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小分子大豆多肽的制备和分离纯化研究 摘要 大豆中蛋白质含量高，氨基酸组成合理，大豆多肽是大豆蛋白经酶解 后产生的分子量较低的化合物。研究表明：其氨基酸组成与大豆蛋白基本相 同，且在整个p h 范围内均有良好的溶解性及低粘度，比大豆蛋白具有更好 的营养价值和生物功能，如抗氧化、降血压、降胆固醇、抗疲劳等。这些特 性使得大豆多肽在食品、医药、化妆品等领域得到广泛的开发和利用。 本文主要研究大豆分离蛋白水解过程中，在微波加热、保持体系的p h 、 温度不变条件下，用碱性蛋白酶和中性蛋白酶、胰蛋白酶三酶水解大豆分离 蛋白制备小分子大豆肽。以大豆分离蛋白水解氨基氮为评价指标，用荧光分 析等方法，系统研究了水解工艺过程，并详细介绍了主要的工艺步骤。重点 讨论了影响酶水解的各种因素如酶用量，p h 值，底物浓度，反应温度，微波 作用时间等。首先用单酶水解大豆分离蛋白，确定最佳条件，然后确定双酶、 三酶分步协同水解的顺序和制备小分子大豆多肽的最佳条件，以及大豆多肽 的理化性质与毛细管电泳法、凝胶排阻色谱法、反相高效液相色谱法分离纯 化条件，并通过毛细管电泳方法、凝胶排阻色谱法对水解多肽的分子量分布 范围进行测定。实验表明：三酶水解优于单酶和双酶，制得的大豆肽分子量 主要集中在2 0 0 - 1 1 0 0d 之间。实验结果如下： 1 小分子大豆肽的制各 大豆分离蛋白溶液在8 5 水浴加热预处理1 5 m i n ， 单酶水解最佳条件： 胰蛋白酶水解大豆分离蛋白的最佳条件：水解最适p h 值为8 0 ，温度5 0 ，底物浓度5 ，酶用量e s 为1 0 ，微波水解时间1 5m i n ，氨基氮含量可 达6 4 0m g g ： 碱性蛋白酶水解大豆分离蛋白的最佳条件是：水解最适p h 值为8 5 ，温度 5 5 ，酶用量e s 为7 ，底物浓度5 ，微波加热水解1 5m i n ，此时a n 为6 2 1 0 m m o l l 中性蛋白酶水解大豆蛋白最佳条件为：水解最适p h 7 0 ，温度5 0 ，酶 用量e s 为1 1 ，底物浓度为5 ，微波水解1 8 m i n ，此条件下水解a n 含量 最高为3 9 8 9m m o l l 。 ( 9 三酶分步协同水解的最佳条件： 将底物浓度为5 的料液，经预处理后，先加碱性蛋白酶，在p h 8 5 ，e s 为7 ，温度5 5 条件下微波加热水解l o m i n ；之后调整参数p h 8 ，温度 5 2 加入中性蛋白酶e s 为9 ，继续微波加热水解1 2 m i n ；之后调整参数 p h 8 ，温度5 5 加入胰蛋白酶e s 为1 0 ，继续微波加热水解2 0 m i n ，最后 灭酶、离心、真空冷冻干燥，得到三酶水解大豆肽，其a n 为1 2 9 0 5 m m o l l 。 水解效果明显高于单酶、双酶。 2 毛细管分离检测条件 以1 0 0 m m o l l t r i s h c l ( p h 8 5 ) + 3 5 m m o l l s d s + 0 1 p e o 为缓冲液，进 样时间1 0 s ，运行电压1 8 k v ，气动进样，用h p c e 以无胶筛分方式，成功 将大豆多肽进行了分离和检测。 3 凝胶排阻色谱法分离纯化条件 酶水解冻干物采用s e p h a d e x - g 5 0 柱( 2 3 0 c m ) 进行凝胶过滤层析分离， 以( o 1 m o l ln a c i + 5 0 m m o l l t r i s p h8 ) 溶液平衡和洗脱，洗脱速度3 om l 1 0 m i n 。每管收集3 0 m l ，于2 8 0 n m 处进行检测，收集4 个组分洗脱液。 4 反相高效液相色谱的分离条件 r p l c 色谱柱对大豆多肽样品的分离过程中，对其进样量和洗脱梯度进行 了选择，每次进样量为2 0 u l ，线性梯度模式为：3 0 6 0 b ，8 0 m i n 线性：检 测波长2 2 0 n m ，在此最佳色谱条件下，大豆肽得到了初步分离。 5 大豆多肽理化性质 经对大豆肽氨基酸分析得知，大豆肽的组成几乎完全与大豆蛋白一样，具 有氨基酸比例平衡、含量丰富的特点。通过电泳和凝胶柱分析，可知大豆肽 分子量分布主要在2 0 0 11 0 0 d 之间。 所制备的大豆肽具有良好的溶解性且不受p h 的影响，具有高浓度、低 粘度的特点；具有良好的吸湿性和保湿性及热稳定性；大豆多肽的起泡能力 强而泡沫稳定性差。 关键词：大豆分离蛋白，小分子大豆多肽，多酶水解，微波，高效毛细管电 泳，凝胶排阻色谱，反相高效液相色谱 i i s t u d y o np r e p a r a t i o no fl o wm o l e c u l e w e i g h t s o y b e a np o l y p e p t i d e sa n ds e p e r a t i o n a b s t r a c t s o y b e a nc o n t a i nh i ：曲p r o t e i nw i t hw e l l b a l a n c e da m i n oa c i dc o m p o s i t i o n s o y b e a np e p t i d e s ( s p ) a r ec o m p o u n d sw i t hs m a l lm o l e c u l a rw e i g h to b t a i n e d f r o me n z y m eh y d r o l y s i so fs o y b c a np r o t e i n s t u d ys h o w e dt h a tt h ea m i n oa c i d c o m p o s i t i o no fs pw a ss i m i l a rt ot h a to fs o y b e a n m e a n w h i l es pw a sh i g h l y w a t e rs o l u b l et h r o u g ht h et o t a lp hr a n g ew i t hl o wv i s c o s i t y , a n dt h e yw e r e s u p e r i o r t o s o y b e a np r o t e i n i nb o t hn u t r i t i o n a lv a l u ea n d p h y s i o l o g i c a l f u n c t i o n s ，s u c ha ss o y b e a np o l y p e p t i d e sh a st h er e s i s t a n tt oo x i d a t i o n ，l o w e r e d b l o o dp r e s s u r ea n dc l o e s t e r i na n ds oo n a l lo fc h a r a c t e r sm e n t i o n e da b o v ea r e p r o p i t i o u sf o rt h ed e v e