（微生物学专业论文）木质素降解酶预处理玉米秸秆试验研究.pdf

河南农业大学学位论文独创性声明、使用授权及知识产权归属承诺书 学位论 文题目 木质素降解酶预处理玉米秸秆试验研究 学位 级别 导师 姓名 硕士 学生 姓名 学位论文 是否保密 陈伟l 善翌 微生物学 杜风光 宋安东 如需保密，解密时间年月 日 独创性声明 本人呈交论文是在导师指导下进行的研究工作及取得研究成果，除了文中 特别加以标注和致谢的地方外，文中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成 果，也不包括为获得河南农业大学或其他教育机构的学位或证书而使用过的材 料，指导教师对此进行了审定。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献 均已在论文中做了明确的说明，并表示了谢意。 研究生签名：渐 日期：口黾年占月髟e l 翩繇彬 日期：留年莎月汤日 学位论文使用授权及知识产权归属承诺 本人完全了解河南农业大学关于保存、使用学位论文的规定，即学生必须 按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版本：学校有权保存提交论文的印 刷本和电子版本，并提供目录检索和阅览服务，可以采用影印、缩印或扫描等 复制手段保存、汇编学位论文。本人同意河南农业大学可以用不同方式在不同 媒体上发表、传播学位论文的全部或部分内容。 本人完全了解河南农业大学知识产权保护办法的有关规定，在毕业离 开河南农业大学后，就在校期间从事的科研工作发表的所有论文，第一署名单 位为河南农业大学，试验材料、原始数据、申报的专利等知识产权均归河南农 业大学所有，否则，承担相应的法律责任。 一 注：保密学位论文在解密后适用于本錾权书：l 子矢l 研究生签名：于珂。i ，年导师签名：霉箩鸳学院领导签鲁；p 建l 。- 。 日期；司年6 月名日日期：翻阵参月形日日期：o 艿年6 月2 7 日 致谢 本论文是在导师杜风光高工和宋安东副教授的悉心指导下完成的，整个论文 从试验设计、论证、实施到完成都凝聚着两位导师的心血。上海天之冠可再生能 源有限公司的杜风光高工对于本论文的完成给予了极大帮助，他平易近人却又果 敢冷静的处事风格和高瞻远瞩的战略眼光给我留下了深刻的印象。宋老师渊博的 学识和务实的教学风格很是令我敬佩不已，试验中每次遇到困难他都会给予耐心 的分析和指导，他丰富的为人处事经验将使我终身受益，内心一直为此感动和感 激着。谨此论文完成之际，谨向两位导师致以崇高的敬意和诚挚的谢意! 本论文主体内容是在上海天之冠可再生能源有限公司完成的，课题进行中得 到全体公司领导员工的大力帮助和支持。在一年半的校外课题工作中，我付出也 收获了很多，使我从各个方面都得到了历练和提高。我不会忘记在上海张江的这 段校外课题生活，不会忘记一起走过互相帮助的同事们，不会忘记对我关怀备至 的领导。在这里向他们表示和表达我最衷心的感谢和深深的情感! “ 在试验和论文完成过程中，贾新成教授、吴坤教授、陈红歌副教授、邱立友 教授、张世敏副教授、刘亮伟副教授、王风芹博士、谢慧老师及微生物学系的全 体教师都给予了热情指导和帮助；微生物实验室的赵玉萍老师、胡渝老师在仪器 设备等方面给予了大力支持，在此表示衷心感谢! 在论文完成过程中，得到了本实验室师兄张建、任天宝，师弟刘杰、王磊、 楚乐然、薛仁军、张雷鸣、万续良，师妹刘玉博、张玲玲、张莎莎；以及裴广庆、 王艳颖、张小强、李岳桦、阮森林、冯锋、付晓记、王庭梁、张东升、田建军、 等同班同学的大力帮助和鼓励，在此表示深深的谢意! 本试验的顺利完成也离不开院领导、研究生处诸位领导的关心和支持，在此 一并表示感谢! 最后再次向所有关心、帮助和支持我的老师、同学和朋友致以最诚挚的谢意! 衷心感谢我的家人，在我学习中给予的无私奉献、鼓励和支持，与我风雨同舟、 同甘共苦，在此我也向他们表示深深的谢意! u 陈伟 2 0 0 8 年4 月 河南农业大学硕士学位论文木质素降解酶预处理玉米秸秆试验条件研究 捅要 本试验利用自腐菌( 黄孢原毛平革菌、杂色云芝) 发酵制备的木质素降解酶粗酶液对玉 米秸秆进行预处理，发现了木质素降解酶对糖化酶( 纤维素酶和木聚糖酶) 的抑制作用。并 用n o v o z y m e s 漆酶初步证实了木质素降解酶一漆酶对纤维素酶的抑制作用，同时得出 n o v o z y m e s 漆酶有破坏木质素和改变纤维质结构的作用，这种作用最终促进了糖化。 初步证实木质素降解酶对糖化酶的直接抑制作用后设计小颗粒水洗工艺。工艺消除了木 质素降解酶粗酶液及n o v o z y m e s 漆酶直接抑制糖化酶作用，分别提高了糖得率1 9 9 9 6 和9 5 。 之后进行了改变不同的生物预处理条件来进一步改善预处理效果试验。结果表明：预处理过 程中对木质素的破坏和纤维质结构性质的改变促进糖化酶的酶解作用。从糖得率的提高得出 了生物预处理对糖化作用的贡献能力，最高可提高糖得率2 3 1 。 最后通过三个试验来分析预处理过程中对玉米秸秆纤维质的性质变化：第一、秸秆预处 理前后秸秆聚合物结晶度的变化( x - 衍射) 。第二，生物法和酸法预处理液中有毒物质含量 对比( 液相色谱) 。