（预防兽医学专业论文）口蹄疫病毒Asia11YZCHA06的全基因组序列分析.pdf

摘 要 口蹄疫( f o o t - a n d m o u t hd i s e a s e ，f m d ) 是偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病， 其病原口蹄疫病毒( f o o t - a n d m o u t hd i s e a s ev i r u s ，f m d v ) 属丁小r n a 病毒科口蹄疫病毒属的成 员，为单股止链r n a ，其基冈组r n a 全长约8 5 k b ，可直接作为m r n a ，编码并翻译出一个多 聚蛋白，然后经过一系列裂解，产生4 种结构蛋向( v p i 、v p 2 、v p 3 和v p 4 ) 和1 0 种1 卜结构蛋 白( l 、2 a 、2 b 、2 c 、3 a 、3 8 1 、3 8 2 、3 8 3 、3 c 和3 d ) 。根据动物交义保护和血清学试验，f m d v 可分为o 、a 、c 、s a t ! 、s a t 2 、s a t 3 利a s i a l 型共7 种血清玳，不同血清型间不能交义免疫保 护，给口蹄疫的控制和消灭造成了极人的凼雉。目前f m d 节世界范同的流行趋势，但其血清型 的分布具有一定的地理区域性。我国丁1 9 5 8 年在云南保山县首先发现a s i a l 型f m d ，且在之后 3 0 多年里该型f m d v 的流行仅局限ta s i a l y n b s 5 8 谱系，但2 0 0 5 年以米我国在江苏、甘肃、北 京、河南等地爆发了江苏谱系a s i a i 型f m d ( a s i a l j s c h a 0 5 ) ，该谱系毒株与a s i a l y n b s 5 8 株相比有较人的遗传偏离，米源丁印度1 9 8 0 年流行毒株( a s i a l i n d 1 9 8 0 ) 。该谱系毒株在我国牛 群中一经流行，趋势迅猛，造成的损火极为严重，闪此积极开展a s i a l 型f m d 江苏谱系毒株的研 究，对我国f m d 的防控具有重要的意义。f m d v 全基冈宝i 的测定利宝i 装，为f m d v 致病性的研 究、以及新型疫苗和诊断技术的研制奠定了基础。 本研究对分离到的江苏谱系a s i a l 型f m d v 猪源毒株a s i a l l y z c h a 0 6 进行了测序和 全基冈组序列分析。同时，根据本实验室已测定的江苏谱系a s i a l 型f m d v 牛源毒株 a s i a l 、r s c h a 0 5 全基冈组序列的基础，利川5 r a c e 方法从a s i a l y s c h a 0 5 株细胞传代毒中扩 增得到5 末端的真实序列，采用常规r t p c r 技术扩增得剑入段相互重叠基冈组片段，分别克隆 至p o k l 2 低拷贝载体中进行序列测定和克隆拼接，构建了a s i a l y s c h a 0 5 株全i 长c d n a 。 关键词 口蹄疫病毒分子演化序列比对全kc d n a 拼接 a b s t r a c t f o o t 。a n d 。m o u t hd i s e a s e ( f m d ) i sa h i g h l yc o n t a g i o u sd i s e a s eo fc l o v e n h o o f e da n i m a l s ，i n c l u d i n g c a t t l e ，p i g s ，s h e e p ，g o a t s ，a n dm a n yw i l da n i m a l s f m dv i r u s ( f m d v ) i sa p o s i t i v es e n s e 。 s i n g l e s t r a n d e dr n av i r u so ft h ef a m i l yp i c o m a v i r i d a e ，g e n u sa p h t h o v i r u s f m d vc o n s i s t so fa g e n o m eo fa p p r o x i m a t e l y8 ，5 0 0b a s e ss u r r o u n d e db yf o u rs t r u c t u r a lp r o t e i n st of o r ma ni c o s a h e d r a i c a p s i d t h er n ai st r a n s l a t e da sas i n g l el o n go p e nr e a d i n gf r a m e ( o r f ) i n t oap o l y p r o t e i n f o l l o w e db y as e r i e so fp o s t t r a n s l a t i o n a lp r o t e o l y t i cc l e a v a g e st og e n e r a t eb o t ht h ei n t