m a l s ，s u c ha sa r b o r i r u s e s ，r i c k e t t s i a e ，s p i r o c h e t e s a n dp a r a s i t i cp r o t o z o a a t p r e s e n t t h e r ea r ea b o u t8 2 0k i n d so f t i c ki nt h ew o r l da n dm o r et h a n1 1 0k i n d so f t i c k sa r ef o u n di nc h i n a r h i p i c e p h a l u sh n e m n p h y s a t o i d e st i c ki sap r e d o m i n a t ek i n d o ft i c k si ns o u t ho fc h i n a ，w h i c ht r a n s m i tb a b e s i ab o r i s ，b e q u ia n db g i b s o n ia n ds o o n t h ee c o n o m i cl o s sc a u s e db yt i c k sa n dt i c k - b o r n ep a t h o g e n si sq u i t eg r e a ta n d i m m u n o l o g i c a lp r o t e c t i o ni sd e e m e da st h em o s tp o t e n t i a lm e a s u r ea tp r e s e n t ，w h i c h m a k e st h es e a r c h i n gf o rt h es e n s i t i v e ，l o n g t e r me f f e c t i v e ，s a f ea n t i g e ng e n e sb et h e b a s ef o ri m m u n o l o g i c a lp r o t e c t i o n 1 e ob i n d i n gp r o t e i ni sa ns i g n i f i c a n tk i n do fp r o t e i n i nt i c k sm a i n l ye x i s t i n gi nh a e m o l y m p ha n ds a l i v a r yw h i c ha r ea b l et ob i n dh o s tl e gt h a t e n t e r i n gt h eh a e m o l y m p ho ft i c k s ，t h u sa v o i d i n gt h ed a m a g et o t h et h e i ri n t e r n a lo r g a n s s o m ek i n d so fi g b p sa r em a l es p e c i f i cw h i c hi se s s e n t i a lf o rt h em a l eh e l p i n gt h ef e m a l et o h a v cas u e c e s s f u lm e a l f i r s t l y ，w eo b t a i n e dt h ef u l l - l e n g t hs e q u e n c ef r o mr a p i da m p l i f i c a t i o no fe d n ae n d s p r o t o c 0 1 t h eg e n eh a d6 8 3 b pe d e o d i n g1 7 8a m i n oa c i dr e s i d u e sw i t h1 9 5 k d ap r e d i c t e d m o l e c u l a r w e i g h t a n ds h o w e dsr a t h e rh i g hh o m o l o g y ( 9 2 e d n ai d e n t i t i e s ) w i t h r h i p i c e p h a l u sa p p e n d i c u l a t u si g b p m b s e c o n d l y 。