（植物学专业论文）壁膜粘着参与植物细胞响应机械应力的实验研究.pdf

重庆大学硕士学位论文中文摘要 摘要 完整的植物植株能在一定范围内通过调整生长速率、改变形态、产生向性等 方式避免不利的或非正常的物理环境对自身造成伤害，这是植物的运动方式之 一。那么，离体的植物单细胞在j l - 力i ：l 机械应力作用下能否进行“运动”呢? 如果会 的话，其运动方式是怎样的呢? 机械应力又是以什么途径传达这种运动指令，需 要哪些细胞成分和结构的参与呢? 如果这些问题得以回答，那么我们其实得到了 一个关于机械应力信号传导机制的解释。这是不同于化学信号传导通路的一种新 的信号传导体系。在动物细胞研究中，已就这种机械信号传导机制作了比较深入 的研究，取得了很多有影响的研究成果。而在植物方面，这个领域的研究相对比 较薄弱。因此，本文试通过合理的实验设计对植物细胞应力响应过程加以剖析， 对涉及的分子或结构进行初步确定，以期能对植物细胞应力响应机制作出比较合 理的、初步的描述。 本文采用了一种计量精确、操作方便的体外机械应力加载装置对低溶点琼脂 糖包埋的菊花单细胞进行单向的体外机械应力加载实验，对植物单细胞在外界应 力刺激下的分裂方向的变化进行了研究。结合r g d 多肽辅以温和质壁分离的方 法对细胞进行壁膜连接中断处理，再以细胞骨架药物细胞松弛素b 和秋水仙素对 微丝、微管进行阻断，就两个可能的应力响应关键环节进行实验论证。 主要实验结果如下： 1 通过机械应力加载和培养后统计分析比较加载组和对照组细胞形态，主要 以伸长细胞的长轴与应力加载方向间的夹角为比较对象，揭示出植物单细胞在单 向机械应力加载条件下有沿垂直主应力方向进行分裂的趋势；采用c a l c o f l u o r 进 行细胞壁荧光染色，比较加载组和未加载组以及g r g d s 五肽处理组发现经过应 力加载会造成植物细胞壁增厚现象，而g r g d s 五肽处理组细胞壁增厚不明显， 但细胞质出现很大程度皱缩，并且皱缩部分出现明亮荧光。可以说明g r g d s 五肽 扰乱了正常的细胞壁膜连接。 2 用g r g d s 五肽处理后实施加载，培养4 天后同样以夹角为对象分析细胞 形态，进行统计比较，结果显示经壁膜连接阻断处理的细胞夹角与细胞数量间的 相关性消失，说明壁膜中断处理后细胞无法再响应外加机械应力，证明这种有关 r g d 识别的细胞壁膜连接确实参与了植物细胞对机械应力的响应过程。 3 采用细胞松弛素b 和秋水仙素阻断细胞骨架后实施机械应力加载，经统计 分析显示，骨架药物处理也抑制了细胞对机械应力的响应，其夹角与所对应的西 部数量间无显著相关性。说明细胞骨架对于植物细胞响应j b ；d n 机械应力同样不可 重庆大学硕士学位论文 中文摘要 缺少。 综合以上实验结论，并考虑到壁膜连接和细胞骨架在细胞中的位置，参考相 关结构在动植物中的其它研究数据，我们可以初步描述出外界机械应力经细胞壁 膜连接感受进而传递到细胞骨架，再由细胞骨架影响下游细胞事件的信号传递过 程。 关键词：机械应力植物细胞细胞壁细胞膜 r g d细胞松弛素 i i a b s t r a c t i n t a c t p l a n t c a na v o i dt h eh a r m n e s si n d u c e db ya d v e r s eo ru n o r d i n a r y e n v i r o n m e n tt h r o u g ha d j u s t i n gt h e i rg r o w t hr a t e ，c h a n g i n gm o r p h o l o g y , p r o d u c i n g t r o p i s m sa n dt h a t sw h a ti sc a l l e dt h em o v e m e n to fp l a n t t h e n ，w h e t h e rp l a n ts i n g l e c e l li nv i v oc a nm o v ei nr e s p o n s et o1 0 a d e dm e c h a n i c a ls t r e s s ? i fi tw e r ed o n e ，w h a t k i n do fm o v e m e n tw i l lt a k ep l a c e ? a n dh o wm e c h a n i c a ls i g n a l st r a n s m i t t e di n t o c h e m i c a ls i g n a l so ro t h e rk i n do n e ，a sw e l la sw h a tm o l e c u l e sa n di n s t r u c tw i l lb e i n v o l v e di n ? a f t e rw ea n s w e r i n gt h e s eq u e s t i o n ，w ec a na c h i e v ea ne x p l a i na b o u tt h e s i g n a lp a t h w a yo fm e c h a n i c a