（有机化学专业论文）含芳香氨基酸受体的设计与离子识别.pdf

中文摘要 中文摘要 各种类型的分子间非共价相互作用， 意义。因而，对非共价相互作用的研究， 面都有重要价值。 在蛋白分子的结构和功能上具有重要 在认识生命过程和设计功能分子等方 在组成蛋白分子的二十个天然氨基酸中，色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸的侧 链取代基团不仅具有强的还原能力，而且是很好的金属离子配体。 1 ，4 ，7 ，1 0 一四氮杂环十二烷一n 一四乙酸( d o t a ) 是一个被广泛研究的配体， 它可以跟许多种金属离子形成稳定的配合物。此类金属配合物被普遍地用于医 学上的诊断成像和治疗。 本工作合成了以d o t a 为模板的含有色氨酸单元的小分子类肽d o t a w 。，其 结构经质谱和和核磁共振技术证实。通过荧光技术对溶液中d o t a w 3 与金属离子 的识别作用做了初步的研究，发现其可以选择性地对c u “和f e “离子进行识别。 另外，我们以多胺多羧酸配体e d t a ，d t p a 作为二价的模板骨架，合成了含 色氨酸，酪氨酸和苯丙氨酸的开链结构的受体分子e w f ，d w f 和e w y ，利用圆二 色光谱，荧光光谱，核磁共振技术和质谱等分析手段，间接检测到了溶液中金 属离子与吲哚环之间的非共价相互作用。研究发现，这三个受体对多种具有重 要生物学和环境保护意义的金属离子有着很好的选择性识别作用。 关键词：受体离子识别荧光光谱圆二色谱核磁共振质谱 。c | a b s 缸a c t a b s t r a c t m 卸yt ) ，p e so f n o n - c o v a l e n ti n t e m c t i o i l sh a v eb e e n f o l l l l dt op l a yi m p o r t a n tr o l e s i nt 1 1 es t n l c t u r ea 1 1 dt h e劬c t i o i l so fp r o t e i n t h er e s e a r c ho nn o n - c o v a l e n t i n t e r a c t i o n si st h o u 曲tt ob ev e r yi i n p o r t a n tt ot l l e 衄d e r 咖n d i i l go fl i f ep r o c e s s e sa n d t l l ed e s i g no f f i l n c t i o n a ls u p m m o l e c l l l e s a m o n gt l l e “e i i t ye s s e n t i a l 鼬i n oa c i d sc o m p o s i i l gt h ep m t e - m ，w er e a l i z e dt 1 1 a t 恤s i d ed l a i n so f 脚t o p h 孤，t 如s 岫锄dp h e n y l a l m l i i l ea r en o to n l ys 仃o n g l y r e d u c t i v e ，b u ta l s og o o dm e t a l _ i o nl i g 锄d s 1 1 1 e l ，4 ，7 ，1 0 t e 仃a a 翻c y c l o d o d e c a n e 一1 ，4 ，7 ，1 0 一t e 仃a a c e t i ca c i d ( d 0 1 a ) i sa w e l l - s n l d i e dl i 曲w m c hf o 珊se x 岫n e l ys 诅b l ec o m p l e x e s 丽mav a r i 啊o fm e t a l s s u c hm e t a jc o m p l e x e sh a v ef b 嘶da 、v i d e s p r e a du s ei l lt h e r a p ya n dd i a 驴o s t i c i m a g i n g h e r cw er e p o r tm es y n 也e s i so fad o t ap s e u d o p e 砸d cd o t a w 3 埘t l lm el l i l i t o ft r y p t o p h 锄nw a sc h a m c t e r i z e db yn m ra n de s i m s i na d d i t i o n ，w ee s t i m a t e d t h a ti th a dl l i 吐s e l e c t i v e t yf o rc u 2 + a i l df e 2 + i ns o l u t i o n b yn u o r e s c e n c e s p l e c 仃d s c o p i cs t u d y a n o t h e rp a r to f t l l i s 、v o