（分析化学专业论文）鲁米诺量子点体系的电化学发光共振能量转移研究.pdf

山东大学硕士学位论文 中文摘要 第一章研究了一种共振能量转移( i 迮t ) 的新方法：鲁米诺过氧化氢量子 点体系的电化学发光共振能量转移( e c r e t ) 方法。当电极表面施加合适的电 位，鲁米诺在碱性条件下与h 2 0 2 发生电化学反应生成电化学发光( e c l ) 发光 体并释放出4 2 5n m 的蓝色光。此e c l 发射光谱与受体量子点( q d ) 的吸收 光谱有效重叠。当e c l 发光体与q d 达到产生r e t 的有效距离时，e c l 发 光体释放的能量就会转移到q d 上使之发出荧光。为了提高r e t 的效率，采 用了硅烷化i t o 导电玻璃与n a t i o n 膜包埋法两种方式固定受体量子点。结果 表明后者更有利于e c r e t 。采用n a t i o n 膜固定量子点的方式，我们对e c r e t 的最佳条件进行了研究。实验结果指出，用q db u f i e r ( p h = 8 3 ) 作为量子点稀 释液，未稀释的n a t i o n 溶液分层法固定量子点，以光透i t o 作工作电极，采 用恒电位作为电化学激发方式，确定了最佳的e c r e t 条件是：量子点固定量为 1 1 0 以2 m o l ，工作电位为0 9v ，狭缝宽度为1 5m m ，l u m i n o l 浓度为l 1 0 弓m o l l ， h 2 0 2 浓度为l 1 0 之m o l l 。此条件下测得e c r e t 效率为3 3 。相对于传统的 f r e t 检测，e c r e t 具有仪器方法简单、无需昂贵的激发光源等优点。 第二章我们利用葡萄糖氧化酶( g o d ) 催化b d g l u c o s e 生成h 2 0 ：的反 应，研究了一种e c r e t 的新体系：鲁米诺葡萄糖葡萄糖氧化酶量子点体系。 g o d 催化底物g l u c o s e 与溶液中的0 2 反应生成葡萄糖酸和h 2 0 2 。生成的 h 2 0 2 在正电位区与碱性溶液中的鲁米诺发生电化学反应生成e c l 发光体。当 e c l 发光体与q d 达到产生r e t 的有效距离时，e c l 发光体就将能量转移至i 量子点。本文研究并讨论了几种因素( 如电位、p h 值、g 】u c o s e 浓度、g o d 浓 度、孵育时间、n a t i o n 膜厚度，g o d 在溶液中和固定在电极表面的方式等) 对 e c i 洹t 的影响。在最佳条件下，测得e c r e t 效率为31 。 关键词：电化学发光共振能量转移；鲁米诺：量子点；葡萄糖氧化酶；n a t i o n 山东大学硕士学位论文 a b s t r a c t i nc h a p t e ro n eo ft h i st h e s i s ，an e wm e t h o df o rr e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r b e t w e e ne l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n td o n o r sa n dq u a n t u md o t s ( q d s ) a sa c c e p t o r sw a s d e v e l o p e d ，w h i c hi sc a l l e de l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r 0 e c r e t ) i nt h ee c r e t , t h ee m i s s i o no ft h ee m i t t e r sg e n e r a t e da ta l le l e c t r o d e t h r o u g ha ne l e c t r o c h e m i c a lr e a c t i o ni sa b s o r b e db yd o n o r s a tt h es a m et i m e ， f l u o r e s c e n c ei se m i t t e db yt h ed o n o r s w eu s e dt h et r a d i t i o n a ll u m i n o l h 2 0 ：e c l s y s t e mt og e n e r a t et h ee m i t t e r sa n dq u a n t u md o t s ( q d s ) 谢t hae m is s i o no f6 5 5n mt o s e r v ea st h ea c c e p t o r s i nt h i sw o r k , t h ec o n d i t i o n sf o rp e r f o r m i n ge c r e t i n c l u d i n g c o n c e n t r a t i