l s t r e s s i ti san e wp a t h w a yd i f f e r e df r o mt r a d i t i o n a l c h e m i c a ls i g n a lp a t h w a y a n dt h e r ei se x t e n s i v ek n o w l e d g eo ft h i sk i n do fr e s p o n s e a b o u ta n i m a lc e l l ，b u tl i m i t e di np l a n tc e l l s o ，w ed e s i g n e de x p e r i m e n t st og r a s pt h e r e s p o n s ep r o g r e s s a n dt h em o l e c u l ei n v o l v e di n t h e n ，w ec a nt r yt oc o n c l u d ea r e a s o n a b l es i g n a lp a t h w a yo fm e c h a n i c a ls t r e s si np l a n tc e l l t h em a i nr e s u l t sa r el i s t e db e l o w 。 1 b yc o m p a r i n gt h ea n g l e sb e t w e e nl o n ga x i so fe l o n g a t e dc e l l sa n dt h ed i r e c t i o no f m a i ns t r e s s ，i ts h o w e dt h a tc e l l st e n dt od i v i d e da n de l o n g a t e da p e a kt ot h es t r e s s w es t a i n e dt h ec e l lw a l lb yc a l c o f l u o r w es e em o r ei n t e n s ec e l lw a l lf l u o r e s c e n c e i n1 0 a d e dc e l l st h a nt h a ti nc o n t r 0 1c e l l s a n dt h e r ei sn oo b v i o u se n h a n c ei nc e l l w a l lf l u o r e s c e n c eb u ts e r i o u ss h r i n k a g eo fc y t o p l a s mw i t hi n t e n s ef l u o r e s c e n c e i t p r o v e dt h ep e r t u r b a t i o ni np l a s m am e m b r a n e c e l lw a l la d h e s i o ni n d u c e db y r g d 2 a f t e rt r e a t i n gw i t hg r g d sa n dl o a d i n gb ym e c h a n i c a ls t r e s s ，c e l l sd i s p l a yn o r e s p o n s et ot h es t r e s s w ea n a l y z e dt h ea n g l ea n dc o r r e s p o n d i n gc e l ln u m b e r i t s h o w e dn o s i g n i f i c a n t c o r r e l a t i o nb e t w e e nt h e m i ts u g g e s t st h a tt h e r g d s p e c i f i e dp l a s m am e m b r a n e - c e l lw a l la d h e s i o ni si n v o l v e di nt h er e s p o n s eo f m e c h a n i c a ls t r e s si np l a n tc e l l 3 i n s t e a dg r d g sb yc y t o c h a l a s i n sba n dc o l c h i c i n e sr e s p e c t i v e l yb e f o r el o a d i n g m e c h a n i c a ls t r e s s c o m p a r i n gt h et r e a t e dg r o u pw i t ht h e i rc o n t r o l ，w ec a l ld r a wa c o n c l u s i o nt h a tc y t o s k e l e t o ni sn e c e s s a r yf o rp l a n tc e l li nr e s p o n s et