r ki st oi i e s t i g a t e 也ei n t e r a c t i o nb e 俩e e nm 洲i o n sa i l d r e c e p t o r s ( e w ed w fa i l de w y ) ，w h i c ha r ep r e p a r c db yl l s i n ga v a i l a b l em l l l t i d e n 眦 吼i i l o c 讪o x y l a t e ， e d t a 锄dd t p a ， r e s p e c t i v e l y ， a sd i v a l e n t t e m p l a t c f o r p r e s e m i n gp e p t i d y lt r pi n d 0 1 e ，t y rp h e n o la i l dp h eb e n z e n e ac o m b i n e dc d ， e s i m s ，n m 哏锄dn u o r e s c e n c es p e c 订o s c 叩i cs t i l d y r e v e a l st l l er o l e so fm c 诅l i o n i n d 0 1 ei n t e m c t i o n s w bf o u n d 也a tm et h r e ew e r ee x c e l l e n tm e t a l l o r e c e p t o r m o d e l s谢t l l 1 l i g hs e n s i t j “t y a n dr e m a r k a b i e s e l e c 蛙v j t y f o rb i o l o 舀c a l l yo r e n v i r o n i n e 删l yi i i l p o n a i l tm e t a li o i l si nw a t e r k e y w o r d s ：r c c e p t o lm 0 1 e c u l a rr c c o g n i z m o n ，f l u o r e s c e n c es p e c 仃a c ds p e c 氇n m re s i m s i i 符号说明 a c b n b z c d c v c l e n d c c d c m d 匝 d m s o d 0 1 a d t p a e d t a e s i m s e b 0 m e m e c n m e o h 删 n h s s o c h t e a 1 下a t s 砷 p h e t 符号说明 乙酰基 苄基 苯甲酰基 圆二色光谱 1 ，4 ，7 ，1 0 一四氮杂环十二烷 二环己基碳二亚胺 二氯甲烷 甲酰二甲胺 二甲亚砜 1 ，4 ，7 ，1 0 一四氮杂环十二烷n 一四乙酸 二乙基三胺五乙酸 乙二胺四乙酸 电喷雾质谱 乙醚 甲基 乙腈 甲醇 磁共振成像 n - 羟基琥珀酰亚胺 二氯亚砜 三乙胺 三氟乙酸 对甲苯磺酰基 色氨酸 苯丙氨酸 酪氨酸 v i y 9 6 8 8 1 南开大学学位论文版权使用授权书 本人完全r 解南开大学关于收集、保存、使用学位论文的规定， 同意如下各项内容：按照学校要求提交学位论文的印刷本和电子版 本；学校有权保存学位论文的印刷本和电子版，并采用影印、缩印、 扫描、数字化或其它手段保存论文；学校有权提供日录检索以及提供 本学位论文全文或者部分的阅览服务；学校有权按有关规定向国家有 关部门或者机构送交论文的复印件和电子版；在不以赢利为目的的前 提下，学校可以适当复制论文的部分或全部内容用于学术活动。 学位论文作者签名：墨兵 一，年月二，日 经指导教师同意，本学位论文属于保密，在年解密后适用 本授权书。 指导教师签名：学位论文作者签名： 解密时间：年 月日 各密级的最长保密年限及书写格式规定如下： 内部5 年( 最长5 年，可少于5 年) 秘密1 0 年( 最妊】0 年，可少丁1 0 年) 机密2 0 年( 最长2 0 年，可少于2 0 年) 南开大学学位论文原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师指导下，进行 研究工作所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本学位论文 的研究成果不包含任何他人创作的、已公开发表或者没有公开发表的 作品的内容。对本论文所涉及的研究工作做出贡献的其他个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本学位论文原创性声明的法律责任 由本人承担。 学位论文作者签名：乏乒 乩年兰其 日 第一章前言 第一章前言 第一节分子识别及受体设计原则 1 1 1 重要的分子识别过程 底物与受体的选择性键合称为分子识别，它可能是一个具有专一性功能的 过程。对应于生物学中底物与受体的概念，我们把分子识别过程中相互作用的 化学物质广义地称为底物及受体，较小的分子称为底物，较大的分子称为受体。 