o n so f1 u m i n o la n dh 2 0 2 t h em e t h o df o ri m m o b i l i z a t i o no fq d so nt h e s u r f a c eo ft h et r a n s p a r e n ti n d i u m - t i no x i d e ( i t o ) e l e c t r o d ew e r ei n v e s t i g a t e da n d d i s c u s s e d i tw a sf o u n dt h a tw h e nlxl o 1 2m o lf o rt h ea m o u n to fq d ，0 9vf o rt h e e l e c t r o d ep o t e n t i a l ，1 5m mf o rw i d t ho fs l i t ，1 1 0 。3m o l lf o rl u m i n o lc o n c e n t r a t i o n a n dlx10 m o l lf o rh 2 0 2c o n c e n t r a t i o nw e r eu s e d ，t h ee c r e t 谢t hah i 曲e n e r g y t r a n s f e re f f i c i e n c yc o u l db eo b t a i n e d t h ea d v a n t a g eo f f e r e db ye c r e ti st h a tn o e x c i t a t i o nl i g h ts o u r c ei sr e q u i r e dt oe x c i t et h ed o n o r , w h i c ha v o i d sp r o b l e m si nf r e t s u c ha sl i g h ts c a t t e r i n g ，h i g hb a c k g r o u n dn o i s e ，p h o t o b l e a c h i n g ，a u t o f l u o r e s c e n c ea n d d i r e c ta c e e d t o re x c i t a t io n i nc h a p t e rt w o ，w ed e v e l o p e da n o t h e re c r e t s y s t e m ：l u m i n o l g l u c o s e g l u c o s e o x i d a s e ( g o d ) - - q ds y s t e m i nt h i ss y s t e m ，g o dc a t a l y z e sg l u c o s et op r o d u c e g l u c o s ea c i da n dh 2 0 2i nt h ep r e s e n c eo fo x y g e n t h e n ，e c r e tc a nb eo b t a i n e d a c c o r d i n gt ot h ep r o c e s sd e s c r i b e da b o v e o p t i m u me x p e r i m e n tc o n d i t i o n si n c l u d i n g p hv a l u e ，e l e c t r o d ep o t e n t i a l ，t h ec o n c e n t r a t i o n so fg l u c o s ea n dg o df o re c k e to f t h es y s t e mw e r ei n v e s t i g a t e da n dd i s c u s s e d w ea ls oi n v e s t i g a t e dt h ee c r e tf o ? g o di ns o l u t i o na n di m m o b i l i z e do n t oi t os u r f a c e k e y w o r d s ：e l e c t r o c h e m i l u m i n e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g ) rt r a n s f e r ；l u m i n o l ； i i q u a n t u md o t s ；g l u c o s eo x i d a s e ；n a f t o n 山东大学硕士学位论文 r e t e c r e t q d e c l g o d f r e t g f p 珏很 m b p b s a f i t c b r e t a b e l c r e t h r p s a - q d i t o t r i s g o p s p b s p m t l s v e m