（生物化学与分子生物学专业论文）dna调节片段及其结合蛋白的筛选与鉴定.pdf

中国协和医科大学博士生学位论文 d n a 调节片段及其结合蛋白的筛选与鉴定 一一一一下卜一 摘要 、f 一切生命现象，实际上都是机体产生的一系列复杂的信息传递和调控的过 程。缩胞水平的信息传递和调控是细胞各种行为的基础。从第一信使细胞外信号、 第二信使、第三信使转录调节因子到靶基因，蛋白质之间的相互作用，蛋白质与 基因调控序列之间的相互作用，通过编码d n a 结合蛋白质的基因的表达，形成 的基因调控信息传递网络，是细胞立体网络的一个核心部分。细胞酌整体功能即 是在基因调控信息传递网络的调控下，维持细胞内整个立体网络的稳定状态，并 按照既定的内在程序分化、发育，或改进自身的结构以适应于环境。 疾病的形成与整个基因调控信息传递网络有关，要对基因调控信息传递网络 和细胞行为有深入透彻的认识，首先要明确细胞内所有的基因，即基因组。基因 组的研究对细胞内所有基因的克隆、鉴定起到巨大的推动作用。功能基因组研究 主要包括以下各个部分：基因组、转录组、蛋白质组和代谢组等。功能基因组对 细胞内的所有分子及它们之间的相互作用进行解析：确定出每一个功能单元的反 应模式，浓度变化规律；确定出它们之间所有的相互作用和反应。即确定细胞立 体网络中所有的结点和网络联系，得到网络的基本结构，作为理解和重建细胞功 能的基础。 d n a 与蛋白质之间的相互作用是构成基因调控信息传递网络的基础之一。通 过d n a 与蛋白质的相互作用，细胞基因组上的基因实现有序、协调表达，使细胞 表现出有秩序和自组织的行为，如细胞的分裂与增殖，细胞的分化与凋亡，和个 体有序的发育过程。已有的研究表明，反式作用因子与相应的d n a 顺式作用元 件的结合是染色质重塑和基因转录调节的基础。所以，筛选、鉴定d n a 调节元 件和d n a 结合蛋白质，对研究基因调控信息传递网络和揭示基因表达调节和基因 组自身组织规律是很有必要的。 现有的研究方法难以大量筛选、鉴定d n a 调节元件，它们在筛选i ) n a 调节片 段时，或者效率不高，不能快速、大量筛选基因组中的d n a 调节片段，或者需要 纯化的转录因子和抗体，只能分离与已知蛋白质结合的d n a 片段。另外，由于转 录调节因子在细胞中的表达水平很低，利用常规的纯化方法很难获得足以进行氨 基酸序列分析或抗体制备的纯化蛋白质，目前已克隆的转录因子不多，对这些因 子的表达模式和d n a - 蛋白质相互作用规律尚缺乏足够的研究。因此，当前转录 ! 旦坐塑垦墅查堂堕主生兰竺堕苎 调节研究的一个主要任务仍然是筛选、鉴定d n a 调节片段和相应的转录调节因 子，研究d n a 与蛋白质相互作用的规律。 本实验室在对原有的全基因组p c r 技术进行改进的基础上，结合凝胶阻滞实 验，建立了筛选d n a 调节片段的新方法。其基本原理是，通过超声波将人基因组 随机打断，与d n a 连接子相连后进行全基因组p c r 扩增、标记，只分离2 0 0 b p 左右的d n a 片段作为探针，与k 5 6 2 细胞核粗提物结合后进行聚丙烯酰胺凝胶 电泳，回收阻滞带d n a 进行p c r 扩增，作为新一轮凝胶阻滞实验的探针，与核 粗提物再次进行凝胶阻滞实验。如此重复多轮，不断富集可与k 5 6 2 细胞核粳提 物结合的d n a ，建立富含调节片段的d n a 部分文库，从中筛选出能与核蛋白特 异结合和具有细胞特异结合模式的d n a 调节片段。这种方法具有以下优点： 能快速、大量克隆、筛选基因组中的d n a 调节片段。能筛选具有细胞特异结合 模式的d n a 调节片段。操作简单，不需要纯化的转录因子或相应抗体及其它特 殊材料和试剂。作为大范围内初步筛选d n a 调节片段的方法，是其它方法难以奏 效的。 但是，利用此方法得到的d n a 序列，因为是在基因组范围内的筛选，范围太 大，在特异性上有一定的欠缺。因此，本论文将此方法用到包含载脂蛋白基因簇 a p o a ，c 。a 。的大片段b a c ( 细菌人工染色体) d n a 上，从中筛选d n a 调节片段。 相对基因组而言，缩小了筛选的范围，提高了针对性。另外，筛选到的序列，可 以肯定的是它们具有序列特异性的蛋白质结合活性，但是否具有特定的调节活 性，必须通过确定的实验来验证。本研究结合荧光素酶报告基因瞬时转染分析确 定筛选到的调节片段的调节活性，再迸一步用酵母单杂交方法筛选鉴定某一调节 ( 一) 调节片段部分文库的构建与e m s a 筛选序列特异性蛋白质结合片段： 大量制备人a p o a i a 4 c 3 基因簇的b a cd n a ，通过超声波将人b a cd n a 随机打断， 与d n a 连接子相连后进行p c r 扩增、标记，分离2 0 0 b p 左右的d n a 片段作为探针， 与h e p g 2 细胞核粗提物结合后进行聚丙烯酰胺凝胶电泳，回收阻滞带d n a 进行 p c r 扩增，作为新一轮凝胶阻滞实验的探针，与核粗提物再次进行凝胶阻滞实验。 如此重复多轮，不断富集可与h e p g 2 细胞核粗提物结合的d n a ，建立富含调节片 段d n a 部分文库，从中筛选出能与核蛋白特异结合的d n a 调节片段。 