t h ee x p r e s s i o nf e a t u r eo fm a l e s p e c i f i c ，i n t h ed i f f e r e n t o r g a n s a n d p h a g e s w e r ea n a l y s i s e d b yt h er e v e r s e t r a n s c r i p t i o np o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o nm e t h o d ( r t - p c r ) ，t h er e s u l t ss u g g e s t e dt h e e x p r e s s i o no fi g b pg e n eh a dn om a l es p e c i f i cc h a r a c t e r i s t i c ，a n d1 g b pg e n ew e r e e x p r e s s e di nt h es a l i v a r y ，s h e l l ，e g g s ，u n f e dl a r v a ，u n f e dn y m p h a ea n da d u l t ，b u tn o t e x p r e s s e di nt h eg u t t h i r d l y ，t h er e c o m b i n a n tp r o t e i n so fg s t - 1 g b pw e r ee x p r e s s e d b yp g e x 一4 t iv e c t o ri ne c o l ia n dt h ef u s e dp r o t e i nw e r ep u r i f i e db yg s ts e p h a r o s e t h er e s u l ti n d i c a t e dt h a ti tc a nb ee x p r e s s e di nh i g hl e v e li ne c o l i l a s t l y ，t h e b i o l o g i c a la c t i v i t yo fi g b pw a sa s s a y e db ye l i s a ( e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n t a s s a y ) i na w o r d ，t h es t u d y c l o n e da n d e x p r e s s e d ai g b pg e n eo fr h 咖i c e p h a l u s h a e m a p h y s a l o i d e sf o rt h ef i r s tt i m ea n dr e s e a r c h e dt h ef u n c t i o ni nap i l o ts t u d y ，t h i s w i l lb et h ef o u n d a t i o nt ot h ef u r t h e rs t u d y k e yw o r d s ：r h i p i c e p h a l u sh a e m a p h y s a l o i d e s ；i g b p ；c l o n i n g ；e x p r e s s i o n i l 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除 了特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究 成果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中做了明确的声明并表 示了谢意。 作者签名：万磅红日期：川s 哆 论文使用授权声明 本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权 保留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅：学校可以公布论文的全部或部 分内容，可以采用影印、缩印或其它手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此 规定。 作者躲乃缈导师签名i 弹舶期：词一，亨码 上海师范大学第章引言 1 1蟀类简介 第一章引言 蜱是一类专性吸血的体外寄生虫。录属于节肢动物门蜘蛛纲蜱螨砸纲蜱螨目蜱亚目蜱总 科，蜱总科包括三科：硬蜱科、软蜱科和纳蜱科，其中危害最大的是硬蜱科，其次为软蛑科， 纳蜱科仅在非洲南部发现一种”。 目前，世界上约有8 2 0 种蜱”1 ，中国发现有1 1 0 多种，蜱的发育要经过卵、幼蜱、若蜱、 成蜱四个阶段”，其中幼虫、若虫和成虫这三个阶段都要在人或动物身上吸血，在幼虫变为 若虫以及若虫变为成虫的过程中，都要经过蜕皮。根据各发育阶段吸血时是否更换宿主可将 硬蟀分为一宿主蜱、二宿主蜱和三宿主蜱。