e r m e d i a t ea n dm a t u r es t r u c t u r a l ( e n c o d i n gv p 4 ，v p 2 ，v p 3 ，v p ! ) a n dn o n s t r u c t u r a lv i r a lp r o t e i n s ( 2 a ，2 b ，2 c ，3 a ，3 b ，3 ca n d3 d ) t h e r e a r es e v e ni m m u n o l o g i c a l l yd i s t i n c t s e r o t y p e s ：o ，a ，c ，s a t ! ，s a t 2 ，s a t 3a n da s i a l w h i c h c o n t r i b u t e st od i f f i c u l t yi ne r a d i c a t i n ga n dc o n t r o l l i n gf m d f m di saw o r l d w i d ed i s e a s ea n di se n d e m i c i nr e g i o n so fa f r i c a ，a s i a ，s o u t ha m e r i c a ，a n de u r o p e c h i n e s e s e r o t y p ea s i a lf m d vw a sf i r s t d i s c o v e r e di nb a o s h a nc o u n t y ，y u n n a np r o v i n c e ，i n19 5 8 i nt h e3 0y e a r s ，a s i ai y n b s 5 8w a s t h eo n l y l i n e a g eo fa s i a lf m d vs i n c e i tw a sd i s c o v e r e di nc h i n a i n a p r i l2 0 0 5 ，f m d vs e r o t y p ea s i a l o u t b r e a ki nj i a n g s up r o v i n c e ，g a n s up r o v i n c e ，b e i ji n ga n dh e b e ip r o v i n c ec a u s e d g r e a td a m a g et o l i v e s t o c ki n d u s t r y f m d v s e r o t y p ea s i a ia s i a l j s c h a 0 5l i n e a g e ，ad i f f e r e n t l i n e a g e f r o m a s i a l y n b s 5 8 ，w a sd e s c e n d e n t o fa s i a l i n d 1 9 8 0 ，t h ec o m p l e t eg e n o m ei n f o r m a t i o no ff m d v w o u l dc o n t r i b u t et ot h ed e v e l o p m e n to fn e wv a c c i n e s ，d i a g n o s i st e c h n i q u e sa n dt h eu n d e r s t a n d i n go f f m d vp a t h o g e n e s i s h e r ew er e p o a ，t h ei s o l a t i o na n dc o m p l e t eg e n o m ea n a l y s i so ff o o t a n d m o u t hd i s e a s ev i r u s a s i a1 l y z c h a 0 6i s o l a t ef r o mp i g ，w h i c hb e l o n g st ol i n e a g ea s i a j s c h a 0 5 i nt h es a m et i m e ， a c c o r d i n gt ot h ec o m p l e t eg e n o m eo ft h ef m d va s i a l y s c h a 0 5i s o l a t ef r o mb o v i n e ，w h i c hw a s p r e v i o u ss e q u e n c e di n o u rl a b o r a t o r y ，s i xe d n af r a g m e n t sc o v e r i n gt h ef m d va s i a l y s c h a 0 5 c o m p l e t eg e n o m ew e r ea m p l i f i e da n dc l o n e di n t ol o wc o p yn u m b e rv e c t o rp o k 12 ，5 r a c ew a s a