c c d f d a 凡 b i o g o d 符号说明 共振能量转移 电化学发光共振能量转移 量子点 电化学发光 葡萄糖氧化酶 荧光共振能量转移 绿色荧光蛋白 四甲基罗丹明 麦芽糖结合蛋白 牛血清白蛋白 异硫氰酸荧光素 生物发光共振能量转移 异鲁米诺 化学发光共振能量转移 辣根过氧化物酶 链霉亲和素修饰的量子点 铟锡氧化物 三羟甲基氨基甲烷 3 环氧丙氧丙基三甲氧基硅烷 生理盐水 光电倍增管 线性扫描伏安法 电子多级放大电感偶合器 受体存在时供体的荧光强度 没有受体存在时供体的荧光强度 生物素标记的葡萄糖氧化酶 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立 进行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含 任何其他个人或集体己经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出 重要贡献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本声明的法律责 任由本人承担。 论文作者签名刭：自 e t期： 2 遂：堕：2 五 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校 保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被 查阅和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编 入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存t 2 交 和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名： 到：函导师签名：金宝宝日 期：2 盔：堕：2 厶 山东大学硕士学位论文 第一章鲁米诺过氧化氢量子点体系的 电化学发光共振能量转移 1 1 引言 1 9 4 8 年，f o r s t e r 首先提出了共振能量转移理论 1 】，这是一项应用能量转移 来测量分子内和分子间距离的技术，作为一种高效的光学“分子尺” 2 ，3 】，已成 功应用于蛋白质结构 4 】、免疫分析 5 、糖类测定 6 、生物医学临床检验中c o - ：_ 的监测 7 】以及高分子和超分子科学研究 8 】等领域。其原理是：一对合适的物质 构成一个能量供体( d o n o r ) 和能量受体( a c c e p t o r ) 对，当两者相隔1 1 0n m ，并且 供体的发射光谱与受体的吸收光谱能有效地重叠，以供体的激发光激发，供体分 子由基态跃迁到激发态之后，由于偶极偶极相互作用，供体分子激发态能量加 就有可能以非辐射的形式被有效地传递至受体分子，而后受体分子通过发射出光 子而弛豫 9 ，l o 】，过程如图1 - 1 所示。由于供受体在大多数情况下为荧光物质， 因此也称为荧光共振能量转移( f l u o r e s c e n c er e s o n a n c ee n e r g yt r a n s f e r ，简称 f i 汪t ) 1 1 】。 依据f o r s t e r 理论，相隔一定距离厂的供受体之间的能量转移效率e 可 用下式表示 1 2 - e ：竺( 1 - 1 )丘= - i ，”4 - r 0 。 民6 = 8 7 9 x 1 0 。2 5 1 c 2 一如 ( 1 - 2 ) 式中；岛称为f o r s t e r 半径，是能量转移效率达到5 0 时供受体对之间 的距离( 即在此距离时，供体一半能量发生转移而另一半能量则按通常的辐鼓 非辐射速率衰减) ，对于特定的体系和能量供受体对，可以将尺。看作恒量7 为 供体与受体之间的距离：，是空间取向因子，依赖于供体和受体偶极的相对取 向，通常假设为2 3 ；西d 是无受体存在时能量供体的荧光量子产率；为供 体与受体之间的光谱重叠积分；刀为供体与受体之间溶剂的折射率。 在实验中，通常通过测定在受体存在和不存在情况下，供体的荧光强度或荧 光寿命而得到e ： 山末大学硕士学位论文 e ：l 一丘：l k 尼 t d f i ) a 、如n 分别为受体存在时供体的荧光强度和荧光寿命 有受体存在时，供体的荧光强度和荧光寿命。 尹1 d o n o r r 15r 不发生能量转移 b 闰1 - lf r e t 的能级图和原理示意圈 af r e t 能级图：b f r e t 原理示意图 利用f 6 r s t e r 半径r 。和实验测得的能量转移效率e 就可根据式1 - 4 计 算出供体与受体之间的距离r ，获得关于分子结构方面的信息【2 ，1 3 。f 6 r s t e ：理 论的正确性已经在已知体系中得到了证实 2 ，1 4 。 ，：咒( 半) ( 1 - 4 由咀上公式可知，能量转移的敬率和供体发射光谱与受体吸收光谱重叠程 立盛 山东大学硕士学位论文 度、供体与受体之间偶极的相对取向以及供体与受体之间的距离等困豪有美 1 2 】。