（蔬菜学专业论文）黄瓜韧皮液中的mRNA和蛋白质对油菜素内酯的响应研究.pdf

浙江大学硕士学位论文摘要 摘要 油菜素内酯( b r s ) 是一种新型的类甾醇激素，除了在植物生长发育方面起重 要的作用外，在植物对生物和非生物逆境的抗逆反应调控中扮演着重要的角色。研 究蔬菜等农作物韧皮液中的基因、蛋白等物质对b r s 的响应不仅对于揭示植物地上 部和地下部间通过信号通讯协同植物生长、发育、抗逆等反应的机制具有重要的理 论意义，而且对于蔬菜作物生长发育及抗性调控途径的探索也具有一定的现实意义。 本文以主要设施蔬菜黄瓜为研究对象，从韧皮液m r n a 和蛋白质物质的运输着 手，通过结合利用消减杂交技术( s s h ) 和r t - p c r ( r e a l t i m ep c r ) 技术，从黄瓜 韧皮液中克隆获得了一系列黄瓜代谢途径中对表油菜素内酯( e b r ) 响应的关键基 因；研究还从蛋白质组学方面，利用2 d p a g e 技术迸一步研究了响应e b r 的黄瓜 韧皮蛋白，并就e b r 对黄瓜生长发育及抗性的影响机制进行了探讨。所取得的主要 结果如下： 1 ) 在e b r 对黄瓜韧皮液r n a 转录本影响的研究过程中，构建了黄瓜韧皮液 受e b r 处理之后的消减抑制杂交( s s h ) 文库，共获得6 5 0 个克隆，随机2 6 0 个克 隆进行测序分析，得到2 8 个独立基因，根据b l a s t x 分析推测这些基因编码的蛋 白功能，可以分为能量与光合作用，运输通道，蛋白合成，细胞骨架，细胞分裂和 分化，激素响应及逆境调控和其它相关的7 大类，其中参与胁迫响应的基因占较大 比侧，表明e b r 诱导了抗性相关基因，生长素和茉莉酸响应基因在s s h 文库中出 现，表明e b r 可能与其它植物生长物质互作。 2 ) e b r 处理黄瓜叶片6h 后，编码c 6 0 、c 4 5 3 、c 5 6 8 、c 6 8 1 、c 5 7 9 、c 5 9 4 、 c 5 6 4 、c 6 2 3 、c 6 3 7 、 c 4 2 0 等基因的表达均上调，说明e b r 促进了这些基因的表 i 达。 3 ) 韧皮蛋白双向凝胶电泳结果表明e b r 处理叶片6h 后，韧皮液中蛋白组成 发生了明显的改变，2 8k d a 蛋白点表达明显高于对照，另外三个蛋白点( 6 0 k d a 、 7 5k d a 、9 5k d a ) 则明显弱于对照，说明e b r 可能影响了相关基因的表达，促进 或抑制了蛋白的合成并通过韧皮部运输到其他器官。 综合以上结果我们认为，表油菜素内酯促进了黄瓜韧皮液中特定m r n a 和蛋白 i l 浙江大学硕士学位论文 摘要 表达的变化，m r n a 和蛋白通过韧皮液运输到其它生长器官，调控植物的生长发育 及抗性。 关键词：黄瓜，韧皮液，长距离运输，消减抑制杂交文库，双向凝胶电泳，信号运 输，抗性 i l l a b s t r a c t b r a s s i n o s t e r o i d s ( b r s ) ，an e w k i n do fs t e r o i d a lh o r m o n e sp l a yi m p o r t a n tr o l e sn o t o n i vi np l a n tg r o w t ha n dd e v e l o p m e n tb u ta l s oi nr e s p o n st ob i o t i ca n da b i o t i cs t r e s s e s t h ep l a n tl o n g d i s t a n c et r a n s l o c a t i o ns y s t e m sp l a y e dac r i t i c a lr o l ei nt h ed e v e l o p m e n to f a ne f f e c t i v ew h o l e p l a n tc i r c u l a t o r ya n dc o m m u n i c a t i o nn e t w o r k s t u d y i n gt h er e s p o n s e o fp h i o e ms a pm r n a sa n dp r o t e i n st ob r sm a yb eh e l p f u lt or e v e a lt h er o l e so fp h l o e m i n f o 册a t i o nn e t w o r ki nc o o p e r a t i n gp l a n tg r o w t h ，d e v e l o p m e n ta n ds t r e s s t o l e r a n c e b e 铆e e na e r i a la n du n d e r - g r o u n do r g a n s t h es t u d yi sa l s oo fs i g n i f i c a n ti m p o r t a n c ef o r d e v e l o p m e n t i n gm e t h o d s t oi m p r o v es y s t e