d o p t e dt og a i nt h ea u t h e n t i cs e q u e n c eo f5 e n d ，a n dt h ef u l l l e n g t hg e n o m i ce d n ao ff m d v a s i a l ，y s c h a 0 5w a sc o n s t r u c t e d k e yw o r d ：f o o ta n dm o u t hd i s e a s ev i r u s ；p h y l o g e n e s i s ；s e q u e n c ea l i g n m e n t ；c o m p l e t eg e n o m i ce d n a a s s e m b l y 英文缩略表 英文缩写 a m p b h k b p c d n a c p e c r e d e p c 英文全称 a m p i c i i i i n b a b yh a m s t e rk i d n e y b a s ep a i r c o m p l e m e n t a r yd n a c y t o p a t h o g e n i ce f f e c t s e i s a c t i n gr e p l i c a t i o ne l e m e n t d i e t h y ip y r o c a r b o n a t e d m s o d i m e t h y ls u l p h o x i d e d n a d n t p e c o l i e b e d t a f m d v h s l f a i r e s k b m c s o r f p t b p r a c e r g d u t r d e o x y r b o n u c i e i ca c i d d e o x yn t p e s c h e r i c h i ac o i i e t h e d i u mb r o m i d e e t h y l e n e d i a m i n et e t r a a c e t i ca c i d f o o t a n d m o u t hd i s e a s ev i r u s h e p a r a ns u l f a t e i n d i r e c ti m m u n o f l u o r e s c e n c ea s s a y i n t e r n a lr i b o s o m ee n t r ys i t e k i1 0 b a s e m u l t i p l ec l o n i n gs i t e o p e nr e a d i n gf r a m e p o l y - p y r i m i d i n et r a c tb i n d i n gp r o t e i n 中文名称 氨苄青霉素 乳仓鼠肾细胞 碱基对 互补d n a 细胞病变效应 顺式作川复制元f ，l 焦碳酸乙二酯 - 二甲基弧砜 脱氧核糖核酸 脱氧核茁二磷酸 人肠杆菌 溴化乙锭 二乙胺四乙酸 口蹄疫病毒 硫酸乙酰叶素 间接免疫荧光分析 内部核糖体进入位点 千碱基 多克隆位点 开放阅读框 嘧啶区域结合蛋白 r a p i da m p l i f i c a t i o no fe d n ae n d se d n a 末端快速扩增 a r g i n i n e - g l y c i n e - a s p a r t i ca c i d u n t r a n s i a t a b l er e g i o n v i 精氨酸甘氨酸天门冬氮 酸 1 卜翻泽区 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成 果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已经发 表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业科学院或其它教育机构的学位或证 书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均己在论文中作了 明确的说明并表示了谢意。 研究蝼轹工 时间：呕年参否月b 日 关于论文使用授权的声明 本人完全了解中国农业科学院有关保留、使用学位论文的规定，即：中国农业科 学院有权保留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩 印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业科学院可以用不同方式在不 同媒体上发表、传播学位论文的全翻：或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 论文作者签名： 导师签名 酗啼 时间：贸年矽月日 时f - j ：d 移年d 彳月么日 中冈农业科学院坝l j 学位论文第一章绪论 第一章绪论 1 1 口蹄疫简介 口蹄疫( f o o t a n d m o u t hd i s e a s e ，f m d ) 是由口蹄疫病毒( f o o t - a n d m o u t hd i s e a s ev i r u s f m d v ) 弓1 起的主要侵害偶蹄动物的一种急性、热性、高度接触性传染病。