f 在本实验中，从4 2 个随机克隆中筛选出2 4 个能与h e p g 2 细胞核粗提物特异 结合的人b a cd n a 调节片段。对1 5 个克隆进行测序分析，1 个序列与g e n b a n k 的已知序列完全相同，1 个序列与已知序列只有一个t c 碱基的差异。其余的 备荧光素酶报告基因质粒载体，构建调节片段一荧光素酶报告基因重组质粒。鉴 定和纯化后用l i p o f e c t a m i n e2 0 0 0 法分别转染真核细胞。裂解转染细胞后检测荧光 强度。用分光光度法测定b 一半乳糖苷酶活性做转染效率的内参照，求取相对的 荧光强度值。在1 6 个从人b a cd n a 中筛选的调节片段中，与对照相比，有6 个片段增强活性为2 5 倍。在以前从人基因组中筛选的1 5 个调节片段中，与对 照相比，5 个增强活性为2 5 倍，1 个片段e 2 5 的增强活性为1 0 3 0 倍，可以肯定 为增强子，且具有肝组织特异性。 ( 三) 利用酵母单杂交体系筛选d n a 结合蛋白质：回收调节片段，构建调 节片段一h i s 报告基因重组质粒，转化酵母感受态细胞，将报告基因载体整合到酵 母基因组中，做背景表达检测。c d n a 质粒文库经滴度测定和扩增纯化后大量转 化酵母感受态细胞。筛选阳性克隆。测定阳性克隆插入片段的序列并做序列分析。 、 5 0 0 0m c i m m o l ( 1 0u c i u 1 ) 。 8 其它主要试剂： d n a 分子量标准：p b r 3 2 2 h i n f l 、xd n a h i n d i i 、1 0 0 b p 与2 0 0 b p l a d e r 为基 础所友谊公司产品。3 一a t ，玻璃珠等购自s i g m a 公司；p e g 4 0 0 0 为f l u k a 公司产 品；h e r r i n g t e s t e sc a r r i e r d n a 为c l o n t e c h 公司产品。r n a s ea 、蛋白酶k 为g i b c o b r l 公司产品。p o l y ( d l d c ) 为s i g m a 公司产品。l t e m i n 、h e p e s 、丙烯酰胺 ( a c r y l a m i d e ) 、双丙烯酰胺( b i s a c r y l a m i d e ) 、d m s 0 、d e p c 为s i g m a 公司分析 纯试剂，t e m e d 购自p r o m e g a 公司，t r i s 为g i b c o b r l 公司分析纯试剂，p m s p 、 d n t p s 购自上海生工公司，过硫酸铵为华美生物工程公司产品，透析袋( 截留分 子量6 0 0 0 1 0 0 0 0d a l t o n ) 购自经科公司。其余所用试剂均为国产分析纯试剂。 9e d n a 文库 人肝m a t c h m a k e r e d n a 文库为c l o n t e c h 公司产品，载体为p a c t 2 ( 图6 ) 。 1 0 主要仪器设备： c 0 2 孵箱( n a p c o5 4 1 0 ) 为p r e c i s i o ns c i e n t i f i c 公司产品，倒置显微镜 ( d i a p h o t t m d ) 为日本n i k o n 公司产品。紫外分光光度计( d u 一6 5 ) 为b e c k m a n 公司 9 曼塑塑堕型查堂竖主竺兰竺丝苎 产品，超声波破碎仪为f i s h e rs c i e n t i f i c 公司产品( 5 5 0s o n i cd i s m e m b r a t o r ) ， p c r 热循环仪为b i o m e t r a 公司产品( u n oi i ) ，冷冻高速离心机、冷冻台式离心 机为e p p e n d o r f 公司产品，超纯水制备装置为m i l l i p o r e 公司产品( m 订l i q p l u s ) 。玻璃匀浆器为国产制品，电洗脱装置购自北京东方仪器厂。m o n o l i g h t 2 0 1 0 荧光分析仪为美国a n a l y t i c a ll u m i n e s c e n c el a b 公司产品，细胞电转化仪为 b i o r a d 公司产品。 1 1 核蛋白提取溶液配制：( 见表4 ) 表3 寡核苷酸序列及用途 名称序列备注 5 一g a c a a g a g c t a a g a c c a t g c t c g a g 一3 互补形成x h o i 连接 0 1 i g od 子，用b a cd n ap c r 5 一c t c g a g c a t g g t c 一3 0 1 i g oe 表4 溶液配制 名称各组成成分的终浓度备注 l ol i l m h e p e s ( p h 7 9 ，4 c )用于核粗提物的提 溶液a 1 5 m mm g c l ： 取。 