体内药物分析样品前处理.ppt

生物分析实验技能培训,样品前处理技术篇,一.样品前处理技术简介(SamplePre-treatment;SampleProcessing;SamplePreparation)二.蛋白沉淀法(ProteinPrecipitation)三.液-液萃取法(Liquid-LiquidExtraction)四.固相萃取法(SolidPhaseExtraction)五.如何处理可能不稳定的样品六.LC/MS/MSBA方法需注意的问题,2,为什么需要样品前处理？主要有以下几个因素：富集样品，提高检测方法灵敏度；最终进样提取物与流动相以及所选色谱柱兼容；生物基质样品太“脏”:各类生物基质中存在大量蛋白，盐分，磷脂类化合物，药物的代谢产物等等，它们均有可能干扰目标化合物的测定。,3,一.样品前处理技术简介,生物基质的复杂性，以最常见的人血浆为例：水分：90-93%;血浆蛋白：7-9%;可溶性盐（电解质），尿酸，肌氨酸酐等：少量。,4,一.样品前处理技术简介,5,一.样品前处理技术简介,样品前处理的预期目标：去除各种干扰物；使进样提取物与分析体系兼容；浓缩样品，提高检测灵敏度；保护分析系统（延长色谱柱寿命）；衍生化目标化合物；,简单,方便,准确度好,重现度高,低成本,安全,6,一.样品前处理技术简介,样品前处理的预期目标：关键词：分离目标化合物与其它组分的不同点是什么？溶解性，极性，亲水亲油，酸碱性，分子大小，在色谱柱上具有不同保留特性等等,7,一.样品前处理技术简介,常见的样品前处理方法：直接稀释法；超滤法（多用于测定游离药物含量）；蛋白沉淀法；液-液萃取；固相萃取法；,信号强度（提取回收率，基质效应）,干扰,稳定性,粗放度,效率,8,一.样品前处理技术简介,直接稀释法最简单的样品前处理方法(dilute-andshoot)；对所有化合物的回收率为100%；有利于不稳定样品的处理；成本低；选择性差；应用有限（灵敏度和基质效应）；不适用于组分复杂基质。,9,一.样品前处理技术简介,非液态样品（组织，器官，干血点采集样品DBS）,液态样品（血浆，尿液，组织匀浆液等等）,直接稀释（所有物质均被提取）,蛋白沉淀（除蛋白）,液-液萃取（极性类似的化合物被提取）,固相萃取（同类结构化合物被提取）,免疫亲和提取（只有目标化合物被提取）,提取物,LC-MS,常用前处理方法的特点：,10,一.样品前处理技术简介,生物样品中，通过使蛋白变性将其分离出体系的方法。通过以下沉淀剂，多种血浆（人，犬，大鼠，小鼠）中超过90%的总蛋白可以被除去,11,二.蛋白沉淀法,12,二.蛋白沉淀法,在96孔板中加入标准曲线样品，质控样品和未知样品各50L,在需要的样品中加入50L内标工作溶液，空白样品用溶剂补加,加入乙腈600L，封板后充分混匀1分钟,平行原则；防止污染,氮气吹干上清后，加入200L重溶解液，摇匀后进样,浓缩样品并使其与分析系统兼容,加入与水互溶的有机溶剂，推荐有机溶剂-血浆体积比至少为1.5比1,蛋白沉淀法的优势与局限性几乎适用于所有的小分子化合物，无论其极性大小；方法快速，易标准化，易采用全自动/半自动化设备进行大批量分析；化合物回收率接近100%，几乎所有的小分子化合物都被提取，尤其适用于代谢产物鉴定。选择性差，容易产生干扰；不利于延长分析色谱柱寿命；基质效应（离子抑制）较为严重。,13,二.蛋白沉淀法,14,三.液-液萃取法,利用目标化合物在生物基质和与水不互溶的有机溶剂中溶解度或分配系数的不同，使化合物从生物基质中转移至有机相中的方法。提取之前，生物样品常与缓冲液混合以改变体系pH；最常用的几种溶剂：甲基叔丁基醚，乙酸乙酯，正己烷，1-氯丁烷或者它们的混合溶剂；通过改变体系的pH值和选择适当的提取溶剂，可去除大部分基质中的磷脂，蛋白与无机盐。,15,三.液-液萃取法,常见的亲水与亲脂官能团,16,三.液-液萃取法,常见的亲水与亲脂官能团(续表),17,三.液-液萃取法,常用的液-液萃取剂,*与水互溶,18,三.液-液萃取法,常用的液-液萃取剂对很多有机化合物来说，乙酸乙酯是一种很强有力萃取剂，因此杂质较多；氯仿和二氯甲烷是非常好的挥发性溶剂，但它们的密度比水大，造成萃取层在底部，两相不易分离，故换用氯代正丁烷较好；甲苯相对于苯来说毒性较小，但其沸点较高不易挥发，是它应用较少的原因;乙醚是一种极性较小的易挥发溶剂，但其与水有一定的互溶性（大约4%），其提取层较难挥干，因此甲基叔丁基醚（MTBE）更为常用。