第三，秸秆预处理前后表面纤维结构的变化( 扫描电镜) 。从三个方面分 析木质素降解酶粗酶液预处理玉米秸秆后结构性质的变化，解释了预处理后的这些变化与糖 化酶糖化作用之间的联系。 关键词：玉米秸秆；预处理；木质素降解酶；糖化；纤维质燃料乙醇 河南农业大学硕士学位论文木质素降解酶预处理玉米秸秆试验条件研究 第一章文献综述 1 1 单一化石经济走入末路 1 1 1 化石原料将最终陷入枯竭 世界原油价格在经过近二十年的相对稳定之后，自2 0 0 1 年起已经进入了一个飞速增长 的时期。目前世界已探明原油储量约为l 万亿桶，如果考虑到今后新的油田发现、现有油田 可能的扩容和新的采油技术的运用，世界原油储量可能达到2 万亿桶。即使按目前世界原油 每年3 0 0 亿桶的消费速度，世界石油储量也只能维持3 5 - 7 0 年u 。 中国是一个化石能源严重短缺的国家，煤炭、油气资源十分有限。我国石油储量仅占世 界总储量的2 ，而消费量已经超过日本居世界第二位比1 。我国已探明的石油可开采储量约 为6 2x1 0 8 t ，现已累计开采3 4 6 x1 0 8 t ，仅剩余2 7 4 x1 0 8 t ，可供开采1 7 年。煤炭可采储 量约为1 0 0 0 1 0 。t ，可供开采约5 0 年。 o r d a i nt h eq u a n t i t yo fe t h a n o is u b s t i t u t i n gf o rg a s o ii n eo f 2 0 0 5i nu s a 目前使用的燃料乙醇基本上是通过使用玉米或小麦淀粉类作为原料发酵生产的。从世界 粮食生产的现状看，玉米作为乙醇原料可能满足e i o 乙醇汽油的需求，但不能满足e 8 5 对乙 醇的需求。以美国为例，美国每年车用汽油消费约4 2 亿t ，全部替换成e i o 汽油需乙醇4 2 0 0 万t ，全部替换成e 8 5 汽油则需乙醇3 6 亿t 。美国年产玉米约2 5 亿t ，即使全部用来生 产乙醇也只能得到约7 0 0 0 万t 乙醇，可以满足e i o 乙醇汽油需求( 每年4 2 0 0 万t ) ，但远不 能满足e 8 5 乙醇汽油需求( 每年4 2 亿t ) 哺1 。木质纤维素是地球上最丰富的可再生资源，据 估计木质纤维素原料占世界生物质量( 1 0 0 亿5 0 0 亿t ) 的5 0 ，这些丰富而廉价的自然资源 可以来源于：农业废弃物，如麦草、玉米秸秆、玉米芯、大豆渣、甘蔗渣等；工业废弃物， 如制浆和造纸厂的纤维渣、锯末等；林业废弃物：城市废弃物，如废纸、包装纸等。由 木质纤维素生物转化成的燃料乙醇越来越引起世界各国的广泛关注。目前世界各国研究利用 木质纤维素发酵生产乙醇的科研机构都围绕着这几大技术关键进行攻关。利用农作物秸秆等 木质纤维素生物质来生产乙醇成为燃料乙醇的出路。近年来，以秸秆等木质纤维素生物质为 原料的新型生物炼制工程已经成为世界各国替代能源研发的重中之重。生物炼制产业以现代 石化工业为模板，采用类似于流化催化裂化、热裂解和加氢裂解等集成化平台技术，用先进 的预处理和酶水解等生物平台技术将生物质中的纤维素和半纤维素转化为各种糖类，再通过 糖平台技术转化为大宗生物乙醇产品和各种高附加值中间体化学晶崎1 。中国每年约有7 亿t 作物秸秆，2 5 亿t 畜禽粪便及大量有机废弃物。以秸秆类木质纤维素为原料的燃料乙醇产 3 河南农业大学硕士学位论文 木质素降解酶预处理玉米秸秆试验条件研究 业可能成为持续高速增长的中国经济的新的主要增长点之一嘲。 1 3 纤维乙醇生产环节关键技术 从木质纤维素生物质生产乙醇一般由预处理、酶水解、乙醇发酵以及产品分离与提纯四 个部分组成。预处理技术是通过物理、化学或生物的方法打开生物质的木质素外壳，降解木 质素半纤维素并使纤维素的晶体结构变成适宜于纤维素酶作用的疏松结构。预处理技术也是 生物乙醇加工过程中成本最高的步骤之一1 。表2 是几种现有的预处理方法。 裒2 玉米秸杆的几种预处理方法伽 t a b 2p r e t r e a t m n tm e t h o d so f ( 3 0 r ns t alk 方法内容 水解法 酸处理法 碱处理法 有机溶剂处理法 湿氧化法 生物法 蒸汽爆破 稀酸( 1 1 2 s o ) 、浓酸( h 2 s 0 、 i c l ) n a 0 i i 、碱性过氧化氢、氨水 甲醇、乙醇、丁醇、苯 q 、n a 2 c o a 木质素过氧化物酶、锰依赖过氧化物酶、漆酶 有效的预处理方法应包括以下几个方面：对生物质原料的外形大小要求不高，保留有效 的戊糖成分，减少抑制酶水解和发酵菌株的降解物，最少的能量和成本投入。其它的要求包 括较低的预处理催化剂消耗和催化剂的低成本循环使用，高附加值的木质素副产品等。预处 理方法分为物理法、化学法和生物法。物理预处理法包括机械法( c o m m i n u t i o n ) 、蒸汽膨爆 法( s t e a me x p l o s i o n ) 、热解法( h y d r o t h e r m o l y s i s ) 化学法处理法在预处理系统中加入酸 或碱可以强化水解并提高葡萄糖的收率，包括硫酸、盐酸、氨溶剂、d m s o 和各种纤维素溶 剂等，最常用的稀硫酸和氢氧化钠。