m i c a l l yt h ew h o l e p l a n ts t r e s sr e s i s t a n c e c u c u m b e r ( c u c u m i ss a t i v u sl ) w a su s e dt os t u d yt h eb r s - r e g u l a t e dm r n a s a n d p r o t e i n si np h l o e ms a p t h r o u g ht h ee s t a b l i s h m e n to fs u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v el i b r a r y i n t e r r o g a t e db yb i o i n f o r m a t i ct o o l s ，t h o s et r a n s c r i p t ss p e c i f i c a l l ye x p r e s s e di nr e s p o n s e t oe b ri n t h em e ta _ b o l i cn e t w o r ko fc u c u m b e rw e r ei n d e n t i f i e d t h er e l i a b i l i t y o ft h es u p p r e s s i o n s u b t r a c t i v el i b r a r yw a sa l s ov e r i f i e db yu s i n gr t - p c rm e t h o d m e a n w h i l e ，c h a n g e si n p r o t e o m eo fp h l o e ms a pa f t e re b r t r e a t m e n tw e r es t u d i e db y2 d p a g e t h ef i n d i n g sa r e a sf o l l o w s ： 1 、ac d n al i b r a r yo fg e n e sw h i c hw e r ep r e f e r e n t i a l l ye x p r e s s e d i nt h ee b r - t r e a t e d p h i o 弓ms 印w a sc o n s t r u c t e db ys u p p r e s s i o ns u b t r a c t i v eh y b r i d i z a t i o n ( s s h ) t os t u d y t h e e f f e c t so fb r so nm et r a n s c r i p t si nc u c u m b e rp h l o e ms a p ，6 8 0c l o n e sw e r eo b t a i n e d ，a n d 2 6 0c i o n e sw e r er a n d o m l ys e l e c t e df o rs e q u e n c i n g ，r e s u l t i n gi n2 8u n i q u et r a n s c r i p t sa n d f a l lt h e mi n t os e v e nc a t e g o r i e sa f t e ra n a l y z e db yb l a s t xa n dg o ：e n e r g yg e n e r a t i o n a n dp h o t o s y n t h e s i s t r a n s p o r t a t i o nc h a n n e l s ，t r a n s p o r t a n ds y n t h e s i so fp r o t e m ， c y t o s k e l e t o n ，c o n t r o lo fc e l ld i v i s i o n ，h o r m o n er e s p o n s ea n dr e g u l a t i o no f s t r e s sr e s p o n s e t h eh i g ho c c u r r e n c eo fs t r e s sr e l a t e dg e n e si n t h es s he d n al i b r a r yp o i n t st o a n i m p o r t a n tr o l e so fb r si n s t r e s sr e s p o n s e t h ea p p e a r a n c eo fa u x i na n dg i b b e r e l l i n r e s p o n s ef a c t o rg e n e si nt h el i b r a r ys u g g e s t st h a tt h ei n t e r a c t i o n sb e t w e e n b r sa n do t h e r h o r m o n e sm