因此，f r e t 供受体对的合理选择显得尤为重要。作为共振能量转移的供 受体对( 简称d a 对) ，荧光物质必须满足以下条件【1 ：( 1 ) 供受体的激发光 谱要分得足够开：( 2 ) 供体的发射光谱与受体的激发光谱要重叠( 3 0 ) ；( 3 ) 供 受体的发射光谱要足够分得开。特殊情况下，受体也可以是一种只有吸收光而没 有发射光的荧光淬灭剂。在选择合适的d a 对时，第一步是确定生物大分子本 身有没有内源性的荧光基团可以作为d 或a ，如色氨酸残基( t r p ) 1 5 ，1 6 、 具有荧光的碱基【1 7 】、血红素【1 8 】、还有核苷酸的荧光类似物 1 9 】等等，这样可以 大大简化标记的繁琐步骤。由于生物体的自身荧光往往太弱或缺乏特异性，研究 中常用的能量供受体对多是合成的荧光物质即外源性荧光基团，通过化学方法将 其标记到不发光的研究对象上。目前，f r e t 研究中常用作供体或受体的主要有： 荧光蛋白、传统有机染料、镧系染料和量子点。 绿色荧光蛋白( g r e e n f l u o r e s c e n c ep r o t e i n ，g f p ) 是1 9 9 2 年p r a s h e r 等人 2 0 首先从维多利亚水母中分离并克隆出的一种生物荧光物质。由于g f p 稳定性 好、量子产率高、无生物毒性，因此很快在基因表达、蛋白质定位、细胞间物质 交换等研究中获得了广泛应用。1 9 9 4 年以来，h e i m 等人 2 i ，2 2 利用定点突变 的方式，得到了多种具有不同荧光光谱或具有更高荧光量子产率的荧光蛋白蟠 g f p s 6 5 t 、b f p 、c f p 、y f p 和r f p 等阱2 7 1 ，以其为基础组成了多个新的f p , z 7 供受体对，适用于观察活体内生物反应的动态变化。 a r 图l - 2 绿色荧光蛋白结构图 a 分子结构式：b 结构示意图 b 揆 山东大学硕士学位论文 在紫外、可见、近红外区域发光的有机染料通常称为传统的f r e t 染料。 其中紫外可见光区的荧光染料有香豆素类 2 8 3 0 1 、芘类 3 1 、萘类 3 2 、荧光素 类【3 3 3 7 、罗丹明类 3 8 - 4 3 和b o d i p y 类等，结构式列于图1 - 3 。近年来以花 菁类为代表的近红外荧光染料发展迅速 4 4 5 0 1 ，其优点在于散射光弱、背景干扰 低，低激发能量减小了光漂白，使用近红外激光器提高了灵敏度，因而特别适合 用于生物样品的测定。除常用的c y 3 和c y 5 等之外，其它多种菁类染料也已 陆续被合成出来。 氛 香豆素类芘类萘类 荧光素类罗丹明类 花菁类 s o ； r 嫩r ， r ff b o d i p y 类 图1 3 常用紫外、可见、近红外荧光染料的结构 r 取代基通常为c o ：s 0 3 o h o c i - 1 3 c h 3 和n o ! r x 标记代表与生物分子的典型结合位点 ， o 中i r批r 夏 玲 簪 蜂 山东大学硕士学位论文 d y e sc y 3 j m + q 7 r r 7 7 4 蚰叫m 析n - 矗】 b o d i p yl | i 掣鲰3 b o m f v 砌g l h i l 蚌ef l u o rf 4 赫f 留 h j l y r e ； l u o r 汀硼疗7 丑 a 丁t 0 d y ei 3 饨心? 科 t 0d y e , 4 1 0 “ _ _ _ - - 。_ _ _ _ - _ _ _ - _ _ _ _ 。_ _ 。_ _ a l e x 譬! 翌：! ! ! 竺! ! ! ：錾二” 紫外光区可见光区近红外光压 图】_ 4 一些常用荧光染料在光谱中的位置 当有适当鳌合物时，一些镧系金属离子( 如e u 3 + 、t b 卜等) 可以与之形成 强荧光配合物。由于镧系染料的荧光寿命很长，比生物样品的背景荧光( 自发荧 光) 寿命长1 矿一1 0 6 倍，因此采用时间分辨技术可以完全克服背景荧光的干扰， 从而大大提高了准确性和信噪比。它们常与传统有机染料联用，分别作为f r e t 的供体和受体，拓展了f r e t 技术 5 1 5 6 。 量子点( q u a n t u md o t 。简称o d ) 又称为半导体纳米晶体( s e m i c o n d u c i o r n a n o c r y s t a l ) ，是一种由i i 族或v 族元素组成的稳定的、溶于水盯、i 寸在2 - - 2 0a m 之间的纳米颗粒 5 7 1 。目前研究较多的是c d s e 、c d t e 、z n s 等 【5 8 6 5 。作为一种最新型的荧光染料，与常规荧光染料相比量子点具有很多优点： 量子点的发射光谱很窄而且不拖尾，这样就减少了供体与受体发射光谱的重壁 避免了相互间的干扰；量子点具有较宽的光谱激发范围，当它作为能量供缸f 可以更自由地从紫外到远红外区选择激发波长，最大限度地避免对能量受体j ：互 接激发：量子点的大小不同，所发射的荧光颜色不同( 见图i - 5 ) ，因此可三 过改变量子点的大小来调节量子点的发射光谱与受体分子吸收光谱的重叠程置 从而调节共振能量转移效率；量子点具有较高的量子产率和良好的化学、光掌i 定性，其荧光寿命是普通有机染料的1 0 0 倍以上。