（微生物学专业论文）高产酒精酵母的筛选及其rdna+its序列的演化分析.pdf

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统发育学研究，并且对从各种基质中分离到的酵母菌株在发酵产酒精性能上作了不同 层次的筛选。本论文研究方面分为2 个部分： 1 高产酒精酵母菌的筛选本部分旨在对分离到的酵母菌，在发酵产酒精性能上作不 同层次的筛选，为其以马铃薯为基质的工业化生产发酵产乙醇提供基础研究背景。 2 酵母菌的系谱分折本部分旨在对酵母菌的系统发生进行分析。试验采用核酸序列 分析方法，扩增并测序了2 l 株来源不同、生理特性不同的酵母菌株，和4 株模式株的 i t s 区段。系统分析结果表明，9 株在种水平上进行了鉴定，9 株鉴定到属水平，余3 株较难在属水平上鉴定。并通过系统树分析了各供试株之间的亲缘关系和系统演化。 关键词：酵母菌；i t s ，基因系谱学；发酵；酒精；筛选 2 a b s t r a c t t h ey e a s t s ，w h i c hs p r e a de x t r e m e l yw i d e l ya r o u n dt h e5 u r f a c 髦o ft h ee a r t h ，i so n e p a r to f f u n g u sw i mh i g he c o n o m i cv a l u e t h eo v e r w h e l m i n go ft h e ma r es a p r o p h y t e s t h e yp l a ya n i m p o r t a n tr o l ei nt h eb i o i n d u s t r y p e o p l ea r eg r e a t l yi n t e r e s t e di ny e a s t sf o ri t ss t r o n gp o w e r o ff e r m e n t a t i o n t h e yc a rt u r nc a r b o h y d r a t ei n t oe t h a n o la n dc 0 2t h r o u g ht h ep r o c e s so f b i o t r a n s f o r m a t i o n t h e r e f o r e , t h e ya r ea p p l i e dw i d e l y i nt h ef e r m e n t a t i v ei n d u s t y , p a r t i c u l a r l yt h es p e c i e ss a c c h a r o r a y c e sc e r e v i s i a e h o w e v e r , t h es t r a i n sf r o md i f f e r e n t o r i g i n sh a v em a n yd i f f e r e n c e si nt h es o m ea s p e c t si n c l u d i n gh e a tr e s i s t a n t , e t h a n o lt o l e r a n c e ， t h ef e r m e n t a t i v ea b i l i t yt op r o d u c ee t h a n o lb yp r o d u c i n gd i f f e r e n tm e d i u ma n ds oo n p r e s e n t l y , w i t ht h ef o s s i lr e s o u r c e sr e d u c i n gd a yb yd a y , i ti sb e c o m i n gm o r ei m p o r t a n tt o d e e p l ye x p l o i ty e a s t s p r o d u c t i v ep o t e n t i a li nt h eb i o l r a n s f o r m a t i o ne t h a n o li n d u s t r y y e a s t s p r e p o n d e r a n tp r o d u c t i v ea b i l i t yc o u l dn o tb es e p a r a t e df r o mt h es t a t u so fp h y l o g e n e t c d e v e l o p m e n ta n dt h es h a p ee v o l u t i o ni nt h ef u n g u sk i n g d o m t h es h a p eo fy e a s ti ss i m p l e , a n di t ss h a p ed a t au s e di nc l a s s i f i c a t i o ni si n a d e q u a t e i nf a c t , t h ec l a s s i f i c a t i o no fs p e c i e s m a i n l yd e p e n do np h y s i o l o g yb i o c h e m i s t r yc h a r a c t e r i s t i c w i t h t h e d e v e l o p m e n to f m o l e c u l a rb i o l o g y , t h i st e c h n o l o g yi sa p p l i e db r o a d l yi nt h ef u n g u ss y s t e ma n a l y s i s t h e r d n ai t se v o l v em o s tq u i c k e l ys ot h a ti tm a yr e f l e c tt h ec h a n g e si nt h er e a lm o l d m u s h r o o ms p a w n0 1 i nt h eg r o u p t h i sp a p e ri st om a k es t u d i e so ny e a s t sw i t hd i f f e r e n t p h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c sf r o md i f f e r e n to r i g i n st h r o u g ht h ea n a l y s i so fr d n ai t s s e q u e n c ei np h y l o g e n e t i c s m o r e o v e r , t h ey e a s ts w a i n sw h i c hw e r es e p a r a t e di nt h e f e r m e n t a t i o nw e s c r e e n e da td i f f e r e n tl e v e l so nt h ea b i l i t yo fp r o d u c i n ge t h a n 0 1 t h e r e s e a r c hi sd i v i d e di n t ot w op a r t sa sf o l l o w i n g ： 1 t h es c r e e n i n go f h i g hp r o d u c t i v ey e a s ts l r a i nt op r o d u c ee t h a n o l t h i sp a r ti sf o rt h ep u r p o s eo fs c r e e n i n gt h es e p a r a t e dy e a s ts t r a i n sa td i f f e r e n tl e v e l so n t h ea b i l i t yo fe t h a n o lp r o d u c t i o ns ot h a ti tc a n p r o v i d et h eb a s i cr e s e a r c hb a c k g r o u n df b ri t s p a t a t o - b a s e di n d u s t r i a l i z e dp r o d u c t i o n 2 p h y l o g e n e t i ea n a l y s i so fy e a s t t h i sp a r ti st oa n a l y z ey e a s t s p h y l o g e n e s i s d u r i n gt h i se x p e r i m e n t , t h er d n ai t so f2 1 i s o l a t es w a i n sw i t hd i f f e r e n c tp h y s i o l o g i c a lc h a r a c t e r i s t i c sf r o md i f f e r e n to r i g i n sa n d4t y p e 3 s t r a i n s ，h a sb e e na m p l i f i e da n ds e q u e n c e dt h r o u g ht h en u c l e i ca c i ds e q u e n c ea n a l y s i s m e t h o d t h er e s u l t sf