（物理化学专业论文）炭载含血红素蛋白质的直接电化学研究.pdf

果。 学位论文独创性声明 本人郑重声明： 1 、坚持以“求实、创新”的科学精神从事研究工作。 2 、本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作和取得的研究成 3 、本论文中除引文外，所有实验、数据和有关材料均是真实的。 4 、本论文中除引文和致谢的内容外，不包含其他人或其它机构已 经发表或撰写过的研究成果。 5 、其他同志对本研究所做的贡献均已在论文中作了声明并表示了 谢意。 作者签名：墟 日 期：0 邋( ! 蛭! 左里 学位论文使用授权声明 本人完全了解南京师范大学有关保留、使用学位论文的规定，学校 有权保留学位论文并向国家主管部门或其指定机构送交论文的电子版 和纸质版：有权将学位论文用于非赢利目的的少量复制并允许论文进 入学校图书馆被查阅；有权将学位论文的内容编入有关数据库进行检 索；有权将学位论文的标题和摘要汇编出版。保密的学位论文在解密 后适用本规定。 作者签名： 日 期： 趁 j 出耻 摘要 摘要 2 l 世纪是能源的世纪。随着传统的化石燃料的日渐耗竭，新能源的开发和利 用正得到各国的广泛重视。燃料电池作为一种转化效率高和清洁的能量转换系统， 已成为当今科技界最热门的研究课题之一。 生物燃料电池是利用生物催化剂和生物燃料的一类燃料电池。生物燃料电池除 了有一般燃料电池的优点外，还有燃料来源广泛、价格低廉、操作条件温和、生物 相容性好等优点，因此，正在引起人们的关注。但目前生物燃料电池的发展还处在 初步的阶段，有许多难题有待解决。一个主要的问题是如何把生物催化剂牢固地固 定在电极上而又不发生变性。 本论文主要研究用平衡吸附法使含血红素的蛋白质，如细胞色素c ( c y t “肌 红蛋白( m b ) 、血红蛋白( h b ) 固定到活性炭上，研究了炭载含血红素的蛋白质的电化 学行为和对h 2 0 2 和0 2 还原的电催化活性及稳定性，为发展生物燃料电池的阴极催 化荆打下基础。主要研究结果如下： 1 用平衡吸附法制备炭载c y tc 、炭载m b 或炭载h b 修饰的玻碳( g c ) 电极，在它 们的循环伏安图中，都可观察到一对氧化还原峰，峰电位差在6 0 m v 左右，氧 化还原峰的峰电流基本相等，表明这三种炭载含血红素的蛋白质都能进行准可 逆的直接电化学反应。不同扫速时的循环伏安曲线测量表明，氧化峰或还原峰 峰电流与扫速成线性关系，说明反应是非扩散控制的，这证明了这三种含血红 素的蛋白质都已吸附到活性炭上。连续进行循环伏安扫描2 0 次，峰电流基本稳 定。把炭载含血红素的蛋白质的g c 电极在磷酸盐缓冲溶液中在4 。c 下浸泡7 d 后，测得的循环伏安曲线中的氧化还原峰峰电位和峰电流与电极制备后马上测 得的基本相同。这些结果都表明含血红素的蛋白质在炭上的吸附比较牢固。因 此，炭载c y tc 、m b 和h b 都能进行稳定的、非扩散控制的、直接的、准可逆 的电化学反应，它们的氧化还原式电位( 矿) 很相近，分别为3 6 1 、3 7 1 和3 6 9 m v 。 2 用n a t i o n 膜固定的炭载c y tc 、m b 和h b 能进行直接电化学反应的原因可能是 活性炭表面的含氧基团防止了它们的变性吸附，而含有磺酸基团n a t i o n 能使水 分子容易进入分子内部而促进了它们的电化学反应。 4 摘要 3 虽然c y tc 、m b 和h b 的标准氧化还原电位并不相同，但它们吸附到活性炭上 并用n a t i o n 膜固定后的p 基本相同，而且，文献报道同一种含血红素的蛋白 质阉定在不同基体上后的f 各不相同，表明微环境对含血红素的蛋白质的电化 学行为有较大的影响。 4 用n a t i o n 膜固定的炭载c y tc 、m b 和h b 对h 2 0 2 和0 2 还原有较好的电催化活 性，说明c y tc 、m b 和h b 吸附到活性炭上后，还能保持它们的生物活性，因 此，炭载c y t c 、m b 和h b 可用作为生物燃料电池的阴极生物催化剂。 5 用平衡吸附法制备n a t i o n 膜固定的炭载c y t c 、m b 和h b 的方法简单、制得的 生物催化剂对h 2 0 2 或0 2 还原有较好的电催化活性，因此，这是一种较好的生 物燃料电池阴极生物催化剂的制备方法。 关键词：生物燃料电池，细胞色素c ，肌红蛋白，血红蛋白，活性炭，n a t i o n 膜 直接电化学反应，阴极生物催化剂 a b s t r a c t a b s t r a c t 2 0c e n t u r yi sa ne n e r g ys o u r c ec e n t u r y w i t ht h eg r o w i n ge x h a u s t i o no ft h ef o s s i l f u e l s ，m a n yc o u n t r i e sa r ep a i dab i ga t t e n t i o nt ot h ed e v e l o p m e n ta n dt h ea p p l i c a t i o no f t h en e