识别过程很可能引起体系的电学、光学性质及构象的变化，也可能引起体系化 学性质的改变。这些变化意味着化学信息的存储、传递及处理。因此，分子识 别在信息处理及传递、分子及超分子器件的制备过程中起着重要作用。分子识 别的目标是研究分子间专一性的相互作用，这在化学及生命过程中起着非常重 要的作用。分子识别的研究已经成为化学、生命科学、材料科学和信息学等众 多学科中的前沿热点研究课题。图1 1 是分子识别的一般模型。 图1 1 分子识别的一般模型 以下是几类重要的分子识别过程“1 ： 1 球形分子识别： 球形底物的分子识别是最简单的分子识别过程。碱金属、碱土金属、稀土 第一章前言 金属等阳离子及卤素等阴离子都是常用的球形底物。对于这类底物，具有球形 空腔的受体比平面大环有更高的识别能力。冠醚、穴状配体、球状配体等都能 同相应的球形底物形成稳定的络合物。3 。图1 2 是典型的球形分子识别。 图1 2 典型的球形分子识别 这类识别虽然简单，但在化学、材料科学、信息学及生命科学中有重要意 义，与分子及超分子器件的研制、分离纯化过程、分析化学过程、神经细胞的 电感应过程、金属离子跨细胞膜运输等有密切的关系。 2 四面体识别过程： 四面体底物的选择性键合要求受体分子具有四面体的识别位点。多氮杂环 类受体对阳离子的识别经常采用这种方式。生命过程中，某些酶同底物的识别 也属于四面体类型的识别过程。图1 3 是典型的四面体分子识别。 图1 3 典型的四面体分子识别 3 多重识别及线性识别过程啪： 一个受体能同时识别两个或更多个底物或同时识别一个底物上的两个或多 个功能基团的过程称多重识别过程。它同协同效应、变构、调控以及信号传输 等过程有着密切的联系。 2 第一章前言 线性识别的受体分子的两端应分别具有成键的亚单元，它们分别同底物的 相应功能基团键合。底物功能基团间的距离应同受体两个亚单元间的距离相匹 配。这就是受体识别底物分子长度过程的距离互补。 许多生物分子如双羧酸化合物、双胺肽、氨基酸、多胺等都可以作为线性 识别的底物。对这类识别过程动力学特征的研究有重要意义。 4 生命体系中的分子识别过程： 。 生命过程中的各种分子识别过程，如酶与底物、激素与受体、抗原与抗体 的识别等都是各种生物功能的分子机制及调控原理的重要基础。原核和真核细 胞的基因表达非常精确地被蛋白质控制。调节蛋白质对一定的d n a 区域的专一 性识别过程是这种调控作用的重要基础。在乳糖操纵子中，乳糖操纵子阻遏蛋 白能够选择性地识别并结合到操纵基因的2 0 个碱基对区域，并防止r n a 聚合 酶结合到启动基因上，从而调控基因的表达。 催化抗体研究领域的诞生，为化学工业开辟了一条绿色革命的新途径。催 化抗体是用识别办法选择反应物及过渡态，并在专一性结合中进行反应，使过 程的活化能降低、选择性提高，能催化某些常规的催化剂难以实现的反应，己 成为当前热门的研究领域。 分子印记技术( m o l e c u l a r 曲硼击咖g ) 是在催化抗体概念启发下发展的新技 术“1 ，已成功用与d l 对映体分离。它相当于半抗原的模板分子与特定的小分子 或生物大分子以非共价键结合。多重非共价相互作用的协同效应使之固定化。 然后用溶剂洗去模板分子得到专一性空穴，这些空穴可识别某些分子达到分离 的目的嘲。 5 有机合成中的分子识别： 在分子识别指导下的有机分子设计、合成和自组装，是二十一世纪有机化 学发展的重要方向嘲，在反应试剂与底物的识别研究的基础上发展的对映选择性 不对称合成已取得重大进展“1 ，建立在高度控制分子间相互作用基础上的自组织 ( s e l f - o 曙l n i z i l l g ) 及自组装( s e l f _ a s s e m b l y ) 有机合成化学已经取得了长足的进 步。 自组织和自组装合成是指分子通过氢键、范德华力、静电相互作用、给体 及受体效应等自发构筑成三维结构，并形成具有确定功能的超分子体系。分子 晶体、液晶、胶束、l b 膜、二维薄膜、三维骨架都可以通过这种方式来合成。 6 无机超分子建筑： 3 一 第一章前言 无机超分子建筑起着越来越重要的作用。生命过程中涉及数十种金属离子， 它们的配位作用影响到离子通道的开关、基因调控等重要的生命过程。在分子 筛内组装某些金属络合物使具有酶的催化功能，是一种酶的模拟物，称 z e o z y m 匣。 金属离子在自组装过程中起模板的作用。在程序化的超分子体系中，金属 离子读出储存于配体中的信息，根据配位几何组装结构。1 。金属离子以三种主要 的途径参加反应过程：一是通过结合反应底物为反应定向，二是通过可逆地改 变金属离子的氧化态调节氧化还原反应，三是通过静电以稳定和屏蔽负电荷。 不管是哪种反应过程，都存在着显著的非共价相互作用。这些弱相互作用的影 响是深远的，甚至可以对酶或其他蛋白起到结构调控的作用。 膜蛋白的研究更是联系到很多受体和离子通道的功能，这些蛋白在维持人 体的正常生理过程以及药物治疗中都有着重要的意义。从金属酶的催化到蛋白 中的协同效应以及构效关系，从各种金属离子通道的工作机理到基于c a 2 + 第二 信使的生物膜信号传递，生命体系中许多重大问题都与此类金属离子参与的超 分子体系的构建过程有关。 