r o mt h es y s t e m sa n a l y s i si n d i c a t et h a t9i s o l a t e s t r a i n sa r ei d e n t i f i e do n s p e c i e sl e v e l ，9o ng e n e r al e v e l ，a n dt h el e f t3s w a i n sa l eh a r di d e n t i f i e do ng e n e r al e v e l m e a n w h i l e ，t h er e l a t i o n s h i pa m o n gt h et e s t e ds t r a i n sa n dt h e i rp h y l o g e n ya r ea n a l y z e db y p h y l o g e n e s i st r e e 4 第一章前言与综述 酵母菌( y e a s t ) 是一类有着重要经济价值的真菌，在地球表面分布极广，特别是在 含糖基质上，如蜂蜜、果树叶及果实的表面，尤为丰富。此外在土壤中、动物排泄物、 牛奶及植物营养体部分等都可找到。它们中的绝大多数是腐生菌( s a p r o p h y t e s ) ，在酿 造、食品、制药、及酶制剂等工业方面有着重要的作用。仅少数种类能引起植物、动 物和人体病害和败坏食品。本章从酵母菌的国内外研究状况，真菌分子系统学在酵母 菌系谱分析中的应用和工业上利用酵母菌生产酒精的研究进展这三方面进行综述。 1 酵母菌的国内外研究概况 i i 酵母菌的分类 酵母菌( y e a s t s ) 一词不是分类学上的用语，没有分类学地位，只是简单的表示一 种生长形式，是一个形态学上的描述语言，代表了一类形态比较简单、缺乏明确分化 器官的真菌群体。这一群体的菌物，包括子囊菌( a s c o m y c e t c s ) 和担子菌 ( b a s i d i o m y c e t e s ) ，在其生活史的大多数阶段主要以酵母形式存在，如酿酒酵母 ( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 。尽管单细胞阶段常被强调为分类特征，还是有一些子囊 菌酵母或担子菌酵母也产生菌丝状( p s e u d o m y c e f i u m ) 结构，如假丝酵母属( c a n d i d a ) 。 由于营养体形态单一和性作用的消失，研究子囊孢子及其化学能力方面显得很重要。 属以下的分类主要依靠生理学特性，在生理特性中又以糖的发酵和同化为重要依据。 在氮源方面是否同化硝酸盐这一点在l o d d e r 系统中提得很高，甚至作为分属的依据， 因为酵母菌株的该性状很稳定。而其它生理特性则只在区分某些属、种时有用，如对 维生素的需求，对高温：高渗透压的耐性和尿素分解等指标。 ， 酵母( y e a s t ) 在分类学上属于真菌类，分属于子囊菌纲和担子菌纲。酵母的分类 最早是从g u i l l i e r m o n d ( 1 9 0 1 ) 、s t e l i n g d e k e r ( 1 9 3 1 ) 、l o d d e r ( 1 9 3 4 ) 开始研究的， 自1 9 5 2 年荷兰学者l o d d e r 和k r e g e r v a nr i j 在其所著n ey e a s t 一书中进行了分 类，此后分类研究工作不断发展。1 9 7 0 年l o d d c l 等1 3 名学者编集了酵母分类专著t h e y e a s tat a x o n o m i cs t u d y ( 1 9 7 0 ) 。该专著将酵母菌主要分三个类群：形成一般子囊孢 子的酵母科( s a c c h a r o m y c e t a e e a e ) 为有孢子酵母类产子囊孢予酵母( a s c o s p o r o g e n o u s 5 y e a s t ) ，根据其增殖方式以及孢子形态、对糖的发酵性能及对硝酸盐的利用情况等，可 分为4 群1 9 个属；无孢子酵母类( a s p o r o g e n o u sy e a s t ) 属于隐球酵母科 ( c r y p t o c o e e a e c a e ) ，根据产生色素能力，产类似淀粉样物质情况以及对肌醇的利用情 况等，可分为红酵母属( r l w d o t o r u l a ) 和隐球酵母属( c r y p t o c o c c u s ) 等1 2 个属；掷 孢子酵母( b a l l i s t o s p o r o g e n o u sy e a s t ) 可分为掷孢酵母属( s p o r o b o l o m y c e s ) 等5 个属。 