wk i n d so ft h ee n e r g ys o u r c e s t h ef u e l c e l la sac l e a ne n e r g yt r a n s f o r m a t i o n s y s t e mw i t ht h eh i g he f f i c i e n c yo fe n e r g yt r a n s f o r m a t i o nh a sb e e no n eo ft h eh o t i n v e s t i g a t i o np r o j e c t s t h eb i o f u e lc e l li sak i n do ft h ef u e lc e l lw i t l lt h eb i o e l e c t r o c a t a l y s ta n dt h eb i o f u e l e x c e p tt h ea d v a n t a g e so ft h eg e n e r a lf u e lc e l l ，b i o f u e lc e l li sp o s s e s s e do ft h em a n y a d v a n t a g e s ，s u c ha s t h ef u e l sw i t ht h ee n c y c l i cs o u r c ea n dl o wp r i c e ，o p e r a t i o n c o n d i t i o n sa tt h er o o mt e m p e r a t u r e ，t h eg o o db i o c o m p a t i b i l i t ye t c t h e r e f o r e ，i ti s b e i n gp a i dt h ea t t e n t i o n h o w e v e r ，a tp r e s e n t ，t h ed e v e l o p m e n to ft h eb i o f u e lc e l li si n t h ep r e l i m i n a r ys t e p ，t h e r ea r em a n yd i f f i c u l tp r o b l e m st ob es o l v e d t h em a i n p r o b l e mi st h a tt h eb i o e l e c t r o c a t a l y s ts h o u l db ef i r m l yf i x e do nt h ee l e c t r o d ew i t h o u t d e n a t u r a t i o n i nt h i st h e s i s ，t h ef i x a t i o no ft h eh e i n e c o n t a i n i n gp r o t e i n s ，s u c ha sc y t o c h r o m ec ( c y tc ) m y o g l o b i n ( m b ) a n dh e m o g l o b i n ( h b ) o nt h ea c t i v ec a r b o nu s i n gt h eb a l a n c e a d s o r p t i o n m e t h o dw a si n v e s t i g a t e d t h ee l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o ro ft h e h e i n e - c o n t a i n i n gp r o t e i n ss u p p o r t e do nt h ea c t i v ec a r b o na sw e l la st h e i re l e c t r o c a t a l y t i c a c t i v i t ya n dt h es t a b i l i t yf o rt h er e d u c t i o no f0 2o rh 2 0 2w e r es t u d i e d i tc o u l dl a yt h e f i r mf o u n d a t i o nf o rd e v e l o p i n gt h ec a t h o d i cb i o c a t a l y s t so ft h eb i o f u e lc e l l t h em a i n r e s u l t sa r ea sf u l l o w s ： 1 t h eg l a s s yc a r b o n ( g c ) e l e c t r o d e sm o d i f i e dw i t ht h ec a r b o n s u p p o r t e dc y tc m b a n dh bw e r ep r e p a r e du s i n gt h eb a l a n c ea d s o r p t i o nm e t h o d a p a i ro f r e d o xp e a k s c a nb eo b s e r v e di nt h e c y c l i cv o l t a m m o g r a mo f e a c h c a r b o n s u p p o r t e d h e m e 。