生物预处理法中主要使用白腐菌等微生物降解木质素， 其中黄孢原毛平革菌( 尸c h r y s o s p o r i u m ) 是最常用的菌种。目前比较先进的预处理技术是美 国再生能源国家实验室( n r e l ) 组织实施的c a f i 计划( b i o m a s sr e f i n i n gc o n s o r t i t u nf o r a p p li e df u n d a m e n t a l sa n di n n o v a t i o n ) 中的预处理方法，包括稀酸法( d il u t ea c i d ) 、热 水冲洗法( f l o w t h r o u g h ) 、中性p h 法( c o n t r o l l e dp h ) 、氨纤维膨爆法( a m m o n i af i b e r e x p l o s i o n ) 、氨水循环法( a q u e o u sa m m o n i ar e c y c l ep e r c o l a t i o n ) 和石灰法( l i m e ) 7 j o 评判预处理方法的标准为：促进糖的生成并有利于后面的水解；糖降解最小化； 避免生成对水解和发酵有害的副产品：具有经济性。预处理方法分为物理法、化学法 和生物法，有些方法兼有物理和化学这两种效果。预处理的基本任务如图2 所示。 1 。3 1 化学法 1 3 1 1 稀酸法 稀酸水解工艺较简单，是木质纤维素原料生产酒精的最古老的方法，也是较为成熟的方 法。革新的稀酸水解工艺采用两步法。第一步稀酸水解在较低的温度下进行，半纤维素非常 容易被水解得到五碳糖产物，分离出液体( 酸液和糖液) 。第二步酸水解是在较高的温度下进 行，重新加酸水解残留固体( 主要为纤维素结晶结构) 得到水解产物葡萄糖。主要工艺为： 木质纤维原料被粉碎到粒径2 5 c m 左右，然后用稀酸浸泡处理，将原料转入一级水解反应器， 温度1 9 0 ，0 7 硫酸水解3 m i n 。可把约2 0 纤维素和8 0 半纤维素水解。水解糖化液经过 闪蒸器后，用石灰中和处理，调p h 后得到第一级酸水解的糖化液。将剩余的固体残渣转入 二级水解反应器中用1 6 硫酸在2 2 0 ；1 2 条件下处理3 r a i n 。可将剩余纤维素中约7 0 转化葡萄 糖，3 0 转化为羟基糠醛等。经过闪蒸器后，中和，得到第二级水解糖液。合并两部分糖化 液，转入发酵罐生产乙醇。在稀酸水解中添加金属离子可以提高糖化收率。金属离子的作用 主要是加快水解速度，减少水解副产物的发生。o u a n gan g u y e n 等详细研究了f e 孙离子的催 化效果。华东理工大学等单位也对f e 2 + 离子的催化效果进行了详细研究。 4 河南农业大学硕士学位论文木质素降解酶预处理玉米秸秆试验条件研究 利用低浓度的稀硫酸( 0 5 - i o ) 对木质纤维原料进行预处理，是目前最接近产业化的方 法阳1 ，秸秆中9 2 5 的总糖可以通过对玉米秸秆稀酸预处理和酶水解获得u 训。美国能源部实 施的6 个生物炼制示范工厂中最先投入工业化实验运行的是位于美国n e b r a s k a 州的 a b e n g o ab i o e n e g y 的乙醇生产厂。这个年产1 5 0 0 t 的工业示范装置中所使用的预处理技术 就是美国再生能源国家实验室( n r e l ) 的稀酸法。 稀酸预处理法的主要问题之一木质素降解产物和稀酸对后续糖化和发酵工艺的抑制，以 及较为复杂的下游物流后处理。稀酸处理法被认为是除去半纤维素较成熟而又有效的方法。 但木质素脱除效果差，而且处理后一部分糖转化成有毒的脱氢化合物，对微生物具有不同程 度的毒性。另一方面稀酸处理成本比许多物理化学法高，能耗大，腐蚀设备，对环境污染严 重，非长远之计m 1 1 3 1 2 碱法 碱处理机理在于0 i 一能够削弱纤维素和半纤维素之间的氢键及皂化半纤维素和木质素分 子之间的酯键。该方法可以在常温常压下进行。使用得较多的碱有n a o h 、k o h 、c a ( o h ) 。和 氨水。其中稀n a o h 溶液可以引起木质纤维素溶胀，内表面积增加，纤维素结晶性降低，木 质素和碳水化合物之间的结构链分离，以及木质素结构破坏，碱处理木质纤维原料的效果主 要取决于原料中的木质素含量引。 石灰( 主要成分为c a o ) 预处理过程中，先把石灰浆化生成c a ( 0 h ) 。，然后把石灰浆喷洒 到生物质上，最后将原料放置几个小时或几个星期。较高的温度则可以缩短预处理的时间。 k a r r 等对玉米秸秆进行了石灰预处理，每克生物质配0 0 7 5 z c a ( o h ) ：和5 9 水，在1 2 0 下 加热4 h 后，玉米秸秆的酶水解能力比预处理前提高了9 倍。 尽管碱处理对原料的可降解性效果较好，但在处理过程中有部分半纤维素被分解损失； 同时碱耗量大，存在试剂的回收、中和、洗涤等问题，不太适合大规模生产。 1 3 1 3 有机溶剂 有机溶剂包括甲醇、乙醇、丙酮、乙烯基乙二醇、三甘醇及四氢化糠基乙醇。有机酸如 草酸、乙酰水杨酸和水杨酸均可作为有机溶剂法的催化剂。