将发光量子点作为能量每! 一 体是近年来f r e t 研究中出现的一个新方向，已显示出广阔的应用前景6 6 1 ， 山东大学碗士坐位论文 言 墓 s 看 芒 宝 喾 3 0 。避t h ( n 盂。 图1 5 不同大小量子点的吸收光谱和发射光谱( 以c a s e 为例) 基于量子点的f r e t 中，一般是量子点作为能量供体。w i l l a r d 等人6 7 1 将 四甲基罗丹明( t e t r a m e t h y l r h o d a m i n e ，t m r ) 标记的链霉亲和索( s t r e p t a v i d i n ) 与生 物素化的b s a 特异性结合，用量子点标记b s a ，这样就形成了以量子点作为 能量供体，有机荧光物质t m r 作为能量受体的共振能量转移体系( 见图1 - 6 a ) ， 可以对生物素与链霉亲和素的结合进行检测。h o h n g 等 6 8 观察了量子点和有机 荧光团之间的单分子f r e t ，获得了两对双链d n a 交叉连接模型的单分子构象 变化信息。链霉亲和素包裹的量子点不仅作为能量转移的供体，还充当了莲接基 底的支架作用( 见图1 6 b ) 。另外，量子点在生物传感器方面的研究中都是以量 子点作为能量供体，以有机荧光染料作为能量受体。c l a p p 等【6 9 】将人工改造的 并且保持结合能力的麦芽糖结合蛋白( m a l t o s e - b i n d i n gp r o t e i n ，m b p ) 与量子点不 a 图i - 6 量子点作为能量供件的f r e t b 一弋整 。矗 图1 7 单个供体一多个受体对的f r e 丁 可逆静电结台，花菁染料( c y a n i n ed y e s ) 共价结台到m b p 上，形成 s a q d m b p c y 3 ，如图1 7 所示。在连接到量子点上的m b p 保持一定数目的 情况下，增加m b p - c y 3 时，量子点荧光强度随之减弱，c y 3 荧光强度相直增 加，也就是说包围在量子点周围的能量受体越多，光谱重叠越好，能量转移效率 越高可以用如下公式表示【7 0 ： c ：型垡，( 1 - 5 ) ，仉。+ ，。 式甲：”代表平均一个量子点上结合的受体的个数：r o 代表能量传递达丑5 0 时的距离；r 代表能量供、受体之间的距离。 在f r e t 中，量子点不但可以作为供体，还可以作为受体。w a n g 等一j 1 应用量子点的共振能量转移原理以发射光谱为6 i in r o 、5 5 5 1 2 1 1 1 的红、曩妻 点分别标记牛血清白蛋白( b s a ) 和抗牛血清白蛋白抗体( i g g ) ，当二者形成竞爱 复台物时，b s a 上的红色量子点荧光增强，i g l 3 上的绿色量子点荧光相应减弱 这是因为抗原、抗体彼此结合，将两种量子点拉得足够近，使其发生偶栝偶榜 相互作用这时尺寸较小的绿色量子点的激发态能量转移绐了尺寸较大的兰三 子点激发态，即发生了共振能量转移。当加入未标记量子点的b s a 时，= 。等 与s a q d - b s a 发生竞争，将s a q d b s a 从免疫复台物上取代下来，匪二 共振能量转移的发生，这时红色量子点荧光强度降下来，而绿色量子点荧光曼三爱 又恢复原样。基于同样的原理，z h a o 小组 7 2 似水溶性c d s e z n s 量子直；一呈 硫氰酸荧光素( f i t c ) 分别作为能量受体和供体标记抗原和抗体，当两孝麓兰 特异性结合时即发生f r e t 。 山东大学硕士学位论文 以上所述的f r e t 体系中，均是采用激光诱导荧光的方式获得供体光源， 即传统意义上的荧光共振能量转移。新的能量供受体对的设计台成、新的f r e t 体系的开拓一直是f r e t 技术发展的主要方向。分子发光的激发模式除了有光 致发光( 即荧光) 外，还有化学发光、生物发光等方式 6 6 1 。当有合适的能量受 体时，它们样可作为供体光源发生共振能量转移。事实上，人们早就发现了在 一些海洋生物( 如水母a e q u o r e av j c t o r i a 和海参rr e n i f o r m i s ) 中自然发生的 一种能量转移现象。在这个过程中，r e n i l l a 的荧光素酶( l u c i f e r a s e ) 在有底物 腔肠豪( c o e l e n t e r a z i n e ) 的存在下发出的蓝光( 4 8 5n m ) 能够能量转移到g f p 的突变体增强的黄色荧光蛋白( y f p ) 上，使后者发出5 3 0n r f l 的绿光，如 图1 - 8 所示。