c o n t a i n i n gp r o t e i n t h es e p a r a t i o no ft h ep e a kp o t e n t i a l si sa b o u t6 0 m v t h ec u r r e n t so ft h ea n o d i ca n dc a t h o d i cp e a k sa r ea l m o s tt h es a m e i ti n d i c a t e d t h a ta l lt h ee l e c t r o c h e m i c a lr e a c t i o n so ft h r e ec a r b o n s u p p o r t e dh e m e - c o n t a i n i n g 6 a b s t r a e t p r o t e i n s a r ed i r e c ta n dq u a s i - r e v e r s i b l e t h em e a s u r e m e n t so ft h ec y c l i c v o l t a r n m o g r a m sa tt h ed i f f e r e n ts c a nr a t e ss h o w e dt h a tt h ea n o d i ca n dc a t h o d i cp c a l 【 c u r r e n t sa r ep r o p o r t i o n a lt ot h es c a nr a t e i ti n d i c a t e dt h a ta l lt h ee l e c t r o c h e m i c a l r e a c t i o n sa r en o tc o n t r o l l e dw i t ht h ec o n f u s i o na n dd e m o n s t r a t e dt h a te a c h c a r b o n s u p p o r t e dh e m e c o n t a i n i n gp r o t e i ni sa d s o r b e do nt h ea c t i v ec a r b o n i t w a sf o u n dt h a ta f t e r2 0c o n t i n u o u sc y c l e s ，t h ep e a kc u r r e n ti ss t i l ls t a b l e a f t e rt h e g ce l e c t r o d em o d i f i e dw i t he a c hc a r b o ns u p p o s e dh e m e c o n t a i n i n gp r o t e i ni s i m m e r s e di nt h ep h o s p h a t eb u f f e rs o l u t i o na t0 cf o r7d a y s ，t h er e d o x p e a kc u r r e n t s a r ea l m o s tt h es a m ea st h a tb e f o r et h ei m m e r s i o n a i lt h ea b o r er e s u l t si l l u s t r a t e d t h a tc a r b o ns u p p o r t e dc y tc ，m ba n dh bc a nu n d e r g oas t a b l e ，n o n - d i f f u s i o n c o n t r o l l e d ，q u a s i r e v e r s i b l ea n dd i r e c te l e c t r o c h e m i c a lr e a c t i o n s t h e i rf o r m a l p o t e n t i a l s ( 酽) a r es i m i l a r t h e ya r e 一3 6 1 、一3 7 1 和3 6 9 m v ，r e s p e c t i v e l y ，f o rt h e c a r b o ns u p p o r t e dc y tc ，m ba n dh b 2 t h er e a s o nf o rt h a tt h en a t i o nm e m b r a n ef i x e d ，c a r b o n s u p p o r t e dc y tc ，m ba n dh bc a l