高温条件下无需添加催化剂，有 机溶剂也可以完全地溶解木质素，对纤维素生物量预处理效果好。a w a d e l k a r i m 等研究认 为丙酮是纤维素较好的润胀剂。志水一允在5 0 一7 0 的甲醇中添加o 2 盐酸处理木材，能脱 去8 0 的木质素，同时半纤维素几乎完全被溶解，可回收相当于半纤维素5 0 的单糖，处理 过的残渣纤维素可以1 0 0 9 6 被糖化。有机溶剂处理可降低成本，避免阻碍微生物生长、酶法 水解和发酵的化合物生成。 图2 预处理和糖化的基本目标 f i g ，2t h eb a s i ct a s ko fp r e t r e a t m e n ta n ds a c c h a r i f i c a t i o n 此法存在腐蚀和毒性等问题的限制，成本高且容易造成坏境污染。 另外化学法还有臭氧处理、氧化处理等木质纤维预处理方法，但这些方法都因缺乏竞争 5 河南农业大学硕士学位论文木质素降解酶预处理玉米秸秆试验条件研究 力而很少被应用。 1 3 2 物理法 木质纤维原料可以通过切碎、粉碎、碾磨处理降低结晶度，使颗粒变小。李盛贤等将新 闻报纸磨粉，细度在7 5 目以下时进行酶水解，水解率可提高5 9 以上。木质纤维素颗粒细 小到一定程度后，继续粉碎只能有限地提高酶解效率，而处理成本相对增加。 此法成本较高，而且对于酶解的贡献能力有限，因此可以和其他方法配合使用已达到效 果最佳。 另外还有直接高温加热、高能电子辐射、微波、超声波等物理预处理技术，但因技术实 施难度大、效果不明显并没有做规模放大试验。 1 3 3 物理化学法 1 3 3 1 蒸汽爆破法 蒸汽爆破是木质纤维素原料预处理较常用的方法。蒸汽爆破法是用高压饱和蒸汽处理生 物质原料，然后突然减压，使原料爆裂降解。主要工艺是用水蒸汽加热原料至1 6 0 - 2 6 0 ( 0 6 9 - 4 8 3 m p a ) ，作用时间为几秒或几分钟，然后减压至大气压。由于高温引起半纤维素降 解，木质素转化，使纤维素溶解性增加。蒸汽爆破法预处理后木质纤维素的酶法水解效率可 达9 0 。李步海等用蒸汽爆破法预处理蔗渣，酶解率提高4 倍之多。徐勇将玉米秸秆蒸汽爆 破后，纤维素几乎不损失，木质素损失1 4 6 ，酶解得率可达7 0 o 。廖双泉等用蒸汽爆破 法处理椰衣纤维，结果使纤维素含量比未处理样品提高1 7 0 5 ，同时木质素含量降低6 6 3 ， 其他成分含量降低了1 0 4 2 ，实现了原料杂质组分的有效降低。韩晓芳等用蒸汽爆破法处 理棉秆，结果表明可增加棉秆的生物可利用性。南京林业大学的余世袁教授研究了爆破秸杆 制取酒精，取得了一些进展。 蒸汽爆破过程中添加h z s 0 4 ( 或s ) 和c o z 或者用乙酸、甲酸等有机酸溶液预先浸溃原料 木片，可使半纤维素的水解程度显著提高。以蒸汽爆破法在通入无水s 0 2 对美国花旗松木片 进行预处理，水解得己糖且发酵后乙醇浓度为1 7 9 l ，纤维素转化率9 0 9 6 。用稀硫酸在室温 下浸渍木片l o h ，然后进行蒸汽爆破预处理，半纤维素的回收率最高。 蒸汽爆破法对木素分离不完全，产生对发酵微生物起抑制作用的水解产物，洗涤爆破产 物会导致整个糖得率降低。蒸汽爆破操作涉及高压装备，投资成本较高。连续蒸汽爆裂的处 理量较间歇式蒸汽爆裂法有增加，但是装置更复杂，投资成本大为增加。 1 3 3 2 氨纤维爆裂 氨纤维爆裂( a m m o n i af i b e re x p l o s i o n ， f e x ) 法是将木质纤维素原料在高温和高压下 用液氨处理，然后突然减压，造成纤维素晶体的爆裂。典型的t f e x 工艺中，处理温度在9 0 9 5 ，维持时间2 0 一3 0 m i n 。每k g 固体原料用1 2 k g 氨。杨雪霞等对玉米秸秆进行氨爆破处理 的结果表明，处理后纤维素含量改变不大，但大大提高了半纤维素的降解率，处理后总糖含 量均比未处理原料的高：氨水浓度的增加有利于提高半纤维素的降解率、原料的总糖得率和 酶解率；但原料经氮化汽爆后，还原糖含量显著减少。氨法爆破法不会产生对微生物有抑制 作用的物质，且木质素除去后大部分的半纤维素和纤维素保留下来得以充分利用。 此法虽然具有很多对进一步酶解十分有利的优势，但氨纤维爆裂装备问题实施难度大， 和蒸汽爆破装置类似。另外需要氨的压缩回收装置，因此投资成本也很高。有望进一步降低 成本以获得生产的可能性。 另外还有c ( h 爆裂法，其原理与水蒸汽爆裂和氨爆破法原理相似，所不同的是强调在处 理过程中部分c ( h 必须形成碳酸，以增加木质纤维素原料的水解率。c 0 2 爆裂法比氨爆裂法更 加有效，而且不产生抑制后续水解的副产物。但投资成本依然会很高。 1 3 4 生物法 采用白腐菌等微生物产生的可以产生专一性地降解木质素酶类可以生物质进行预处理。 6 河南农业大学硕士学位论文 木质素降解酶预处理玉米秸秆试验条件研究 自然界参与降解木质素的微生物种类有真菌、放线菌和细菌，而真菌是最重要的一类。研究 表明，若干种担子菌类的白腐菌能够有效地和有选择性地降解植物纤维原料中的木质素，也 是已知唯一的在纯培养条件下能够将木质素最终矿化的微生物。