1 0m mk c l 0 5 m md t t h e p e s 经0 2 2 u m 过 2 0m mh e p e s ( p h7 9 ，4 c )滤除菌。 2 5 ( v v ) g l y c e r o l 溶液c0 4 2 mn a c ld t t 、p m s f 于用前 1 5 m mm g c l 2加入。 o 2 m me d t a 0 5 m md t t 2 0m mh e p e s ( p h7 9 ，4 c ) 2 0 ( v v ) g ly c e r o l 0 1mk c l 溶液d 0 2 m me d t a 0 5 m md t t ! 里塑塑堕型查兰堕主生堂垡堡茎 ( 二) 、实验方法： 1 实验基本技术路线图：( 图9 ) 提取人b a c d n a 0 超声波打断d n a j 削平d n a ， p c r 标记、 连上连接子 回收d n a 培养h e p g 2 细胞 提取核粗提物 ， s a l l 酶切p u c l 9 质粒d n a 士 去磷酸化、电泳回收 p c r 大量扩增、纯化 士 x h o i 酶切、电泳同收 l r 一 连接，s a l i 、x h o i 酶切连接产物 + 转化感受态细菌 士 挑取单克隆培养，j 、量提取质粒d n a 钝化，酶 回收插入片段，同位素标记插入p g l 一3p r o m o t e r 报告基因载体插入h i s 报告基因载 体 e m s a ，判定是否含特异性调节元件瞬时转染转化酵母细胞，检测背景 d n a 测序，序列分析荧光素酶活性分析c d n a 文库大量转化 0 挑取阳性克隆，鉴定，测序和分析 图9 从人基因组中筛选d n a 调节片段的实验流程图 2 ， 中国协和医科大学博士生学位论文 大量制备人a p o a i a 4 c 3 基因簇的b a cd n a 、超离纯化后用脉冲场凝胶电泳 f p f g e ) 回收纯化酶切片段，将b a c 大片段d n a 用超声打断到2 0 0 b p 左右，再 将其用绿豆核酸酶削平，用k l e n o w 大片段补平，与连接予连接，再用p c r 扩增 后切胶回收，掺入放射性核素用p c r 标记，制备第一轮凝胶阻滞实验用的人b a c d n a 小片段探针。同时培养h e p g 2 细胞制备细胞核粗提物。用d n a 探针与h e p g 2 细胞核粗提物作凝胶阻滞实验( e m s a ) ，切取阻滞带，回收纯化，再做放射性 核素掺入p c r 标记和e m s a ，重复4 次以富集调节片段。对富集后调节片段作 p c r 大量扩增与回收纯化，然后酶切消化调节片段使其具有两个粘端。限制性 消化质粒p u c l 9 ，去磷酸化处理载体d n a 。连接调节片段与p u c l 9 载体，转化d h s a 感受态细胞，构建d n a 调节片段质粒文库。 培养单菌落，小量制备质粒d n a 酶切鉴定质粒d n a 中有无插入片段，做放 射性核素标记，利用e m s a 筛选有序列特异性结合的插入片段，测其序列，做 d n a 片段的b l a s t 同源性分析和潜在反式作用因子结合位点的分析。 回收调节片段，制备荧光素酶报告基因质粒载体，构建调节片段一荧光素酶 报告基因重组质粒。鉴定和纯化后用l i p o f e c t a m i n e2 0 0 0 法瞬时转染真核细胞。裂 解转染细胞后检测荧光强度。用分光光度法测定b 一半乳糖苷酶活性做转染效率 的内参照，求取相对的荧光强度值。 回收调节片段，构建调节片段h i s 报告基因重组质粒，转化酵母感受态细胞， 将报告基因载体整合到酵母基因组中，做背景表达检测。c d n a 质粒文库经滴度 测定和扩增纯化后大量转化酵母感受态细胞。筛选阳性克隆。测定阳性克隆插入 片段的序列并做序列分析。 2 人a p o a i a 4 c 3 基因簇的制备 2 1b a c d n a 的大量制备川 以单菌落接种至含适当抗菌素的5m ll b 培养基中，3 7 。c 振荡培养过夜， 取0 im l 过夜培养物加到含抗菌素的2 5m ll b 培养基中，3 7 c 振荡培养到o d 6 0 0 达0 6 ，将2 5m l 培养物转移至含抗菌素的5 0 0m ll b 培养基中，3 79 c 振荡2 5 小时( o d 6 0 0 约为0 4 ) ，加入2 5m l 氯霉素溶液( 3 4 m g m 1 ) ，3 7 振荡培养过夜， 于4 c4 0 0 0r p m 离心1 0 分钟收集细菌，用2 0 m l 含溶菌酶( 5 m g m 1 ) 的溶液i ( 2 5m mt r i s - h c ip h 8 0 ，1 0m me d t a ，5 0m ms u c r o s e ) 悬浮细菌，室温静置5 分钟，加入新鲜配制的溶液i i ( 0 2nn a o h ，1 s d s ) 4 0m l ，冰上混匀变性1 0 分钟，加入3 0m l 溶液i i i ( 3m n a a c p h4 6 ) 于4 c 中和1 0 分钟。于4 c ，1 2 0 0 0 r p m 离心2 0 分钟，转移上清至另一管中，加入o 6 倍体积的异丙醇，混匀，室温放置3 0 ! 