l u n d e r g o t h e q u a s i r e v e r s i b l e e l e c t r o c h e m i c a lr e a c t i o n s m a yb e a t t r i b u t e dt ot h a tt h e o x y g e n c o n t a i n i n gg r o u p so nt h es u r f a c eo f t h ea c t i v ec a r b o nc a np r e v e n tf r o mt h ed e n a t u r a t i o n a d s o r p t i o no fc y tc ，m b ，h ba n ds u l p h o n i ca c i dg r o u p c o n t a i n i n gn a t i o nm a k e sw a t e re a s yt o e n t e ri n t ot h eh e m e c o n t a i n i n gp r o t e i n ，l e a d i n gt ot h a tt h e i re l e c t r o c h e m i c a lr e a c t i o n sa r e p r o m o t e d 3 a l t h o u g ht h es t a n d a r dr e d o xp o t e n t i a l so f c y tc ，m ba n dh ba r ed i f f e r e n t ，p o f t h e n a t i o nm e m b r a n ef i x e d ，c a r b o ns u p p o r t e dc y tc ，m ba n dh ba r ea l m o s tt h es a m e i na d d i t i o n ，i tw a sr e p o r t e di nt h el i t e r a t u r e st h a tp o fa h e m e c o n t a i n i n gp r o t e i n f i x e do nt h ed i f f e r e n tm a t r i x e sa r ed i f f e r e n t t h e s er e s u l t s i n d i c a t e dt h a t m i c r o e n v i r o n m e n tc o u l ds i g n i f i c a n t l ya f f e c tt h ee l e c t r o c h e m i c a lb e h a v i o r so ft h e h e m e c o n t a i n i n gp r o t e i n s 4 t h en a t i o nm e m b r a n ef i x e d ，c a r b o ns u p p o r t e dc y tc ，m ba n dh bs h o w e dt h eg o o d e l e c t r o c a t a l y t i ca c t i v i t yf o rt h er e d u c t i o no f0 2o rh 2 0 2 ，i n d i c a t i n gt h a tt h ec a r b o n s u p p o r t e dc y tc ，m ba n dh bc a nk e 印t h e i rb i o a c t i v i t i e s t h e r e f o r e t h ec a r b o n s u p p o r t e dc y tc ，m ba n dh bc a nb eu s e da st h ec a t h o d i cb i o c a t a l y s t so ft h eb i o f u e l 了 a b s t r a c t c e l l 5 t h ep r e p a r a t i o no f t h en a t i o nm e m b r a n ef i x e d ，c a r b o ns u p p o r t e dc y tc ，m ba n dh b u s i n gt h eb a l a n c ea d s o r p t i o nm e t h o di ss i m p l e t h en a t i o nm e m b r a n ef i x e d ， c a r b o ns u p p o r t e dc y tc ，m ba n dh bo b t a i n e ds h o w e dt h eg o o de l e c t r o c a t a l y t i c a c t i v i t yf o rt h er e d u c t i o no f0 2o rh 2 0 2 t h e r e f o r e ，i ti sag o o dm e t h o df