目前国际上研究最多并表现 出有效降解能力的白腐真菌是黄孢原毛平革菌( p h a n e r o c h a e t ec h r y s o s p o r j u m ) 。 木质素的降解主要通过多种胞外酶的协同作用实现，这些酶主要包括能够利用过氧化氢 降解非苯酚类木质素的木质素过氧化酶( 1i g n i np e r o x i d a s e 。l i p ) 、降解苯酚类木质素的锰 依赖过氧化酶( m a n g a n e s ep e r o x i d a s e ，m n p ) 、降解苯酚二聚体的漆酶( 1 a c c a s e ，l a c ) ，以及 能够产生过氧化氢的各类氧化酶( g l y o x a lo x i d a s e ，g l u c o s eo x i d a s e ，m e t h a n o l o x i d a s e ) 旧1 。在降解木质素的过程中，由于木质素聚合体的庞大结构，因此白腐菌的木质素 降解酶系统是细胞外的：由于木质素结构是由内部单元c - c 键和醚键构成的，因此与降解纤 维素和半纤维素的酶系统相比较来说，木质素降解酶的催化机制是氧化作用而不是水解作 用：另外，由于木质素聚合体立体结构的不规则性，因此降解木质素的酶系统在很大程度上 必须是非专一性的酶系统，非特异性地分解木质素结构。氧化后的木质素经过产生不稳定的 自由基，然后可进行一系列的非酶催化的自发裂解反应，从而引起木质素聚合体的氧化与断 裂“引。一些白腐菌产生所有上述这3 种分解木质素的酶，而大多数白腐菌仅产生2 种甚至1 种分解木质素的酶“毛坫1 ，因此表明这三种酶在分解木质素的过程中并不是全都必需的制。 研究表明，上述三种酶都能与低分子量的中介体共同作用，即酶产生具有攻击木质素结构能 力的反应中间产物，间接地引起木质素的氧化反应，从而导致木质素的分解，这已被提出作 为木质素的降解机制1 。 1 ，3 4 1 木质素降解酶类 1 3 4 1 1 木质素过氧化酶 木质素过氧化物酶曾被称为木质素酶，它是一种含f e 3 + 卧啉环( ) 和血红素( h e i n e ) 辅 基的过氧化物酶u 别。木质素过氧化物酶首先在黄孢原毛平革菌中发现。目前已知只有几种白 腐菌能够产生l i p ，分子量大约4 0 k d a ，是糖基化的、有酸性等电点和偏酸性的最适p h 值， 它们包含一个亚铁原卟啉i x 血红素半体。l i p 氧化还原电位为1 5 v 。这种酶易受h 2 0 2 的影 响而失活，并且木质纤维素基质的一些成分有抑制和覆盖l i p 活性的作用。 rrh 图3 木质素过氧化物酶( l i p ) 的催化循环 f i g 3t h ec a t a l y t i cc y c l eo fli g n i np e r o x i d a s e ( l i p ) 木质素过氧化物酶与其它过氧化物酶如辣根过氧化物酶相似，运行一个典型的过氧化物 酶催化循环。对木质素底物的催化氧化作用，起始于木质素过氧化物酶作为过氧化氢h z 0 2 的电子供体，被其氧化产生缺2 个电子的中介体称作l i p 化合物i ，l i p 化合物i 接下来进 行两步对芳香底物的1 个电子的氧化作用而返还到本体状态。第1 步1 个电子的氧化使l i p 化合物i 成为缺1 个电子的中介体称作l i p 化合物i i ( 如图3 ) 。 由于l i p 具有较高的氧化还原潜能，是比其他的过氧化物酶更有力的氧化剂，因此不 仅能氧化通常的过氧化物酶底物苯酚和芳香胺，也能通过适当的离子化作用氧化一系列其他 7 河南农业大学硕士学位论文 木质素降解酶预处理玉米秸秆试验条件研究 的芳香醚和多环芳香化合物引包括能够氧化没有自由酚基的甲氧基芳香环，木素过氧化物 酶最简单的芳香底物是甲氧基苯和苯甲基醇。 l i p 可直接与芳香底物发生反应也有研究提出l i p 通过氧化低分子量的中介体而间接 地发挥作用，这些低分子量的氧化剂穿透细胞壁氧化木质素聚合体2 。特别地，可人工 合成的次生代谢产物藜芦醇，可由黄孢原毛平革菌分泌，能被l i p 氧化成阳离子基1 ，证 明了l i p 能通过氧化低分子量的中介体而间接地发挥作用。藜芦醇可以增加l i p 对许多底物 包括木质素的反应活性并且藜芦醇还起着保护l i p 不失活的中介体作用，或者在酶的催化 循环中作为第1 个电子还原的优先底物。l i p 是唯一已知的在非细胞状态下能裂解c a - c b 和使芳香环开裂的氧化酶，这是白腐菌分解木质素的特征。 1 3 4 i 2 锰依赖过氧化酶 m n p 也是一种带有糖基的胞外过氧化物酶，是由两个国际研究小组2 0 年前在黄孢原毛 平革菌中发现的幢3 川1 ，但和黄孢原毛平革菌产生的另一种细胞外氧化酶- l i p 相比，这种酶 最初并没有受到足够的重视。 m n p 是一种最常见的降解木质素的过氧化物酶，是分解木质素的主要酶系，广泛存在于 白腐菌中删如著名的生物制浆菌种虫拟蜡菌( c e r j p o r i o p s i ss u b v e n m s p o r a ) 产生m n p 和漆酶1 。