旦塑塑垦至! 查兰蔓兰= 兰兰堡堡苎； 分钟，于室温1 2 0 0 0r p m 离心1 5 分钟，用7 0 7 , 醇洗沉淀一次，室温晾干后溶于 8 m l t e 缓冲液中。 注意：操作中要避免剧烈振荡并使用粗口t i p 头抽吸d n a 以减少机械剪切力 对b a c 完整性的影响。 2 2b a c d n a 的超离纯化 称取8g c s c l 加入d n a 溶液中，加入0 6 m l e b 溶液( 1 0 m g m 1 ) ，完全溶 解后于2 0 。c ，4 5 0 0 0r p m 离心2 4 小时，用1 8 号注射针头吸出质粒d n a 区带。水 饱和正丁醇抽提数次去除e b ，用4 倍体积去离子水稀释含c s c l 的d n a 溶液， 再用2 5 倍体积无水乙醇沉淀d n a ，室温静置3 0 分钟，于4 。c 、1 2 0 0 0r p m 离心 2 0 分钟，用7 0 乙醇洗沉淀一次，室温晾干后，溶于适量( o 5 1m 1 ) t e 缓冲液 中，电泳检查d n a 质量，读取o d 2 6 0 及o d 2 8 0 ，鉴定纯度并计算d n a 浓度。 2 3b a c d n a 的n o t i 酶切与脉冲场凝胶电泳( p f g e ) 回收纯化 在6 0 u l 反应体系中依次加入5 0 u lb a cd n a ( 8 u g ) ，6 u l1 0 x b u f f e r ，4 u 1 n o ti ，0 6 u lb s a 。3 7 。c 水浴2 小时，7 0 0 c1 5 分钟灭活限制性内切酶。 灌制1 的低熔点琼脂糖凝胶，完全凝固后拔出梳子，将含p f g e 级d n a 分子量标准用已消毒刀片切下，填入加样孑l 中，用1 的琼脂糖凝胶密封。将凝 胶放入专用的电泳槽中，在0 5 x t b e 缓冲液中于1 4 。c 平衡1 小时。点样，再平 衡3 0 分钟。用自动程序5 2 1 0 k b 进行电泳，场强6 v & m 脉冲时间o 2 2 秒_ 2 3 5 秒，电泳时间1 5 小时1 6 分钟。电泳结束后e b 染色观察并照相，切下1 2 0 k b 左 右的主带，移至1 5 m l 的e p e n d o r f 管中，加入凝胶条5 倍体积的 2 0 m m o l l ( p h 8 0 ) ，l m m o l le d t a ( p h 8 0 ) ，6 5 0 c 水浴中加热5 分钟溶化凝胶。冷 却到室温时加入等体积的0 1 m o l lt r i s c l ( p h 8 0 ) 饱和酚，强烈振荡混匀2 0 秒钟，室温下4 0 0 0 9 ，离心1 0 分钟。用等体积酚氯仿、氯仿各抽提一次，加1 5 体积l o m 醋酸铵、2 倍体积无水乙醇，混匀后室温放置1 0 分钟，1 2 0 0 0 9 ，于4 、1 2 0 0 0r p m 离心2 0 分钟，用7 0 乙醇洗沉淀一次吸尽液体，空气中晾干，溶 于1 0 0 u lt e ，紫外分光光度法测定d n a 浓度和纯度。 3 b a c 小片段探针的制备 3 1 超声打断b a c 大片段d n a t 6 2 】： 吸出5 0 u g 人b a c9 n a 至1 5 m l 离心管中，超声波打断d n a 至1 5 0 3 0 0 b p 片 段时停止。样品放于冰上防止温度过高使d n a 变性，超声波打断时吸出l u l 电泳 观察d n a 断裂情况。用酚、酚氯仿、氯仿各抽提一次，加入1 5 体积1 0 m 2 3 主璺垫塑垦型查兰竖主圭兰垡堡塞 醋酸铵、2 倍体积无水乙醇，混匀后室温放置3 0 分钟，1 2 0 0 0 r p m 室温离心l o 分 钟，7 5 乙醇洗涤沉淀两次，吸尽液体，空气中晾干，溶于l o o u l 灭菌水，紫外 分光光度法测定d n a 浓度和纯度。 3 2 小片段d n a 的削平： 从3 1 超声波打断的人b a cd n a 中吸取4 u g ( 1 0 u 1 ) ，进行削平反应，条件 如下： 灭菌水 l o x 绿豆核酸酶缓冲液 超声打断的人b a cd n a ( 4 u g ) 绿豆核酸酶( 4 0 u u 1 ) 1 6 8 u l 2 0 u l 1 0 u 1 2 u l 3 74 c 孵育l o 分钟，6 5 。c 灭活1 5 分钟。 3 3d n a 片段的纯化： 按q i a e xi i 回收试剂盒说明进行操作，去除绿豆核酸酶、盐类和小片段d n a ， 回收人基因组d n a 片段。具体步骤如下，在d n a 削平反应体系中加入3 倍体积的 b u f f e r ( i x l 和f o u lq i a e xi i ，室温孵育1 0 分钟，每隔两分钟混合一次，以使 d n a 与q i a e xi i 充分结合。1 2 0 0 r p m 室温离心3 0 秒钟，弃上清。用5 0 0 u lb u f f e r p e 洗涤q i a e xi i 两次。空气中晾干沉淀。