om e c h a n i c a l s t r e s s t h i n k i n ga b o u tt h e s e r e s u l t t o g e t h e r , a s s o c i a t e t h el o c a t i o no fp l a s m a m e m e m b r a n e c e l lw a l la d h e s i o na n dc y t o s k e l e t o na n dt h er e l a t e de x p e r i m e n t a ld a t a ，w e c a r ld e s c r i b eas i g n a lp a t h w a yi n i t i a l e db ym e c h a n i c a ls t r e s s ，t h e ns e n s e d a n d i l l 重庆大学硕士学位论文英文摘要 t r a n s m i t t e db yp l a s m am e m b r a n e c e l lw a l la d h e s i o nt ot h ec y t o s k e l e t o nw h i c hc a d _ i n d u c em o r ed o w n s t r e a me v e n to rr e a c ta sat a r g e to r g a n k e y w o r d s ：m e c h a n i c a ls t r e s sp l a n tc e l lp l a s m am e m b r a n e c e l lw a l lr g d i v 独创性声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取 得的研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文 中不包含其他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得重麽态堂 或其他教育机构的学位或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本 研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名：瘩。匈， 签字日期：拶d 石年p 月7 0 日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解重麽太堂有关保留、使用学位论文的 规定，有权保留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许 论文被查阅和借阅。本人授权重麽太堂可以将学位论文的全部或部 分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或扫描等复制手段 保存、汇编学位论文。 保密() ，在年解密后适用本授权书。 本学位论文属于 不保密( ) 。 ( 请只在上述一个括号内打“”) 学位论文作者签名：巷缅。导师签名： 签字目期：汐汐占年0 月肋日签字日期：沙汐易年f 汐月勿日 重庆大学硕士学位论文1 绪论 1 绪论 1 1 引言 植物对外界刺激特别是应力信号的反应已被大量实验所证实，由最初研究完 整植株对敲打、摩擦等刺激产生何种响应到研究植物组织或愈伤组织在机械载荷 下的形态变化、分裂状况 4 j 等，再到对植物单细胞乃至亚细胞结构在应力刺激下 的变化的研究 4 ”。从某种程度上讲，细胞所处的力学环境对细胞形态改变的作 用匹敌甚至超过了某些蛋白质或细胞配合体传递的信号。我们知道植物虽然不能 运动，但在一定范围内它是可以控制自身的生长活动的，通常我们称之为植物的 运动。这种运动包括向性运动和感性运动。向性运动即向光性、向水住、向重性、 向化性；感性运动包括感夜性、感震性、感触性等。植物的这些运动大部分是受 物理信号控制，如光照、渗透压、重力、震动、触碰等。对光照、渗透压和重力 因素对植物生长发育的影响的研究开始得比较早，而对像震动、碰触这类机械应 力对植物的影响的研究则开始相对较晚，从上世纪8 0 年代才开始有比较多的研 究者投入到这个方面的研究。并提出了向触性形态建成的概念，在建成模式、信 号通路、分子机制、基因调控等方面就碰触对植物生长发育的影响进行了研究。 向触性反应通常包括单向生长抑制，而最为人们熟知的向触性反应是含羞草的叶 子和小叶受到碰触后立即折叠和下垂，其机制在于叶片基部的叶枕构造，平时叶 枕水分含量高，具有较高的膨压，可以支持叶片和小叶的伸展。当受到碰触后， 叶枕内部离子浓度发生变化，膨压降低，以致叶片和小叶折叠下垂 4 9 】。那么机械 应力对植物的影响可能存在一种机制，即类似重力对植物向性影响机制那样，通 过对某些特异性感受细胞中的特殊结构在不同应力状态下发生位置、活性或其它 某种变化扳动细胞的响应反应呢? l i n t i l h a e 等人在实验中对包埋后的单细胞进 行点压发现细胞分裂呈现有序化【l 】。结果说明对机械应力的响应不是限于组织或 植株，细胞也能对机械应力产生响应。