o r p r e p a r i n gt h ec a t h o d i cb i o c a t a l y s to ft h eb i o f u e lc e l l k e y w o r d s ：b i o f u e lc e l l ，c y t o c h r o m ec ，m y o g l o b i n ，h e m o g l o b i n ，a c t i v ec a r b o n ，n a t i o n m e m b r a n e ，d i r e c te l e c t r o c h e m i c a lr e a c t i o n ，c a t h o d i cb i o c a t a l y s t 8 第一章绪论 1 1 生物燃料电池 第一章绪论 2 1 世纪是能源的世纪。随着传统的化石燃料的日渐耗竭，新能源的开发和利 用正得到各国的广泛重视。燃料电池作为一种能量转化效率高、清洁的理想能量转 换系统，由于能够很好地解决能源资源的综合利用和环境污染这两大可持续发展的 问题，已成为当今科技界最热门的研究课题之一。 生物燃料电池是利用酶、蛋白质等生物催化剂和生物燃料的一类特殊的燃料电 池 1 3 】。生物燃料电池除了有一般燃料电池的优点外，还具有如下特点： 1 燃料来源广泛，价格低廉 生物燃料电池可以利用一般燃料电池所不能利用的多种有机、无机物质作为燃 料，甚至可利用光合作用或直接利用含生物燃料的污水等作为其燃料。当以含生物 燃料的污水为原料时，生物燃料电池具有了双重功能，即在处理污水的同时，利用 污水中的废物作为燃料发电。 2 操作条件温和 由于酶催化反应在常温、常压下就能进行，因此生物燃料电池一般在常温、常 压、接近中性的环境下工作，因此电池维护成本低、安全性强。 3 生物相容性 由于生物燃料电池用酶、蛋白质等生物催化剂和葡萄糖等燃料，因此有很好的 生物相容性。如利用人体内的葡萄糖和氧为原料的生物燃料电池可以直接植入人 体，作为心脏起搏器等人造器官的电源。 生物燃料电池可分为间接型和直接型生物燃料电池两种。间接型生物燃料电池 是通过电子传递媒介体的作用来实现燃料的氧化。在生物燃料电池发展的前期，占 主导地位的是间接型生物燃料电池，并得到了较好的发展。如美国得克萨斯大学的 生物工程学家h e l l e r 等 4 利用导电聚合物作为分子导线，通过聚阴离子和聚阳离 子间的静电作用将作为阳极催化剂的葡萄糖氧化酶和作为阴极催化剂的胆红素氧 化酶分别固定到2 根长2c m 、直径7 岬的碳纤维上，获得可在植物体内工作的微 9 第一章绪论 型单室生物燃料电池，工作电压高达o 5 2 v ，功率密度为4 3 “w m m 2 。w i l l n e r 等 【5 ，6 用一种媒介体、葡萄糖氧化酶和细胞色素c 氧化酶分别为阳极和阴极生物催化 剂制得了可作电化学开关的生物燃料电池。 尽管媒介体能有效地提供电子迁移的途径，但是有电子传递链长，制各工序繁 杂和寿命短等弱点，因此，近年来，开始研究基于酶、蛋白质等的直接电子传递的 直接型生物燃料电池。在直接型的生物燃料电池中，最大的问题是在把酶固定在电 极上时要不变性，而且能在没有媒介体的情况下，进行直接电化学反应。 大多数酶和蛋白质具有庞大的三维空间立体结构，电活性中心深埋于其分子内 部，仅仅是酶或蛋白质外面肽链的厚度就己超出电子隧道距离，所以酶和蛋白质与 电极间难以直接交换电子，另外，溶液中的酶易吸附在电极表面而变性、失活，因 此，酶的固定化是保持酶的活性、提高酶的稳定性的有效途径。通过选择合适的电 极材料和固酶载体及固酶方法，可在电极表面构筑仿生微环境，实现酶在电极表面 的固定，从而能使酶与电极间进行直接电子传递，并大幅度提高电子传递速率 7 1 0 】。已报道过的固酶载体有有机高分子载体( 如琼脂、海藻酸钠和球状纤维素 单宁树脂等) 、无机载体( 如碳纳米管、多孑l - - - 氧化硅珠等) 和复合载体等 1 3 ，i i 】。 固载的方法随载体的不同而变化，这方面的工作是比较困难的。迄今为止，只有很 少关于固载酶直接电化学的报道；有些固载酶的稳定性不好，容易失活；有些载体 材料本身就没有生物相容性；有些固载方法很复杂等。由此可看出，研究酶和蛋白 质的固定方法和它们的直接电化学对发展生物燃料电池是非常重要的。 鉴于上述情况和课题组过去工作的基础，本论文主要研究用平衡吸附法制备炭 载c y tc 、m b 和h b ，并研究它们的直接电化学行为，为发展生物燃料电池的阴极 生物催化剂打下基础。 1 2c y tc 直接电化学研究概况 1 2 1 研究生物分子直接电化学的意义 二十世纪七十年代以来，随着人们对生命现象和生命过程理解的不断深入，认 识到生命过程的核心问题是能量转换，而生物体内的能量转换依赖于生物体内的电 1 0 第一章绪论 子迁移反应，因此，人们越来越关注生物大分子和电极之间的电子转移过程。通过 对生物大分子电子传递反应的研究，可以获得它们的热力学和动力学参数，为进一 步理解生物体内能量转换和电子传递反应机理提供重要信息，同时还为发展新型实 用的生物电化学传感器和生物燃料电池奠定基础。