掌握大肠杆菌非中断杂交分析的技术.ppt

实验十大肠杆菌（E.coil）梯度转移基因定位（非中断杂交）（一）,一、目的：熟悉细菌接合和基因定位分析的原理；掌握大肠杆菌非中断杂交分析的技术；理解、区分中断杂交和非中断杂交分析的关键技术点。,二、内容：母液配制，培养基培制，器具干热、湿热灭菌。活化菌种，接种，扩菌，杂交，涂平板，培养，点种A，点种B-G。实验结果观察统计分析，基因位点距离计算。,二、实验原理：,F因子：DNA小环，占染色体DNA的2%。,Hfr菌株F-菌株：Hfr染色体从原点断裂，染色体向F菌株起始转移。,杂交时间：全部染色体进入F需要100min。,如何选出各种重组子，排除供（父）、受（本）体？,选择性标记(selectedmarker)基因：目的：选择出全部的重组子，排除杂交中的受体菌。,措施：培养基中不加Met和Leu。,选什么样的基因？,反选择性标记(nonselectedmarker)基因：目的：排除供体菌，同时保证全部的重组子存活。,选什么样的基因？,措施：在培养基中添加链霉素(Str)。,Met和离Leu离原点最近,Str离原点最远，使Hfr染色体更多机会进入受体,本实验所配制的选择培养基：A培养基：排除供、受体选择全部重组子BG培养基：选择各种重组子求出重组频率确定基因连锁情况,各种选择性培养基,添加物质碳源10A琼脂粉水MgSO4硫胺素(盐酸噻胺，VB1)精氨酸腺嘌呤色氨酸组氨酸链霉素,ABCDEFG-葡萄糖-乳糖半乳糖,四、方法步骤：,重组子数目取决于接合细胞数，通常Hfr与F细胞数之比为1:1020。重组子的检出：影印法，单菌落点种法本次实验单菌落点种法。,（一）配制各种选择性培养基的基本溶液,试剂名称10A葡萄糖乳糖半乳糖MgSO4.7H2O硫胺素精氨酸色氨酸组氨酸腺嘌呤,溶液规格(119页）20%20%20%0.25M1mg/1ml10mg/ml10mg/ml10mg/ml10mg/ml,配制量500ml200ml25ml25ml25ml25ml25ml25ml25ml25ml,注：1)色氨酸(Trp)需在50-60水浴条件下溶解。2)腺嘌呤（Ade）不溶于水，需先用1N（不要过浓过稀）HCl调成糊，逐滴加1NHCl直到溶，再补水定容。3)链霉素(Str)受热易分解，所以不能加入培养基中一起灭菌，而应在倒平板前，用无菌水现配现用。,（二）配制LB液体培养基：150ml，分装：2瓶/组，5ml/瓶，其余交给老师（三）每组包装灭菌：培养皿20个蓝、黄tip头各1盒，接合用的空三角瓶（100ml）1个牙签200支（20支左右一包）,用50ml小三角瓶分装,更正：教材p118“LB液”配制中，蒸馏水应为mL,配制方法：1.称取琼脂+水,煮沸2.另取其它各成分于一小烧杯中，一同加入煮好的琼脂中。3.分装,灭菌（8磅，112，20min）,各小组灭菌后需收齐的物品：A培养基250mL（分装2个250ml三角瓶）B-G培养基各30mL（装于6个100mL三角瓶）LB培养基10mL（分装2个50mL三