f m d v 是德国科学家l o e f f l e r 春d l f r o s c h 在1 8 9 8 年证实的，是第一个被发现的动物病毒，根据动物交义保护和血清学试验可将该 病毒分为7 个血清刑( 0 、a 、c 、s a t 一1 、s a t 一2 、s a t 一3 羊l l a s i a l ) ，型间无交义保护性免疫( g r u b m a n e ta 1 ，2 0 0 4 ) 。根据v p i 核营酸序列同源性，可将o 犁f m d v 分为e u r o - s a 、m e - s a 、s e a 、c a t h a y 、 w a 、e a 、i s a 一1 利i s a 一2 共8 种基冈型或称拓扑璀( 张显升等，2 0 0 3 ：s a m u e le ta 1 。2 0 0 1 ：殷震 等1 9 9 7 ；m a r v i ne ta 1 ，2 0 0 4 ) 。f m d v 的感染宿主除牛、羊、猪等家畜外，还有黄羊、麝、野猪、 野牛等多种野生偶蹄动物。发病动物的主要症状是精神沉郁、流涎、跛行、卧地，在口、鼻、蹄 等处有水疱。该病传播途径多、传播速度快，白1 5 1 4 年在意人利发生口蹄疫以来，该病曾多次在 世界范围内发生人流行。 1 2 口蹄疫病毒的形态结构和理化特性 口蹄疫病毒是小r n a 病毒科的成员之一( 见表1 1 ) ，病毒粒子牛球形，为止二十面体结构， 直径2 0 - 3 0 n m 。口蹄疫病毒的分子苗为6 9 1 0 6 d ，病毒颗粒由单股r n a 和农壳蛋白构成，不含囊 膜。超速离心可以见到人小不同的粒子：最人的粒子是完整病毒，沉降系数是1 4 6 s ，在氯化铯中 的浮密度是1 4 3 9 c m 3 ：第2 种粒子是不含r n a 的空农壳，没有感染性，沉降系数是7 5 s ，7 5 s 空农 壳由结构蛋向v p o 、v p i 、和v p 3 各6 0 个分子组成，在氯化铯中的浮密度是1 3 1 9 c m “：第3 种粒 子是空农壳蛋白弧单何五粒体，是病毒颗粒装配过科中的前体之一，由v p 0 、v p l 和v p 3 各5 个分 子组成，沉降系数是1 4 s ：最小的一种颗粒是由v p 0 、v p i 和v p 3 各一个分子组成的5 s 原体，分 子量8 0 0 0 d 左右。 对病毒粒子作x 衍射分析( 见幽1 1 a ) ，病毒粒子成光滑平褴的球形，并证实口蹄疫病毒只 有v p i 的第1 4 1 - 1 6 1 位氨基酸突出丁病毒离子表面，没有其他小r n a 病毒那样的凹陷结构。 口蹄疫病毒对酸碱十分敏感，p h 低丁6 或高丁9 时，病毒迅速火活。在p h 中性的淋巴结和 骨髓中存活较久，但可住p h 小丁6 o 的肌肉中火活。在污染的饲料利环境中可存活1 个月以上， 但存活时间与温度和p h 值有关。冈此，1 - 2 的氢氧化钠，4 的碳酸氢钠，3 的草k 灰，卜2 的甲 醛溶液等都是口蹄疫的良女，消毒剂，日光直射6 0 m i n 后病毒即可夕匕亡。 表1 1 小r n a 病毒科的分类( 引自k n i p ed 2 0 0 6 ) t a b l e l 1 m e m b e r so f t h ef a m i l yp i c o m a v i r i d a e ：i ：訾l i l ! ! ! i ：! ：至鍪 小r n a 病毒科 m 请缸d ( n u m b e r代表种( t y p es p e c i e s ) l l 他成员f o l h 日m e m b e 曲 u 日接“4 屈f o o l a n d i t hd v i h i s c sa a n d ca s i a is a i is 【25 a i3 0 肌“毒属 t h c i l l e f sn 1 n c 。p l l a l c | 】t i s s 肠4届 i i n a o s n c k l n i 】s c s 1 一a 2 2 m l da 2 4 j u m a nc o x s a c k 】e v j r u s c s b i b 5 m柏奇属 “歧柑“毒襁 #“e 嚣：鎏：篇：嚣。“m 。 