a ye x i s t 2 、r t - p c rv e r i f i e dt h a te b rf o l i a ra p p l i c a t i o nm r n a l e v e l si n c r e a s e ds i g n i f i c a n t l y f o rt h o s eg e n e s ：c 6 0 、c 4 5 3 、c 5 6 8 、c 6 8 1 、c 5 7 9 、c 5 9 4 、c 5 6 4 、c 6 2 3 、c 6 3 7 、 c 4 2 0 ，t h i sp r o v et h a te b rp r o m o t et h i sg e n e se x p r e s s i o n 3 ) 码e 细d i m e n s i o n a lp o l y a c r y l a m i d eg e le l e c t r o p h o r e s i so fc u c u m b e rp h l o e m p r o t e i nr e v e a l e dt h a t6ha f t e ro 1m g u 1e b rf o l i a ra p p l i c a t i o nt h ea b u n d a n c eo fa2 8 k d ap r o t e i nw a su p r e g u l a t e da n dt h r e eo t h e rp r o t e i n ( 6 0 k d a 、7 5k d a 、9 5 k d a ) w e r e d o w n r e g u l a t e db ye b r t h i ss u g g e s t s t h a te b ri n d u c es y n t h e s i so fs o m er e l a t e dp r o t e l n s i nc u c u m b e rl e a v e sa n dt r a n s p o r tt oo t h e ro r g a n st h r o u g h t h ep h l o e mt r a n s l o c a t i o ns t r e a m - i nc o n c l u s i o n ，e b ri n f l u e n c e st h ee x p r e s s i o no fr n a a n dp r o t e i ni nc u c u m b e r p h l o e ms a p w eh y p o t h e s i z et h a tb r sr e g u l a t es y s t e m i c a l l yt h ed e v e l o p m e n t 叽d s t r e s s r e s i s t a n c eo fd i s t a n to r g a n sb ym r n a a n dp r o t e i nt r a f f i c k i n gt h r o u g ht h ep h l o e m k e yw o r d s ：c u c u m i ss a t i v u sl p h l o e ms a p ，l o n g d i s t a n c em o v e m e n t ，s u p p r e s s l v e s u b t r a c t i v eh y b r i d i s a t i o n ，p r o t e i n ，m r n a ，t w o - d i m e n s i o n a p o l y a c r y l a m i d e g e l e l e c t r o p h o r e s i s ，s i g n a lt r a n s d u c t i o n ，r e s i s t e n c e v 浙江大学硕士学位论文 缩略词 a b a b l b r s b r l l c c c m n a c p c m p p l 6 c o 2 dp i a g e e b l e b r e g t a f d a f t i e f k n l l c m l d m m a p s m d a m p n p c p c r p p 2 p rp r o t e i n s p t g s r t p c r 缩略词 a b s c i s i ca c i d b r a s s i n o l i d e b r a s s i n o s t e r o i d s b r a s s i n o s t e r o i dr e c e p t o r c o m p a n i o nc e l l c u c u r b i tm a x i m an o n a u t o n o m o u sc e l l p r o t e i n p u m p k i np h l o e m r n ab i n d i n gp r o t e i n s 16 一k dc 。