它们间的能量转移只有在l u c i f e r a s e 和y f p 的两个融合蛋白( a 和b ) 接近到足够近( 9 9 8 ， a m r e s c o ，s o l o n ，o h i o ，u s a ) ：t w e e n 一2 0 ( s i g m a ，s t l o u i s ，m o ，u s a ) ： h c i ( 分析纯，莱阳市康德化工有限公司，莱阳) ；h 2 0 2 ( 含量 3 0 ，莱阳市 康德化工有限公司，莱阳) ；氨水( 分析纯，济南市红旗第三化工厂，济南) ； n a 2 h p 0 4 1 2 i - 1 2 0 ( 分析纯，汕头市化学试剂厂，汕头) ；n a h 2 p 0 4 2 h 2 0 ( 9 9 ， 西安化学试剂厂，西安) ；n a c l ( 分析纯，天津市塘沽化学试剂厂，天津) ；丙 酮( 分析纯，天津市富宇精细化工有限公司，天津) ；无水乙醇( 分析纯，天津 市富宇精细化工有限公司，天津) ；甲苯( 分析纯，天津市富宇精细化工有限公 司，天津) ；3 一环氧丙氧丙基三甲氧基硅烷( 3 - g l y c i d o x y p r o p y l t r i m e t h o x y s i l a n e ， g o p s ，9 8 ，a l d r i c h ，s t l o u i s ，m o ，u s a ) 。 2 0 x 1 0 之m o l ll u m i n a l 溶液：称取0 0 3 5 4gl u m i n o l ，用0 1m o l ln a o h 溶 解，并用0 1m o l ln a o h 稀释至1 0m l ，作为储液于4 避光保存，陈化一 周后方可使用。其它浓度溶液均由该储备液用o 1m o l ln a o h 稀释而成。 o 2 0k t m o l ls a q d6 5 5 溶液：链霉亲和素修饰的量子点每5 止一份分装 4 存放。用时取其中一份向内加入4 5 止量子点缓冲液，震荡充分混匀。芳 装与稀释操作均在超净工作台中进行。 o 1 0m o l l h 2 0 2 溶液：移取1 0 3 止3 0 h 2 0 2 ，用水稀释至1m l 。低浓度 h 2 0 2 溶液可由此溶液用二次水稀释而得，现用现配。 o 0 5m o l lt r i s - h c l 缓冲液( p h = 9 0 ) ：称取o 6 0 5 7g i r i s ，用5 0m l 刀：溶 解，然后用0 1m o l l 的盐酸调节p h 值到9 0 ，混匀后加水定容至1 0 0m l 二 下保存。 生理盐水( p h y s i o l o 罾c a lb u f f e r e ds a l i n e ，p b s ，p h7 4 ，0 1 5m o l ln a c ： 7 6 1 0 一m o l ln a z - i p 0 4 ，2 4 x 1 0 。m o l ln a h 2 p 0 4 ) ：称取n a c l1 7 0 g ， n a 2 h p 0 4 1 2 h 2 00 5 1 6g ，n a h 2 p 0 4 2 h 2 0o 0 8 7g 溶于水中，然后定容至2 0 0m l 容量瓶中。现用现配。 山东大学硕士学位论文 i t o 活化液：分别移取浓氨水、3 0 h 2 0 2 和二次水，将三种溶液混台，得 到体积比为1 ：l ：5 的n i - 1 3 h 2 0 h 2 0 j h 2 0 溶液。现用现配。 i t o 硅烷化溶液：含g o p s 体积分数为1 的无水甲苯溶液。现用现配。 其它试剂均为分析纯，除注明外，溶液均用二次蒸馏水配制。 1 2 3 实验方法 1 2 3 1i t o 导电玻璃的预处理 1 2 3 1 1i t o 导电玻璃的清洗 将购买的成品大块i t o 导电玻璃( 厚1 1m m ) 用玻璃刀切割成所需的小 块( 1 8c m 2 3c m ) ，为获得超洁净和光滑均匀的表面采用以下步骤进行i t o 片 的彻底清洗：首先将i t o 片放在3 0 白猫洗涤液中超声清洗1 5r a i n ，自来水 冲洗干净；然后依次置于丙酮、无水乙醇、二次水中各超声清洗3 次，每次5r a i n ； 最后，将清洗干净的i t o 片子置于硅胶干燥器中干燥备用。 1 2 3 1 2i t o 导电玻璃的硅烷化 i t o 片的硅烷化分为清洗、活化、硅烷化三个步骤。第一步清洗同上i t o 导电玻璃的清洗。第二步( 为了增加表面羟基的覆盖率) ，将洗净的i t o 片浸 入1m o l lh c i 溶液中静置1 0r a i n 进行预活化 8 8 ，取出后用二次水超声清洗 i t o 片3 次，每次5m i r a 然后在密封条件下，恒温7 0 置于体积比为l ：1 ： 5 的h 2 0 2 山o h h 2 0 溶液中活化1h 8 9 】；再用二次水超声清洗i t o 片3 次，每次5m i n ；最后置于1 0 0 烘箱中烘4h ，确保i t o 表面没有水分残留。 第三步( 为使电极表面连接上环氧基团) ，用3 环氧丙氧丙基三甲氧基硅烷实 现i t o 片的硅烷化。室温下将活化后的i t o 片浸在含有1 ( v v ) g o p s 的 甲苯溶液中硅烷化2 4h 。耦合反应后，被修饰过的i t o 片从溶液中取出，依、置 在甲苯、无水乙醇、二次水中各超声清洗2 0r a i n ，清除物理吸附在电极表面自毒 硅烷。