中罔农业科学院硕l j 学位论文 第一帝绪论 圈1 1 a f m d 病毒x 一射线衍射图 1 1 b 口蹄疫病毒衣壳蛋白示意图 f i g i a m o d e lo f f m d vb a s e do nx r a yc r y s t a l l o g r a p h i cs t r u c t u r ed c t e r m i n e da t2 9ai b s c h e m a t i co f f o o ta n dm o u t hd i s e a s ev i r u sc a p s i d ，s h o w i n gt h ep s e u d o e q u i v a l e n tp a c k i n ga r r a n g e m e n to f v p i ，v p 2 ，a n dv p 3 v p 4i s o nt h ei n t e r i o ro ft h ec a p s i d t h eb i o l o g i cp r o t o m e r ( g r a y ) i sn o tt h es a m ea st h ei c o s a h c d r a la s y m m e t r i cs u b u n i t ( t r i a n g l e e x p a n d e da tr i g h t ) 1 3 口蹄疫病毒分子生物学特性 1 3 1 基因组的结构与功能 口蹄疫病毒( f m d v ) 是小r n a 病毒科( p i c o r n a v i r i d a e ) 口蹄疫病毒属( a p h t h o v i r u s ) 的唯一成员。 口蹄疫病毒基冈组为单股止链r n a ，既是m r n a ，义是负链r n a 的模板，全k 约8 5 0 0 个核茁酸，io i 病毒组分的3 0 9 6 。基冈宝f i 由y - i t 编码区( u n t r a n s l a t i o nr e g i o n ，u t r ) ，开发阅读框( o p e nr e a d i n g f r a g m e n t ，o r f ) ，3 1 卜编码区( y u t r ) 和p o l y ( a ) 组成( g r u b m a nm j e ta 1 ，1 9 8 4 ) 。口蹄疫病毒 基冈组结构和成熟蛋白见图1 2 。 图1 2 口蹄疫病毒基因组结构( 引自p w n a s o n 2 0 0 3 ) f i g i 2 s c h e m a t i cd i a gr a mo ft h ef m d vg e n o m e 5 u t r k 约1 3 0 0 b p ，5 共价连接小蛋1 5 t v p g ( 3 b 蛋白) ，由s 片段( s h o r t f r a g m e n to f t h e g e n o m e ) 、 p o l y ( c ) 区段( p o l yc y t o s i n et r a c t ) 、假结结构( p s e u d o k n o t s ，p k s ) 、顺式作川元f l ：( c i s - a c t i n gr e p l i c a t i v e e l e m e n t ，c r e ) 和内部核糖体进入位点( i n t e r n a lr i b o s o m ee n t r ys i t e ，i r e s ) 等部分组成。高度 结构性的5 u t r 起着稳定r n a 的作川。参与调控病毒蛋向和r n a 复制。s 片段约含3 6 0 个碱基，能够 折叠形成一个长的举环结构。这一结构可使基冈组避免宿土细胞核酸酶的消化。p o l y ( c ) 的k 度从 1 0 0 至i j 4 2 0 个核茁酸不等，其k 短冈毒株不同而有很人的筹异，可能与病毒的毒力有关。p o l y ( c ) 片 段中儿乎由胞嘧啶( c ) 构成，偶尔有几个u ，缺火p o l y ( c ) 的c d n a 不具有感染性。f m d v 的p o l y ( c ) 的长度与病毒r n a 的感染性利复制有关，是维持病毒r n a 具有感染性的必要元件。i r e s 是蛋白翻 译顺式作用元件，长约4 5 0n t ，能与真核生物起始冈子、特异性反式作川冈子、p t b 币i i 核糖体弧单 位结合形成起始复合物，i r e s 对翻译的起始有重要作刖( s t a s s i n o p o u l o s ，e ta 1 ，2 0 0 1 ) 。口蹄疫病 毒5 u t r 结构见图1 - 3 。 中困农业科学院硕f 学位论义 第一章绪论 图1 3 口蹄疫病毒5 7 u i r 结构( 引自p w m a s o n 。2 0 0 3 ) f i g 1 3 e x p a n d e dv i e wo f t h e5 u t r 3 u t r 长约9 0n t ，含有与负链r n a 合成有关的顺式作川元什，一些r n a 转录物可与该位点 互补结合暂时性地抑制病毒的感染性。c a r r o l l 等对a ，的序列分析表明，终i 卜密码子为u a a ， 距p o l y ( a ) 3 末端有9 3 n t ，而a - z 终i 卜密码子距p o l y ( a ) 3 末端有9 6 n t 。 p o l y ( a ) 尾巴k 约1 0 0 n t ，与病毒感染性有关，一般认为p o l y ( a ) 越k ，病毒的感染性越强。 g r u b m a n ( 1 9 7 9 ) 认为，p o l y ( a ) 尾巴具有起始r n a 的合成、保护m r n a 免遭细胞核酶降解的作圳。 