蜱的繁殖能力很强，一般硬蜱一生产卵数千粒， 璃眼蜱属和花蜱属中有些种类产卵数可达2 0 0 0 0 粒以上，软蜱一生产卵多次一般情况下可产 卵i o o o 余个“1 。蜱的活动具有明显的季节性，在季节变化分明的地区，他们一般都在一年中 温暖的季节活动。在同一地区，不同种类的蜱活动季节各不相同，而同一种蜱在不同地区， 由于气候和环境的不同，活动时间的长短也有差别。 蜱类宿主范围广泛，包括哺乳类、鸟类、爬行类以及两栖类。蜱类在宿主体上的寄生部 位有明显的选择性，主要选择在皮肤嫩薄或宿主不易搔咬之处。蜱不仅吸食大量血液，刺激 叮咬部位发炎，有的还可以引起宿主呈现功能麻痹性瘫痪，更为重要的是它是许多病原体的 传播媒介和保虫宿主，经蜱携带和传播的病毒性疾病有1 2 6 种，立克次氏体性疾病有2 0 种， 螺旋体性疾病有1 8 种，细菌性疾病1 4 种和原虫性疾病2 6 种”，其中大多数是自然原性疾病 和人畜共患病，如森林脑炎、莱姆病、出血热、q 热、蜱传斑疹伤寒、野兔热、布氏杆菌病 等。蜱及蜱传播疾病引起的经济损失十分巨大，据联合国粮农组织( f a o ) 统计，世界上有 8 0 的牛被侵袭，仅硬蜱给畜牧业造成的损失，全球每年就高达7 0 亿美元”“。在中国记录的 1 1 0 多种蜱类中，其中1 0 余种具有明显的医学重要性，它们传播森林脑炎、莱姆病、丝虫病、 q 型热2 0 余种危害严重的疾病“1 。 蜱的防治主要有以下几种：化学防治、生物防治、遗传防治和免疫防治。( 1 ) 化学防治： 化学防治是最主要的防治方法，过去国内外常用有机氯制剂，有机磷制剂，有机氮制剂来灭 蜱，这些药物虽然有效，但对人、畜毒性大，残效其长，造成极大的环境污染，有的现已命 令禁止使用。目前多采用拟除虫菊酯类化合物( 如灭菊酯类) 和抗生素类药物( 如伊维菌素) 。 ( 2 ) 生物防治：自然界中有些动物可大量捕食蜱类。如一些鸟类、啮齿动物、家禽、蚂蚁、 寄生蜂等。如曾发现有5 种膜翅目的跳小蜂寄生于蜱体内，它们将卵产于蜱体内，待发育成成 虫时，才从蜱体飞出，寄生后不久，蜱即死亡。据k a a y a 和h a s s a n 报道，昆虫病原真菌( 1 0 勺包 子体, l ) 能杀死具尾扇头蜱( 肋i p i c e p h a l u sa p p e n d i c u l a t u s ) 和彩饰花蜱( a m b l y o n m a v a r i e g a t u m ) 的全部幼虫、8 0 - 1 0 0 的若虫和8 0 - 0 0 的成虫”1 。 ( 3 ) 遗传防治：利用遗传学 方法改良牲畜品种及利用辐射、化学不育剂、激素等可使蜱产生染色体异位，失去生殖能力， 然后将它们释放到野生种群中，在那里让处理的成虫与野生成虫交配。这样，下一代的数量 就会大大的减少，使蜱的自然种群不断衰减。( 4 ) 免疫防治：澳大利弧的r a n d 等从微小牛蜱 ( b o o p h j l u sm j c r o p l u s ) 体内克隆和表达了的肠道上皮细胞表面保护性抗原分子b m 8 6 ，它的 上海师范大学第一章引言 基因工程疫苗成为第一个抗节肢动物的商业化疫苗“。抗蟀疫苗在蜱类防治中具有很大的潜 能，它比传统的化学防治更有应用前景，但目前尚未实现大面积应用，目前抗蜱疫苗的研究重 点集中在分离、纯化、鉴定与蜱类生理功能密切相关的目标抗原，并对其生物功能进行研究。 长期以来，药物灭蜱一直是蜱及蜱传疾病的主要控制手段，但随之出现的食品安全、环 境污染以及蜱的抗药性等问题，使人们寻找新的防制策略“。1 9 9 5 年由w i l l a d s e n 和他的 同伴们，研制出微小牛蜱的肠抗原b m 8 6 的重组疫苗，它的成功使人们确信，免疫控制是目前 最有希望自叨法之一。但该疫苗不足之处也十分明显，主要表现在( 1 ) 对其它种的蜱无疫苗 效果，而自然条件下，常常是几种蜱混合感染；( 2 ) 对同一种蜱，在不同国家和地区，效果 不一；( 3 ) 由于该疫苗是由蜱的肠道抗原制备，疫苗的迟效性并不能阻止蜱的吸血和病原的 传播，而蜱的重要性不仅是作为吸血寄生虫，主要是其传播疾病的媒介特性。b m 8 6 的局限性 激励有关学者寻找其他分子。 镰形扇头蜱( r m p y c e p h a i u sh a e m a p h y s a i o i d e s ) 属于硬蜱科扇头蜱属。该蜱是三宿主 蜱，3 - 8 月份在宿主体上发现成虫，主要寄生于水牛，也能寄生于黄牛、猪、山羊、绵羊、 犬、野猪、野兔、水鹿等动物。有时也侵袭人。该蜱是我国南方的优势蜱种，分布全国1 5 个 省，主要传播牛的巴贝斯虫病、马巴贝斯虫病、吉氏巴贝斯虫病“2 ”“ 1 2 蜱体内功能分子的研究进展 生物技术和信息技术的迅速发展，为蜱的功能分子的研究提供了有力的手段，在过去十 多年间，蜱的功能分子研究取得快速进展，并显示出多方面的良好应用前景，成为在分子水 平上寻找新的防治策略的主要突破口，其中，表达序列标签( e s t ) 、蛋白质组学和计算机生 物学与功能分析己成为最重要的蜱的功能分子研究途径。