然而许多在生物体内具有氧化还 原性质的蛋白质在金属电极上的电化学反应是十分不可逆的，所以人们更加关注生 物大分子在电极上的直接电化学反应。由于c y tc 分子较小，对它的结构已了解得 比较清楚，因此，对c y tc 的直接电化学研究进行得最早，有关的报道最多。 1 2 2c y tc 分子结构 c y tc 是1 8 8 4 年首先为英国光谱学家m a c m u n n 发现的。直到四十多年后，1 9 2 5 年k e i l i n 对一系列动物组织和微生物进行了详尽的研究才重新证实了c y tc 的存 在。 c y tc 存在于所含线粒体呼吸链的生物体内，位于线粒体的内外膜之间的细胞 液中。c y tc 由血红素和包裹着血红素的肽链组成，肽链可由8 2 到1 3 4 个氨基酸残 基组成，血红素可看作是它的核心。c y tc 中血红素的铁离子可以在正二价和正三 价之间互变，从而在生物体内起着电子传递的作用f 1 2 。由于铁的价电子参与卟啉 环的大n 键，因此从任何方向进入卟啉环的电子或者从卟啉环上流出的电子最终都 体现在铁离子的氧化还原上。c y tc 的铁离子无论二价还是三价都处于低自旋状态， 高铁c y tc 是顺磁性分子，而亚铁c y tc 是抗磁性分子。含有三价铁离子的c y tc 被称为高铁c y tc ，或氧化型c y tc ，由亚铁离子组成的c y tc 被称为亚铁c y tc ，或 还原型c y tc 。 已经确定了几十种甚至近百种生物物种的c y tc 的氨基酸顺序。d i c k e r s o n 在 1 9 6 3 年发表了c y tc 的三维空间结构，对不同c y t c 的三维结构和生物活性、功能 结构和性质等进行了广泛的研究。以马心c y tc 为例，它是由一条1 0 4 个氨基酸残 基组成的肽链和一个与之共价相连的血红素基团组成 1 3 】。血红素位于c y tc 分子 中肽链的裂缝之内，并被肽链包围，处于疏水环境中，仅有一裂缝使血红素的部分 边缘可与溶液相接触，此暴露的面积仅占整个分子面积的o 6 ，这一区域被认为 是c y tc 分予反应的活性区域 1 4 】。图1 1 为c y tc 的结构简图。 第一章绪论 c y tc 分子的形状近似于球状，直径约为3 4 a ，是一平孛高度离子化 的分子。在溶液p h = 7 5 时，它的氧化态和还原态分别带有9 个和8 个正电荷，其 表面电荷分布是不均匀的，带有正电荷的氨基酸强基( 如赖氨酸残基j 分布于分子 的反应活性区域附近，而带负电荷的氨基酸残基则处于裂缝的另侧。 圈1 1c y l c 的结构簿图 1 9 7 2 年由d i c k e r s o n 等提出的x 射线衍射的结果最终明确表明铁离子与硪s 1 8 中的咪唑氮原子和m e t - 8 0 中的硫原子配位。所有哺乳动物的c y tc 都有这种配位， 在氧化态和还原态c y tc 中也都是这种配位。f e s 配位键在c ”c 中十分重要，它 对于环境和条件的变化特别敏感，它可以显示c y tc 分子的完整性和稳定性。c y tc 中铁的配位状况可用图12 表示： 第一章绪论 h ，c 、，s c h ， 眦- - 笈, , ：1i 建i , - 。h ，1 ： “。f e 掣善hh 冬炒h 雠一。；刍8 、：矿之、c n 。f ：。 c h 2 c 0 ，一南、， h o o cc o o h ，一乙h 、一 图1 2 c y tc 中铁的配位状况 1 2 3c y tc 电化学反应的促进剂研究 虽然c y t c 在生物体内能进行可逆的氧化还原反应，但它在金属电极，如h g 、 p t 、a u 、a g 等电极上的电化学反应却是不可逆的。这是由于c y tc 氧化还原中心， 血红素基团被多肽链包围，阻碍了电子转移。其次，c y tc 分子的高离子特性和表 面电荷的非对称分布，常使其活性区域不能向着电极表面而进行电化学反应。第三， c y tc 易在金属电极表面上产生变性吸附，妨碍了溶液中的c y tc 的电化学反应。 另外，在一般的c y tc 的样品中，常含有能强烈吸附在电极表面的少量多聚体杂质， 也阻止了c y tc 的电化学反应。 媒介体是一类通过其本身的电化学反应来使生物分子进行氧化还原反应的物 质。在媒介体，如亚甲蓝、甲基紫精、黄素腺嘌呤二核苷酸等的存在下，c y tc 电 化学反应的可逆程度大大增加，但由于媒介体在所研究电位范围内也发生氧化还原 反应，这会对研究c y tc 的电化学反应带来干扰。 早在1 9 7 7 年，h i l l 研究小组 1 5 发现4 , 4 联吡啶在所研究的电位范围内不发 生任何电化学反应，但它能促进c y t c 的电化学反应。这类物质被称为生物分子电 化学反应的促进剂，在促进剂作用下的生物分子的电化学反应被称为直接电化学反 应。在研究了五十余种有机小分子促进剂的基础上，h i l l 等【1 6 】根据促进荆的结构 特点，提出了作为c ”c 电化学反应的促进剂分子应为具有双功能团结构，即x y 构型，如图1 3 ( a ) 所示。其中x 为表面活性基团，能强烈吸附在电极表面上，通常 第一章绪论 为n 、s 等原子；y 为中性或阳离子基团，能与反应活性区附近的赖氨酸残基形成 氢键或盐桥，在c y tc 和电极之间形成电子迁移通道，从而有利于电荷传递的进行。 