那么这种细胞对机械应力的响应应该以广 泛存在的细胞结构和物质为基础的。分析大量资料数据后，我们将目标集中在细 胞壁膜连接的部分。本文旨在确立单细胞响应机械应力时的形态学变化并对这种 变化进行定性分析，和在此基础上对壁膜连接是否参与了机械应力的响应以及可 能的相关下游响应结构，主要是细胞骨架进行初步的探讨和论证。 1 2 细胞连接与机械应力的关系 动物细胞连接主要包括三种形式：封闭连接、锚定连接和通讯连接。自1 9 8 7 年整合素被公认作为一种细胞普遍表达的细胞表面粘着受体后【3 1 ，其对外界应力 的的介导作用越来越突出。 重庆大学硕士学位论文1 绪论 整合素家族包括1 8 种a 亚基和8 种1 3 亚基组合而成的2 4 种整合素。它们连 接着胞外基质( e c m ) 和细胞骨架肌动蛋白微丝等，能介导胞内至胞外，胞外至 胞内的双向信号传递。整合素蛋白识别的主要部位是配体上的r g d 三肽结构。 从2 0 0 1 到2 0 0 2 年，基于x 射线结晶学及核磁共振和电子显微镜对整合素非活 性无粘着状态到活性粘着状态结构转换的研究取得了重大进展。此间，m a r t i n 等 人提出了第一个整合素蛋白胞外区域x 射线晶体结构 6 1 。x i o n g 等人在提出的整 合素蛋自晶体结构中描绘出了其识别r g d 三天序列的部位和氨基酸组成1 7 1 f 3 司。 图i 1 整合素蛋白晶体结构图( a ) 以及其r g d 三肽识别部位( b 、c ，箭头所示) f i g 1 1t h ec r y s t a ls t r u c t u r e o f i n t e g r i n ( a ) a n d t h e r g dr e e o g n i s e ds i t e o f i t ( 8 c ，a g l o w s h o w e d ) 整合素蛋白是动物细胞粘着斑的重要组成部分。粘着斑是一种多分子复合体 连接了胞外基质与细胞骨架( 微丝) 。整合素在其中作为跨膜蛋白其胞外部分通 过r g d 识别与配体( 纤连蛋白、层粘连蛋白等) 结合，迸而与胶原相连。胞内 部分连接着一个由5 0 种以上的蛋白质组成的紧密的细胞膜次层结构。其中既包 括结构组成成分也包括信号传导蛋白如f a k ，s r e ，i l k 等。通过这层结构，粘 着斑达到与细胞骨架微丝相连的目的。 粘着斑的装配和维持都需要局部机械应力。这个应力既可以由肌动蛋白驱 动的细胞骨架等容收缩产生，也可以是细胞外波动如基质拉伸或流体剪切所产 生。应力引起的粘着层装配可以活化多种控制细胞增殖、分化、生存的信号途径， 包括m a p 激酶途径和p 1 3 激酶途径等。还可通过g 蛋白r h o 途径等调节细胞骨 架结构。 2 重庆大学硕士学位论文1 绪论 图1 2 粘着斑复合结构模拟图 f i 9 1 2 a n i m a lf o c a la d h e s i o n 另一方面，胞外基质、整合索和细胞骨架组成了一个对物理信号敏感的连续 体，通过这个连续结构很容易实现胞内和胞外机械应力的双向传递【16 1 。实验证明， 缺乏某种整合素蛋白的变异小鼠，当肌原纤维开始收缩时，由于没有适当的结构 对这种拉伸进行传递，结果肌腱连接结构被打断m 】。w a n g 等设计的实验将小球 裹上整合素蛋白受体后粘附到细胞上，通过扭动这个小球引起了一种特有的、应 力有关的僵硬响应。并且随着施加的应力增大，细胞对这种机械形变的抗性也加 大【1 0 1 。另一个类似的实验则是将纤连蛋白( 一种整合素受体) 包裹的小球沿细胞 表面移动而引起了细胞的抗性反应【“】。这类实验更直接有力的证明了整合素蛋白 对于动物细胞感受和响应外界应力的重要性。整合素感受和传递机械刺激的机制 主要是通过和配体的结合引发其二聚化从而实现从非活性构象到活性构象的转 变 1 8 1 ，进而将信号传递给不同的下游信号分子，如蛋白激酶( f a k , i l ks r c , f y n ) ，接头蛋白( s h e , c j r b 2 ，c r k ) ，r h o 和r a s 等，再扳动m a p k ( 有丝分裂原 活化蛋白激酶途径) 途径或协助生长因子受体信号途径【1 9 1 1 2 0 蝇外界机械应力对 细胞生长、分裂等方面的影响。 随着研究的深入，实验表明，同样是粘着斑结构成分的跨膜硫酸乙酰肝素蛋 白聚糖家族的某些分子作为协同受体在整合素信号感受过程中起着重要作用【2 1 1 。 由此，对以整合素蛋白为关键连接分子的整个粘着斑复合结构在细胞对机械应力 进行响应过程中的作用机制值得我们进一步关注。 g e i g e r 等人对粘着斑进行了深入研究，特别是它与动物细胞感受外界机械应 力间的关系，提出了两种比较合理的以粘着斑机械应力感受机制：( 1 ) 外界机械 应力改变了粘着斑细胞膜次层结构三维蛋白网络中某些成分的相对位置。而这种 3 重庆大学硕士学位论文1 绪论 波动使其容易与一些新的细胞质溶质分子结合。实验证明，这种应力依赖性粘着 斑位点分子重组确实存在。首先，初生粘着斑复合体向成熟粘着斑转化过程( 需 要应力环境) 伴随着v b 3 整合素密度的增加。此外，光漂白荧光恢复( f i 溶p ) 实验证明在一粘着斑内部，尚整合素亚基能借助能量和肌球蛋白i i 进行移动 z 2 1 。 ( 2 ) 外界应力波动造成了某些分子构象的变化。而己知的有几种粘着斑蛋白确 实存在两种构象，即“关闭”和“开启”两种状态。如纽蛋白、e r m 蛋白，p p 6 0 ， 纤连蛋白，甚至整合素二聚体也包括其中。经粗略测定，加载到粘着斑的应力在 p n 范围即可引起这些分子的构象变化t z 3 。而机械应力很有可能引起这种构象变 化，开启信号分子，暴露出可以结合新的信号分子的连接位点 g l 。有关粘着斑更 为详细的分子基础，功能，特性还不十分清楚，因此在这里还无法对粘着斑介导 的应力响应机制作出更明确阐述。 图1 3 粘着斑细胞膜次层的机械应力感受开关工作机制推测。( a ) ( b ) ：粘着斑成分相 对位置改变响应机制；( c ) 粘着斑成分构象变化响应机制 f i 9 1 3 t h e h y p o t h e t i c a l m o d e l s o f h o w t h e m e e h a n o s e n s o r ys w i t c h i n a d h e s i o n m i g h t w o r k ( a x b ) m o l e c u l a r r e o r g a n i z a t i o no f a d h e s i o ns i t e s ( e ) t h ee o n f o r m a t i o n a ls w i t c hm o d e l 动物细胞与外界物理刺激的关系研究取得了相当的成果，从整个过程来看， 整合素蛋白是研究的突破口，而粘着斑复合结构的分子基础和功能机制则是现在 研究的重点。植物细胞研究者参考动物细胞的研究结果，也进行了大量关于植物 中是否存在整合素同源蛋白的研究，如果这个猜测被证实将把植物细胞应力响应 机制研究往前推进一大步。比较早而且有深度的研究是s c h i n d l e r 等人关于一种 依赖于r g d 进行识别的系统存在于高等植物中的报道。在文章中列出了大量图 片和数据，证明植物细胞确实会受含r g d 序列多肤的影响，出现某些形态变化 肼】。也就是说植物细胞可能存在一种能识别r g d 序列的物质。s c h i n d l e r 等人也 就针对这种物质进行了分离纯化，采用的是抗人体玻璃粘连蛋白受体( v n r ) 的 抗体对该物质进行特异性结合，得到了一种7 0 k d 左右的r g d 识别蛋白【2 4 j 。在 此之后，陆续有在植物细胞中分离到类整合素蛋白的报道，比较近期的报道有 4 重庆大学硕士学位论文i 绪论 f a i k 等人从拟南芬中分离到的约6 0 k d 的能特有识别r g d 序列的蛋白f 2 5 】以及孙 颖等人以百合花粉管细胞为材料得到两条能被两种种动物整合素单体的抗体和 一种动物整合素配体的受体的抗体所识别的电泳带，分子量分别为1 5 0 k d 和 9 5 9 7 k d 2 6 1 。但来自于基因组学的研究【2 7 1 和蛋白质同源性比较的数据瞄1 以及此 类实验本身的漏洞，如所用动物抗体大多是整合素某单体的抗体、没有很好的可 信的植物抗体以及用植物抗体作出的实验结果不理想等事实，使得至今仍无法确 定植物类整合素蛋白的存在，对此的研究也颇受争议。 但另一方面，大量实验数据确实表明含r g d 序列的多肽会对植物的某些生 理过程造成影响，赵欢、王晶波等人的实验证实r g d 多肽对机械压力所诱导的 黄瓜抗毒素积累产生抑制口1 1 1 3 1 。c h a r a 节间细胞，在其一端加入r g d s 多肽后， 其重力极性调控的胞质环流将被阻断【3 5 1 9 1 。向日葵的原生质体胚芽形成及其细胞 骨架也会受含r g d 的多肽影响，出现胚芽形成率下降，形态异常，细胞骨架被 阻断，结构瓦解等现象【3 6 1 1 0 】。其他一些由于添加r g d s 多肽阻断细胞过程的例 子还包括耐盐烟草原生质体的细胞连接，豌豆防御反应【3 5 】【9 】，豇豆和车前草的防 御反应及其病原菌的交叉感染实验【3 2 】【1 1 】，玉米愈伤组织的形成3 7 】【1 2 1 等。由此看 来，植物细胞机械应力感受体蛋白很有可能属于一类与动物整合素蛋白在结构上 非常不同，但都有结合和响应r g d 配体特性的信号受体。 关于植物细胞粘着成分的研究对象还包括w a k s ( 细胞壁结合激酶) 和细胞 壁果胶、阿拉伯半乳糖蛋白( a g p s ) 、磷脂酶d 、纤维素合酶、植物肌球蛋白 等( 详见附录) 。特别是细胞壁果胶，实验证明其在介导细胞间和细胞与基质问 的粘附过程中起着重要作用，但是其缺乏类似整合素蛋白的双向信号传递功能， 也未见有识别r g d 序列的报道。植物细胞粘着的研究还有待进一步深入。 1 3 细胞骨架在机械应力响应中的作用 在动物细胞中，机械应力信号经粘着斑感受并转换后，主要的下游细胞响应 结构就是细胞骨架。细胞骨架作为细胞结构中重要的力学相关结构，除了维持细 胞形态和保持细胞内部结构的有序性，参与肌肉收缩、变形运动、细胞分裂和细 胞信号传递等生命活动之外，它作为机械应力刺激的传递结构或者目标结构与应 力响应的关系、反应机制等也是很多研究者所关心的问题。 