1 1 2 受体设计的一般原则 受体是一种能够识别和选择性结合某种配体的大分子物质，包括与配体结 合和产生效应的两个区域，受体与配体结合后，构象的改变导致生物学活性的 产生。设计合成各种受体( r e c e p t o r ) 不仅在底物一受体识别方面能够提供很多关 键的信息，而且随着探针在医学和环境分析等方面“”越来越广泛的应用而越发 显出其重要性。在过去几十年里，人们在主体一客体化学( h o s t g i l e s tc h e i i l i s 仃y ) 和超分子( s u p e 珊o l e c u l a r ) 化学领域取得了显著的成绩o “，也因此推动了合理 设计各种受体的长足进步。 近来在受体设计方面的发展强调的是化学工程结构意义和作用基团，例如： 官能团的补足和新的离子载体作为选择性的络合单位“。设计多种类型的受体 使之适合于过渡金属离子及其他阳离子、阴离子、中性的无机、有机及生物分 子等各种类型的底物，需遵循一些基本原则“1 ： 为了达到高的识别效果，受体与底物应有大的接触面积，受体应具有包容 底物的空腔以能产生较多的非共价相互作用，并与底物很好的互补。根据这个 一4 一 第一章前言 原则设计的各种受体包括各种大环及大多环化合物“，如冠醚类化合物、穴状 配体( c 聊t a i l d s ) 、开链配体( p o d a n d s ) 及球状配体( s p h e r a n d s ) 等。这些受体 都具有能同底物匹配的空腔，并有不同数目的连接段、枝权等使其具有某些动 力学特性，具有合适的键位置及功能基团。 受体设计必须遵循柔性与刚性的平衡，它关系到受体及受体同底物识别过 程中的动力学特性。受体结构的稳定性需要刚性的分子结构，但是识别过程中 的变换、调控、协同及变构过程需要一定的柔性。特别是对于生物体系，受体 的柔性是非常重要的。因此，受体设计应兼顾受体的动态及静态性质。 第二节以多肽导向的靶向胍l 造影剂“帕 1 2 1生物靶向造影剂的研究现状 核磁共振成像技术m r j ( m a 驴e t i cr e s o n 锄c ei m a 舀n g ) 在肿瘤及其他病变的 早期诊断中起着重要的作用。生物靶向造影剂在成像诊断中又是最为关键的因 素之一。靶向造影剂的研究是从放射性标记的单克隆抗体( m c a b ) 开始的，利 用了抗体和抗原之间高度的特异性亲合力。由于完整抗体甚至f a b 片段都具有 较大的分子量，药代动力学不甚理想“”，血液清除和到达靶点速度慢、穿透力 不强、信噪比低、不易获得好的图象，同时还易引起免疫反应。因此，虽然近 几十年来人们对m c a b 试用于核磁共振成像进行了广泛的研究，但是，能够实 际应用的却几乎没有。目前只有欧洲批准的i n d t p a a n t i m y o s i i l 用于心肌坏死 的检测“”，用于检测结肠癌的川i n d t p a c y t - 1 0 3 有可能成为美国第一个放射 性标记的单抗药物n “。 顺磁性标记的单抗作为m 融造影剂也已经有研究。由于顺磁性元素不存在 衰变问题，许多生物大分子如人体白蛋白、抗体和多糖等均可作为导向分子， 但由于细胞上抗原位点有限，单抗导向的m i u 造影剂很难达到核磁共振成像的 有效浓度。 为了寻找新的更有效的靶向造影剂，人们把目光转向了多肽与受体间的特 异性结合上，它们为靶向药物的研究发展提供了多种新的途径。 5 第一章前言 1 2 2 导向多肽的种类简介 目前用于代替单抗片段作为导向分子研究的多肽主要有三类：单链抗原结 合蛋白、抗体高变区序列的合成肽和自然界提供的大量生物活性肽。 1 单链抗原结合蛋白( s f v ) ： s f v 是具有抗体中可变区序列的单链片段，保持了对抗原的特异结合性，比 f a b 小一半，能很快的达到靶点，目前已经被用于核磁共振成像研究。 2 高变区序列的合成肽： 高变区是抗体识别功能的结构基础。合成具有高变区序列的多肽片段用于 靶向造影剂应最为理想，但是，实验表明这类合成多肽与抗原结合的特异性没 有改变，而亲和力却大大地降低了“”。利用先进的分子设计方法解决这个问题 是目前核磁共振成像研究和生物化学研究中的一个尖端领域。将精细的核磁共 振谱与分子模型理论相结合，使人们能够了解特定氨基酸残基对抗原结合性质 的影响，从而加以改进和提高，设计并合成出相应的多肽以符合药物应用的目 的。 3 天然生物活性肽： 种类繁多的天然生物活性肽是生命活动中不可缺少的信号传递与识别物 质，包括各类激素、神经递质、神经调节剂、生长因子、生长抑制因子和细胞 激动素等，它们与受体之间的亲和力一般要显著地高于抗体抗原作用，且分子 量较小，更适应于生物靶向造影剂的要求，是目前m r j 造影剂研究中的一个热 点。 目前，由配位基团对多肽或者蛋白进行非失活修饰，再标以金属离子，以 成为靶向造影剂中的一个重要方向。对于小肽，这种修饰可直接的由固相或者 液相的化学合成方法得到；对于较大的肽链( 多于5 0 个氨基酸残基) ，则多采 用分子克隆而得到多肽样品后再进行化学修饰。 1 2 3 生物靶向造影剂的标记方法 一般来讲，标记多肽的技术与标记蛋白相似，通常要考虑以下几个方面：标 记核素的选择、标记方法、标记产物的稳定性、在体内的分布特点以及特异性。 