,19,三.液-液萃取法,混合溶剂提取与pH的影响,不同的提取溶剂组合与pH条件下，酮康唑的相对回收率，峰面积已用内标面积校正。0H100E表示：正己烷:乙酸乙酯0:100(体积比)。,20,在96孔板中加入标准曲线样品，质控样品和未知样品各50L,在需要的样品中加入50L内标工作溶液，空白样品用溶剂补加,10分钟后，加入100L缓冲液（0.5M醋酸铵溶液，含2%甲酸）,内标配置溶剂尽可能含有少的有机溶剂,氮气吹干上清后，加入200L重溶解液，摇匀后进样,MTBE极易挥发，需充分润枪头以防滴漏和交叉污染,10分钟为平衡时间，可使内标与基质充分平衡,三.液-液萃取法,液-液萃取法的优势与局限性为提高方法灵敏度有时会取较大样品体积，采用液液萃取法，带来信号的提高一般大于基质效应所带来的信号损失；不同pH体系中与不同的萃取剂组合，可控制回收率，并降低基质效应；低成本，重复性好，方法转移容易。较难实现自动化（混匀提取步骤）；不适用于水溶性化合物的提取；对于极性相差较大的多化合物同时提取困难。,21,三.液-液萃取法,常见固相萃取法原理介绍（以C18,HLB,MAX,MCX,WAX,WCX为例）.,22,四.固相萃取法,HPLC与SPE的区别,23,四.固相萃取法,HPLC可分离结构类似的化合物，SPE的分离依靠各化合物之间显著不同的选择性。在SPE与HPLC保留机理相同的前提下，如果化合物在HPLC柱上不能得到很好的分离，那么它将不可能在SPE上得到更优分离。,普通C18固相萃取的局限性去湿效应(De-wettingEffect);固相萃取材料耐受pH范围较窄(2-7);对极性化合物保留差；碱性化合物回收率较低（由于少量未键合的硅羟基所致）。,24,四.固相萃取法,HLB(Hydrophilic-LipophilicBalanceCopolymer)材料的优点水可侵润(waterwettable);具有反相保留能力;pH1-14范围内稳定;没有裸露硅羟基。,25,四.固相萃取法,HLB萃取法的一般流程,26,四.固相萃取法,离子交换与反相混合模式的固相萃取材料适用于易电离(ioniccompound)的化合物:弱酸(weakacidic)与弱碱(weakalkaline);强酸(strongacid)与强碱(strongbase);季铵盐(quaternaryammoniumsalt)。,27,四.固相萃取法,为什么需要混合模式的SPE材料？离子交换力往往强于亲脂作用，在SPE的清洗步骤中，可以使用纯有机相去除因亲脂作用保留下来的杂质;经过调解pH值，离子型化合物可以回到中性状态(neutralstate)，然后被洗脱出来。,28,四.固相萃取法,混合阳离子模式(Mixed-ModeCationic-eXchanger)与混合阴离子模式(Mixed-ModeAnionic-eXchanger),29,四.固相萃取法,OasisMCX,30,四.固相萃取法,OasisMAX,31,四.固相萃取法,混合弱阳离子模式(MixedModeWeakCationic-eXchanger)与混合弱阴离子模式(Mixed-ModeWeakAnionic-eXchanger),32,四.固相萃取法,OasisWCX,33,四.固相萃取法,OasisWAX,34,四.固相萃取法,固相萃取法的优化,35,四.固相萃取法,生物样品要求测试的稳定性：室温稳定性，长期（冰箱）稳定性，冻融循环，（血浆样品还要求做其相应的全血稳定性）；生物样品中原药或者代谢产物的不稳定可导致不准确的TK/PK参数；不稳定性一般由化学（化学反应）与生物学（酶反应）两大因素导致；从生物样品的采集，运输，储存到分析，每一个步骤都需要考虑稳定性；,36,五.如何处理可能不稳定的样品,37,五.如何处理可能不稳定的样品,化学反应导致的不稳定,38,五.如何处理可能不稳定的样品,生物酶导致的不稳定,全血稳定性(wholebloodstability)，血样从采集到离心收集血浆之前，考查化合物在全血中的稳定性情况。近几年法规部门逐渐开始要求做全血稳定性;由化合物在血浆中的稳定性，不能预知其在全血中的稳定性;通常可通过衍生化或者采集血样前，在采集管中加入酶抑制剂来解决。,39,五.如何处理可能不稳定的样品,40,五.