1 3 2 病毒结构蛋白及其功能 o r f 艮约6 5 k b ，由l 基冈、p l 结构蛋白基冈、p 2 和p 31 卜结构蛋向基冈以及起始密码子和 终i 卜密码子组成，其中p 1 结构蛋白基冈编码4 种土要的农壳蛋向v p l 、v p 2 、v p 3 平i iv p 4 ，分别 含2 1 3 、2 1 8 、2 2 0 和8 5 个氨基酸残基( 不同血- 清型略有不同) ，见表1 2 。2 a 和3 c 催化结构蛋 白前体p 1 裂解产生v p 0 、v p l 和v p 3 。v p 0 、v p l 和v p 3 各一分子组成1 个1 卜对称的原体，5 个原体形成一个五聚体单位，1 2 个五聚体借助组氨酸聚合成病毒农壳。v p o 能白我裂解为v p 2 和 v p 4 ，从而完成成熟病毒粒子的包装过程。这样农壳蛋白就由v p l 、v p 2 、v p 3 和v p 4 各6 0 分 子组成，形成2 0 面体对称结构，只有2 、3 、5 对称结构。 口蹄疫病毒粒子无囊膜，v p l 人部分露在病毒粒子表面，是决定病毒抗原性的土要成份乖血 清玳特异性蛋白，能诱导机体产生中和抗体，并能产生部分的保护作川。v p l 、v p 2 、v p 3 位t 农壳表面，为外农壳蛋白，它们具有相似的结构，均由8 个1 3 桶和2 个a 螺旋宝l 成，每个b 桶 有2 个4 条链组成的b 片层结构组成。病毒农壳蛋白至少有以卜儿种功能：( 1 ) 保护病毒r n a 不 被环境中的r n a 酶水解：( 2 ) 识别由宿主细胞编码的位丁细胞膜上的病毒受体；( 3 ) 决定宿土范同； ( 4 ) 具有特异的抗原性；( 5 ) 将病毒r n h 包装进农壳和病毒r n a 释放剑宿土胞浆中。 4 中罔农业科学院顾f j 学位论义 第一章绪论 表1 2 口蹄疫病毒结构蛋白的基本特征( 引自毕英佐2 0 0 5 ) t a b l e1 2 c h a r a c t e r i s t i co ff m d vs t r u c t u r a lp r o t e i n 1 3 3 病毒非结构蛋白及其功能 f m d v 的非结构蛋向包括前导蛋白酶( l 即) 、2 a 、2 b 、2 c 、3 a 、3 b 、3 c 蛋白酶( 3 c p ”) 雨l 3 d 聚合酶( 3 d p o 。) 以及它们的前体( 两种以上蛋白的复合体) 。它们参与r n a 的复制、多聚蛋白 的裂解和结构蛋白的折叠与装备等过程。与结构蛋白相比，非结构蛋白的变异较少，相对保守。 l 基冈被翻译成2 个密切相关的前导蛋白，冈为其起始密码子a u g 不同，二者相距8 4n t ， 所以两个前导蛋白l a b ( 人) 和l b ( 小) 相著2 8 个氨基酸。两种蛋白作为酶能使自己在l p l 连接 处进行白我切割释放，还可介导e i f 4 g 和e l f 4 f 的裂解。e l f 4 f 是c a p 结合蛋白复合体中的成 分，是宿主细胞蛋向质翻译过程中所必需的起始冈子。这样，l 蛋向使宿主细胞依赖c a p 的蛋白 合成受阻。l 蛋白酶的作川域具有5 个a 螺旋和7 个b 甭小瓜酶样折叠片，其第2 3 位的c y s ， 第1 2 0 位的h i s 是该酶的催化活性位点，而且第2 7 何的t h r 、4 8 位的g l u 和1 3 6 位的a s p 都 参与了上述位点的作川。将含有l y s 2 2 3 位突变的感染性c d n a 在b h k 2 1 细胞中盲传，第2 3 何突变的氨基酸义同复其原来的l y s ，表明l y s 2 2 3 对_ 丁l 蛋白酶在l p 1 处的剪切活性是必 需的。 p 2 基冈编码4 8 8 个氨基酸的聚合蛋白，称为2 a b c 。该蛋白随后被裂解为2 a 、2 b 和2 c 。 f m d v 的初级聚合蛋向2 a b 是由2 a 介导在c 末端裂解的。2 a 和2 b 连接处的序列为保守的 n p g p 。2 a 能够白我催化p 卜2 a 同2 c 解离，因而认为2 a 是一个顺式裂解元件。2 a 为p i 2 a 间 裂解提供识别序列。2 b 、2 c 、3 a b 和3 c d 形成复制复合物。为病毒r n a 的合成创造条什，而且 与装配有关。2 b 和2 c 的功能尚不清楚。脊髓灰质炎病毒2 b 和2 c 与病毒r n a 的合成有关。 2 c 可能与r n a 的复制有关，2 b 与病毒感染宿主的范围有关。2 c 币i 其前体2 b c 联合诱导细胞膜 上的囊突形成，为病毒r n a 的合成创造条件。f m d v 的2 c 、3 d 和3 b 形成的复合物将模板r n a 和子代r n a 附着在细胞内膜结构上，完成r n a 的复制。 p 3 区编码序列的长度为2 7 1 2n t ，编码3 a 、3 个3 b 、3 c 和3 d 蛋白。3 a 蛋白被认为是小r n a 病毒复制复合体与膜结构结合的锚定蛋白，与病毒诱导的细胞病理效应录i 阻断细胞内蛋白的分解 有关。3 a 似乎与f m d v 感染的宿土范同密切相关，不同血清型f m d v3 a 基因的改变或缺火均 会减弱其对牛的致病力。k n o w c l s 等通过对2 8 株f m d v 分离毒株进行v p i 和3 a 基冈的核营 酸序列和氨基酸序列比较，发现3 a 的缺火发生在两个部位，即9 3 - 1 0 2 位氨基酸残基和1 3 3 - 1 4 3 5 中冈农业科学院硕卜学位论义 第一辛绪论 皇曼曼曼曼曼! ! 