l a n g n l e 和a d a m s o n 以及n o r i a 、j e n g - j i a n n c h i u 等人均对血管内皮细胞和骨 骼细胞这两种长期处于流体剪切力和重力加载状态的细胞进行了详细的研究。包 括细胞的极化作用、细胞伸长情况、微管和微丝系统排列情况等。对内皮细胞在 流体剪切力作用下的形态学响应分析发现，细胞内肌动蛋白丝在应力刺激后出现 排列的重组现象：在静态环境中，肌动蛋白丝定位于细胞的外围；剪切力作用 重庆大学硕士学位论文1 绪论 2 4 h 后长形的、有组织且平行的肌动蛋白应激纤维在细胞的中间区域与剪应力方 向平行排列【2 】【2 9 1 。 组成细胞骨架微丝的肌动蛋白在高等植物中普遍存在，且其结构、功能与动 物肌肉的肌动蛋白相同，因此在植物细胞的应激响应过程中也可能存在相似的现 象。h u s h 和o v e r a l l 在1 9 9 1 年的研究报道中就观察到大豆根细胞的皮层微管在 压力条件下排列方向可以由横向排列变为倾斜或者纵向排列1 3 0 1 。z a n d o m e n i 和 s c h o p f e r 则报道玉米胚芽鞘表皮细胞的切片被弯曲时其微管排列方向改变t t 3 1 1 。 另外，对植物防御反应的研究发现，细胞骨架系统的完整性也是病原菌入侵诱发 正常的细胞壁关联的防御反应的必要条件【3 ”。j a m e skm o r e l l i 等在研究中还发 现在马铃薯块茎组织中，微丝解聚影响到了应力诱导进行翻译的的某些基因的翻 译活性【3 3 】。由此，不难看出，微管、微丝等细胞骨架成分对细胞生理和功能以及 对外界环境的感受性等方面的重要作用。 1 4 课题的提出 虽然还没有实验证实植物细胞具有类似动物细胞粘着斑一类的细胞连接，但 是不管以什么形式存在，细胞连接作为植物细胞间通讯的基本形式的重要性是不 亚于其在动物细胞中的【3 9 1 。植物中可能存在以下几种形式的细胞粘着：细胞壁与 基底物质间的粘着，两相邻细胞壁间的粘着，以及细胞壁膜间的粘着。 从对植物细胞内外信号传递的另一些研究来看，比较多的研究对象如w a k ( 细胞壁结合蛋白激酶) 、磷脂酶d 、纤维素合酶等均属于细胞壁蛋白或跨膜蛋 白，而且在某种程度上参与了细胞壁膜的连接，信号传递等。考虑到对动物细胞 响应外界应力有着关键作用的粘着斑同样属于一种跨膜的细胞连接结构，其组成 成分或位于细胞质膜上，或位于细胞质膜内表面或外表面，与e c m 中的蛋白的 连接是信号传递必不可少的环节等事实，我们有理由将植物细胞响应机械应力的 关键定位在细胞壁膜连接部分，其对应力的响应涉及r g d 序列的识别。这也是 本文希望解决的主要问题之一。其次，鉴于细胞骨架在力学响应方面的重要功能 和对相当多的细胞生理过程的影响，本文将对细胞骨架在实验所加载应力条件下 的信号传递参与情况予以考察。思考其在机械应力传递与细胞响应行为间的作 用。 1 5 研究目的 一、考察植物细胞分裂方向与外加机械应力方向之间是否有联系，如果有则 将这种关系进行初步确立。 二、论证植物细胞壁膜连接特别是基于r g d 识别的部分参与了植物细胞对 6 重庆大学硕士学位论文 1 绪论 外加机械应力的响应过程。 三、初步分析细胞骨架对于植物细胞响应外加机械应力的意义。 1 6 主要内容 建立菊花( d e n d r a n t h e m am o r i f o l i u m ) 悬浮培养系。 对菊花单细胞进行包埋并施加定向定量的机械应力刺激，考察细胞分裂方向 与应力主应力线方向问的关系。 对细胞进行不同药物( 细胞松弛索、秋水仙素、g r g d s 五肽) 处理后，再 对细胞分裂方向的变化进行考察 对不同状态下的细胞进行简单的形态学观察和分析，对细胞壁进行荧光染色 观察，获得更多绍胞与应力关系的数据，以更详细的分析壁膜连接与应力响应的 联系。 7 重庆大学硕士学位论文i 绪论 1 7 技术路线 图1 4 壁膜粘着参与植物细胞响应机械应力的实验研究技术路线 f i 9 1 4 t h e t e c h n i c a l l i n e o f t h e e x p e r i m e n t a ls t u d y o f t h e r o l e o f p l a s m a m e m b r a n e - c e l l w a j l a d h e s i o nd u r i n gp l a n tc e l lr e s p o n s et oe n v i r o n m e n t a lm e c h a n i c a ls t r e s s 8 重庆大学硕士学位论文2 菊花悬浮细胞系建立及琼脂耱固体细胞培养 2 菊花悬浮细胞系建立及琼脂糖固体细胞培养 2 1 实验材料 植物材料： 理论上，植物的任何部分都可以被用来诱导愈伤组织。但是成功率高低要视 植物的品种和质量而定。通常来讲，幼嫩、新鲜的植物材料的诱导率较高。本实 验采用了生长3 0 天左右长势良好的菊花( d e n d r a n t h e m am o r i f o l i u m ) 无菌苗，取 其带叶茎段为接种材料。 