如何处理可能不稳定的样品,全血/血浆中的水解酯酶,班布特罗（前药）,特布他林（代谢产物）,新斯的明,阻断水解,基质效应（MatrixEffect,IonizationEffect）样品中除被测化合物之外的组分，对化合物测定造成影响的效应；两种方式检测基质效应：柱后流动注射法（定性），样品处理比较法（定量）；降低基质效应的影响可从多方面入手，如改变样品前处理方法，优化色谱条件与质谱条件，选择同位素标记内标等。,41,六.LC/MS/MSBA方法需注意的问题,生物基质中的磷脂类化合物易导致基质效应，大多数表现为离子抑制。,42,六.LC/MS/MSBA方法需注意的问题,磷脂类化合物的LC/MS/MS检测,43,六.LC/MS/MSBA方法需注意的问题,串联质谱方法中常用离子对184/184检测磷脂类化合物。,应用举例：如何通过LC/MS/MS直观“看到”基质效应。地高辛,44,六.LC/MS/MSBA方法需注意的问题,样品制备提取剂：乙酸乙酯:二氯甲烷=350:100，液-液萃取1.在96孔板中加入血浆，内标和提取剂，混匀约20分钟；2.离心之后小心将96孔板置于干冰中冷冻10分钟；3.将上层（有机层）取出，35摄氏度条件下真空挥干；挥干的提取物将用含有少量有机溶剂的缓冲溶液重新溶解并摇匀；进样20L进行LC/MS/MS分析。,优化前,45,六.LC/MS/MSBA方法需注意的问题,OriginalGradientMinB%0251.2952.2952.3253.125Flowrate:400ul/min,Matrixblank,Solvent,ULOQ,优化后,46,六.LC/MS/MSBA方法需注意的问题,NewGradientMinB%0252.0952.4952.5253.525Flowrate:350ul/min,Matrixblank,Solvent,ULOQ,回收率，蛋白沉淀vs.固相萃取（HLB）,47,六.LC/MS/MSBA方法需注意的问题,去除磷脂化合物能力比较，蛋白沉淀vs.固相萃取（HLB）,48,六.LC/MS/MSBA方法需注意的问题,基质效应结果比较，蛋白沉淀vs.固相萃取（HLB）,49,六.LC/MS/MSBA方法需注意的问题,回收率，蛋白沉淀vs.固相萃取（HLB,MCX）,50,六.LC/MS/MSBA方法需注意的问题,去除磷脂化合物能力比较，蛋白沉淀vs.固相萃取（HLB,MCX）,51,六.LC/MS/MSBA方法需注意的问题,基质效应结果比较，蛋白沉淀vs.固相萃取（HLB,MCX）,52,六.LC/MS/MSBA方法需注意的问题,回收率，液-液萃取（多次萃取）vs.固相萃取（MCX）,53,六.LC/MS/MSBA方法需注意的问题,去除磷脂化合物能力比较，液-液萃取vs.固相萃取（MCX）,54,六.LC/MS/MSBA方法需注意的问题,基质效应结果比较，液-液萃取vs.固相萃取（HLB,MCX）,55,六.LC/MS/MSBA方法需注意的问题,同位素标记内标vs.结构类似物内标同位素标记内标与待测化合物的物理化学性质极为相似，可有效补偿/消除基质效应或者样品前处理过程中的误差；结构类似物内标的物理化学行为无法跟待测物完全保持一致，在测定过程中产生的基质效应可能无法完全和待测物统一，有可能对数据的准确性造成影响；采取结构类似物内标的方法，有的问题直到样品分析过程中才会暴露出来，比如内标响应在未知样品中与在标准曲线/质控样品中差距较大，必须严密监视。,56,六.LC/MS/MSBA方法需注意的问题,采用结构类似物作为内标的某方法，优化前的内标响应趋势图,57,六.LC/MS/MSBA方法需注意的问题,ShimadzuLC-20ADsystem,API4000MS/MS;AgilentEclipsePlusC18(5m,2.150mm)MPA:0.1%AAinwaterMPB:100%ACN,优化方法后的内标响应趋势图,58,六.LC/MS/MSBA方法需注意的问题,WatersUPLCAcquityUPLC,API4000MS/MS;AcquityUPLCBEHC18(1.7m,2.150mm)MPA:0.1%AAinwaterMPB:100%ACN,非特异性吸附（Non-SpecificBinding,NSB）在低蛋白含量的生物基质（尿液，脑脊液，透析液等）中，化合物在存放/转移过程中与容器材料发生非特异性结合的现象；在相应的生物基质或水中测试，做转管实验；通常更换储存容器材料，或在基质中加入一定量表面活性剂可消除NSB现象。,59,六.LC/MS/MSBA方法需注意的问题,60,六.LC/