根据a i n s w o r t h 等( 1 9 7 3 ) 的真菌分类系统，侠义的酵母菌属于子囊菌亚门 ( a s c o m y c o t i n a ) ，半子囊菌纲( h e m i a s c o m y c e t e s ) ，内孢霉目( e n d o m y c e t a l e s ) ，酵母 菌科( s a e e h a r o m y c e t a e e a e ) 。 1 2 酵母菌的生物学特性 酵母菌科( s a c c h a r o m y c c t a c e a e ) 包含了所有的不形成菌丝体( m y c e l i u m ) 的子囊 菌。营养体单细胞，球形，卵圆形，椭圆形或长方形。以芽殖或裂殖方式进行无性繁 殖。芽殖时往往在一个芽出细胞还没有脱落时，母细胞或芽细胞又生出第二个芽出细 胞，因而形成一串细胞，外表上很象菌丝( h y p h a ) ，称为假菌丝( p s e u d o h y p h a ) 。少数 酵母菌的菌体生长到一定长度时，在细胞中间断裂而增殖。有性生殖由营养细胞或子 囊孢子结合，先质配( p l a s m o g a m y ) 后核配( k a r y o g a m y ) ，组成双倍体的结合子，然 后行减数分裂( m e i o s i s ) ，进一步发育成子囊( a s c u s ) ，并在子囊内形成4 个或8 个子 囊孢子( a s c o s p o r e ) 。子囊孢子单细胞，球形，卵圆形，帽状，半球状或星形等。 酵母菌因为有很强的发酵力而引起人们的极大兴趣，它能把碳水化合物转化成酒 精( e t h a n 0 1 ) 和二氧化碳，因而被广泛的应用于发酵工业中，其中以酿酒酵母( & c e r e v i s i a e ) 用得最普遍，酿造业主要是取它的酒精产物，而烘制业则主要利用它发酵 后产生的二氧化碳来发面。 1 3 酵母菌系统发生研究的进展 过去的几年中，酵母菌的系统分类方面取得了巨大的进步。当缺少有性生殖时， 就有研究人员利用重氮蓝( d i a z o n i u mb l u eb ，d b b ) 染色、芽孢子形成方式、脲酶产 生以及细胞壁组分和超微结构将子囊菌酵母与担子菌酵母分开。其它特征如氧化呼吸 链中的辅酶q 曾被用于辅助属级水平的建立，然而现今认为这一特征具有更大的可变 性。为在低级分类等级上区分酵母菌，碳水化合物的同化和发酵及其它生理特征常被 使用，这些方法的可靠性已经被早期用于这一问题的分子生物学方法证实，主要包括 6 鸟嘌呤，胞嘧啶( g c ) 比率和d n a d n a 杂交( k l g e r - v a nr i j ，1 9 8 4 ) 。而当前d n a 序列研究主要是分析和解决子囊菌酵母分类群间的亲缘关系。 在一个细胞上芽细胞形成的位置已用于高分类等级的特征( k r e g c r - v a nr i j ，1 9 8 4 ) 。 如二极芽殖( b i p o l a rb u d d i n g ) 是拿逊酵母科( n a d s o n i a c e a e ) 和类酵母科 ( s a c c h a r o m y c o d a c e a e ) 成员的特征，其它酵母菌是多边芽殖。裂殖酵母目 ( s c h i z o s a c c h a r o m y c e t a l e s ) 裂殖酵母属( s c h i z o s a c c h a r o m y c e s ) 的种是以横裂方式进 行繁殖的酵母菌，其生境同于酵母目的生态。它的一个种八孢裂殖酵母 ( s c h i z o s a c c h a r o m y c e so c t o s p o r u s ) 因其孢子壁含有直链淀粉，遇碘而使孢子变蓝，可 以清楚的在子囊中被鉴别出来。裂殖酵母属的四个种传统上与酵母目中的酵母菌归在 一起，然而这类酵母就以细胞分裂方式和细胞壁多糖等特征与酵母且分开。k u r 乜r n a n ( 1 9 9 3 ) 的r d n a 序列分析支持它们归入一个独立的目，n i s h i d a a n d s u g i y a m a ( 1 9 9 4 ) 将这个属放于古子囊菌( a r c h i a s c o m y c e t c s ) 。以前菌物学研究者对一些古子囊菌和酵 母日之间的关系存在很大的分歧，但是近年来，这两类菌物的关系已为多数菌物学家 所接受。另外，有时候主要以子囊孢子和分生孢子的形态为依据，将酵母目的某些成 员与丝状子囊菌归在一起，尤其是蛇口壳属( o p h i o s t o m a ) 和长喙壳属( c e r a t o c y s t i s ) ( r e d h e a da n d m a l l o c h ，1 9 7 7 ；y o n a r x a n d v a n d c r w a l t ，1 9 8 7 ) 。