几乎所有能引起木材白色腐朽的担子菌和各种栖息土壤的枯落层降解担子菌都能 产生这种酶，这些担子菌主要分布于非褶菌目木材腐朽菌中的伏革菌科( c o r t i c i a c e a 国、 韧革菌科( s t e r e a c e a e ) 、猴头菌科( h e r i c i a c e a 曲、灵芝菌科( g a n o d e z 豫a t a c e a e ) 、刺革 菌科( h y m e n o c h a e t a c e a e ) 和多孔菌科( p o l y p o r a c e a e ) 以及伞菌目土壤枯落层分解菌中的 球盖菇科( s t r o p h a r i a c e a 功和口磨科( t r j c h o l o m a t a c e a e ) 等。但是细菌、酵母菌、丝状真 菌和菌根菌都不产生m n p 田 融o o a ! 她 h 图4 锰依赖过氧化物酶m n p 的催化循环 f i g 4t h ec a t a l y r i cc y c l eo fm a n g a n e s ep e r o x i d a s e ( m n p ) 催化循环由h z 0 2 结合到m n p 本体上起开始启动，形成一种过氧化铁复合体。然后过氧 化物的氧一氧键断裂，从亚铁血红素上转移2 个电子，形成由i z 晓2 个电子的氧化产生的中介 体之一m n p 化合物i ，它是一个f e “一氯一卟啉复合体，可以氧化酚底物和二价锰离子m 一+ ， 此时0 2 的双氧分子键断裂后释放一个水分子。接下来氧化还原反应继续进行，一个二价锰 离子m n 2 + 首先被有二齿的有机酸螯合剂如乙醇酸盐或草酸盐螯合，螯合的m n 2 + 充当m n p 化 合物i 的1 个电子供体，被氧化成m n 3 + ，乙醇酸盐和草酸盐继续稳定由m n 孙转化成的m n ”产 物，并促进鼢3 + 螯合物从酶内的释放，而m n p 化合物i 被还原，形成m n p 化合物i i ，也是一 个f e 4 + _ 氧一卟啉复合体。m n p 化合物i i 的还原反应以m n p 化合物i 同样的方式继续进行下 8 河南农业大学硕士学位论文 木质素降解酶预处理玉米秸秆试验条件研究 去，只是p 化合物1 1 只能被二价锰离子m n 2 + 还原，即另一个m n 2 + 转化成3 + ，从而导致 i l n p 本体被释放，同时也产生第二个水分啪崩1 ( 如图4 ) 。 m n p 首先被认为是一种酚氧化酶，因为u n 3 + 能氧化各种单酚和二聚酚，包括酚木质素模 型化合物。酚结构的底物被氧化成苯氧基，苯氧基然后进一步被脱甲基化、烷基苯基键断裂、 a 碳原子被氧化、a 碳原子和b 碳原子之间的键断裂。一个黄孢原毛平革菌产生的m n p 、丙 二酸钠、m n 弘和h 2 0 2 组成的反应体系，可催化b - 1 型木质素结构酚紫丁香基的0 碳原子和 b 碳原子之间的键断裂、0 碳原子被氧化、烷基一芳基键的断裂【3 训。 锰过氧化物酶一妇系统的氧化还原潜能较木质素过氧化物酶低，因为妇3 + 螯合物不是一 种很强的氧化剂，弱于l i p 的氧化作用，简单的l i n p 酶系统不能攻击和氧化木质素的非酚 单元。l i n p 和白腐菌分解木质素的其他细胞外氧化酶有益的协同合作效应已经显示出来了， 包括m n p 和漆酶、m n p 和l i p 以及与糖氧化酶如纤维二糖脱氢酶的协同效应，都同样地提高 了对所用木质素制备物的降解作用。进一步探索这些酶的协同作用机制，将具有非常重要的 理论和应用意义。 1 3 4 1 3 漆酶 漆酶是一组对双酚蓝铜氧化酶，广泛存在于真菌中的担子菌、半知菌和子囊菌中。在一 些昆虫、细菌和植物中也有漆酶的存在。漆酶具有单体、双体和四聚体形式，一般以单体形 式存在。腐菌漆酶的分子量在6 0 k d a 8 0 k d a 之间，是糖基化的，其中含有1 5 _ 2 0 的碳水化 合物。有酸性等电点，最适p h 值在3 5 7 o 之间。漆酶可以由大多数的白腐菌产生，而黄 孢原毛平革菌是著名的缺乏漆酶的特例。尽管漆酶早在1 8 8 3 年就已被发现，但是漆酶对木 质素的降解机制及生理作用到目前还不十分清楚。 像锰过氧化物酶- m n 系统中的m n 3 + 螯合物一样，漆酶正常地只催化氧化大多数带有自由 酚基的木质素模型化合物，包括苯酚、多酚、含有甲氧基的一元酚、芳香胺和其他相对容易 氧化的富电子芳香化合物如儿茶酚、对苯二酚、2 ，6 - - - 甲氧基苯和丁香醛连氮等，催化反应 包括4 个连续的1 个电子的氧化作用，是一个电子转移的芳香底物的氧化反应，氧化酚环， 形成自由基中间产物苯氧基团。苯氧基团是以氧为中心的阳离子基团，通常可以发生非酶催 化的裂解反应，最终导致芳基与0 碳原子( c 。) 之间的键断裂，氧化还原反应转移电子到 分子氧中，将氧分子( 0 0 还原成水，酶回到原先状态。但是在漆酶引起的氧化还原反应中 并不释放活性氧自由基 漆酶可氧化单酚、双酚、氨基酚和芳香胺化合物，酶对木质素酚亚基的催化氧化反应结 果包括烷基一芳香基的断裂、c 。- c o 的断裂、0 碳原子的氧化和酚木质素二聚体断裂，漆酶还 有使芳香环脱甲氧基、脱甲基作用以及聚合和解聚木质素的作用。 