用5 0 u lt e 悬浮q i a e xi i ，室温放置 5 分钟洗脱d n a ，1 2 0 0 0 r p m 离心3 0 秒钟，转移上清，吸取2 u l 电泳估计d n a 量， 于4 保存备用。 3 4 0 1 i g oe 的磷酸化和d n a 连接子的形成 0 1 i g oe 磷酸化反应条件如下： 灭菌水 1 0 x 多核苷酸激酶缓冲液 0 1 i g oe ( 1 0 0 p m o l u 1 ) l o m ma t p y 一”p a t p ( 1 0 u c i u 1 ) t 4 多核苷酸激酶( 5 u u 1 ) 1 3 u l 2 u l 2 u l 1 u l 0 5 u l 2 u l 3 7 c 孵育1 小时，1 0 0 。c 灭活5 分钟，加入2 u ll o o p m o l u l 的o l i g od ，离心3 0 秒，9 5 。c j j n 热2 分钟，缓慢冷却至室温形成x h o ld n a 连接予。 3 5 连接反应 主旦坐塑墨型查堂竖主生堂竺丝苎一 吸取4 u lx h o id n a 连接子和2 u l 超声打断后削平的人b a cd n a 片段进行连 壁医窒：垦窒签丕垫工! 灭菌水 2 0 u l 1 0 t 4d n a 连接酶缓冲液 5 0 p e c r 4 0 0 0 d n a 连接子 超声打断后削平的人b a cd n a t 4d n a 连接酶( 5 u u 1 ) 4 u l 8 u 1 4 u l ( 0 1 u g ) 2 u 1 2 u 1 1 6 连接过夜。吸取1 0 u l ，6 5o c 灭活1 5 分钟。加入2 7 u l 灭菌水、4 u l1 0 k l e n o w 片段反应缓冲液、5 u l2 m md n t p 和0 5 u lk l e n o w3 e x o 一( 5 u u 1 ) 片段，3 7 。c 孵育1 5 分钟，6 56 c 灭活1 5 分钟。 3 6p c r 扩增 从以上反应体系中吸取2 u l ，按如下条件进行热启动p c r 灭菌水 1 0 p f u 缓冲液 2 f i l md n t p 0 1i g od ( 5 0 p m o l u 1 ) q 一“p d c t p ( 1 0 u c i u 1 ) b a c 板 5 7 u 1 8 u l 1 0 u 1 2 u 1 1 u 1 2 u 1 9 5 。c2 分钟，8 0 。c 时加入如下反应液 灭菌水 1 0 x p f u 缓冲液 p f ud n a 聚合酶( 4 u u 1 ) 1 8 u 1 2 u l 0 5 u l 9 5 3 0 秒、5 7 3 0 秒、7 2 5 0 秒进行循环反应。1 0 个循环后每增加5 个循 环就从反应管中取出5 u l ，上样于1 5 琼脂糖凝胶中，1 0 0 v 快速电泳5 分钟， 观察p c r 扩增情况。当p c r 扩增产物可见时，暂停于7 2 继续反应1 5 分钟。加 入3 0 0 u l 灭菌水，酚氯仿、氯仿各抽提一次，加1 5 体积1 0 m 醋酸铵、2 倍体 积无水乙醇，混匀后- 7 0 放置3 0 分钟。1 2 0 0 0 r p m4 离心l o 分钟沉淀d n a ， 7 5 乙醇室温洗涤沉淀两次，吸尽液体，空气中晾干，溶于2 0 u lt e 。 3 7 第一轮凝胶阻滞实验用的人b a cd n a 探针的制备6 0 1 ： 将以上b a cd n ap c r 产物上样于8 聚丙烯酰胺凝胶( 丙烯酰胺甲叉双丙烯 酰胺为6 9 ：1 ) ，以0 5 t b e 为电泳缓冲液，2 0 0 v 恒压电泳2 小时，拆除电泳装 主里坠塑垦型查兰堕土生兰丝堡壅 一 置后，直接在玻璃板上压上x 光片，室温放射自显影1 小时，按下述3 8 中的方 法从聚丙烯酰胺凝胶中回收2 0 0 b p 左右( 1 5 0 3 0 0 b p ) 的d n a ，作为第一轮凝胶 阻滞实验用的d n a 探针和新一轮b a cd n ap c r 扩增用的d n a 模板。 3 8 聚丙烯酰胺凝胶中d n a 的回收： 放射自显影后，冲洗x 光片，根据d n a 条带的位置，用酒精灯烧灼的手术刀 片挖取相应的聚丙烯酰胺凝胶块，放入电洗脱槽负极侧的透析膜上，于4 恒压 1 5 0 v 电泳4 0 分钟。从电洗脱槽正极侧吸出d n a ，等体积氯仿抽提一次，转移上 清，加入1 1 0 体积3 m 醋酸钠( p h 5 2 ) 、2 倍体积无水乙醇和l o u g 糖原，混匀 后一7 0 放置3 0 分钟。1 2 0 0 0 r p m4 离心1 0 分钟沉淀d n a ，7 5 乙醇室温洗涤沉 淀两次，吸尽液体，空气中晾干，溶于2 0 0 1t e ，吸取4 u l 上样于1 5 琼脂糖凝 胶( 含0 5 u g m le b ) ，电泳估计d n a 浓度，用t e 稀释后用作凝胶阻滞实验的探 针或进一步p c r 扩增的模板。 4 细胞核粗提物的制备 4 1 细胞复苏与培养 迅速从液氮罐中将h e p g 2 细胞、k 5 6 2 细胞冻存管取出，放入4 2 水浴中快 速复苏细胞，将细胞悬液转移入培养瓶中，加入含1 0 胎牛血清的r p m i1 6 4 0 培 养基中，5 c o 。