由于在子囊菌酵母系 统学研究中引入了d n a 序列分析，这些分歧已基本解决( b a r n s e t a l ，1 9 9 1 ；h e n d r i k s e ta 1 ，1 9 9 2 ；b e r b e ea n dt a y l o r ，1 9 9 3 ；k u r t z m a n ，1 9 9 3 ；k u r t z m a na n dr o b n e t t ，1 9 9 4 ) 。 2 真菌分子生物学技术在酵母菌系统发生研究中的应用 酵母菌这一形态学上的类群并非一个单系类群，而是一个复系群( p o l y p h y l e t i c g r o u p ) 或并系群( p a r a p h y l e t i cg r o u p ) 。酵母菌的传统分类在以前主要是建立在形态和 生理生化特性基础上，然而由于表型特征的不稳定性使结果变得不是很明确。新的分 类技术，尤其是分子生物学技术的发展，和经典的分类方法的结合给生物类群的分类 带来了巨大的活力。d n a d n a 同源性分析、脉冲电泳核型分析核r d n a r r n a 序列分 析等的应用，给酵母菌阐述自己的历史带来了极大的方便。分子系统学( m o l e c u l a r s y s t c m a d c s ) 是检测、描述并解释生物在分子水平的多样性及其演化规律的学科。 核酸分析方法主要有r d n a r r n a 序列分析法、r f l p 分析法、r a p d 分析法等。 近几年来，这几种方法在酵母菌分类中都得到了广泛的应用。加上i n t e m e t 数据库的日 益完善以及相关软件的日趋成熟，使我们能简便快捷的反映酵母菌自然的系统演化关 7 系。但是由于酵母菌自身的特性，我们依然不能忽略生理生化方法、化学方法以及数 值分类方法等传统分类方法的运用。具体应用有如下几个方面。 2 1r d n 酣r m 峨序列分析法 酵母菌是单细胞的真核微生物，其核糖体r n a ( r r n a ) 由相应的编码基因编码。 而编码r r n a 的基因及其间的间隔区( s p a c e r ) 统称为核糖体d n a ( r d n a ) 。间隔区 包括内转录间隔区( i n m r m d 订a n s c r i b c ds p a c e r ，i t s ) 、外转录间隔区( e x t e r n a lo a n s c r i b e d s p a c e r ，e t s ) 等，其中在酵母菌分子系统学中应用较多的是i t s 。 r d n a r r n a 序列分析法较为可靠，且有日益完善的g e l l b 卸k 门既i b l 仍d b j 数据库 和序列分析软件作为支撑，因而成为酵母菌主要的分类方法，但该法相对较为复杂， 当菌株数量很多时有些费时。 2 1 1 2 3 2 8 sr c 黼r n a 序列分析 自g u a d c t 等( 1 9 8 9 ) 和o d o n n e l l ( 1 9 9 3 ) 首次使用2 3 2 8 sr d n a r r n a d l d 2 区序列分析来鉴定真菌以来。f e l l 等( 2 0 0 0 ) 通过2 3 2 8 sr d n ad 1 d 2 区序列分析对酵 母菌进行了分子系统学研究。结果表明，这些酵母菌种和属在系统发育上分布在3 个 纲的1 1 个进化枝中。其中b e n s i n g t o n i a 、c r y p t o c o c c u s 、r h o d o t o r u l a 和s p r o b o l o m y c e s 等属是多系的，而b u l l e r a 、c r y s t o f i l o b a s i d i u m 、f e l l o m y c e s 等其它一些属则是单系的。 此外，他们发现尽管区分紧密相关的种时需要运用i t s 区，但大多数种都可以用d 1 d 2 区序列分析鉴定出来。这是对所有已知担子菌酵母的r d n ad 1 d 2 区序列的首次研究。 k u r t z m a n 等( 1 9 9 3 ，1 9 9 4 ，2 0 0 3 ) 钡e 定了子囊菌酵母的2 3 2 8 sr d n ad 1 d 2 区的序列，认 为酵母菌不同菌株2 3 2 8 sr d n a d l d 2 区核苷酸替换率超过了1 可以表示为不同的 种，而属于不同种的菌株其核苷酸替换率则一般较大。 对根据常规形态和生理生化性状难以确定分类学地位的8 株假丝酵母，白逢彦等 进行了2 3 2 8 sr d n a d l d 2 区的碱基序列分析为依据的分子分类学研究，并确定了各 个菌株的归属问题。 现在，所有己描述的酵母菌种的2 3 2 8 sr d n ad 1 d 2 区的序列都可以在i n t e r a c t 的核苷酸数据库上查询，如g e n b a n k 、e m b l 和d d b j 等。因而通常仅根据其d 1 d 2 区序列就可以鉴定到一个菌株到种。