m a x i m ap h l o e mp r o t e i n c o n s t a n s t w od i m e n s i o n a le l e c t r o p h o r e s i s 2 4 一e p i b r a s s i n o l i d e 一 e p i b r a s s i n o l i d e e t h y l e n eg l y c o lt e t r a a c e t i ca c i d f l u o r e s c e i nd i a c e t a t e f l o w e r n 、j gl o c u st l s o e l e c t r i cf o c u s i n g k n o t t e d 】 l a s e rc a p t u r em i c r o d is s e c t i o n l o n gd i s t a n c em o v e m e n t a s s e m b l ym a p s m a l o n y l a l d e h y d e m o b i l ep r o t e i n n u c l e a rp r o t e i nc o m p l e x p o l y m e r a s ec h a i nr e a c t i o n p p 2 p a t h o g e n e s i s - r e l a t e dp r o t e i n s p o s t t r a n s c r i p t i o n a lg e n es i l e n c i n g q u a n t i t a t i v er e a l - t i m ep c r 脱落酸 油菜素内酯 油菜素甾醇类 油菜素内酯受体 伴胞细胞 葫芦科非细胞自主蛋白 南瓜韧皮r n a 结合蛋白1 6 锌指蛋白 双向凝胶电泳 2 4 表油菜素内酯 表油菜素内酯 乙二醇二乙醚二胺四乙酸 荧光素二乙酸酯 开花信号分子 等电聚焦 玉米同源域蛋白 激光显微切割 长距离运输 装配m a p s 丙二醛 可运输的蛋白 核酸蛋白复合体 聚合酶链反应 韧皮蛋白2 病原相关蛋白 转录后基因沉默 实时定量p c r 浙江大学硕士学位论文 缩略词 s a s e s a r s d s p i a g e s s h s u t l s a l i c y l i ca c i d 水杨酸 s i e v e - t u b ee l e m e n t筛管分子 s y s t e m i ca c q u i r e dr e s i s t a n c e 系统获得抗性 s o d i u md o d e c y ls u l f a t ep o l y a c r y l a m i d e 十二烷基磺酸钠聚丙烯酰胺 g e le l e c t r o p h o r e s i s 凝胶电泳 s u p p r e s s i v es u b t r a c t i v eh y b r i d i s a t i o n 削减抑制杂交 s u c r o s et r a n s p o r t e rr n a 编码的叶蔗糖转运子 i l 浙江大学硕士学位论文 独创性生声明 浙江大学研究生学位论文独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的研 究成果。除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发表或 撰写过的研究成果，也不包含为获得逝姿盘堂或其他教育机构的学位或证书而 使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明 确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：耄降乎 签字日期：髫年 多月 1 3 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解逝江盘堂 有权保留并向国家有关部门或机构送 交本论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。本人授权逝姿态堂可以将 学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索和传播，可以采用影印、缩印 或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。 ( 保密的学位论文在解密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 研茜午 签字日期：1 巾s 年 占月7 ；日 导师签名： 签字日期：a 墙年6 月”日 浙江大学硕士学位论文致谢 致谢 本论文是在导师喻景权教授、周艳虹博士的悉心指导下完成的。从论文的选题、 试验设计、实验操作到论文的撰写、修改和定稿，凝聚了导师许多的心血和智慧。 两年来，学业、生活等各方面都得到了导师无微不至的关心和照顾；导师渊博的学 识，敏锐的思维，严谨的治学态度，以及严以律己、宽以待人的崇高风范潜移默化 地影响着我，使我不仅接受了全新的思想观念，领会了基本的思维方式，掌握了通 用的研究方法，而且还明白了许多待人接物与为人处世的道理，这一切我将受用终 生。