曼曼鼍曼舅! l i i 一_ 曼曼! 曼曼皇曼皂! ! ! ! 曼曼鼍曼曼! 曼! 蔓! ! ! 曼曼曼皇曼曼曼曼 t 7 ：氨基酸残基，缺火部位周用有人量氨基酸替换，对t a i w a n 9 7 猪源毒株9 3 - 1 0 2 位氨基酸缺失 研究认为，3 a 的缺火与此毒株对猪的嗜性增高有关。3 c 蛋向酶具有病毒加i ：、宿主蛋白裂解和 与二叶草r n a 和3 a b 形成较弱的r n p 复合物的作用。3 c 蛋白酶为g i n g l y 特异的蛋白酶。 催化人部分聚合蛋白的裂解：同时，3 c 也参与组蛋白h 3 的裂解，裂解能点- 住h 3 的l e u 2 。和a 1 砸 之间，对宿主的基冈转录可能有阻抑作h j 。g r u b m a n 等( 1 9 9 5 ) 认为，f m d v 的3 c 不仅可以裂解 p 卜p 2 连接1 1 i ) = 点，可以在p 1 、p 2 和p 3 内裂解。而且在多数情况卜，人i ：突变的蛋白酶基冈都 被病毒拯救并同复到它的野生璎3 c 蛋白酶密码子。3 c 能单独发挥酶的作川，前体3 c d 也有酶活 性。3 d 为r n a 依赖的r n a 聚合酶，义称病毒相关抗原( v i a a ) 。催化病毒r n a 的合成。病毒 以v p g 为引物，以3 d 为r n a 聚合酶，与3 a 、2 b 、2 c 以及一些宿土蛋白形成复制复合体，附 着在胞质内膜结构上合成负链r n a ，再以负链r n a 为模扳合成止链r n a 。 1 3 4 口蹄疫病毒的复制过程 病毒通过吸附宿土细胞的受体、穿入和脱壳完成其内化过程，脱壳后，病毒r n a 释放剑细胞 浆中，开始病毒蛋白的翻译。翻泽之前，细胞酶裂解染色体连接蛋v p g ，形成含有v p g 的蛋白合 成起始复合体m r n a 。与绝人多数宿主m r n a 不同，病毒m r n a 的5 端没有7 一甲基一g 帽结构，由内 在核糖体进入位点( i n t e r n a lr i b o s o m ee n t r ys i t e ，i r e s ) 起始蛋白合成。l 呷通过裂解蛋白合成起始 冈子e i f 4 g ，使细胞内帽依赖m r n a 翻译受到抑制。完整的e i f 4 g 桥迮m r n a 帽：乖i t 4 0 s 核糖体弧单 位，帽连接蛋e i f 4 e 与e l f 4 g 的n 端区域连接，而e i f 4 g 的n 端i 又：域与e l f 4 a 连接、与4 0 s 核糖 体弧单位在e i f 3 处相连。f m d vr n a 翻泽起始只依靠l 即产生的c 端e l f 4 g 裂解产物，此产物与 f m d vi r e s 连接后与4 0 s 核糖体e l f 4 a 和l e l f 3 相互作用。而e i f 4 b 与f m d vi r e s 相连，参与4 8 s 起始复合体前体：祠1 8 0 s 核糖体的形成。 病毒r n a 的翻译毕多核糖体型，即一条r n a 链上同时结合数个剑儿十个核糖体，启动多条蚩向 多肽的合成。翻译起始后，产生的多肽链经裂解形成结构蛋白和1 卜结构蛋白。初级裂解有l p m 白动 从聚合蛋白上裂解，由1 8 个氨基酸组成的2 a 白我催化从p 2 蛋白上裂解卜米，还有2 a ：； i t 2 b 之间的裂 解，次级裂解由3 c 邮完成。病毒蛋白合成达剑一定的水平，启动r n a 的复制。病毒3 b ( v p g ) 尿 茁酸化后，与p o l y ( a ) 连接形成负链r n a 合成的引物，3 d 叫催化合成负链r n a 。新生成的负链 r n a 作为模板合成止链r n a 。止链r n a 的合成速度比负链r n a 快，一条负链r n a 可以同时启动多 条正链r n a 的合成。在病毒复制早期，新生成的止链r n a 分子进入蛋白的翻译平t i r n a 复制过程。 这样复制山的止链r n a 节数莓级增k 。 d , r n a 病毒只装配连有v p g 的r n a ，不装配病毒其他r n a 和细胞r n a 。并且只装配新合成 的r n a ，表明r n a 复制和装配之间的联系。可能是r n a 止链内的顺式活性包装信号启动了装配。 在装配前，结构聚蛋白p 1 裂解并形成原粒( v p 0 、v p _ j 4 t v e 3 通过弱的化学键凝集而成) 。原粒装配 成五聚体，1 2 个五聚体包装一个r n a 分子形成前病毒粒子。前病毒粒子无感染性，感染性的病毒粒 子需要结构蛋白的成熟裂解。一个完整的复制周期一般需要3 一1 2 个小时。复制周_ 】的k 短冈毒株 不同而有著异，同时受p h 、温度、细胞类艰、营养臀网素的影响。 6 中罔农业科学院f 砍1 1 学位论文 第一审绪论 曼舅! 曼皇曼! i i i i mm i 一蔓! 