饱和湿度3 7 。c 培养。当细胞生长丰度达7 5 左右时，h e p g 2 细胞 用胰酶消化后传代，k 5 6 2 细胞吹散后传代。 4 2 细胞冻存 收集对数生长期细胞，重悬于含1 0 d m s o 、2 0 胎牛血清的新鲜培养基中 一2 0 。c 放置2 小时，一7 0 。c 放置过夜，移入液氮中保存。 4 3 核粗提物的制备： 按d i g n a m 方法提取1 6 ”，具体步骤为：2 0 0 0 r p m 室温离心1 0 分钟收集培养 的细胞，用5 倍体积p b s 悬浮细胞，细胞计数，同上离心洗涤细胞一次( 以下均 在0 - 4 操作) 。加5 倍细胞压积的溶液a 悬浮细胞沉淀，冰上溶胀1 0 分钟， 2 0 0 0 r p m4 离心1 0 分钟。加2 倍细胞压积( 溶胀之前的细胞压积) 的溶液a 悬 浮沉淀，用玻璃匀浆器匀浆，吸取少许用台盼蓝染色观察匀浆情况，当细胞核蓝 染达8 0 9 0 时停止匀浆，2 0 0 0 r p m4 离心1 0 分钟收集细胞核( s o r v a l ls s 3 4 转头) ，小心倒出上清，用s o r v a l ls s 3 4 转头1 5 0 0 0 r p m4 离心2 0 分钟压紧细 胞核沉淀，吸去上清得到粗核。按每1 0 9 细胞加入3 m l 溶液c 悬浮细胞核沉淀， 主曼堕塑垦至! 查堂塑主竺兰焦丝苎 用玻璃匀浆器4 c 匀浆1 0 次，冰上搅拌3 0 分钟抽提核蛋白。用s o r v a l ls s 3 4 转 头1 5 0 0 0 r p m4 c 离心3 0 分钟，转移上清至透析袋中，用5 0 倍体积的溶液d 透 析5 小时，上清用s o r v a l ls s 3 4 转头1 5 0 0 0 r p m4 c 离心2 0 分钟，上清即为核粗 提物( n u c l e a re x t r a c t ，n e ) ，分管冻存于液氮或一8 0 。 4 4 蛋白质定量 蛋白质定量按考马斯亮蓝比色法测定( 从1 0 9 细胞中可获1 5 2 0 m g 核蛋白) 。 5 多轮聚丙烯酰胺凝胶阻滞法富集调节片段 5 1e m s a 探针与h e p g 2 细胞核粗提物的第一轮凝胶阻滞实验： 用t e 稀释探针至1 0 n g u l ，取出l u l 进行凝胶阻滞分析，结合反应的条件 如下： 为了排除加样误差对实验结果的影响，各反应中相同的试剂均合并于一个 反应管中，再分装于各管。3 0 c 反应2 0 分钟后，上样于8 聚丙烯酰胺凝胶( 丙 烯酰胺甲叉双丙烯酰胺为2 9 ：1 ) 中，以o 5 t b e 为电泳缓冲液，1 5 0 v 恒压 电泳4 5 分钟，剥离凝胶后，用保鲜膜包裹，- 7 0 。c 放射自显影4 1 2 小时 5 2 d n a 探针与h e p g 2 细胞核粗提物的第二至五轮凝胶阻滞实验： 冲洗x 光片，按上述3 8 中的方法从第一轮凝胶阻滞实验的聚丙烯酰胺凝 胶中回收阻滞带d n a ，以此为模板进行p c r 扩增，扩增条件为： 灭菌水 1 0 p c r 缓冲液 3 3 m md a d g d t t p o l i g o d ( 5 0 p m o l u 1 ) 回收的阻滞带d n a a 一3 2 p d c t p ( 1 0 u c i u 1 ) 6 1 u 1 8 u l 3 u l 3 u l 2 u l 3 u l 9 5 。c 2 分钟，8 0 c 时加入如下反应液 一：型墼型些些篁丝些：一 灭菌水 1 8 u l 1 0 p f u 缓冲液 2 u 1 p f ud n a 聚合酶( 4 u u 1 ) 0 5 u l 9 5 。c3 0 秒、5 6 。c3 0 秒、7 2 。c2 0 秒，1 0 个循环后每增加5 个循环就从反应管 中取出5 u l ，上样于2 琼脂糖凝胶中，快速电泳观察p c r 扩增情况，当p c r 扩增 产物可见时暂停于7 2 。c 继续反应1 0 分钟。按上述6 7 和7 中的方法抽提、沉淀 d n a ，溶于l o u lt e 后，上样于8 聚丙烯酰胺凝胶( 丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺 为2 9 ：1 ) 中，1 5 0 v 恒压电泳l 小时，室温放射自显影3 0 分钟，从凝胶中挖取 d n a 探针，电洗脱回收、纯化d n a ，作为第二轮凝胶阻滞实验的探针。按第轮 的条件进行第二轮凝胶阻滞实验，如此重复共进行五轮凝胶阻滞实验。 5 3 富集后调节片段的p c r 大量扩增与回收纯化： 回收第五轮凝胶阻滞实验的阻滞带d n a ，以此为模板进行p c r 大量扩增，共 扩增血管，各管的反应条件如下： 灭菌水 l o p c r 缓冲液 2 m md n t p o l i g od ( 5 0 p m o l u 1 ) 回收的阻滞带d n a 6 4 u l 8 u 1 3 u 1 3 u l 2 u 1 9 5 。