总的来说，2 3 2 8 sr d n a d l d 2 区序列分析结果 与d n a 杂交结果及标准表型分析结果相一致，但有时具有相同d 1 d 2 区序列的菌株， 杂交遗传学和标准表型特征却表明它们不属于同一个种。 2 1 21 6 1 8 sr d n a r r n a 序列分析 酵母菌1 6 1 8 sr d n a j r r n a 存在不同保守程度序列的现象，使得该分子可以用来 衡量亲缘关系较远的酵母菌株。 s u b ( 1 9 9 6 ) 和n a k a s e ( 1 9 9 9 ) 分析了b u l l e r a 和u d e n i o m y c e s 属几个种的1 6 1 8 s r d n a 序列，证实了b u l l e r a 属和u d e n i o m y c e s 属分开的合理性，并发现b u l l e r a 属的异 源性。c a i 等用1 8 sr r n a 序列分析方法对子囊菌酵母4 属2 8 个菌株作了分子系统学 研究。结果表明，b r e t t a n o m y c e s 、d e k k e r a 和d e b a r y o m y c e s 属显示了一定的同源性， 而k l u y v e r o m y c e s 属则具有显著的异源性。 除了单独运用2 3 s 2 8 s 或1 8 sr d n a r r n a 进行酵母菌分子系统学研究外，也有 不少研究者将二者结合起来进行研究。g u e h o 等( 1 9 9 0 ) 利用这两类r r n a 序列研究了 s t e r i g m a t o m y c e s 和f e l l o m y c e s 属的无性型。认为根据序列相似性，s t e r i g m a t o m y c e s 属 由两个种组成，而f e l l o m y c e s 属则包括3 个种。与相应有性型比较表明，s t e r i g m a t o m y c e $ 和f e l l o m y c e s 这两属紧密相关，而s t e r i g m a t o m y c e s 则与l e u c o s p o r i d i u m 关系稍密切。 这是小亚基和大亚基r r n a 序列在担子菌酵母分类研究中的首次应用。 2 1 3 n l s 序列分析 i t s 区序列的比较分析对酵母菌的分类是很有用的。有研究者认为，只有i t s 区全 序列才能确保鉴定的正确性。若两个菌株整个i t s 区序列相似性超过9 9 ，则可认为 是同一个种。原则上讲，i t s 区在确定密切相关种问的亲缘关系时是引人注目的，与 1 8 sr r n a 序列相比，i t s 区具有较高的差异率。 i t s 区序列往往与其它序列相结合，应用于酵母菌分子系统学研究中。j a m e s 等 ( 1 9 9 6 ) 分析了t o r u l a s p o r a 和z y g o s a c c h a r o m y c e s 两个属小亚基r r n a 序列和两个内转 录间隔区，即i t s i 和i t s 2 序列，认为这两个属在系统发育上是相互混杂的。基于小 亚基r r n a 、i t s l 和i t s 2 的系统树虽有微小差异，但总的来讲，三种系统树是一致的。 这两个属种间的i t s 2 序列比小亚基r r n a 序列存在大得多的种间差异，因而在衡量紧 密相关种的系统发育关系时优于小亚基r r n a 。尽管一些种i t s 序列存在株间差异，但 在两个i t s 区域有可能识别出能区分种的保守区。 2 2 r f l p 分析法 限制性片段长度多态性( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r f l p ) 主要取 决于限制酶使用的种类和数量。应用限制酶的目标是获得限制酶识别位点的准确位置， 9 这些特征可用于说明d n a 序列本身的特征，为群体及物种的进化和系统发育提供信 息。b o s t e n 等在1 9 8 0 年最早用此法对菌种及菌株进行鉴定。r f l p 分析法技术方法简 便，影响因素少，稳定性高。但用限制酶消化整个基因组d n a 产生的酶切图谱往往伴 有浓重的背景，使特征性酶切条带在这一背景下较难辨认。 在酵母菌系统分类研究中，m t d n a 的r f l p 分析得到广泛应用，这是因为m t d n a 较小，适于进行限制性酶切分析，而且不同的种具有种内独特的m t d n a 限制性图谱， 尽管存在种内差异，但种内限制性图谱显示高度的相似性。很明显，限制性酶切分析 法在区分酵母菌种方面有一定的应用潜力，也是酵母菌系统学有用的手段。