皇曼 幽1 4u 蹄疫病毒的复制州期( ，j i 白f i e l d sv i r o l o g y 5 e 2 0 0 6 ) f i g 1 4 o v e r v i e wo f f m d vr e p l i c a t i o nc y c l e 1 4 病毒的遗传变异 口蹄疫病毒冈其r n a 依赖的r n a 聚合酶缺乏高保真性，极易发生变异，导致该病毒具有“准 种”特性( d o m i n g o ，e ta 1 ，1 9 8 0 ：d o m i n g oe ta 1 ，1 9 8 5 ：d o m i n g oe ta 1 ，1 9 9 2 ) 。这种准种病毒理论 认为，f m d v 病毒种群不是由一种定义的分子种群组成的，而是由一种或儿种住基冈组中i l i 。优舞 的少数的显性序# l j ( m a s t e rs e q u e n c e ) 雨l - - 些不相同的但相犬的分子种群构成。即在机体内每一个变 异株都与其他的突变株竞争突变以利丁获得在种群分布中的优辨地位。在k 期的进化过程中，变 异基i 灭l 组受剑宿土止向选择压力的影响，也受剑一个或儿个感染颗粒从一种感染宿主传播剑另一 种敏感宿土的随机性的影响。这些突变的病毒株就可以逃避宿土针对原毒株已诱生的体液和细胞 介导免疫，导致宿主产生持续性感染。口蹄疫病毒的在免疫选择压力条什卜发生抗原变异，即使 在没有选择压力的条1 i ，l ：卜，f m d v 也能发生变异，但在选择压力。卜变异频率明显增高。 1 5 口蹄疫的防控措施及难点 口蹄疫的防控应遵循传染病防治的基本原则“早、快、严、小”四个字。尽早发现疫情，快 速采取措施，严格封锁疫点，将损火降低到最小程度。 在具体实施过样中可采取以卜一项或多项，疫情发生后立即捕杀病备及受感染的动物，消灭 传染源。病眚是最重要的传染源，其次是1 卜持续性感染的隐性带毒动物。采取免疫接种，保护易 7 中陶农业科学院帧l 学位论义第一幸绪论 感动物。限制动物、动物产品及感染1 2 1 蹄疫病毒的动物。采取严格的卫生措施，彻底清除疫源。 进行流行病学调查与监测。在无1 2 1 蹄疫的国家或地区暴发口蹄疫时，通过应川“扑灭”( s t a m p i n g o u t ) 政策控制该病；一口疫病已被控制，在根除战役消灭病毒的最后阶段，也可以应川“扑灭， 控制该病。 尽管有常规免疫计划的实施，口蹄疫却常常暴发，分析其原冈： 口蹄疫病毒易感动物多，除了家备中牛、羊、猪等偶蹄动物易感外，还有多种野生动物感染， 野生动物感染后不发病却携带病毒，对家畜造成直接威胁，一口传染给家畜，往往会引起暴发。 f m d 病毒基冈组具有小r n a 病毒准种的特性，病毒变异性极强，有七个血清型。型间不能 交义免疫保护，即使型内不同病毒株间的遗传变异，也可导致抗原差异，其至会导致一次新的疫 情。 f m d 病毒的感染性和致病力特别强。由丁f m d 病毒可以经由与感染动物的直接接触、污染 物及机械设备的( 直接或间接) 接触，还可通过气溶胶经空气远距离传播，经空气、吸入、损上1 i 的皮肤等途径感染，感染动物能从多种途径排出病毒，散布到环境中的病毒相对来说有较强的抵 抗力和存活力，少莓病毒就会引起易感动物感染。 f m d 病毒的一人特点是其r n a 具有感染性，冈此存在灭活苗灭活不彻底的可能性，欧洲曾有 灭活苗注射动物斤引起口蹄疫暴发的报道，而0 型口蹄疫鸡胚传代致弱苗对牛的致病力降低，却 对猪有致病性。冈此，疫苗的安全和效力是评价疫苗最重要的指标，开发安全高效的实川疫苗成 为口蹄疫病毒研究的重要课题之一。 口蹄疫疫苗对猪的保护期短，而且不能使猪产生坚强的免疫。 接种动物接触到与疫曲毒株同型的不同毒株时，动物可能得不剑有效保护，从而导致感染。 除了上述原冈之外，其他社会经济l 灭l 素等也极人地影响了口蹄疫病毒的防控。 1 6 本研究的目的和意义 f m d 引起幼备死亡、产奶昔卜降、肉食减少、肉品卜降、动物的生产性能降低，导致巨人的 经济损火。此外，由于贸易的限制利禁i 卜而引起的损火更人。全世界每年由此造成的直接经济损 火可达数白亿美元。冈此，e d d 在国际上被称为“政治经济病”，历来受剑各国政府的重视。a s i a l 型口蹄疫在1 9 5 4 年首次确认( a s i a l p a k 5 4 ) ( b r o o k s b yj b e ta l ，1 9 5 7 ) ，1 9 5 8 年，中国在 云南省保山首次分离剑a s i a l 刑口蹄疫病毒( a s i a l y n b s 5 8 ) ( d uj e ta 1 ，2 0 0 7 ) ，然而在过去的 近4 0 年里，中国流行的a s i a l 型1 2 1 蹄疫病毒只有一个谱系( a s i a l y n b s 5 8 ) ：近年来，山现了3 个新的谱系，包括a s i a l l h n u c h a 0 5 谱系、a s i a l j s c h a 0 5 谱系和中缅边境的 a s i a l b r m y a n m a r 0 6 的谱系。闪此，目前在中国出现的a s i a l 型口蹄疫病毒可分为4 个不同的谱 系，其中义以a s i a l j s c h a 0 5 谱系流行范围最广，造成的经济损火最为严重。白2 0 0 5 年5 月至 2 0 0 7 年底，江苏谱系毒株在江苏、北京、河北、甘肃、青海等1 6 个省的牛群流行，引起严重的 a s i a l 型口蹄疫。a