我愿借此机会向导师表示衷心的感谢! 祝愿导师合家欢乐，一生平安! 在研究期间，还得到了师恺、傅丰庆、丁桔、夏晓剑、王虹、张韵、姜玉萍、 李苹芳、丁小涛等中心大楼南楼3 8 3 生理生化实验室师兄姐弟妹们在实验及生活中给 予的诸多帮助及勉励；2 0 0 6 级蔬菜专业全班同学的关心，在此一并表示由衷的感谢。 特别感谢家人二十多年的关爱和支持，正是他们默默无闻的奉献和一贯的支持 与鼓励，才使我健康成长并顺利地完成了数年的求学生涯。他们一点一滴的教导我 将铭记于心，他们不求回报的付出永远是我进取向上的动力。衷心地祝愿他们身体 健康、永远快乐! 最后，非常感谢在我成长过程中所有支持、鼓励和帮助过我的老师、亲人、同 学、领导和朋友，我愿在未来的学习和工作中，以更好的成绩来答谢所有这些关心 我的人。同时向参加论文评阅及答辩委员会的各位专家、教授致以诚挚的谢意! 郭银平 2 0 0 8 年5 月于浙江大学华家池畔 浙江大学硕士学位论文 前言 第一章前言 1 植物韧皮部大分子运输研究进展 1 1 植物韧皮部结构概述 在高等植物中，水分和有机物的运输，主要由徽管系统承担。微管系统包括木 质部和韧皮部，木质部主要负责运输水分、无机盐以及a b a 等小分子物质，韧皮 部主要运输光合产物，包括糖，淀粉，氨基酸，多肽等。输导组织是植物体中担负 物质长距离运输的主要组织，根部从土壤中吸收的水分和无机盐，由它们运送到地 上部。叶片的光合产物，则由它们运送到根、茎、花、果实中去。植物体各部分之 间经常进行的物质的重新分配和转移，也要通过输导组织来进行( 图1 ) 。 韧皮部是一种复合组织，包含筛管分子、筛胞、伴胞、薄壁细胞、纤维等不同 类型的细胞，其中与有机物的运输直接有关的是筛管分子或筛胞。筛管分子是管状 细胞，在植物体中纵向连接，形成长的细胞行列，称为筛管，它是被子植物中长矩 离运输光合产物的结构。 筛管分子只具初生壁。壁由果胶和纤维素组成。在它的上下端壁上分化出许多 较大的孔，称筛孔，具筛孔的端壁特称筛板。粗的原生质联络索穿过筛孔使上下邻 接的筛管分子的原生质体密切相连，在各联络索的周围有胼胝质鞘包围。筛管分子 的侧壁具有许多特化的初生纹孔场，称为筛域，其上的孔较一般薄璧细胞壁上初生 纹孔场的孔大，比胞间连丝更粗的原生质丝在此通过，这使筛管分子与侧邻的细胞 有更密切的物质交流。 筛管分子的侧面通常与一个或一系列伴胞细胞( c c ) 相毗邻，伴胞是与筛管分 子起源于同一个原始细胞的薄壁细胞，具有细胞核及各类细胞器，与筛管分子相邻 的壁上有稠密的筛域，反映出二者关系密切。筛管的运输功能与伴胞的代谢紧密相 关。 筛管运送养分的速度每小时可达1 0 l o o c m ，通常，筛管功能只有一个生长季， 少数植物可更长，如葡萄、椴、碱蓬的筛管可保持二至多年。在衰老或休眠的筛管 中，在筛板上会大量积累胼胝质，形成垫状的胼胝体( c a l l u s ) 封闭筛孔，当次年春 浙江大学硕士学位论文h 0 再 v 震 b 图1 植物微管系统在远距离器官之间的信息 通讯中作为通道。( a ) 木质部和韧皮部的作用 原理简图。( b ) 微管横切面( 源自：l o u g ha n d l u c a s 2 0 0 6 ) 。 f i g 1t h ep l a n tv a s c u l a rs y s t e mf u n c t i o n sa s t h ec o n d u i tf o rl o n g d i s t a n c ec o m m u n i c a t i o n b e t w e e n d i s t a n t l y l o c a t e d o r g a n s ( d ) s c h e m a t i ci l l u s t r a t i o no ft h ex y l e ma n d p h l o e m ，i l l u s t r a t i n gt h ef u n d a m e n t a lf e a t u r e t h a t ，i nc o n t r a s tt ot h ea n i m a lh n g d o m ，t h e f l o wp a t h w a yi s n o n c i r c u l a t o r yi nn a t u r e ( 6 ) t r a n s v e r s es e c t i o no far o o td e m o n s t r a t i n gt h e p h y s i c a ls e p a r a t i o no f t h ep h l o e ma n dx y l e mt i s s u e s ( f r o m ：l o u g ha n dl u c a s 2 0 0 6 ) 季筛管重新活动时，胼胝体能消失，联络索又能重新沟通。此外，当植物受到损伤 或其他外界刺激时，筛管分子也能迅速形成胼胝质，封闭筛孔，阻止营养物的流失。 因此，韧皮部在植物的物质运输过程中，特别是叶片和根部之间的物质以及信 息互换中扮演着重要的角色。目前，植物韧皮部的研究日益深入，微管运输的机理 不断完善，在植物信号物质的研究中，具有理论性意义。 