标记方法主要为直接和间接两种。但由于多肽分子小，可标记位点少，直接标 记对分子结构和生物活性的影响更大。所以目前研究中多采用间接标记法，特 一6 一 第一章前言 别是通过双功能螯合剂来进行标记。 1 放射性标记： 目前核医学中用于m 诊断的放射性核素主要有1 2 3 i 、 1 8 f 、1 1 c 、6 7 g a 和2 0 1 t l 等。 2 顺磁性标记： 顺磁性元素能对其周围的水质子的弛豫时间产生影响， 剂。常用的顺磁性元素有h 恤2 + 、f e ”、g d 3 + 等。 1 3 1 i 、1 1 1 m 、咖t c 、 故可用作m i u 造影 m n 2 + 和f e 3 + 为过渡金属，均有5 个未成对电子，它们在m i u 造影剂的早期 研究中起了重要的作用。但由于它们的弛豫率比g d 3 + 弱，目前多限于金属酶或 磁性分子筛用作m 造影剂的研究中“。 g d 3 + 是镧系元素，有7 个未成对电子，是稳定元素中弛豫率最高的，其反应 性能与碱土金属相似，能够与体内各种生物配体发生作用。因此，以g d ”为基 础的m i u 造影剂都选用g d 3 + 的稳定配合物啪1 ，有极强的热力学稳定性和动力学 惰性，以防止体内解离，如已经商品化的g d d n ，a - 2 n m g 、g d - d o t a n m g 、 g d ( h p d 0 1 a ) 等。 3 双功能螯合剂和间接标记法： 体内稳定性是一切含金属类药物的先决条件。为了防止金属解离出来引起 毒性，各类配体已被广泛使用。在生物靶向造影剂的研究中，配体不仅要能与 重金属离子形成稳定的配合物，还要能与导向分子如多肽、蛋白或单抗稳定地 结合，同时不影响其生物活性。目前最常用的双功能螯合剂是多胺多羧酸类配 体及其衍生物，如d t p a 。最近的实验表明，大环氮杂多羧酸配体d o t a ( 1 ，4 ， 7 ，1 0 一四氮杂环十二烷n 一四乙酸) 能与重金属离子形成更加稳定的配合物，使 得d 0 1 a 及其衍生物在生物标记方面更具应用潜力。 利用双功能螯合剂标记多肽一般是先将螯合剂与多肽共价结合，再标记金 属离子，这样得到的反应产物单一，便于分离提纯。 此外，人们还提出一种巧妙的连接思路，即通过一个小分子的连接基团， 把导向分子( 蛋白、多肽) 与标记配合物连接起来。连接基团可以是一氨基酸、 b 一氨基酸或者小肽等。这样，就可以减少导向分子与标记基团之间的相互影响， 既减轻了标记对于生物活性的影响，又降低了对配位基团的要求，也扩大了选 择范围。在某些情况下，可以将多个多肽分子结合于一点，以增加亲和力；在 另外一些情况下，又可将多个标记基团结合于一点，增强标记浓度。这种方法 7 第一章前言 对于标记蛋白与单抗也同样适用，但对易受标记影响的多肽最有影响力。 1 2 4 生物靶向造影剂的发展前景 多肽应用于生物靶向造影剂目前尚处于起步阶段，其主要优点有：( 1 ) 药 代动力学性质好，能很快地到达靶点和从血液中清除；( 2 ) 能够合成具有生物 活性的类似物，适于标记；( 3 ) 体内分布性质好，本底少；( 4 ) 成像快。 显然，以多肽为导向的靶向造影剂为快速、准确地诊断肿瘤及其他疾病提 供了有力的武器。通过化学家、生化学家和临床医师们的共同努力，它必将成 为二十一世纪诊断医学发展的重要基础。 第三节t a 衍生物的合成方法简介 多氮杂环化合物( 也称氮杂冠醚) 及其衍生物在近年愈来愈受到人们的广 泛关注。1 ，4 ，7 ，1 0 一四氮杂环十二烷n 一四乙酸( 简称d 0 1 a ) 及其衍生物是 其中最主要的一类。d 0 1 a ( 图1 4 ) 作为一种正待开发应用的优良的多齿配体， 可以与许多金属离子形成稳定的络合物，而且其形成络合物的稳定性要比e d l i a 的络合物大很多。“。 r ，c o o h h o o c 、r 山 l _ p叫_ 、 ，叩夕 c o o h ) h o o c 图1 4d o t a 的结构 d o t a 络合物具有较高稳定性，但是由于其单一的结构模式使其在性质研究 和应用方面受到了极大限制。近年人们把视线转移到各种d 0 r i a 衍生物的研究 上。d o t a 衍生物比单纯的d 0 1 a 具有更优良的配位络合能力，对各种金属离子 具有更高的选择性，同时它们具有的特殊的动力学特性使其在化学、生物学、 医学等领域有了更加广泛的应用潜力。 d 0 r i a 衍生物的性质研究促进了d o t a 衍生物合成方法的不断发展，各种新 颖奇特的合成方法层出不穷。尽管如此，合成高纯度的d o t 刈 常困难，制备符 一8 一 a 衍生物的各 d o t a 单取代衍生物主要是以酰胺键和酯键的形式连接，其中又以酰胺键为 常见连接方式，我们将主要介绍以酰胺键为基础的d o t a 单取代衍生物的合成方 法，对于以酯键形式连接的化合物，我们只做简略介绍。 l _以d 0 1 a 为原料合成其单取代衍生物是一种简便易行的方法，也是被广泛 应用的方法之一。