至此，i t o 表面结合有暴露的活性环氧基团。最后，将硅烷化后洗净的i t o 片子置于硅胶干燥器中干燥备用。 1 4 ：东六学硕士学位论文 1 2 3 2i t o 工作电极的制作 取一根长约6c m 直径为5 0 0 岬的铜丝，用砂纸将其打磨光亮以除去表面 的氧化物，然后将铜丝端卷成螺旋状并使其成一平面，用银导电胶把铜丝螺旋 状一端固定在清洗过或硅烷化过的i t o 导电玻璃片的一端，置于烘箱中1 5 0 下烘3 0m i n ，令银胶充分固化，取出，用环氧村脂胶进一步将铜丝固定在i t o 导电玻璃上，如图1 1 2 所示。 3 2 图1 1 2i t o 工作电极示意图 1 。铜丝；2 ，银导电胶：3 。i t o 导电膜。 1 2 3 3 电化学发光的检测 1 2 3 3 1e c l 电解池的制作 。 将1 5m l e p p e n d o r f 离心管的上部切下一个内径约0 9c m 、高1 0c l t i 自勺圆 环，切口要齐，绕圆环底部均匀涂上一层环氧树脂胶，将其粘到清洗过i t c 导 电玻璃制成的工作电极上，室温下固化2 4 小时备用。 1 2 332 电化学发光的检测 图1 1 3 为电化学发光检测装置示意图。实验中先将e c l 电解池匿是 二 p m t 窗口正上方，向电解池内移入7 0 0u lp h9 0 的0 0 5m o l lt r i s h c 缓毋 液、4 0u l 2 0 x 1 0 2m o l ll u m i n a l 及8 0u lo 1 0m o l l h 2 0 2 ，插入a g a g c l 参三二 电极和铂片对电极，连接好三电极体系；然后电化学分析仪分别采用线性扫捶伊 安法( l s v ) 和计时电流法作为电化学反应激发方式，同步记录反应液的电信号 及光信号曲线。 山东大学硕士学位论文 ， ，一一 _ 、p j j 芒 f 一“o 譬剖b w _ 。 1 ic 吨化粉o ii 0 竺苎 ) 41 睦爨 。、 l l jo - i l 机 ： ， 静棠飒 记勰 ，j o ； 一i 狲 图1 1 3 电化学发光检测装置示意图 l ，工作电极；2 对电极；3 ，参比电极；4 ，第二工作电极；5 ，电解池。 1 2 3 4 量子点的固定 1 2 3 4 1 硅烷化i t o 导电玻璃固定量子点 为了量子点孵育的方便，我们把自制的微池用环氧树脂胶粘到硅烷化后制 作好的i t o 工作电极上，并将微池外的i t o 膜层均匀涂上一层环氧树脂胶 ( 如图1 1 4 a 所示) ，室温下固化2 4h 备用。实验时用e p p e n d o r f 移液器向微 池内加入5 止o 2 0 t m o l ls a q d ，使之将微池底部均匀铺满薄薄一层。这栏： 量子点表面链霉亲和素上的氨基就可与i t o 表面修饰的环氧基团发生矢侈毒 合反应，从而将量子点固定到电极表面 9 0 。由于实验过程中所加的孵育液的量 很少，并且孵育时间较长，为了防止反应液的挥发，我们将带有微池的i t o 片 置于有盖的保湿盒内，以确保整个反应过程能在一定湿度下进行。孵育一段e j 。i 后，i t o 上的环氧基与s a q d 上的氮基共价结合的十分牢固。先将微淮晚鸵 溶液弃去，然后用e p p e n d o r f 移液器吸取o 0 1m o l lp h = 7 4 的p b s ( 含体移e 1 6 山东大学硕士学位论文 数为0 1 t w e e n 2 0 ) 轻轻冲洗微池5 次，以除去微池内过量的未反应的 s a - q d 。 1 2 3 4 2n a f i o n 膜包埋法固定量子点 由于n a t i o n 膜固定量子点没有孵育环节，因此我们可省却环氧树脂胶粘微 池一步。而是首先在制作好的i t o 电极的非导电面用标记笔画好同光学多道分 析仪狭缝大小( 1 5m m 1 5e m ) 相同的矩形框，然后用e p p e n d o r f 移液器吸取 5 止0 2 0l a m o l l 的s a q d 均匀涂敷在i t o 电极导电面的矩形框内，紧接着 再在量子点溶液表面滴加未稀释的n a t i o n 。待室温挥发掉溶剂后，将矩形膜层 夕k 侧的i t o 导电膜均匀涂上一层环氧树脂胶( 如图1 1 4 b 所示) ，室温下固 化1 2h 备用。 4 4 a 2 2 b 图1 1 4 量子点固定示意图 1 铜丝：2 。银导电胶：3 微池；4 。环氧树脂胶：5 量子点固定层。 山东大学酌! 士学位论之 1 2 3 5 落射荧光显微术对量子点固定的表征 为了了解量子点的固定情况，我们采用落射荧光显微术对其进仃表征。图 1 1 5 为落射荧光检测系统示意图。实验中我们选择的滤光片组由激发滤光片 b p 4 7 0 - 4 9 0 、双色镜5 6 5 和发射滤光片5 8 0 i f 三部分组成。