s u 等( 2 0 0 1 ) 对代表c a n d i a 属的7 个种和l o d d e r o m y c e se l o n g i s p o r a 的1 9 株菌进行了m t d n a 限制 性内切酶酶切分析，结果出现了似乎呈现种特异性不同的断裂图谱，极少有明显的共 同限制性片断，8 株c a n d i ap a r a p s i l o s i s 菌株，包括模式菌株以及一度被认为是c p a r a p s i l o s i s 有性型的l o d d e r o m y c e se l o n g i s p o r a 具有不同的限制性内切图谱，这为两个 菌种的区别又提供了一个证据。 此外，r d n a 的r f l p 分析也屡见报道。m o l i n a 等( 1 9 9 6 ) 扩增了d e k k e r a 属及其无 性型b r e t t a n o m y c e s 属的1 1 个模式菌株的小亚基r d n a 的序列，并用一系列核酸内切 酶消化，聚类分析产生了4 个不同的产子囊孢子类群。结果与同工酶电泳分析和d n a 同源分析具有一致性，并证实以前报道的无性有性型对和属内同名。 2 3r a p i d 分析法 广义随机扩增多态性d n a ( r a n d o ma m p l i f i e dp o l y m o r p h i cd n a ，r a p d ) 包括侠 义r a p d 、a f l p ( a m p f i f i c a f i o n f r a g m e n t l e n g t h p o l y m o r p h i c ) 和a p - p c r ( a r b i t r a r y p r i m e r p c r ) ，分别由w i l l i a m s 等( 1 9 9 0 ) 、w e l s h 等( 1 9 9 2 ) 、g e a t a n o - a n o l l e s 等( 1 9 9 1 ) 发明， 这三种方法本质上都是任意引物的随机扩增，区别是所用引物的长度不同而已。r a p d 分析方法的发现，为在事先不清楚d n a 序列的情况下检测基因组中存在的多态性片断 提供了方便，这一技术被首先用于分子系统学研究中。 m e s s n e r 等用r a p d 分析解释了s p o r o b o l o m y c e sa n t a r c t i c u a 、s t e r i g m a t o m y c e s a p h i d i s 和i i l l e t i o p s i s 属中相关种不是同种的可能性。认为r a id 分析法是一种简便、 高度灵敏的方法，可用于d n a 水平上种的区分，可用于替代n d n a - n d n a 杂交试验 进行酵母菌种的鉴定、特征描述及界定。 l o 3 酵母菌生物转化碳水化合物生产酒精的工业研究概况 该类菌物给我们的生活带来了巨大的影响。首次利用酵母菌大约在公元前6 0 0 0 年， 酿酒酵母( & c e r e v i s i a e ) ，因其发酵碳水化合物的能力而备受关注。由于酵母菌的这 一性能及其产物酒精和二氧化碳，被广泛用于啤酒、果酒和烧酒酿造以及面包焙制等 工业中。酵母的功能只是在发酵历史的近期才被我们了解( p a s t e u r ，1 8 6 6 ) ，在1 8 8 7 年，d eb a r y 用现代方法对子囊菌酵母进行了研究。因这类生物重要的工业价值，此后， 人类加快了对酵母菌知识的认知( e da n d n a g o d a w i t h a n a ，1 9 9 1 ) 。 3 1 燃料乙醇的提出 近年来的能源危机和环境恶化引起世界各国高度重视，寻找替代石油的燃料己成 为全球日益紧迫的课题( a l a n e w h e t s 等，1 9 9 9 ) 。燃料乙醇因清洁便捷和可再生，是最有 发展前景的液体燃料，被纳入许多国家的发展战略规划，将其部分或全部代替汽油作汽 车燃料己成为世界范围的一种趋势，得到各国政府的支持和鼓励。通过适当预处理， 任何类型的生物量( b i o m a s s ) 都可以作为酒耪发酵的底物。美国能源部在1 9 9 3 年和 1 9 9 7 年的2 次规划中都将生物能源( b i o e n e r g y ) 作为重点发展方向，并预测2 0 1 0 年生 物能源将占整个能源市场的5 0 。2 0 世纪7 0 年代始，巴西经过3 0 年的努力，乙醇燃 料已得到广泛应用，直至2 0 0 2 年，巴西乙醇替代汽油的比率接近5 0 。欧盟在2 0 0 0 年1 1 月提出了清洁能源“绿皮书”，又于2 0 0 2 年4 月启动了“欧洲聪明能源计划”， 计划2 0 1 0 年生物能源至少达到1 2 以上( g g r a s s i1 9 9 9 ) 。我国也在“十五”规划 中将开发生物能源摆在了重要位置，并通过试点已初步实现汽油中添加1 0 燃料乙醇 的目标( 路明，2 0 0 5 ) 。 燃料乙醇是一种“生长出来的绿色能源”，可以用含淀粉( 玉米、小麦、和薯类等) 、 纤维素( 秸秆、林木等) 或糖质( 甘蔗、糖蜜等) 等原料经发酵蒸馏而制成。