c2 分钟，8 0 4 c 时加入如下反应液 灭菌水 1 0 p f u 缓冲液 p f ud n a 聚合酶( 4 u u 1 ) 1 8 u 1 2 u 1 o 5 u l 9 5 。c 3 0 秒、5 6 。c 3 0 秒、7 2 。c2 0 秒，1 0 个循环后每增加五个循环就从反应管 中取出5 u l ，上样于2 琼脂糖凝胶中，快速电泳观察p c r 扩增情况，当p c r 扩增 产物可见时暂停于7 2 。c n 续反应1 0 分钟。酚氯仿、氯仿各抽提次，乙醇沉 淀、洗涤d n a ，溶于t e 中，电泳估计d n a 浓度。 6 d n a 调节片段质粒文库的构建 6 1 调节片段的酶切消化： 上述5 3 中纯化的人b a cd n ap c r 产物用限制性核酸内切酶x h oi 进行消 化，反应条件如下： 中国协和医科大学博士生学位论文 灭菌水 2 5 u l 1 0 缓冲液h 4 u l p c r 扩增产物 l o u l x h oi ( 1 0 u u 1 ) 1 u l 3 7 。c 反应l 小时，上样于1 5 琼脂糖凝胶，5 0 v 恒压电泳，用手术刀片挖出d n a 条带，q i a e xi i 试剂盒纯化d n a ，溶于4 0 u lt e 中。 6 2 质粒p u c l 9 的限制性消化 p u c l 9 质粒用限制性内切酶s a li 进行消化，反应条件如下 灭菌水 l o 缓冲液h p u c l 9 质粒d n a ( 4 u g ) s a li ( 1 0 u u 1 ) 3 0 u l 4 u 1 4 u 1 2 u l 3 7 。c 反应2 小时。用q i a e xi i 试剂盒纯化d n a 后，2 0 u l 灭菌水洗脱d n a 。 6 3 载体d n a 的去磷酸化处理”“： s a ti 酶切后纯化的p u c l 9d n a ，按以下条件进行去磷酸化处理 灭菌水 l o 碱性磷酸酶缓冲液 s a l i 酶切的p u c l 9 质粒d n a 碱性磷酸酶( 1 0 u u 1 ) 1 4 u 1 4 u 1 2 0 u 1 2 u 1 3 7 反应1 小时，用q i a e xi i 试剂盒纯化d n a ，2 0 u lt e 洗脱d n a 。 6 4 富含调节元件的人b a cd n a 与p u c l 9 载体的连接： 从上述纯化的x h oi 酶切的人b a cd n ap c r 产物和去磷酸化p u c l 9 载体d n a 中各吸取l u l ，上样于1 5 琼脂糖凝胶，电泳估计d n a 浓度，按以下条件进行连 接反应： 灭菌水 1 0 x 连接缓冲液 x h oi 酶切的p c r 产物( 2 0 n g ) 去磷酸化的p u c l 9 载体d n a ( 1 0 0 n g ) t 4d n a 连接酶( 5 u u 1 ) 3 0 u l 4 u l 2 u l 4 u l l u l 1 4 c 连接过夜。 主璺塑塑垦型查兰堡主竺兰堡堡窭 6 5 载体自身连接产物和目的片段多拷贝插入的连接产物的去除： 从上述连接产物中取出1 0 u l ，6 5 c 灭活1 5 分钟后，与如下试剂混合 灭菌水 1 0 缓冲液h s a li ( 1 0 u u 1 ) x h oi ( 1 0 u u 1 ) 7 u l 2 u l 0 5 u l 0 5 u 1 3 7 反应1 5 分钟，6 5 灭活1 5 分钟。 6 6d h 5 a 感受态细胞的制备与转化【6 习 感受态大肠杆菌的制备： 将大肠杆菌d h 5a 在l b 琼脂平板上划线培养1 4 小时，挑取单克隆接种于 5 m 1l b 培养基中，3 7 1 5 0 r p m 过夜培养。转移l m 细菌培养液至1 0 0 m l b 培 养基中，3 7 c2 0 0 r p m 培养2 5 小时。耿出细菌培养液，放于冰上l o 分钟，转 移至5 0 m l 离心管中，4 0 0 0 r p m4 离心1 0 分钟，弃上清，各管用1 0 m l 冰冷的 o 1 mc a c l ：悬浮细菌，冰上放置l o 分钟，4 0 0 0 r p m4 c 离心1 0 分钟，弃上清。 各管中加入2 m l 冰冷的0 1 mc a c ：悬浮细菌，4 保存备用。 连接产物转化感受态细菌： 吸取4 u l 连接产物与2 0 0 u l 感受态大肠杆菌d h 5a 混合，冰上放置3 0 分钟， 4 2 c 热休克9 0 秒钟，冰上放置2 分钟，加入8 0 0 u ll b 培养基，铺于3 7 预热 的含1 0 0 u g m l 氨苄青霉素的l b 琼脂平板，3 7 过夜培养。 7 d n a 调节片段的e m s a 筛选 7 1 单菌落的培养、菌种保存和质粒d n a 的小量制备【6 6 】： 从d n a 调节片段部分文库中随机挑耿单菌落，接种至5 m l 含1 0 0 u g m l 氨苄 青霉素的l b 培养基中，3 7 1 5 0 r p m 过夜培养。从各管中吸取8 0 0 u l 细菌培养 物，加2 0 0 u l8 0 无菌甘油，混匀后保存于一7 0 c 。取3 m 1 培养物，小量提取质 粒，保存于4 。 