仪器药品： m s ( m u r a s h i g ea n ds k o o g ) 培养基 蔗糖( 3 0 9 l ) ，琼脂( 4 9 l ) 植物激素：2 , 4 二氯苯氧乙酸( 2 ，4 - d ) ，6 - 苄氨基嘌呤( 6 b a ) ，玉米素( z a ) 抗生素( 氯霉素) ，聚乙烯毗咯烷酮( p v p ) ，医用酒精( 9 5 ) 筛网( 6 0 目) 2 2 实验方法 愈伤组织诱导：取3 0 天左右的菊花无菌苗带叶茎段( 约l e n a ) 接入愈伤组织 诱导培养基，1 0 1 5 天进行一次传代。在进行至少3 次传代以后可作为建立悬浮 细胞系的材料。 悬浮细胞系建立：取1 9 左右愈伤组织块进行切碎( 在超净工作台进行) ，最 大限度使细胞分散，然后将细胞接入悬浮培养液，同时加入抗生素( 终浓度 0 0 0 9 r n 】) 并放入振荡培养箱进行1 0 0r p m ，2 5 c 避光振荡培养。5 7 天后用 6 0 目筛网将悬浮培养液进行过滤，留滤液分瓶加入新鲜培养液( 体积比1 ：1 ) 和 抗生素后放入培养箱继续振荡培养。然后每7 1 0 天进行一次传代，将原代培养 液一分为二分别加入等体积新鲜培养基和适量抗生素后继续培养。传代3 次以后 开始进行生长量测定，周期3 0 天。由于是液体培养，褐化的现象不很明显，因此 我们在培养液中没有加入p v p 。 悬浮细胞生长量测定：每隔1 天测定一次以细胞鲜重为代表的生物量。测定 方法为将悬浮培养的细胞液样品( 在5 瓶培养液中取样，每瓶取t o n a l ) 注入离心 管中在3 0 0 0 r p m 离心1 0 m i n ，移去上清液后称量积压在管底的细胞质量( g ) 。 2 3 实验结果 2 3 1 愈伤组织诱导培养条件确定 利用实验室已有的菊花愈伤组织诱导培养基进行诱导时发现愈伤组织有褐化 9 重庆大学硕士学位论文2 菊花悬浮细胞系建立及琼脂糖固体细胞培养 的现象，并且诱导出的愈伤组织疏松度稍差。因此，在此基础上我们添加了有抗 氧化作用的聚乙烯吡咯烷酮( p v p ) 后褐化现象得以改善。随后适当提高了2 ，4 _ d 含量，由原来的o 5 m g l 增加到l m g l ，愈伤组织的疏松度大大增加。最后实验 采用的愈伤组织培养基组成如下： m s + 2 ，4 - d ( 1 m g l ) + b a ( o 2 r n g , l ) + z t ( o 3 r n e j l ) + p v p ( 1 l ) 2 3 2 建立悬浮细胞系 悬浮细胞系中细胞的生长速率较固体培养的细胞高。经多次继代后可得至含 大量小细胞团和单细胞的悬浮培养系。本实验主要对i 2 m s 和全m s 两种浓度下 细胞生长情况进行了比较，以决定选用m s 培养基的浓度。 表2 1 细胞在m s 和l 2 m s 培养基中的生长量比较 t a b l e2 1g r o w t hr a t co f c e l li nm sa n d1 2 m s c e l lw e i g h t ( g ) m s 4 4 1 士- 0 1 8 3 9 7 ：k 0 5 0 3 9 i ：l - 0 3 5 4 4 2 士o 6 5 4 7 7 i - 0 6 7 5 3 i ：l - 0 7 1 6 7 9 - 士- 0 8 9 8 2 l y e 0 j 1 1 0 2 5 士- 0 5 l 1 1 8 2 - 1 ：0 9 6 1 2 9 9 士o 1 3 1 4 3 0 i - 0 8 l 1 5 2 4 - 士0 9 6 1 6 - 3 1 o 5 7 1 6 4 0 - 士- 0 4 8 1 6 ，5 6 士1 0 1 l 2 m s 4 7 8 - + 0 ，5 1 4 3 6 士- 0 4 3 4 0 6 - 士- 0 4 2 5 4 8 ：l - 0 3 7 6 7 2 士o 8 9 7 1 妇d ，7 0 1 0 9 4 士0 7 5 1 2 4 0 - 主0 8 2 1 3 3 s 如6 9 1 5 9 8 + 2 5 9 1 8 8 4 i - 0 9 2 2 0 4 2 - - i ：1 5 5 1 9 6 6 ：t ：1 9 5 1 7 9 仕1 4 2 1 7 9 0 - 士1 5 5 1 5 3 8 - - i ：1 1 6 i o 姆 o 2 4 o o m惶h坻体勉m拍嚣如 重庆大学硕士学位论文2 菊花悬浮细胞系建立及琼脂糖固体细胞培养 图2 1 在m s 和1 2 m s 培养基中菊花悬浮细胞生长曲线 f i g2 1g r o w t hc u r v eo f c e l l sc u l t u r e di nm s a n di 2 m s 从图2 1 我们可以看出细胞在1 2 m s 培养基中的生长量总体高于全m s 培养 基。延滞期的时间相对较短。达到的最大细胞生长量明显高于全m s 培养基。在 此基础上我们还对两种条件下的细胞形态进行了显微观察，发现生长在全m s 培 养液中的细胞有部分质壁分离现象( 图2 2 ) ，而1 2 m s 培养液中的细胞则几乎没 有这种现象( 图2 2 ) 。 