目前从蜱的唾液腺、血淋巴、肠道 等组织与嚣官分离鉴定了许多重要的功能分子，它们在抗凝血、免疫调节、固定口嚣、维持 蜱的正常生理代谢等方面具有重要作用。从现有的研究看，蜱体内的功能分子有如下几类： ( 1 ) 抗凝血分子：蜱的吸血会立即引起宿主的凝血反应，为了完成持续的吸血以及病原的传播， 蜱分泌了具有抗凝血作用的功能分子来达到目的。1 9 9 0 年w a x m a n 等成功地从毛白钝缘蜱 ( o r n i t h o d o 孵o sm o u b a t a ) 体内分离鉴定出第一个蜱抗凝血分子t a p ( t i c ka n t i c o a g u l a n t p e p t i d e ) ，分子量为6 k d a ，是人类凝血因子x a 的特异性抑制剂”。随后在其它硬蜱和软蜱 中分离出许多抗凝血分子，除少数分子量为6 0 k d a ，其它均为6 2 0k d a 的小分子多肽。 ( 2 ) 免疫调节分子：蜱可以调节宿主的天然免疫和获得性免疫。1 9 8 2 年w i k e l 第一次报道了 蜱对宿主具有免疫调节作用“，随后，应用唾液腺粗提物对蜱的免疫调节机理进行了许多研 究。1 9 8 7 年。r i b e i r o 在肩突硬蜱( i x o d e ss c a p u l a r i s ) 的唾液腺中发现了一个具有补体活性 的4 9 k d a 的蛋白“；1 9 9 4 ，w a n g 等从具尾扇头蜱唾液腺中发现了i g g 结合蛋白( i g cb i n d i n g p r o t e i n ，i g b p ) ；2 0 0 0 年，v a l e n z u e l a 等从肩突硬蜱的唾液腺c d n a 文库中克隆并成功表 达了一个分子量为1 8 5 k d a 的新抗补体蛋白分子，重组蛋白具有明显的抑制补体作用“”；2 0 0 0 年，b e r g m a n 在安氏革蜱( d e r m a c e n t o ra n d e r s o n i ) 体内克隆出一个具有免疫抑制作用的 3 6 k d a 的蛋白分子“；2 0 0 2 年，l e b o u l l e 从麓子硬蜱( i x o d e sr i c i n u s ) 克隆鉴定了一个4 3 k d a 的蛋白分子，具有免疫抑制作用“。 2 上海师范大学第一章引言 ( 3 ) 粘合剂蛋白分子：粘合剂蛋白分子在固定口器，保证蜱持续吸血方面起重要作用。蜱的唾 液腺粘合剂，主要由蛋白质构成，以脂蛋白和糖蛋白的形式存在，绞粘成牢固的分子结构， 只有强酸强碱才能溶解。1 9 9 9 年，m a l e n g a 从长角血蜱( h a e m a p h y s a l i s o n g i c o r n i s ) 唾液腺 c d n a 文库克隆表达了一个分子量为2 9 k d 的细胞外间质蛋白质，用p 2 9 重组蛋白免疫兔，取得 了良好的免疫效果，蛋白质结构分析表明它是一种粘合剂类分子”“。 ( 4 ) 酶及酶的抑制剂分子：在蜱体内含有多种酶和酶的抑制剂，已分离鉴定的酶分子有：氨基 肽酶、羧酸酯酯、甘油三脂脂肪酶、核苷酸酶、过氧化物酶、a t p 酶等，有些功能因子己用于 抗蜱疫苗的研究。1 9 9 2 年，v u n d l a 等从具尾扇头蜱中肠纯化了两个天门冬氨酸蛋白酶“；1 9 9 6 年，m e n d i o l a 等从微小牛蜱中肠纯化了一个天门冬氨酸蛋白酶和一个组织蛋白酶- - l 样半胱 氨酸蛋白酶”“：h e 。”和r o s a ”先后从微小蜱中克隆到三种不同的g s t 酶分子；2 0 0 2 年，h e 分离了与抗药性有关的蜱p 4 5 0 分子“；d a s ”、t s u j i ”1 分别从硬蜱和血蜱中克隆到过氧化物 酶；m u l e n g a 从长角血蜱体内克隆鉴定出两个丝氨酸蛋白酶分子”1 ；本实验室的陈灵芝等克 隆并表达了镰形扇头蜱的r h c a 和r h c b 基因，根据同源性比较的结果分别r h c a 和r h c b 基因 命名为镰形扇头蜱两个新的组织蛋白酶l - 样半胱氨酸蛋白酶c y s a 和c y s 8 ”：柴国祚等从镰 形扇头蜱体内克隆出一种金属蛋白酶”。 ( 5 ) 抗菌多肽：抗菌多肽广泛存在于生物体内，并在天然免疫防御系统中发挥重要作用。现已 从多种蜱体内分离出抗菌样物质，在蜱天然免疫中发挥重要作用。