首先打开整套落射 荧光显微镜系统的各个电源，设置工作模式和曝光时间等参数，选择1 0 x 物镜； 然后将固定有量子点的i t o 电极置于显微镜载物台上，调整载物台，使量子点 固定区域处于镜头正上方，这样当开启激光时，激发滤光片允许波长处于 4 7 0 - 4 9 0n m 之间的激发光通过，双色镜将 5 8 0n m 的荧光通过) 到达e m c c d ，利用 量子点在e m c c d 上的成像精确调好焦距，用m e m m o r p h 软件拍摄图像，通 过多次调整载物台从而可观测到整个量子点的固定区域。 图1 1 5 落射荧光检测系统示意图 一 激光光路；一赫荧光光路 山东大学硕士学位论文 i 2 3 6 电化学发光共振能量转移光谱的检测 1 2 3 6 1 共振能量转移电解池的制作 由于光学多道分析仪的采光1 2 1 位于光栅侧面，因此有必要自制一立式电解池 在其内部进行电化学发光反应。为了实验过程中方便快速的更换t o 电极，我 们采用透光性较好的玻璃作为电解池材料，并在电解池内部靠近狭缝一面的两侧 各粘一玻璃隔段，这样实验中可将i t o 电极插入靠近狭缝面与隔段之间的空隙 处( 注意要将导电面朝向电解池内部) ，使i t o 电极能够紧贴靠近狭缝的电解 池一面垂直立于电解池内而不倒，并且还可以很方便的更换电极( 如图1 。1 6 所 示) 。 2 图1 1 6 共振能量转移电解池示意图 1 i t o 工作电极；2 电解池；3 。隔段。 3 1 2 362 电化学发光共振能量转移光谱的检测 图1 1 7 为电化学发光共振能量转移光谱检测装置图。实验操作时，首先打 开光信号采集系统和电化学分析仪，在暗室中采集环境光作为背景；将电船池置 于光学多道分析仪狭缝前端，使固定有量子点的矩形区域与狭缝对准；向电解沲 内加入一定量的o 0 5m o l l t r i s h c l ( p h = 9 0 ) 、l u m i n o l 和h 2 0 2 ，固定溶液总 体积为2m l ，使其刚好没过量子点固定区域；插入a g a g c l 参比电极和铂片 对电极，连接好三电极体系，电化学分析仪采用恒电位计时电流法作为电化学苏 发方式；设置恒电位电压0 9v 、电解时间2 0s 、静止时间2s 等电化学参数衣 曝光时间2 0s 、狭缝宽度1 5m m 、探测器面积1 0 0 个像元等光学参数：电钙 池内产生的电化学发光及共振能量转移产生的荧光透过i t o 导电玻璃和玻璃 山东大学硕士学位论文 图1 1 7 电化学发光共振能量转移光谱检测装置图 电解池通过狭缝进入光学多道分析仪( 注意电信号激发和光信号采集要同时进 行) ，经光学多道分析仪内的光栅分光后，以一连续谱带照射到被设置到2 5 的 c c d 光敏区，这样即同时得到电化学发光共振能量转移发光光谱及电化学曲线。 1 3 结果与讨论 1 3 1 电化学发光共振能量转移原理 电化学发光试剂鲁米诺在碱性水溶液中可以在+ o 9v 附近被电化学氧化 其电氧化产物( 鲁米诺发光前体) 能与过氧化氢反应生成激发态的3 氨基邻苯 二甲酸根离子( 即e c l 发光体) ，然后在4 2 5n m 附近形成e c l 辐射 8 6 ，鲁 米诺电化学发光光谱如图1 1 8 曲线1 所示。前面我们提到量子点较传统荧光 试剂具有很多光学特性，例如：激发光谱宽，可以被紫外到红外区间的任惹波长 光激发；荧光峰狭窄而对称；荧光量子产率较高；通过调节组成和大小可以侵英 发射出不同颜色的光。因此，我们可以选择不同波长的量子点使其吸收光谱与鲁 米诺的e c l 发射光谱有效重叠，并且两者的发射光谱分得足够开，符合芙摄能 量转移供受体对的选择原则( 见图1 1 8 ) 。这样，当激发态的3 氨基邻芸二翠 酸根离子( e c l 发光体) 与量子点达到产生共振能量转移的有效距离时，两者 之间就会产生鲁米诺电化学发光量子点荧光共振能量转移，其过程原理如图 山东大学硕士学位论文 1 1 9 所示。量子点的阳极e c l 电位较高 9 1 ，避免了鲁米诺与量子点同时产生 e c l 辐射。 1 0 0 2 0 03 0 04 0 05 0 06 0 07 0 08 0 0 w a v e l e n g t h ( 1 1 1 1 1 ) 图l 一1 8 鲁米诺与量子点的丸谱图 l ，鲁米诺电化学发光光谱；2 ，量子点吸收光谱；3 。量子点荧光光谱。 7 | 上 hl ，i 如 1 1 ：y 趔 自_ _ _ - 蜊- _ _ - 耕 i t o 光透电极 o i - 1 , o ， 量转移 图1 1 9 鲁米诺过氧化氢量子点体系的共振能量转移原理图 o 【lvo囊i=-三一z；ilsi=ll riv茁_、=lli-二警荔ii 山东大学硕士学位论文 1 3 2 鲁米诺过氧化氢体系的电化学发光 1 3 2 1 鲁米诺过氧化氢体系e c l 原理 早在1 9 2 9 年，h a r v e y 在电解碱性鲁米诺水溶液时就观察到了电极附近的 蓝色发光现象 9 2 。鲁米诺在碱性条件下的电化学发光体系通常由l u m i n o l 和 h 2 0 2 组成。鲁米诺的e c l 反应机理一般认为 9 3 ：鲁米诺在碱性溶液中首先 离解为一价阴离子( l h ) ，阴离子被电极氧化，生成鲁米诺发光前体；与此同时， 溶液中的h 2 0 2 在碱性溶液中离解为过氧化氢阴离子( h 0 2 ) ，然后被电极氧化、 脱氢，生成超氧基阴离