y y y - - 叶 y y 丫 图1 3 ( a ) h i l l 提出的双功能团分子促进剂模型，( b ) 2 , 2 - 联吡啶在电极表面吸附示意图 但是，陆天虹小组 1 7 】发现，过去认为不能加速c y tc 电化学反应的物质，如 2 ，2 联吡啶及吡嗪分子 1 8 】也具有促进剂的作用，表面增强拉曼光谱的研究表明， 2 , 2 一联毗啶在金电极表面的吸附具有顺式结构，如图l3 ( b ) 所示，这一吸附模型相 当于只有一个功能团，因此提出具有单功能团有机小分子也可能对c y tc 具有促进 作用。这一发现修正了h i l l 提出的x y 双功能团结构模型。进一步研究表明，具 有单功能团的分子如吡啶、咔唑和噻吩等均对c y t c 的电化学反应具有较好的促进 作用【1 9 】。但是象四氢噻吩这样的物质却没有促进作用，说明分子中的共轭n 键起 了重要作用。 除了上述提到的有机化合物能促进c y tc 的电化学反应之外，无机物也能起到 促进作用 2 0 2 3 。早在1 9 7 7 年，y e h 和k u w a n a 2 4 就报道了在掺锡的氧化铟电极 上得到了c y tc 准可逆的电化学反应。此后，用金属氧化物电极来研究生物分子的 电化学一直受到人们的关注。金属氧化物能促进c y tc 电化学反应的主要原因是其 表面带负电荷，因而有利于c y tc 带正电荷的活性区域一端靠近电极表面而使c y t c 电化学反应容易进行 2 5 1 。研究过的c y tc 的金属氧化物促进剂有l n 2 0 3 、s n 0 2 、 r u 0 2 等。 与金属氧化物类似，碳电极，尤其是热解石墨表面存在含氧功能团，如羧基。 羰基、酚基及类脂基团等，这些基团也是电负性的，因而也能起c y tc 电化学反应 的促进剂的作用 2 6 3 5 。 1 4 4f1；1q1 ；5；一 x x x x q寸鬟n77q1 第一章绪论 其它类型的无机物促进剂主要包括杂多酸1 2 0 1 、卤素离子等。用电化学方法制备 的聚合物修饰电极对c y tc 也具有促进作用 3 6 - 3 7 】。这类电极性能稳定，逸一特征 将有利于聚合物修饰电极在传感器方面的应用。一些固体材料，如纳米离子材料对 于c y tc 也具有较好的促进作用【3 8 。 c y tc 能催化0 2 、h 2 0 2 j 1 有机过氧化物的还原 3 9 4 1 。 w c y t c 对0 2 和h 2 0 2 还 原的催化作用，使人们越来越重视它在生物燃料电池和传感器方面的潜在应用 4 2 ，4 3 。 1 2 4 促进剂对c y tc 直接电化学反应的促进机理 通过对c y tc 电化学反应的促进剂的研究，人们提出了几种促进剂对c y tc 直 接电化学反应的促进机理。 1 快速吸附一解附模型 a l b e r y 等 4 4 1 认为c y tc 在促进剂修饰电极上的反应经历了反应物和产物在电 极表面的快速吸附和脱附，这与呼吸链中所进行的生理氧化还原物质间的相互作用 相似。并提出了以下电子传递反应机理： c y tc ( 1 1 1 ) 一c y tc ( i i i ) 。由本体扩散到电极表面 c y tc ( i i i ) 。一c y tc ( i i i ) a d 。 在电极表面发生吸附 c y tc ( 1 1 1 ) 。d 。一c ”c ( i i ) 。d s进行电子交换反应 c y tc ( i i ) a d 。一c y t c ( i i ) o 产物在电极表面的脱附和吸附 c y tc ( i i ) o - - c y tc ( i i ) 产物由电极表面扩散向溶液本体 反应式中c y tc ( i i i ) 和c y tc ( i i ) 分别代表高铁c y tc 和亚铁c y tc ，该模型认为 c y tc 在4 , 4 - 联毗啶修饰电极上n n 应物，及溶液本体中的c y tc 和产物，及吸附 在电极表面上的反应后的c y tc 都能在电极表面进行快速吸附和脱附过程。 2 非变性吸附模型 n i k i 等 4 5 1 探讨了几种4 ，4 - 联吡啶衍生物促进剂在c y tc 电子传递中的作用， 得出c y tc 在电极表面至少存在如图1 4 所示的三种吸附类型。 第一章绪论 舳乳 渺 t y p ei u tyoetype蕊 图1 4 促进剂吸附模型 o 5 0 m v 第一种类型：促进剂在电极上的吸附能力弱，当将c y tc 和促进剂共存于溶液 中时，c y tc 优先吸附到金属电极表面并发生变性。这种情况与c y tc 在一般金属 电极上的吸附情况相似，因而c ”c 的电化学反应是不可逆的。 第二种类型：这类促进剂在电极表面具有较强的吸附能力，促进剂分子与c y t c 分子在电极表面会发生竞争吸附。如n i k i 小组利用多种光谱技术证实了4 , 4 联 吡啶促进剂分子和c y tc 共吸附在电极表面，此时c y tc 的氧化还原反应在电位 2 0 0 m v 左右。 第三种类型：促进剂强烈地吸附在电极表面，如4 ，4 二硫联毗啶，这时c y tc 与吸附于电极表面的促进剂键合，形成非变性的c y tc 分子吸附层，且c y tc 氧化 还原电位发生在o v 左右a 这类促进剂修饰于电极表面上后，性能稳定，促进效果 很好。 