2 0 0 1 年，j o h n s 等首次从 变异革蜱( d e r m a c e n t o ra l b i p i c t u s ) 血淋巴中分离到一个分子量为4 2 k d 的抗菌肽，该抗菌肽 具有很强的抗菌作用1 ；几乎同时n a k a j i m a 等从毛白盾缘蜱( o r n i t h o d o r o s m o u b a t a ) 克隆 表达了两个抗菌肽基因1 ；2 0 0 4 年，l a i 等从希伯来花蜱( a m b l y o ah e b r a e u m ) 血淋巴分离 了两种抗菌肽。这两种抗菌肽均具有抗g + 菌和g 。菌作用”1 白霞等克隆并表达了微小牛蜱的 一种抗菌多肽基因，经过初步体外抗菌实验证明具有一定的抗菌活性”。 ( 6 ) 结构蛋白分子：r a n d 等从微小牛蜱体内克隆和表达了肠上皮细胞表面保护性抗原分子 b m 8 6 ，它的基因工程苗成为第一个商业化的寄生虫疫苗“”。r i d i n g 从微小牛蜱的肠道鉴定出 保护性抗原分子b m g l ，与b 8 6 联合起来，可大大提高免疫效果”1 ；c a r c i a 从阿根廷株微小 牛蜱体内克隆和表达了肠上皮细胞表面保护性抗原分子b m 9 5 ，对b i n 8 6 有抗性和敏感的微小牛 蜱株都有免疫效果，被认为是比b m 8 6 更广谱的抗微小牛蜱抗原1 ；f e r r e i r a 分离鉴定一个微 小牛蜱肌肉蛋白一副肌球蛋白分子，能与i g g 和胶原蛋白结合，被认为有免疫潜力的抗原分 子。；马腾等从镰形扇头蜱体内克隆出一个肌钙蛋白i 基因，经w e s t e r n b l o t 分析具有良好 的免疫性 1 3i g b p 的研究进展 1 9 8 1 年，a c k e r m a n l 等发现，蜱可以把进入其血腔的宿主免疫球蛋白( i m m u n o g l o b u l i n ，i g ) 分子通过唾液腺摔出体外，表明蜱有一套保护自己免受宿主抗体袭击的机制。1 9 9 4 年“， 蜱血淋巴和唾液腺i g b p 的发现，进一步明确了蟀对宿主i g 的消除机制，蜱体内i g b p 的重要 作用，使之成为抗蜱疫苗的候选抗原分子之一。 3 上海师范大学 第一章引言 1 3 1i g b p 的发现 在吸血过程中，成熟的雌性硬蜱要吸入大量的血液，体重可从吸血前的4 m g 增加到吸血 后的6 0 0 r a g 即增加1 0 0 多倍“，虽然雄性硬蜱吸取的血液量远没有雌蜱的多，但在吸血 过程中体重也增加约1 5 倍。浓缩的血液主要由中肠细胞通过异体吞噬处理来消化。蜱不仅 保留了未消化血液中有潜在危害性的i g ，并有- - d 部分i g g 和一些宿主血浆蛋白穿过蜱的肠 壁进入血淋巴，宿主1 9 6 在蜱血淋巴中仍有生物活性，并能检测到可结合蜱体内器官的特异 抗体“。蜱在吸血过程中，血淋巴中的宿主1 9 6 浓度升高，然而却未被宿主1 9 6 损害， 在长期进化中，蜱逐渐获得了清除宿主i g g 能力“1 ，早期的许多证据都支持蜱拥有一套经 唾液腺把宿主1 9 6 排出体外的机制的假说“：( d c h i n z e iy 等发现毛白钝缘蜱雌蜱的血淋 巴中，宿主i g g 从吸血前的t o n g pl 下降到饱血后的o “”：( 墓) w a n g 等的研究表明，以牛或绵 羊为宿主的美洲钝眼蜱( a r a b i y o g aa m e r j c a n u m ) 和变异革蜱雌蜱血淋巴中的宿主i g g 浓度 在吸血的早期是下降；( ) w a n g 等发现具尾扇头蜱半饱血雌蜱唾液中宿主i g g 浓度略高于血 淋巴和唾液腺提取物( s a l i v a r yg l a n de x t r a c t s ，s g e ) ，在吸血的第4 、6 天，唾液中1 9 6 的相对浓度大于血淋巴中的1 0 倍“。在以上发现的基础上，1 9 9 4 年，w a n g 和n u t t a l l 在 具尾扇头蜱雌性成蜱的唾液、s g e 、血淋巴中都检测到了分子量为5 5k d a 的i g g 重链，用i g g 一 琼脂糖亲和层析法，首次在具尾扇头蜱雌蜱体内分离到i g b p ，蜱体内1 6 b p 的发现进一步证 实了蜱经唾液腺把宿主i g g 排除体外的机制的假说“1 。 1 3 2i g p b 的生物化学性质 有人曾怀疑i g b p 是一种凝集素。1 9 9 1 年，g r u b h o f e r 等描述了蓖子硬蜱、塔氏钝缘蜱 ( o r n i t h o d o r o st a r t a k o v s k y i ) 、乳突跗钝缘蜱( o r n i t h o d o r o sp a p i i l i p e s ) 和波兰锐缘蜱 ( a r g a s p o l o n i c u s ) 血淋巴中的外源凝集素，作者认为凝集素在蜱体内起自身与非自身识别 作用。但并没有发现i g b p s 与外源凝集素有关的证据“。