质粒d n a 的小量制备：在1 5m le p p e n d o r f 管中，加入过夜培养的菌液， 1 2 0 0 0r p m 离心3 0 秒，倾出上清，加入1 0 0 g l 含1 0 0g g m lr n a s e a 的溶液i ( 2 5 m mt r i s h c ip h 8 0 ，1 0m me d t a ，5 0m ms u c r o s e ) 振荡混匀，再加入2 0 0u l 溶 液i i ( 0 2 n n a o h ，1 s d s ) 混匀后室温变性5 分钟，加入1 5 0u l 溶液i i i ( 3 m n a a c p h4 6 ) 混匀于4 c 中和5 分钟， 1 2 0 0 0r p m 、4 。c 离心5 分钟，转移上清 至另e p p e n d o r f 管中，加lm l 无水乙醇，室温静置5 分钟，1 2 0 0 0r p m 、4 c 离 ，l i , 5 分钟，7 0 7 , 醇洗沉淀一次，室温晾干，沉淀溶于5 0u lt e 缓冲液中。 3 0 中国协和医科大学博士生学位论文 7 2 质粒d n a 的酶切鉴定： 取1 5 u l 质粒d n a ，按以下条件进行限制性核酸内切酶消化 灭菌水 l o 缓冲液k 质粒d n a h i n di i i ( 1 5 u u 1 ) b a m hi ( 1 2 u u ) 6 5 u l 2 5 u l l5 u 1 o 5 u 1 0 5 u l 3 7 消化2 小时，上样于1 5 琼脂糖凝胶，5 0 v 恒压电泳l 小时，3 0 2 n m 紫外 光透照灯上观察。 7 3 插入片段d n a 的回收： 在3 0 2 n m 紫外光透照下，挖取含插入片段d n a 的琼脂糖凝胶块，用q i a e xi i d n a 提取试剂盒回收d n a ，用2 0 u lt e 进行洗脱，电泳估计d n a 浓度。 7 4 插入片段d n a 的放射性核素标记： 吸取4 u l ( 约4 0 n g ) 回收的插入片段d n a ，按以下条件进行放射性核素标 记： 灭菌水 1 0 k l e n o w 片段缓冲液 回收的插入片段d n a k l e n o w3 e x o 一( 5 u u 1 ) 1 3 o u l 2 o u l 4 0 u l 0 5 u 1 o 一”p d a t p ( 1 0 u c i u 1 ) 0 5 u l 3 7 。c 反应3 0 分钟，6 5 灭活1 5 分钟。 7 5 插入片段的e m s a 筛选 从上述标记反应中吸取0 5 u l 用做凝胶阻滞实验的探针，吸取4 u 1 未标记 堕塑丛幽! 旦垡鱼星壁墨塞鱼! 坠：堡工姿叁鲑鲎堡塑壁堕堂塞坠! 灭菌水 6 5 u l 2 5 u 1 溶液d 1 1 o u l 1 1 o u l p o l y ( d l d c ) ( 1 u g u 1 )1 0 u l1 0 u 1 未标记的插入片段d n a o u l4 0 u 1 插入片段d n a 探针0 5 u l 0 5 u l 型! 塑堕垫塑堡塑! ! 坚墨尘! ! ! ：! 坚! ：! 坐 3 f 堕塑塑垦型奎堂壁圭竺堂篁笙奎 3 0 反应2 0 分钟，上样于6 聚丙烯酰胺凝胶( 丙烯酰胺甲叉双丙烯酰胺为6 9 ： 1 ) ，以0 5 x t b e 为电泳缓冲液，2 0 0 v 恒压室温电泳2 小时，一7 0 放射自显影 2 4 4 8 小时，冲洗x 光片，分析实验结果。 8 d n a 调节片段的初步分析 8 1d n a 调节片段的测序 挑选阻滞带可被自身d n a 特异竞争的克隆，送交上海博亚生物技术有限公 司，按双脱氧测序法进行d n a 自动测序。 8 2b l a s t 同源性分析 获得的d n a 序列用b l a s t 软件( 网址为蝇p ；型坠型：墼b i ：! ! 盟：! i h ：g ! ! ) 与互 连网上的g e n b a n k 等生物信息库进行比较分析。 8 _ 3d n a 上潜在反式作用因子结合位点的分析： 获得的d n a 序列用m a t l n s p e c t o r 软件与t f d ( t r a n s c r i p t i o nf a c t o r d a t a b a s e ) 生物信息库进行比较分析，寻找潜在的反式作用因子结合位点。主要 参数的设置为：核心序列( c o r es e q u e n c e ) 匹配指数为0 9 0 ，基质序列( m a t r i x s e q u e n c e ) 匹配指数为0 9 0 。所用网站的网址为 ( h t t p ：t m n s f a c g b f d e t r a n s f a c i n d e x h t m l ) 。 9 荧光素酶报告基因真核表达质粒在细胞中的瞬时表达及其酶活性的测定 9 1调节片段一荧光素酶报告基因重组质粒的构建 9 1 1 调节片段的酶切消化： 上述阻滞带可被自身d n a 特异竞争的、以p u t l 9 为载体的克隆，质粒提取 纯化后，用限制性核酸内切酶h i n d i i i 进行消化，反应条件如下： 灭菌水 1 0