1 3 4 2 国内外白腐菌降解木质纤维素研究进展 1 3 4 2 1 国内研究进展 席北斗、刘鸿亮指出对纤维素和木质素有降解能力的微生物主要是高温放线菌和高温 真菌，其中有独特降解机制的白腐菌在木质素降解中起着重要作用。池玉杰、于钢引试验证 实6 种木材白腐菌对山杨木材木质素的分解能力不同，依次为血红密孔菌、偏肿拟栓菌、冬 拟多孔菌、三色革裥菌、粗毛盖菌和火木层孔菌。谢君等哺驯指出侧耳s p 2 ( p l e u r o t u ss p 笏 和粗毛栓菌( t r c u n e t e $ g a l l i c a ) 是产木质纤维素降解酶能力强，且产酶较快的菌株。在液 体培养基中具有很强的木质纤维素降解酶产生能力且产酶速度较快，在固体培养基中具有很 强的降解麦秸生物质能力。产生木质素降解酶行为相关性小，而产生纤维素酶和半纤维酶有 较强的相关性，表明白腐菌在液体和固体培养基中的产酶机制是各不相同的。 董旭杰等们对3 种自腐菌一黄孢原毛平革菌、变色栓菌和木质层孔菌在恒温振荡培养条 件下产漆酶、锰过氧化物酶的情况进行比较研究，变色栓菌产漆酶相对最高，木质层孔菌产 锰过氧化物酶相对最高，培养过程中还原糖含量随培养时间的延长而逐渐降低。戴永鑫等啪1 9 河南农业大学硕士学位论文木质素降解酶预处理玉米秸秆试验条件研究 研究了白腐菌及其产生的木质素降解酶系对秸秆的木质素生物降解方法，探讨了黄孢原毛平 革菌和杂色云芝单一菌株生物降解及双菌株联合降解木质纤维素的规律，白腐菌双菌联合固 态培养可使木质素降解率达到4 7 6 4 ，采用模拟大规模白腐菌堆积培养( 厚度3 0 c m ) 的方 法降解秸秆木质素，培养3 0 d ，木质索降解率为3 2 5 4 。杨玉楠等m 1 试验证实经白腐菌预处 理后，秸秆的结构受到破坏，木质素含量降低，从而大大缩短了厌氧发酵周期，提高了甲烷转 化效率。 张晓昱等认为白腐菌对木屑基质中纤维素、半纤维素和木质素三者的降解具有一定的 顺序和选择性，即先降解半纤维素和木质素，再同时降解半纤维素、纤维素和木质素：先将 三大素大分子进行氧化、裂解，再将所得的短链或单体( 如小分子木素单体、愈创木基单体 等) 等氧化成小分子酸类、酯类等，整个过程是个氧化还原、非专一的降解过程。江凌、吴 海珍等m 认为每一种白腐菌产生不止一种木质素降解酶，如l a c 和m n p 单独存在都不能很好 的降解木质素，而两种酶同时存在时，木质素却能得到很好的降解，表明两种酶具有协同作 用。但当体系中一些条件发生变化时，这两种木质素降解酶会发生相互抑制现象，如液体培 养条件下，m n 2 + 浓度增加会导致l i p 活力大大降低，而m n p 和l a c 的活力却相应增加，说明 这种协同作用可能存在正负两种机制。研究表明纤维二糖脱氢酶( c d h ) 是白腐菌的又一重 要酶种，它与l i p 、m n p 和l a c 有密切的关系。 1 3 4 2 2 国外研究进展 k w a n g h ol e e 刚等提出褐腐菌可能比以前所认为的具备更大的降解木质素的能力。褐腐 真菌通常不被看作在细胞壁中形成空腔或者产生木质素降解酶。观察显示褐腐真菌对于木质 素的降解能力比以前所研究的菌更强。在酶分析和由粉孢革菌降解的细胞壁微形态学观察基 础上，目前研究证实了褐腐真菌降解了所有细胞壁层包括富含木质素的中间层，同时也证实 产生了漆酶。b k l u c z e k - t u r p e i n e n 1 等从由地方垃圾、纸及木材屑组成的混合料中分离 了两个半知菌纲膨大拟青霉菌。我们通过对带有h c 一标签的合成木质素的无机化进行了木质 素的降解研究。把固体培养料灭菌并接入真菌大约6 5 的合成木质素后被无机化；另外有 1 5 5 转变为水溶性片段。分离的菌种在灭菌培养基中生长时漆酶是可以检测到的唯一的木 质素降解酶。酶的产生和生长相关，并且依赖于培养条件。漆酶产生的最适p h 值在4 5 5 5 之间，晟适温度3 0 左右。漆酶酶活在低分子物质存在情况下将增加，例如黎芦醇、黎芦 酸、香草醛和香草酸。 自然界中担子菌类的白腐真菌和分解垃圾的真菌都是最有效的木质素降解类型川1 。 代表性的白腐真菌在纯氧中4 周可以降解5 0 - 7 0 合成h c - 标签的木质素m 洲。在空气环境 中将更慢。白腐菌( n e m a t o l o m af r o w a r d i i ) h 别在木质纤维素( 1 i g n o c e l l u l o s i c ) 材料中生 长时可以降解其中7 5 的合成木质素( 1 4 c - d h p ) 为c 0 2 ，微真菌( m i c r o f u n g i ) 可以从少量浓缩 的1 4 c 稻草木质素中释放出最高2 4 5 的h c 晓并降解几种类似木质素模型的化合物。进一步说， 据报道这些真菌产生漆酶，但没有过氧化物酶一。担子菌类、半知菌和子囊菌 ( a s c o m y c e t e s ) 中发现大量的漆酶旧1 。通常这些酶的最适p h 在3 0 - 6 0 m m o 相当数量的 芳香族化合物显示可以诱导白腐菌产生漆酶。用担子类自腐菌和简单的芳香化合物( 黎芦醇、 黎芦酸、香草醛、香草酸和苯甲醇) 做了更为细致的研究哺1 跏。木质素降解的过氧化物酶 被看作是木质素降解最重要的酶。