较早见于报道的是在d 0 1 a 上连接一分子乙二胺“2 “3 ，本 方法最早由i c a r e k 和t u c k e r 提出，反应步骤见图1 5 。 r ，c o o 出 h o o c f 、 八7 + 。l 。i 。! ! ! 堕竺! ! ! ! ! ! 塑! ! 兰譬 旬oc 、r n h 2 l i_ r 、”- p ”删8 ”i 而蒹5 + _ k 。0 、 o v v 、夕c o o “弋，_ 、夕b o o - h o o c 旬o c j 图1 5d o t a 与正丙胺的反应 反应将化学计量的d o t a 和三乙胺( t e a ) 溶解在极性较高的溶剂中( 例 如d m s o ) ，在室温下滴加等摩尔量的氯甲酸异丁酯作为活化试剂，搅拌一段时 间，待混合酸酐形成后再滴加大大过量的正丙胺，反应混合物在室温下搅拌半 小时。混合物通过阴离子交换柱( 1 5 2 0c m d o w e x 一1a i l i o n e x c h a i l g ec o l u 枷) 进行分离与纯化，洗脱液冻干后以3 0 的总产率得到d o t a 与简单小分子胺类 的单取代衍生物。 此方法合成步骤简单，起始原料也比较经济易得，能以较高的产率得到 d 0 1 a 单取代酰胺衍生物，是一种制各d o t a 单取代衍生物较理想的方法。但 由于本反应是以d 0 1 a 作为起始原料，所以产生多取代衍生物的可能性大大提 高，这就要求具有较强的分离纯化手段对反应混合物进行分离与纯化。 d 0 1 a 与小分子胺类的连接不论是在反应过程方面还是在反应的后处理上 都比较简单，并且容易操作，而且我们发现金属离子与此类大环配体络合物的 顺磁性质要比同类型的d 矸i a 衍生物好很多，对稀土元素也有很好的络合能力， 因而在合成d o t a 衍生物的初期，此类化合物被大量合成。但是，此类化合物 由于在结构方面过于简单和老旧，性质方面的研究和开发利用就受到了很大限 第一章前言 制。有远见的科学工作者开始把目光投向更加复杂的d o t a 类肽的合成。 随着合成多肽技术日趋完善与成熟，d o t a 单取代类肽的合成方法如雨后 春笋般发展起来，我们仅举几个涉及到不同合成方法的例子。 ( 1 ) 以n h s ( n - h y d r 0 x y s u c c i i l i i n i d e ) 为活化试剂，以e d c i ( 1 - e 山y l - 3 - ( 3 一d i m e m y l a i i l i i l o p m p y l ) c a r b o d i i r n j d e ) 为缩合剂，具体反应步骤嘲见图1 6 。 c o o h h o o qf 、7 + d p h e c y s t y r - l y s ( d d e ) t h 卜c y s t h r ( 。1 ) nh 。h ，v c h s s h 。 w a t e r ，l n h s d m f e d c l c o n h d - p h e _ c y s t y r l y s ( d d e ) - t h 卜c y s - t h r ( o i ) h o o cf 八山、占当 l 沁 一一，、 ，叩 c o o h j h o o c 7 图1 6 以n i s 活化d o t a 的反应( e d c i 为缩合剂) 产物纯化使用了制备型高效液相色谱( p p e p a m t i v er e v e r s 耐p h 勰e 册l c ) ，产 率为3 8 5 2 ，所得化合物纯度为9 8 9 9 。 此方法起始原料容易获得，该反应速度较快，反应过程耗时较少( 2h ) ，缩 合产率较高( 9 8 ) ，几乎没有副产物，是一种较为理想的合成d o t a 单取代 衍生物的方法。但其主要的限制是在分离纯化阶段。制备型高效液相色谱并不 十分普及，国内仅有几家著名的研究所和科研机构具有该设备，而且该纯化方 法也导致产品大量损失，致使总反应产率急剧下降。该方法适用于有条件的科 学工作者，而且不适用于产品的大量合成，合成量一般控制在1 0 0 5 0 0m g 为 适宜。 ( 2 )与方法( 1 ) 类似，同样以n h s ( n - h y d r o x y s u c c i n i 商d e ) 为活化试剂，只 是将其中的缩合剂e d c i 换成了d c c i ，但是本方法在产物后处理和纯化方法上 一1 0 剂用c h 2 c 1 2 ，m e o i ，a c o i i h 2 0 的混合液( 7 0 4 0 1 0 1 0 ) ，以4 0 的总产率得到 了纯度较高的化合物。 2 采用d 0 1 a 作为起始原料，不可避免在产物中搀杂多取代的化合物，这给化 合物的分离与纯化带来了极大的困难，也给性质研究造成了很大的影响。随着 合成技术不断发展，人们逐渐认识到将d o t a 的羧基进行适当保护，可以得到 较理想的实验结果。 ( 1 )d 0 3 a t r i s ( t e n b u 时1 ) e s t e r 的保护形式 a d 0 3 a t r i s ( t e r t - b u 哆1 ) e s t e r 的一般制备方法。