凝集素是一类具有糖专一性能的糖 蛋白，能与糖类专一性非共价可逆结合，在豚鼠i g g _ 琼脂糖亲和层析分离s g e ( s a li v e r y g l a n de x t r a c t ，s g e ) 中的i g b p s 的实验中，如果用d 一葡萄糖、d 一甘露糖、d 一半乳糖、d 一海藻糖、d 一乙酰基一半乳糖胺洗脱层析柱，并不能洗脱出任何1 6 b p s 1 ，表明i g b p 可能并 不属于外源凝集素。 一些i g b p s 可能是糖蛋白，用过碘酸除去蛋白质上的糖类可以减弱条带背景的颜色 1 7 ， 4 2 。1 9 9 5 年，w a n g 等从具尾扇头蜱雄蜱体内分离到三种雄蜱特异性i g b p ，分别称为i g b p m a ( 2 9 k d a ) 、i g b p m b ( 2 5 k d a ) 、i g b p m c ( 2 1 k d a ) ”，并对其基因和氨基酸序进行了分析。对重 组蛋白的序列分析表明，i g b p 髓和1 6 b p l i c 都有天冬酰胺糖基化位点，用天冬酰胺一祷苷酶f 处理，发现天冬酰胺连寡糖链结合在i g b p m c 第3 3 个天冬酰胺残基，如果去掉这个寡糖链， 用s d s - - p a g e 检测到重组i g b p w c 的分子量将减少3 5 k d a 。用天冬酰胺糖苷酶f 消化天然的 i g b p i b 及i g b p m c ，分子量减小到与重组蛋白相同，说明天然的i g b i 船和i g b p w c 都是糖蛋白， 而经天冬酰胺糖苷酶f 消化的i g b p w a 的分子量却并没有减小。这些结果表明，硬蜱体内的一 些i g p b s 是糖蛋白，虽然i g b p 结合i g g 的机制还不太清楚，但这种机制可能涉及到一个有寡 糖链参与的特异认别反应1 。 1 3 3i g b p 在蜱体内分布及其特点 目前只在一部分硬蜱的血淋巴和唾液腺中检测到i g b p 。其它的组织和器官中尚未发现。 4 上海师范大学第一章引言 血淋巴和唾液腺中的i g b p 并不相同，w a n g 等在吸血前具尾扇头蜱雌雄成蜱的血淋巴中发现 有两种i g b p s ，唾液腺中有五种i g b p s ，唾液腺中的i g b p ，有的具有信号肽，属于分泌蛋白， 可以分泌到唾液中，有的没有信号肽，不能分泌到唾液中。被人们称为“隐藏”抗原1 ；同 一蜱种雌雄蜱i g b p s 的种类在吸血过程中变化不同，如w a n g 等在吸血和未吸血的具尾扇头蜱 雌雄蜱的血淋巴和唾液腺中都检测到了i g b p 的存在，吸血前血淋巴中发现有两条i g b p 带 ( 9 8 k o a 、8 8 k d a ) ，吸血后又发现了一条新的7 8 k d a 的蛋白条带，虽然吸血前后雌蜱s g e 中的 i g b p 条带没有变化，但吸血后雄蜱的s g e 中出现了三条新的i g b p 条带；不同蜱种体内的i g b p 的种类和大小不同，在未吸血的雌雄六角硬蜱的s g e 中都只检测到2 条i g b p 条带，而在未吸 血的雌雄彩饰钝眼蜱的s g e 中则检测到4 条蛋白条带1 ，并且条带位置明显不同。 1 3 4 不同种类蜱体内的i g b p 到目前为至，发现或推测有i g b p 的蜱的种类尚不多。1 9 9 4 年，w a n g 和n u t t a l l 使用豚 鼠i g g 一琼脂糖亲和层析法，在具尾扇头蜱、彩饰钝眼蜱，六角硬蜱中发现了数量和分子量大 小不同的i g b p ：2 0 0 0 年，r e c h a v 和n u t t a l1 根据血红扇头蜱( 肋i p i c e p h a l u ss a n g u i n e u s ) 和美洲钝眼蜱雄性成蜱对吸血中的幼蜱和若蜱的影响，推测i g b p 也存在于这两种雄性硬蜱中 。2 0 0 2 年，p a c k i l a 和g u i l f o i l e 用正在交配的肩突硬蜱雄蜱构建c d n a 文库，在文库中发 现了一基因片段所编码的氨基酸序列与具尾扇头蜱雄蜱的i g b p m c 氨基酸序列非常相似( 相同 性2 6 ，相似性4 6 ) ，推测也编码一种i g b p ”1 。2 0 0 2 年，f e r r e i r a 等在微小牛蜱的c d n a 文 库中克隆筛选出一个副肌球蛋白( b o o p h i l u sm i c r o p l u sp a r a m y o s i n ，b m p i i j i ) 基因，它在 雌性微小牛蜱的卵、幼蜱、成蜱这几个生长阶段和唾液腺、肠、壳中都有表达，实验表明， 重组b m p 聊不仅可以结合纯化的牛i g g 。也可以结合牛血清中的完整i g g ，初步推测也是一种 i g b p ，但1 3 m p l 娃l 基因序列与基因文库中其它的i g b p s 基因相似性比较小1 。