半知菌的漆酶则像是一种相关的对木质素降解能力低但相 对较稳定的关键酶。 x g e n g 等研究了白腐菌朱红密孔菌对木质素的降解。真菌培养3 个月后，超过4 0 的 非酚类木质素和大约7 0 的酚类木质素被降解。木质素中酚类羟基的存在极大提高了木质素 的降解。这项研究揭示了白腐菌朱红密孔菌这一专产漆酶的真菌具备氧化降解酚类和非酚类 木质素的能力，真菌降解非酚类木质素的能力表明漆酶中介系统和木质素完全的降解有关 联。真菌降解木质素后，酚类和非酚类木质素的羧酸含量都明显增加1 。黄孢原毛平革菌是 1 0 河南农业大学硕士学位论文木质素降解酶预处理玉米秸秆试验条件研究 一种研究最为深入的白腐菌，它降解木质素时分泌l i p 和m n p 。但它可能不能代表大多数自 腐菌，因为在到目前为止研究的白腐菌中只有4 0 产生l i p 和m n p 组和。污叉丝孔菌 ( d i c h o m i t u ss q u a l e n s ) 和虫拟蜡菌( c e r i p o r i o g s i ss u b v e r m i s f l o r n ) 在降解木质素的过 程中并不能检测出l i p 和m n p 。 天然的木质素酚类基团中因为有酚上的羟基而更容易被降解，而木质素中却有9 0 的非 酚类基团。x g e n g 等也证明了真菌可以降解非酚类基团，但比起对酚类基团的降解要低得 多。真菌对木质素的降解的结果是羧酸的增加，每克酚类木质素大约产生0 4 4 m m o l 的羧酸， 同时每克非酚类木质素可以产生0 1 3 t o o l 的羧酸。可能的情况就是因为酚类木质素中芳香 环断裂导致羧酸量比来自非酚类木质素要多。羧酸看起来像是在完全无机化最终形成c 0 2 和 h 2 0 的中间降解产物。真菌降解非酚类木质素造成了脂肪族羟基增加( 1 o l m m o l g 木质素) ， 相反对酚类木质素的降解却只有更少的脂肪族羟基的增加( 0 1 7 m m o l g 木质素) 。非酚类木 质素中的苯丙烷侧链比起芳香环将优先得到降解。侧链断裂将增加脂肪族羟基单元的总数。 酚类木质素的降解中，芳香环包括苯酚羟基将比苯丙烷侧链优先得到降解，因为苯酚羟基容 易被氧化。3 一羟基邻氨基苯甲酸3 - h y d r o x y a n t h r a n i l i c ( 3 - 1 1 a a ) 作为真菌的代谢物能够 使漆酶降解木质素类似物和合成的木质素，被认为是自然的漆酶中介体。但更深入的研究证 实3 一h 从在真菌降解木质素过程中并不起着非常重要的作用嘲耵。 聚合木质素片段是木质素降解其中至关重要的一个步骤，因为小的木质素成分都可以在 细胞内代谢掉旧1 。有几种形成木质素片断的方法，第一，朱红密孔菌产生漆酶氧化酚类单元， 释放低分子量成分同时暴露新的酚类末端。继续释放酚类末端将最终引发木质素的完全瓦 解。第二，因为朱红密孔菌可以降解非酚类基团，它可以在体内产生促使漆酶氧化一些非酚 类基团的漆酶一中介体，这样就可以解聚木质素。第三，朱红密孔菌利用不可知的酶或者非 酶机制降解非酚类基团。k r e m e ra n dw o o d ( 1 9 9 2 ) 提出黄孢原毛平革菌产的纤维二耱脱氢酶 最初的作用是降低f e ( 1 i d 变成f e ( i f ) 。f e ( i t ) 和过氧化氢反应形成羟基自由基。羟基自 由基可以解聚木质素矧。 1 4 研究内容和技术路线 1 4 i 目的和意义 目前化学法预处理玉米秸秆会产生大量的抑制物如乙酸、糠醛等，这对于糖化和发酵均 非常的不利，而且如果采用化学法和物理法生产燃料乙醇，对设备的要求也会加大，增大投 入成本。本文则是通过白腐菌所产木质素降解酶类对玉米秸秆的预处理，在温和的条件下实 现木质素的降解和玉米秸秆结构的改变，为糖化酶进一步糖化形成有利的条件，并最终为发 酵产生乙醇奠定基础。 本文通过黄孢原毛平革菌和杂色云芝对玉米秸秆的预处理研究，探索生物法预处理对玉 米秸秆的作用效果，探索生物法预处理途径实现纤维乙醇产业化的道路。为进一步真正实现 纤维质替代粮食作物生产燃料乙醇提供新的思路和参考。 通过白腐菌预处理玉米秸秆前后成份的变化、分子构型及结晶度的变化证实白腐真菌所 产酶类对秸秆造成了结构性改变，并通过进一步糖化显示了白腐菌预处理对提高糖化率有积 极的作用。 1 ，4 2 工艺流程 如图5 利用白腐菌( 黄孢原毛平革菌和杂色云芝) 发酵制备木质素降解酶粗酶液，用粗 酶液预处理玉米秸秆，再用糖化酶( 木聚糖酶和纤维素酶) 进行糖化。通过糖得率评判预处 理效果；通过粗酶液预处理液和酸预处理液进行有毒物质含量对比、秸秆预处理前后结晶度 变化和表面微观结构的变化分析预处理促进糖化的原因。 河南农业大学硕士学位论文木质素降解酶预处理玉米秸秆试验条件研究 1 4 3 技术路线 图5 试验工艺流程 f i g 5t h ep r o c e s so ft r i a i 假设 发酵液中木质 素降解酶抑制 了糖化酶作用 体系 闯题：发酵液预处 理后灭活与否均 抑制糖化 水 根据1 扫描电镜( 预 处理前后结构 表面结构状态 的改变) 糠醛等有毒物 质( 生物预处 理液和酸预处 理液有毒物质 对比) 图6 全文思路框架 f i