1 2 韧皮部r n a 和蛋白质的运输 近年来，学者对韧皮部有广泛的研究，韧皮部是高等植物体内大分子物质运输 的网络体系，是光合产物从植物体的源运输到库的主要通道。韧皮部的进化史反映 出植物与外界环境的交流，例如，成熟的器官或分裂中的萌芽感受外界环境的信号 等。这个长距离信号运输系统产生的结果，可以使正在形成中的器官能更好的向着 产生，成熟，功能化的方向发展。韧皮液中除光合产物和一些其他的小分子物质以 外，还有一系列的大分子物质，除了传统意义上的蛋白质和一些调节植物生长的小 分子物质，还有r n a s 。目前已经报道了韧皮部中几种类型的r n a 分子，如细胞 r n a ，病原体r n a ，小r n a s ( y o o 和l u c a s ，2 0 0 4 ) 和基因沉默相关的成分等， 在近来的研究进展中认为，这些大分子物质是植物体内信号物质长距离运输系统的 浙江大学硕士学位论文 h u 舌 一部分，在韧皮部中具有调节运输，感应环境信号和病原物的功能。 随着r n a 分子在基因表达调控中重要作用的发现，r n a 分子如何在植物体内 运输移动，如何在目标组织中发挥作用等问题引起人们越来越多的关注。 目前对于携带信息的大分子物质( 包括转录因子和m r n a 分子) 在细胞和整个植 物系统间运输的深入研究，产生了维管植物细胞间信号的新概念。大分子物质在细 胞间和整个植物中的运输，分别发生在胞间连丝和植物维管系统两种特殊结构中 ( o p a r k a ，1 9 9 9 ；l u c a s ，1 9 9 6 ) 。 m r n a 分子作为遗传信息的载体，在产生它们的细胞中发挥作用。近来研究表 明，m r n a 也作为一个活跃的信号分子，调控基因表达和植物发育( d o e r i n g s a a d ， 2 0 0 4 ) ，而各种类型的r n a 分子从合成位点长距离运输到植物不同器官的调控机制 ( y o o 等，2 0 0 4 ) ，逐渐成为人们的研究热点。 对于植物系统运输的r n a 类型，目前已知主要有3 种r n a 分子能够进行系统 运输，即植物病毒基因组r n a 、转录后基因沉默的r n a 信号和内源特异m r n a 分 子。 植物病毒基因组r n a 的研究一般通过接种，把病毒感染到宿主植物细胞中进 行表达，黄瓜花叶病毒接种到南瓜上，感染其核酸( r n a 或d n a ) ，并结合特定的 可运输的蛋白( m p ) ，形成核酸蛋白复合体( 1 9 9 6 ；g i | b e r t s o n 和l u c a s ，1 9 9 6 ) 通 过伴胞筛管运输( l u c a s 等，2 0 0 2 ) ，在感染的过程中，病毒的可运输蛋白在伴胞中 导致细胞内的r n a 分子发生异常的长距离运输，影响植物的正常生长发育( a a r t ， 2 0 0 4 ) ，进一步说，改变韧皮部中长距离运输的m r n a 的数量和种类( r u i z m e d r a n o 等，2 0 0 7 ) ，是导致病毒影响植物发育的主要原因，最近有用建立抑制差减文库的手 段来研究病毒对植物的作用危害，结果显示，病毒感染植物的韧皮液中只有极少的 m r n a 数量的改变，说明，m r n a 在进入植物细胞时，即伴胞和筛管间的信号大分 子物质的交换时，有一个高级筛选调控机制( z a m b r y s k i 等，2 0 0 2 ；a o k i 等，2 0 0 5 ) 病毒可运输蛋白( m p ) 不能大量的改变内源m r n a ，但在感染的植株内，仍有少量的 细胞周期调节因子和转录因子能够被病毒诱导产生，进而影响植株的正常发育 ( r u i z m e d r a n o ，2 0 0 7 ) 。 在非自主细胞基因沉默的研究上，采用转基因和病毒侵染的方法居多，转基因 浙江大学硕士学位论文 刚茜 沉默可能会引起直接自发的基因沉默或在主要区域被诱导后在整个植株内传播 ( v o i n n e t 和b a u l c o m b e ，1 9 9 9 ；v o i n n e t 等，1 9 9 8 ) ，相似地，病毒引起的基因沉默 并不一定在被侵染的器官( r u i z m e d r a n o 等，2 0 0 4 ) ，信号物质最先在伴胞中合成， 继而在韧皮部中运输到植物的各个器官( g i l b e r t s o n 等，1 9 9 6 ；k l a h r e ，2 0 0 2 ；s m i t h ， 2 0 0 7 ) 。 刊篡e n d o g 善e n o u s 三仓 o a厂k j ” 二r n a z i pc o d 吖伶 卜_ j ffj 叩e 导：端_ 心 夕 广伊却o 。删n c i i n g p 吲百n 心乞口。 乡|口o o 厕b 眦n o n n - c u c e l l e - a 叫u t o 删n o m n o c 。u s m 一似 “js u p r a c 3 e i l u l a r 。p 诊 岔绲。n 洲a 图2 非自主细胞r n a 在韧皮液中运输调控机理：模型中r n a 分子结合c i s a c t i n g 序列，即伴胞中 细胞特异z i p 编码结合蛋白，通过胞间连丝运输到筛分子中。 ( 源自：l u c a s 2 0 0 1 ) f i g 2p o t e n t i a lm e c h a n i s mf o rr e g u l a t i n gt h et r a n s p o r to fn o n - c e l l a u t o n o m o u sr n a i n t ot h ep h l o e m t r a n s l o c a t i o ns t r e a m i nt h i sm o d e l ，n o n c e l l a u t o n o m o u sr n am o l e c u l e sc o n t a i nc i s a c t i n gs e q u e n c e e l e m e n t s ，t e r m e d z i pc o d e s ，w h i c h f u n c t i o ni nc o m b i n a t i o nw i t hc o m p a n i o nc e l l s p e c i f i cz i p c o d e b i n d i n gp r o t e i n s ，t r a n s p o r tt h r o u g ht h ep l a s m o d e s m a t at os i e v ee l e m e n t ( f r o m ：l u c a s 2 0 0i ) 在已知的r n a 系统运输中( c i t o v s k y ，2 0 0 0 ) ，内源m r n a 细胞间运输的生物学 意义最引入关注。在韧皮部中还发现其他内源m r n a ，在某种机制作用下定位于特 殊组织，如c m p p l 6 是南瓜的一个韧皮蛋白，在c c s e 之间以序列非特异方式运输 r n a ( r u i z m e d r a n o 等，1 9 9 9 ) 。利用r t - p c r 方法在异质嫁接南瓜的韧皮液，检 测出有近1 0 0 种m r n a 存在于韧皮部中，对其中一个m r n a 转录物c m n a c p 做了 详细研究，发现大量转录本从南瓜砧木移动到黄瓜接穗的分生组织中，由于 c m n a c pm r n a 的选择性，还需要一个蛋白质特异地识别这个m r n a 并将此m r n a 4 浙江大学硕士学位论文前言 运输到顶端组织，即c m p p l 6 蛋白( x o c o n o s t l e c a z a r e s 等，2 0 0 2 ) 。有关c m n a c p m r n a 或其他m r n a 长距离运输的生物学基本原理已有报道( r u i z m e d r a n o 等， 1 9 9 9 ) ，微注射实验表明，n t n c a p p i 在介导选择性蛋白的细胞间运输中的作用 ( r u i z m e d r a n o 等，1 9 9 9 ) ，n c a p ( n o n c e l la u t o n o m o u sp r o t e i n ) 传递到胞间连丝的模 型具有选择性，并且可以对植物中r n a 运输的生物学机制其进行调控。 目前，韧皮部内蛋白质的研究目益深入，其中，拟楠芥光周期诱导花芽分化的 基因的特性已经研究比较深入，光周期途径中，完整信号的主要部分是c o 蛋白 ( p u t t e r i l l 等，1 9 9 5 ) 和r n f 类激酶抑制蛋白f t ( k a r d a i l s k y 等，1 9 9 9 ；k o b a y a s h i 等，1 9 9 9 ) 。f t - m r n a 是韧皮部中可运输的开花信号分子，和c o 相反，f t 蛋白不 单在源器官的伴胞中表达会引起开花，在其他器官( 分生组织) 表达也会引起植物 开花( a n 等，2 0 0 4 ) ，以此证实f t 的表达是被c o 所控制( s a m a c h 等，2 0 0 0 ) ，且 f t 是促进植物开花的必要条件( k a r d a i l s k y 等，1 9 9 9 ；k o b a y a s h i 等，1 9 9 9 ) ，这些 都证实f t 是开花信号系统中的重要组成部分。 在植物韧皮部中，大分子信号物质如：d n a 、r n a 、蛋白质以及多肽的运输具 有特殊形式( h a y w o o d ，2 0 0 2 ；w u ，2 0 0 2 ) ，m r n a 与特定的蛋白形成核蛋白复合 物在植物韧皮部进行长距离运输ig o m e z 和p a l l a s ，2 0 0 4 ；j a n s s e n ，2 0 0 1 ) ，韧皮部 中的p 蛋白在大多数被子植物韧皮部中存在，这些蛋白在伴胞中合成，通过胞间连 丝进入到筛管中进而在整个植株运输( g o l e c k i ，1 9 9 9 ；a o k i ，2 0 0 5 ) 。r n a 的长距 离运输的特点：r n a 结合活性、胞间连丝通道尺寸大小的可改变性、核蛋白复合 体的形成和内源或病原菌r n a 结合等。嫁接试验表明c m m l e c l 7 是可运输的韧皮蛋 白，可以从甜瓜接穗运输到南瓜砧木中，并且可运输性和r n a 结合活性也被证实 ( g o m e z ，2 0 0 5 ) 。