2 0 0 5 年，向飞宇 等构建了镶形扇头蜱吸血前后雄蜱唾液腺以p g 尉一t - e a s y 为载体的c d n a 消减抑制杂交 ( s u p p r e s s i o ns u b t r a c t i o nh y b r i d i a t i o n ，s s h ) 文库，在所得的有效序列中，发现有一片段 编码的蛋白质与具尾扇头蜱的i g b p 同源性高达9 0 ，推测这段序列也编码一种i g b p 。 1 3 5 雄蜱的特异性i g b p 研究发现，有些种类的i g b p 具有雄性特异性。1 9 9 5 年，w a n g 等从半饱血的具尾扇头蜱 雄蜱中分离出三种i g b p s ：i g b p m a 、i g b p m b 、i g b p m c ”“。纯化后分别用来在豚鼠体内激发抗 血清，免疫印迹实验发现每种i g b p 有不同的抗原性，并且是正在吸血的具尾扇头蜱雄蜱所特 有的，与雌蜱s g e 中的任何蛋白都没有抗原交叉反应。在吸血过程中，无论有无雌蜱的存在， 在雄蜱唾液腺中都能检测到这三种i g b p s 。 已经确定i g b p m c 可结合三种宿主的i g g ( 豚鼠、人、牛) ，而i g b p m a 不能结合牛的i g g ， 2 5 k d a 的i g b p m b 是否能够结合人或者牛的i g g 尚不能确定，因为它在胶上的位置与i g g 轻链 相同。氨基酸序列分析表明i g b p - m b 和i g b p k 是相关蛋白( 序列相同性5 0 、相似性7 0 ) ，而i g b p m a 与i g b p m b 和i g b p m c 没有相关性“。 免疫印迹显示，i g b p m b 和i g b p m c 的抗原性不同，生物信息学预测i g b p m b 和i g b p m c 唯 一可能相似的抗原区是i g b p m b 的p g t y y 与i g b p m c 的p g l t 坩，但在i g b p m c 最保守的区域没有 任何抗原序列。序列分析和数据都表明i g b p m c 是一个分泌蛋白，而i g b p m b 没有任何信号序 列，表明i g b p m b 并不分泌到唾液中1 。i g b p m b 和i g b p m c 抗原性的不同可能具有生物学上的 5 上海师范大学 第一章引言 重要性，蜱可能只把分泌蛋白暴露给宿主，隐藏了非分泌蛋白的抗原特性，使宿主防御机制 无法破坏非分泌蛋白。 雄蜱特异的i g b p m c 除了有清除i g 的功能外，还帮助雌蜱吸血。寄生在用重组i g b p m c 免 疫过的豚鼠身上的具尾扇头蜱成蜱，雄蜱的吸血情况没有受到影响，但雌蜱完成饱血的时问 却延长了，然而重组i g b p m b 疫苗却没有这种效应。考虑到雄蜱的吸食的血液量比较少，到达 唾液腺靶蛋白的宿主特异性抗体，大概还不能足以产生免疫效应，在吸血的第4 天把抗i g b p m c 血清在原位注射入雄蜱体内。注射抗血清的雄蜱依旧存活了下来，与注射了抗血清的雄蜱一 起吸血的雌蜱的饱血体重明显下降，卵块重量也下降。雄蜱对抗i g b p m c 血清的耐受性表明 i g b p m c 对雄蜱的生存来说并不是必需的。抗雄蜱i g b p 血清对雌蜱的显著影响表明，雄蜱与 雌蜱在一起吸血不仅仅是为了交配，它也帮助雌蜱完成了吸血1 。 吸血雄蜱唾液腺中丰富的i g b p 的出现，提示了雄蜱已经发展了一套雄性特异机制来保 护自己免受宿主i g 的可能危害”。 1 4 总结 综上所述，i g b p 是存在于蜱体内的重要蛋白质，它不仅对蜱的生长起重要作用，也可作 为人们防制蜱和开发新型生物制剂的源泉。但是总的来说，人们对蜱i g b p 的研究还处于初步 阶段，对它功能的许多认识还只是处于推测和假想阶段。i g b p 可能还有其它更重要的功能。 如蜱在i g b p 的协助下修饰加工宿主的i g 从而为己所用，来抵抗对己不利的细菌、病毒、外 来抗原等等。另外，还没有在体外建立能结合i g g 的重组i g b p 模型，对于软蜱中的i g b p 的 研究基本上还处于空白状态，目前只是在毛白钝缘蜱雌蜱的血淋巴中发现有宿主i g g 的转移 现象“”，却没有在软蜱体内检测到i g b p 。因此，对i g b p 的研究很值得深入下去。 本研究拟在已有工作的基础上，克隆镰形扇头蜱i g b p 全长基因并将该基因进行原核表达。 为以后的研究工作奠定基础。 