“2 “，具体合成步骤见图1 8 。 r 锚 n h h 卜j o ； b r c h 2 c 0 0 b z c h c l 3 ，r m h n ，、 hh 户c o o b z i o 目j b 忙h 2 c o o b u l a c c n ，k 2 c 0 3 r 他5h 讹。cr 芘洲叱州刚c 、r 咚 b u 啪：文。# 等筹筹啪t ：太咖小飞v 儿删1 = 唧5 “乙v 芦、o o e u t b u t o o c 7 b u t o o d 第一章前言 b d 0 3 a t r i s ( t e n _ b u t y l ) e s t c r 在合成中的应用”3 1 1 d 0 3 a 三叔丁酯保护形式的出现在d 0 1 a 单取代衍生物合成历史上是一次 重大的改进，不但对于合成一般d o t a 单取代衍生物具有极其重要的作用，更重 要的是在d o t a 单取代类肽的合成过程中引起了革命性变革。这使得我们能够 将d o t a 引入一个多肽片段的任何想要达到的活性位点。具体合成举例见图 1 9 。 ，c o o b u t b u t o o qf 山 +n h 2 c h 2 c h 2 s s c h 2 c h 2 - n h b o c i ，甲 c o o h 啪o c i 箩删砷d e ，c o o b u t r m “ b o c 厂、山7 、 。毒n 吨| 一：生：三_ 。一：生：苎- ； 一b 。c l ( 甲 cn cc ss c c n b o c b u t o o c t 一啊u o r c e a ca c i d h o 。下：讯啦剀s 喜协。一 i ：l 、 c n c c s s c c n h 3 + c f 3 c o o 一 此方法优点在于缩合产率高，生成多取代副产物的几率小，产品容易纯化和 分离，而且反应条件比较温和，更加适应于d o t a 类肽的合成。并且反应的可预 见性高，基本上会遵从最初的设计，得到纯度较高的化合物。因而本方法是目前 国际上合成d o t a 单取代衍生物最普遍采用的方法之一，也是合成d o t a 类肽的 最常见方法。但是它也并非是十全十美的，在用三氟乙酸去掉酯基保护的时候会 影响到化合物中其他对酸不稳定的基团，也会使酰胺键遭到一定程度的破坏，使 最终产物的收率减低，因此在选用本方法时要充分考虑到所要合成化合物中各 个基团的性质，慎重选择。 一1 2 第一章前言 ( 2 )d 0 1 a 仃i s ( p h e n y h n e l y l ) e s t e r 的保护形式 乱d o t a t r i s 蛐e n y l i n e t l l y l ) e s t e r 的一般制备方法口2 1 具体反应步骤见图1 1 0 。 田瞥吩b u b 吒h 2 c b ” k 2 c 0 3 d m f ，c 0 0 b n ，c b n b n o o c 、r 1佗m 蚓b n o 啦r 1 飞v 扎”蒜飞，儿。 ，) b n c b n o o c j 图1 1 0d o t at r i s ( p h e n y l m e t h y l ) e s t e r 的一般制备方法 b d 0 1 a 仃i s q ) h e n y l m e t l l y l ) e s t e r 在合成中的应用m 1 随着合成技术进一步发展，科学工作者已经不再满足于d 0 3 a t r i s ( t e n - b u 哆1 ) e s t e r 的保护形式，开始寻求更广泛的保护手段，d 0 1 a 仃i s q h e n y l m e l y l ) e s t e r 便是一个很好的例子，具体合成步骤见图1 1 1 。 b n o o cr 队q 5 仁o o l i_ _ 、 + 、n h h c i l v v c 0 0 “7 b n o o c 1 5 h 3 1 c o o e t 3 n c h 2 c 1 2 ，c 0 0 b n e n o o qr 己，了p b n o o c r ，”、 。，。，o ，j l h 2 p d ，c e t o h o o c c l 5 h ” 7 c 阳o h h o o qr 1 弋v p h 0 0 c r ，n 、 c 1 5 h 3 1 c o o c c ，5 h 3 1 图1 1 ld o t at r i s ( p h e n y l m e t h y l ) e s t e r 在合成中的应用 一1 3 靠爷 第一章前言 d o t at r i s ( p h e n y l i n e 血y 1 ) e s t e r 的保护形式为需要单一反应活性位点的d 0 1 a 衍生物的合成提供了一条可行的途径。此种保护形式可以通过一个酰胺键与其 它化合物相连接，然后去掉保护得到d o t a 单取代衍生物。比起d 0 3 a t r i s ( t e r t _ b u 谚1 ) e s t e r 的保护形式，此种方法避免了在脱保护阶段所需要的酸性条件 而是在温和的中性条件下采用催化氢化的办法脱掉保护基团，避免了在酸性条 件下酰胺键的部分破坏，使最终产物的收率大大提高，是一种值得一试的好方 法。 ( 3 )以活性单酯的形式合成d o t a 单取代衍生物o ” d 0 1 a 羧基保护中间体的合成是一个十分繁琐的实验过程，而且缩合之后必 需的去保护步骤极有可能导致敏感的生物活性基团失活，特别是在某些蛋白质 合成中。d o t a 活性单酯的应用是改变这一缺点的较好方法，常见的d o t a 活性 单酯见图1 1 2 。 c o o r h o o cr 入i j 、 n h f r ： o f i c 。h h o o c 还；复 f 心 f f 图1 1 2 常见的d o t a 活性单酯 化学计量的d o t a 和取代苯酚以e d a c 或者d c c 为缩合剂发生反应，可以 高产率地得到d o t a 单取代苯酚酯，通过h p l c 可以获得纯度较高的产物。此方 法可以通过价廉易得的d o t a 获得在合成上比较有价值的d o t a 单取代活性酯， 纯化后可保存用于d 0 1 a 的缩合反应。这些活性酯可以用于多种具有生物活性 分子的合成，还能够避免保护和脱保护等一系列繁琐步骤。 3 以间接形式合成d o t a 单取代衍生物” 具体合成步骤见图1 1 3 。 1 4 一 第一章前言 曝 删一$ 笋0 0 垒洲 舡洲a 1 3 2d o t a 四全同取代衍生物的合成 四全同取代的d 0 1 a 衍生物在合成研究中并不多见，这主要是由于四个羧基 被其他基团取代后在空间取得一定的三维立体结构，造成了较大的空间位阻， 使得d o t a 本身空腔的体积减小，严重阻碍了其衍生物对其他分子的配位和识 别。因此，在合成d o t a 四全同衍生物时，大部分都是引入了一些体积较小、结 构相对简单的基团，而且在分子识别和金属络合的研究方面，也是针对一些较 小的分子和金属离子( 例如碱金属) 。尽管如此，对d o t a 四全同取代衍生物的 合成和分子识别研究还是方兴未艾“。具体的合成举例见图1 1 4 。 h o 瞰，。p r 2 n e t ， x = o h ，o m s n 3 ，n h 2 图1 1 4d o t a 四全同衍生物的合成 第四节论文选题 化学生物学主要是使用化学小分子作为工具解决生物学的问题或者通过干 扰调节正常生理过程来了解蛋白质和基因的功能。随着国际上肽库技术的迅速 一1 5 第一章前言 发展，人们在蛋白质分子识别方面的观念和认识也有了进一步的深化。蛋白质 之间的相互作用是少数几个关键氨基酸残基的弱相互作用提供了大部分的结合 能，这种弱相互作用可以用小肽来模拟。因而，我们的研究课题就是设计合成 能模拟生物体内复杂蛋白质的化学小分子模型，通过对这些结构简单，具有代 表性的小分子模型结构和性质的研究来了解生命科学的分子化学基础，期望可 以揭示蛋白质间相互作用的本质，为小肽分子药物和疫苗设计以及复杂超分子 体系的研究提供理论基础和实验依据。 对具有重要生物学意义和环境保护意义的金属离子( 前者如ca _ ”、m 9 2 + 、 f e 3 + 、c u 2 + 、z n 2 + 等，后者例如h 9 2 + 、c d 2 + 等) 具有高选择性识别和检测能力的 受体和探针的设计，由于环境检测、生物化验和医学研究的迫切需要，是近几 年另一个受到十分重视的课题。 基于以上两点思考，我们的工作就是以二乙三胺和二乙醇胺为原料合成了多 n 杂环的胺羧配体1 ，4 ，7 ，1 0 一四氮杂环十二烷n 一四乙酸( 简称d 0 1 a ) ，并 在此基础上合成了含有色氨酸的d o r i a 类肽，分离纯化得到了三取代的d o t a 类肽( d o t a w 3 ) 。利用荧光技术初步研究了d o t a w 3 与金属离子之间的离子 识别和络合性质，期望能对m i u 造影剂的研究提供实验和理论依据。 另外，我们还以胺羧配体e d t a 、d 狐作为二价模板框架，合成了含芳香 氨基酸( 色氨酸、酪氨酸和苯丙氨酸) 的开链结构受体e w f 、d w f 和e w y ， 并利用荧光光谱、圆二色散、核磁共振技术和质谱等多种分析手段，间接检测 到了水溶液中金属离子与受体之间的非共价相互作用( c a t i o n n 作用) ，并且 通过计算得到了多种金属离子与芳香环之间发生作用的不同程度。 我们的工作，期望对生物分子非共价识别、生物受体模型设计、化学传感器 设计及含有芳香氨基酸的多肽链功能预测和m i u 造影剂等领域的进一步研究有 一定促进作用。 1 6 第一章前言 参考文献 徐筱杰，陈丽蓉化学进展，1 ”6 ，8 ，1 8 9 a r a “k ，n a k a l l l u r aro t s u l ( ah ，e ta 1 j = c 删嵋c 矗e 珊c d m 研研1 9 9 5 ，2 1 2 1 f 曲b r i z z il ，p a l l a v i c i n ip ，p a m d il ，e ta 1 j ：鲫勋c 删锄删”1 9 9 5 ，2 4 3 9 m o s b a c hk t1 9 9 4 j 只9 t a l l a b ek t a l ( e u c l l it m a t s u i