由此可见，c y tc 在金属电极表面发生变性吸附时会产生较大过电位而使得电 化学反应难以进行，c y tc 只有在促进剂修饰电极表面发生非变性吸附时，才可以 获得它的准可逆的电化学反应。 3 静电作用模型 陆天虹研究组发现卤素离子能促进c y tc 的电化学反应 4 6 】，其中以碘离子的 促进作用最好，表面增强拉曼光谱的研究结果表明，c y tc 在碘离子修饰的电极表 面上是以低自旋方式存在的，与本体溶液中c y tc 的状态相同，这表明c y tc 分子 在碘离子修饰的金电极上并没有发生变性吸附。 他们根据c y t c 的结构特点和碘离子的吸附特性提出了一个以静电作用为基 第一章绪论 础的模型。c y tc 是一种表面电荷分布极不对称的分子，正电荷分布于分子前部的 活性反应区域，而大多数负电荷分布在分子的背面。当碘离子修饰于金电极表面时， 电极表面荷负电，由于静电作用，c y tc 将以带正电荷的一端接近电极表面，而使 其活性部位与电极表面比较接近，所以c y tc 能发生准可逆的电化学反应。而当金 电极表面未被碘离子修饰时，金电极表面荷正电，由于静电作用使c y t c 分子以荷 负电的一端趋近于电极表面，这样使c y tc 分子的氧化还原活性部位就远离了电极 表面，因而使c y tc 表现出不可逆的电化学性质。后来，有人用双电层电场法使 c y tc 以固定的取向吸附到g c 电极表面上，c y tc 在电极表面的取向影响了它的电 化学性质 4 7 5 0 1 ，当g c 电极带负电荷时，c y tc 能进行准可逆的电化学，当g c 电极表面带有正电荷时，c y tc 以另一种取向吸附到电极表面上，这一取向使c y t c 分子成为电化学非活性的，这一结果进一步支持了静电作用模型。 1 3m b 直接电化学研究概况 1 3 1m b 分子的结构简介 m b 属于一种较小的血红素蛋白，存在于肌肉细胞中，是哺乳动物肌肉中的储氧 蛋白。在潜水哺乳类如鲸、海豹和海豚的肌肉中含量特别丰富，以致使它们的肌肉 呈棕色。由于m b 储氧并加速氧透过细胞的扩散速度，使这些动物能长时间潜在水 下。不同物种的m b 的氨基酸排列顺序非常相似，其中以对鲸的m b 的研究为最多 。x 一射线衍射研究表明，抹香鲸m b 是由一条肽链和一个血红素辅基构成的，如 图1 5 所示，分子量约为1 7 5 0 0 ，含1 5 3 个氨基酸残基 5 l 】。 一般认为，m b 分子比c y tc 分子大，而且m b 分子中的血红素比c y tc 分子中 的更深的埋在肽链内部 5 2 ，使得它的电化学反应比c y tc 更难进行，如在汞、金 5 3 和铂 5 4 】等电极上电化学反应都是极不可逆的，同时表面增强拉曼光谱表明， m b 在金属电极上会发生强烈吸附而变性，阻碍了溶液中m b 的电子传递，所以对 m b 的电化学研究远少于c y t c 。 第一章绪论 图1 5x 射线晶体结构分析抹香鲸m b 的分子结构 1 3 2m b 电化学反应促进剂研究 为了获得m b 的电化学反应，象c y tc 样，人们尝试寻找一些媒介体修饰于 电极表面来研究m b 的电化学反应，如在甲基紫精修饰的金网电极上获得了抹香鲸 m b 的电化学f 5 5 ，在聚香精a 修饰的铂电极 5 6 】，灿烂甲酚蓝修饰的铂网电极【5 4 】 等媒介体修饰电极上，研究m b 的电子传递过程。 k i n g 和h a w k r i d g e 5 7 用循环伏安法在掺锡的导电玻璃电极上得到了m b 的电 化学反应，峰电位差约为5 0 0 m v ，其氧化电流明显低于还原电流。同时发现溶液 中0 2 的存在对于m b 的电化学反应的影响很大。在各种m b 分子中只有亚铁m b 才能可逆地与氧以配位的形式键合。1 9 9 2 年，t a n i g u c h i 在导电玻璃上获得了纯化 的马心m b 准可逆的循环伏安响应，f 为o 0 5 6 v ( v s s h e ) ，与m b 的标准氧化还 原电位一致。并指出，m b 的进一步提纯是获得其准可逆氧化还原反应的主要原因。 未经进一步提纯的m b 样品中含有低聚体或脱辅基m b ，这些低聚体分子强烈吸附 到电极表面从而阻止了溶液中的m b 进行可逆的电化学反应。 r u s l i n g 等人 5 8 - 6 0 获得t m b 在热解石墨电极上一种表面活性剂，双十二烷基 二甲基溴化氨( d d a b ) 膜中的直接电子传递反应。同时在铂、锡掺杂氧化铟以及 金电极f l q d d a b 膜中也得到了类似结果 6 1 6 5 1 。如果没有表面活性剂存在，只有当 m b 经色谱纯化且必须在亲水的锡掺杂的氧化铟或热解石墨电极上才能观察到m b 第一章绪论 的电化学反应。反射红外光谱和x 一射线光电子能谱表明，当电极暴露于未经进一 步纯化的m b 溶液中时，电极表面存在蛋白质吸附物，这些吸附物阻止了电极与溶 液中的m b 或f e ( c n ) 6 3 - 电子传递。作者指出强烈吸附于电极表面的活性剂可能加速 了d d a b 膜中m b 的电化学反