6 上海师范大学第二章材料与方法 2 1 材料与试剂 2 1 1 主要仪器 第二章材料与方法 p c r 仪p t c 一2 0 0 型：l ur e s e a r c h ，i n c p c r 仪p t c - 2 2 0 型：m jr e s e a i i c h ，i n c 3 e 连续变倍体视镜：上海新芝生物技术研究所 生化培养箱s l i p 一1 5 0 型：上海精宏实验设备有限公司 霉菌培养箱( 恒温恒湿箱) 耵一1 8 0 b - i i 型：上海跃进医疗器械厂 恒温培养箱b n - 3 1 l 型：e s p e c 公司 电热恒温真空干燥箱d z k 8 8 - a 型：上海医疗器械七厂 电热鼓风干燥箱1 0 1 c 一2 型：上海实验仪器厂有限公司 恒温振荡器t h z - c 型：江苏太仓市实验设备厂 定轨摇床t s 6 型：江苏太仓市实验设备厂 玻璃仪器气流烘干器星火牌b 型：郑州市上街区仪器厂 立式压力蒸气灭菌器y x o - l s 一3 0 s 型：上海博迅实业有限公司 上皿电子天平i y 2 0 0 1 型：上海精密科学仪器有限公司 电子天平j a 2 0 0 3 n 型：上海精密科学仪器有限公司天平仪器厂 电热恒温水槽d k - 8 d 型：上海精宏实验设备有限公司 超声波匀浆器c p - 6 0 1 型：c o l e p a m e ri n s t r u m e n t s 紫外透射反射分析仪k h - u v m 型( 3 1 2 r i m ) ：上海康禾光电仪器有限公司 分光光度计7 2 1 型：上海第三分析仪器厂 图像分析f h ，5 0 0 型：p h a r m a c i ab i o t e c h 电泳 j u m - 2 5 0 型：大连捷迈科贸有限公司 m i n i - p r o t e a n3 电泳仪：b i o r a d 公司 转印电泳槽：b 1 0 r a d 公司 台式离心机t g l l 6 b 型：上海安亭科学仪器厂 低温高速离心机r c - 5 cp i s 型：美国d up o n t 公司 微型涡旋混合仪w h 2 型：上海泸西分析仪器厂 垂直流超净工作台z i j l 一1 2 6 0 8 型：上海智城分析仪器有限公司 d y b 2 型脱色摇床：江苏兴化市分析仪器厂 酶标仪e l x 8 0 0 型：美国b i o _ t e k 公司 p h 计8 f 9 3 型：_ i s s e n s c h 8 f t l i c ht e c h n i s c h e 去离子水机z l x s s 0 0 3 y 型：m i l l i p o r e 公司 7 上海师范大学 第= 章材料与方法 c o m l e r c i a li c es y s t e m ：e e l i u s 2m a s o n i au s a 分光光度计系统 8 4 52 ad i o d ea r r a ys p e c t r o p h o t o m e t e r ； 1 1 0 r e v2 0c h e ms m t i o n ：h e w ie t rb u = l 乙岫 d e s k j e t 5 0 0 ：旺m e t r p a 伽 2 1 2 实验材料 实验动物：镰形扇头蜱来自本实验室人工饲养。新西兰大白兔购自中科院上海实验动物中心。 菌种质粒：大肠杆菌菌株d i - l s a 、b l 2 1 ( d e 3 ) r g 嘣2 p e t 3 2 a 、p g e x - 4 t - 1 3 j 为中国农科院上海 兽医研究所第二研究室提供，p g e m - te a s y 载体购f lp r o m e g a 公 2 1 3 主要试剂 引物合成赛百盛公司 t r i z o l 试剂、5 - r a c e 试剂盒、3 - r a c e 试剂盒、蛋白预染l n v i t r o g e n 公司 d n a 胶回收试剂盒，p c r 产物同收试剂盒、质粒提取试剂盒t a k a r a 公司 t a qd n a 聚合酶、限制性内切酶s a li 、n o ti 、d n a m a r k e r t a k a r a 公司 t e m e d 、a e r 、b i s 、t 4 d n a 连接酶p r o m e g a 公司 氨苄青霉素、琼脂糖、i p t g上海生工生物工程有限公司 透析袋、d r r 、0 p d 、d a b 华美生物工程公司 低分子量蛋白m a r k e r中科院上海生物化学研究所 硝酸纤维膜 a m e r s h a m 公司 蛋白胨、酵母提取物o x o i d 公司 一抗( 兔i g g ) 、感受态细胞北京博大泰克生物基因技术有限责任公司 二抗关( 羊抗兔i g g _ h i c p ) 、x - g a l上海普飞生物技术有限公司 2 1 4 主要试剂配制 2 1 4 1r n a 提取、变性电泳相关试剂 d e p c 处理的去离子水 d d i - i z o 5 0 0 m l d e p co 5 m l 搅拌数小时( ) 4 h ) ，5 0 m l 离心管分装，1 2 1 c ，2 0 m i n x 菌两次，以使d e p