我国淀 粉资源丰富，年产玉米至少1 2 亿t ，小麦1 0 亿t 左右，薯类0 3 5 亿t ，它们都是 是可再生的有机资源，将其生物转化( b i o t r a n s f o l n m t i o n ) 为燃料乙醇，可以缓解日 益增长的能源问题。国内外已有大量关于淀粉产酒精的研究报告，并初步建立了相关 的产业链。目前，美国以淀粉质原料为基质生产的最终酒精浓度可达到9 5g d l ，而我 国大部分的酒精厂则在6 0 8 0g d l 之间( 章克昌2 0 0 0 ，谢林等2 0 0 0 ) 。然而传统酒 精发酵工艺存在原料转化率不高、产生的酒糟和废水对环境造成一定程度的污染，并给 酒精生产企业带来较大的酒糟后处理压力等问题。这给科研工作者今后如何充分利用 生物质能( b i o m a s se n e r g y ) 提出了新的课题和研究方向。目前已有一些成果得以应 用，如双酶法糖化等，但有些成果的应用却因料液带渣所扰，如各种固定化发酵技术、 差压精馏技术等。笔者从生物学的角度，以其工艺流程为线综述了淀粉生产燃料乙醇 的研究进展。 3 2 发酵基质的生物处理 乙醇发酵微生物如酿酒酵母( & c e r e v i s i a e ) 和运动发酵单孢菌( z y m o m o n a s m o b i l i s ) ，缺乏淀粉水解酶，不能直接转化淀粉为乙醇，必须在发酵之前将淀粉水解 为乙醇发酵微生物可以利用的糖类。目前对酶法水解和微生物水解研究较多。 3 2 1 双酶法直接水解 淀粉原料生产酒精一般要经过液化( l i q u e f a c t i o n ) 和糖化( s a c c h a r i f i c a t i o n ) 过程，传统液化方式主要通过高温蒸煮来完成，这种方式不仅能耗高，而且液化效果也 欠佳，在一定程度上影响了原料的转化率。近年来，隧着酶制剂行业的发展，加酶液化技 术已广泛应用于淀粉水解，并已取得了很好的效果。双酶法糖化是淀粉发酵生产酒精的 重要前期处理步骤，即中温蒸煮时加入a 一淀粉酶，糖化时加入糖化酶，蒸煮目的是使 颗粒状态的淀粉变为糊化状态的淀粉，而糖化的目的则是要把糊化状态的淀粉转化为 酵母能够发酵的糖类。但双酶法糖化醪制备十分费时，同时由于糖化酶的逆合作用和糖 化酶制剂中所含葡萄糖苷转移酶的作用，不可避免地会产生异麦芽糖和潘糖等非发酵 性糖，从而影响到淀粉的利用率，而且还要考虑体系温度、p h 值、作用时间、酶用量和 原料成分等因素对水解率的影响。 当前利用淀粉质原料发酵生产酒精，其高成本主要有2 个原因：一是酵母菌不能直 接利用淀粉，需要使用酶；再者就是淀粉质原料需要蒸煮。虽然采用低温蒸煮或非蒸 煮发酵使能耗降低5 0 ，但添加大量酶以获得可发酵的糖是必须的。因而面对高运作 成本的问题，对于如何通过糖化工艺的改善有效降低酒精的生产成本显得尤为重要。 3 2 2 微生物水解 采用商业糖化酶水解淀粉原料以生产酒精时成本较高，而将糖化茵与酒精生产菌 混合培养于合适的条件下，同步糖化发酵淀粉生产酒精，不仅可以省去糖化工序，更重 要的是能解除淀粉水解产物对糖化的反馈抑制作用。能产生葡萄糖淀粉酶的微生物主 要是根霉( r h i z o p u ss p ) 、黑曲霉( a s p e r g i l l u sn i g e r ) 、泡盛曲霉( a s p e r g i l l u s a w a m o r i ) 、扣囊拟内孢霉( b n d o m y c o p s i sf i b u l i g e r a ) 、枯草芽孢杆菌( b a c i l l u s s u b t i l i s ) 等，但目前主要用的菌种是彳n i g e r 和r h s p 产生的糖化酶。r h s p 是 最常见的霉菌，繁殖生长快，条件要求不苛刻，在代谢过程中可产生丰富的葡萄糖淀粉 酶，具有较强的生淀粉水解能力。曲霉在代谢过程中能产生多种活性酶如葡萄糖淀粉 酶、a 一淀粉酶、蛋白酶等，现在工业上生产糖化酶的菌种主要是爿n i g e r 的变异菌种。 有不少研究者对此进行了尝试。 早在2 0 世纪5 0 年代，日本学者y a m a s a k i 等就报道过淀粉不经蒸煮直接进行酒精 发酵，发现丘n i g e r 的淀粉酶活力比米曲霉( 彳o r s z e ) 高，淀粉可不经蒸煮就能被 用来发酵生产酒精。1 9 8 6 年，h i d e o t a n a k e 等将能产a 一淀粉酶的好氧微生物泡盛曲 霉( a s p a 嬲册r 力和运动发酵单孢菌( zm o b i l i s ) 混合固定于海藻酸钙中，直接发 酵淀粉生产酒精。y e o n 等混合培养$ c h w a n n i o m y c e se a s t e i 和sc e r e v i s i a e , 直接 发酵可溶性淀粉产酒精，利用率达9 4 。但