c m p p l 6 和c m p p 3 6 蛋白作为分子伴侣加强内源m r n a 在韧皮 部的运输功能，南瓜的韧皮液蛋白c m n a c p m r n a 与它们的同源m r n a 分子一起 从伴胞运输到筛分子( r u i z m e d r a n o 等，1 9 9 9 ；x o c o n o s t l e c a z a r e s ，2 0 0 2 ) 。 韧皮液中m r n a 和蛋白可以运输到长距离的器官中反映出，可能存在一个机制 来调节植物的生长发育和抗性。而探明植物韧皮系统中这种发挥重要作用的相关基 因和蛋白，对于从植物个体整合的角度解析植物地上部地下部、各个器官之间如何 通过信号通讯机制相互协调其生长发育及抗性调控过程有着重要的意义。 浙江大学硕士学位论文前言 2 油菜素内酯及其生理作用 油菜素内酯是美国农业科学家g r o v e 等( 1 9 7 9 ) 首次从油菜花粉中分离、鉴定 的一种能促进植物生长的甾族化合物。迄今，油菜素内酯作为一种新型植物生长激 素，已受到人们的广泛重视，至少己有4 0 余种与油菜素内酯有关的化合物，从植物 中分离出来，它们总称为油菜素甾醇类( b r a s s i n o s t e r o i d s ，简称b r s ) ( m a n d a v a 等， 1 9 8 8 ；m o o r e 等，1 9 8 9 ) 。这类化合物的生理活性功能不同于五大类植物激素( 生长 素、赤霉素、细胞分裂素、脱落酸和乙烯) ，因此，将它作为第六大类植物激素( m o o r e 等，1 9 8 9 ) 。 表油菜素内酯( e b r ) 是其中的一种。它的生理作用引起了人们的广泛注意。 人们最初发现它与调控植物的生长发育密切相关，并在生理和分子生物方面进行了 较为深入的研究。后来还发现b r 与植物的胁迫反应也很密切关系，可提高植物的 抗逆性( s a t e e s hk ，2 0 0 6 ) 。 目前，b r 的主要生理功能及作用机理表现在以下几个方面： 1 促进细胞生长和分裂。适宜浓度的b r 能促进许多植物的幼茎伸长，其活性 是其它激素的1 0 0 1 0 0 0 倍，但高浓度的b r 会抑制营养器官的伸长( 鲁旭东等， 2 0 0 5 ) 。 2 提高光合速率。b r 对叶片中光合产物运输有促进作用。可改善源一库的关系， 能促进同化物的运输和再分配( 侯雷平等，2 0 0 1 ；胡文海等，2 0 0 6 ) 。 3 保幼延衰作用。b r 有利于切花瓶插期间鲜重的保持、瓶插前期还原糖含量 的增加以及延缓花瓣和叶片质膜透性的增大( 储昭庆等，2 0 0 6 ) 。 4 提高植物的抗冷性。表油菜素内酯在低温下可以减缓黄瓜幼苗叶绿素的降解 和电解质的外渗，保护生物膜，从而延缓黄瓜幼苗冷害症状的出现及生长的恢复。 ( y u 等，2 0 0 2 ；丁锦新等，1 9 9 8 ；k a g a l e 等，2 0 0 7 ) 。 5 促进花粉管生长，调节开花。b r 是首先从花粉中分离出来的，而花粉又是 b r 含量最丰富的器官，b r 还可诱导雌雄同株异花的西葫芦雄花序开出两性花或雌 花( 谷端银等，2 0 0 6 ) 。 6 其它生理功能。b r 能够提高作物抗热性、抗旱性，抗病性等。表油菜素内 6 浙江大学硕士学位论文前言 酯( e b r ) 对黄瓜种子浸种2 4h ，能提高幼苗对热激的忍耐性，降低植物水分的蒸 腾量，提高植物抗旱能力( k a g a l e 等，2 0 0 7 ) ；b r 也能提高植物对盐害( c l o u s e ， 1 9 9 8 ) 、除草剂、药害、真菌侵入等逆境的抵抗力( c u t k e r 等，1 9 9 1 ；k h r i p a c h 等， 1 9 9 6 ) ，因此有人将其称为“逆境缓和激素”( 尚庆茂等，2 0 0 6 ) 。 在逆境条件下，b r s 可能是通过减轻植株的膜脂过氧化作用，稳定膜系统的结 构与功能，减缓丙二醛( m d a ) 的积累，维持较高的抗氧化酶活性，从而减轻逆境 对植株幼苗的伤害( 朱诚，1 9 9 6 ；c i o u s e ，1 9 9 8 ；a n u r a d h a 和r a o ，2 0 0 1 ；邹华文 和陈凤玉，2 0 0 1 ) 。 b r s 还可以提高植株体内抗性物质的含量，k u l a e v a 等( 1 9 9 1 ) 观察到高温胁 迫下小麦叶片细胞中的热激蛋白颗粒( h s p s ) 以小簇聚集在一起，且b r s 处理叶片 的小簇中h s g s 的平均数目和平均大小都高于未处理叶片。b r s 处理能减少马铃薯 植株晚疫病菌侵染的发生，其抗性的增加与脱落酸( a b a ) 、乙烯的增加及酚类和 萜类物质的变化有关( k h r i p a c h 等，1 9 9 6 ) ， 近年来，许多学者在分子水平上对b r s 诱导的抗逆机制进行了深入的研究。在 干旱和冷害条件下，表油菜素内酯( e b r ) 诱导的抗性与抗性相关基因的表达密切 相关( k a g a l e 等，2 0 0 7 ) 。在生物胁迫中，b r 诱导烟草抗病性的提高与水杨酸( s a ) 诱导抗病相关基因( p r ) 表达的增加无关，这表明b r 诱导的抗性机制与系统获得 抗性( s a r ) 和机械伤害诱导抗性不同( n a k a s h i t a 等，2 0 0 3 )