图2 2 在m s ( 左) 和1 2 m s ( 右) 培养基中生长的细胞照片箭头所示为生长不良的细胞 出现质壁分离状态b a r = 5 0 f i g2 2m i c r o g r a p ho f d e n d r a n t h e m am o r i f o l i u mc e l l sc u l t u r e di nm s ( 1 e f oa n dl n m s ( d g h t ) a n d t h eu n w e l lc e l lw i t hp l a s m o l y s i s ( a r r o ws h o w e d ) a r eo b s e r v e di nm s b a r = 5 0 p m 综合看来，使用i 2 m s 培养基不仅能获得性状比较良好的单细胞，对于药品 材料也是比较节约的一种方式。因此，我们最终确立了菊花( d e n d r a n t h e m a m o r i f o l i u m ) 悬浮细胞系的培养条件是：1 2 m s + 2 , 4 - d ( 1 i n g l ) + b a ( 0 2 r a g l ) + z t ( o 3 m g l ) ，抗生素1 0 0 t g m l ，在2 5 ( 2 避光1 0 0r p m 振荡培养。 重庆大学硕士学位论文3 机械应力加载实验 3 机械应力加载实验 3 1 机械应力加载对细胞生长形态的影响 3 1 1 实验材料 菊花悬浮细胞，琼脂糖，菊花细胞悬浮培养液，p v p ，耐热塑料模具( 2 0 3 0 5 0c m 3 ，厚1 0 r a m ) ，l o o m l 针筒，机械应力加载装置 所有药品和仪器均经1 2 1 、2 0 m i n 灭菌处理后使用。( 后同，特别说明除外) 3 1 2 实验方法 菊花细胞包埋：取1 5 m l 左右悬浮培养的细胞3 0 0 0 q 皿离心5 r a i n ，将下层的 悬浮细胞与约2 0 m l4 5 c 预融的基于菊花悬浮培养液的含2 o 低熔点琼脂糖 ( 3 3 士1 5 c ，f m cb i o p r o d u c t s ，u s a ) 的包埋培养基快速混匀，并迅速倒入方型模具。 在室温下自然冷却，待完全固化后，将注射器吸入空气并沿模具棱线伸入到接触 模具底部后将注射器内的空气打出，使琼脂糖块与模具分离。 机械应力加载和制片：将脱模的琼脂糖块放到机械应力加载装置的应力加载 面，使用加载强度3 0 0m n 进行加载，加载时间2 4h 。加载过程保持在2 5 、黑 暗条件下进行。加载完成后将琼脂糖块取出，浸没在悬浮细胞液体培养基中，黑 暗条件下孵育4 7 天。最后放入组织培养室进行常规培养。对照组则不进行加载， 放在黑暗条件下同样时间后移入培养室进行培养。显微观察用切片选择琼脂糖块 表面5 m m 以下部分，切面平行于应力方向，厚度为0 2 0 s 蛐，切好后置于p h 7 4 的p b s 溶液中，以备观察。 形态及统计分析：对细胞进行显微照相，并对照片中的细胞进行形态学分析 和统计分析。细胞长轴长度、长轴与应力加载方向的夹角等参数采用“s c i o n i m a g e w i n d o w s 版图象处理软件进行测量。数据统计分析采用s p s s l 3 0w i n d o w s 版统计软件进行。 3 1 3 实验结果 实验首先对在刚包埋后和应力加载结束对两组细胞进行形态观察，并对圆球 型细胞数量以及细胞长轴长度进行统计。计算每1 0 0 个完整细胞中圆球型细胞个 数得到其百分比以及对1 0 0 个细胞的长轴进行测量并相加得到长轴总长，每份实 验样品计数5 次。然后用统计软件对其平均值和标准差进行计算。通过i n d e p e n d e n t - - s a m p l et 检验结果显示加载前后圆球型细胞数量和长轴总长都没有显著差异 ( 表3 1 ，表3 2 ) 。可以认为应力加载没有造成细胞明显的塑性形变。 重庆大学硕士学位论文3 机械应力加载实验 表3 1 加载前和加载后圆球型细胞百分比比较 t a b l e 3 1c o m p a r e t h e p e r c e n t a g e o f s p h e r e c e l l b e f o r e l o a d i n ga n d i m m e d i a t e l y a t t e r l o a d i n g t = 0 0 9 4 。s i g = 0 9 2 7 ( t e s ta t0 0 5 ) 。两组数据间无显著性差异 表3 2 加载前和加载后细胞长轴总长比较 t a b l e3 2c o m p a r et h et o t a ll e n g t ho f t h em a j o ra x i so f a l lk i n d so f c e l l sb e f o r el o a d i n ga n d i m m e d i a t e l ya f t e rl o a d i n g t = 0 3 7 8 ，s i g 卸7 1 5 ( t e s ta to 0 5 ) 。两组数据间无显著性差异 加载机械应力后第4 天对样品进行观察，发现呈伸长状态细胞明显增多( 图 3 1b ，c ) 。我们将所获得的细胞图片进行计数并对伸长细胞的伸长方向与应力加 载方向的夹角角度作了统计。分别对加载组和对照组中1 0 0 0 个细胞