l o p m e n to fs o y b e a np o l y p e p t i d e si nf o o d ，m e d i c i n ea n d c o s m e t i cf i l e d u n d e rt h em i c r o w a v eh e a t i n g ，p ha n dt e m p e r a t u r eb e i n gn o tc h a n g e dd u r i n g e n z y m eh y d r o l y s i so fs o y b e a np r o t e i ni s o l a t e s ，t h ep r o c e s s i n gt e c h n o l o g yo fl o w m o l e c u l ew e i g h ts o y b e a np e p t i d e sw i t ha l k l i n gp r o t e a s ea n dt r y p s i n ，n e u t r a l p r o t e a s et oh y d r o l y z es o yp r o t e i ni s o l a t ei ss y s t e m a t i c a l l ys t u d i e di nt h i sp a p e r b yt h es t a n d a r d so fp e r c e n t a g eo fa m i n on i t r o g e na n dm e t h o do ff l u o r e s c e n c e ， t h e p r i n c i p a ls t e p si n c l u d i n gp r e - t r e a t m e n t o fs o y b e a n p r o t e i ns o l u t i o n ， e n z y m a t i ch y d r o l y s i s o fs o y b e a np r o t e i n ，e m b i t t e r i n go fh y d r o l y s e sa l e i n t r o d u c e di nd e t a i l t h ef a c t o r ss u c ha s e n z y m eq u a l i t y , p h ，s u b s t r a t e c o n c e n t r a t i o n ，t h et e m p e r a t u r eo fr e a c t i o n ，t h et i m eo fm i c r o w a v ea r ed i s c u s s e d i ne m p h a s i s ，t h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n so fo n ee n z y m eh y d r o l y s i s ，t h eo r d e ro f d o u b l ea n dt h r e ee n z y m e sh y d r o l y s i sa n dt h eb e s tc o n d i t i o no fl o wm o l e c u l a r w e i g h tp o l y p e p t i d e sh a v eb e e nf o u n d ，p h y s i c a la n dc h e m i c a lp r o p e r t i e sf r o m s o y b e a np r o t e i ni s o l a t e sa n di t sp h y s i c a lc h e m i c a lp r o p e r t ya n dc o n d i t i o no f s e p e r a t i o nb yc a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sa n dg e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h y ， r e v e r s e d p h a s eh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y w e r es t u d i e s s y s t e m a t i c a l l y w i t hc a p i l l a r ye t e c t r o p h o r e s i sa n dg e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h y , t h em o l e c u l a rw e i g h to fs o y b e a np o l y p e p t i d e sw a sd e t e r m i n e d t h er e s u l t s i l l s h o w st h a tt h r e ee n z y m e sh y d r o l y s i si sp r e f e rt ot h a to fo n ee n z y m ea n dd o u b l e e n z y m e ，t h em o l e c u l a rw e i g h to fs o y b e a np o l y p e p t i d e sm o s t l yb e t w e e n2 0 0 d a n d1 i o o d t h er e s u l t sa r ef o l l o w s ： 1 p r e p a r a t i o no f l o wm o l e c u l ew e i g h ts o y b e a np o l y p e p t i d e s ： b e f o r eh y d r o l y s i ss o y b e a np r o t e i ni s o l a t e s s o l u t i o nw a sh e a t e da n d h o m o g e n i z e da t8 5 i nw a t e rb a t hf o r15m i n ； t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sf o ro n ee n z y m eh y d r o l y s i s ： t h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n so ft r y p s i nh y d r o l y s i si s5 s p i ，t e m p e r a t u r e5 0 c ， p h 8 0 ，e n z y m eq u a l i t yi se s 2 1 0 ，a f t e r l 5m i no f h y d r o l y s i si nm i c r o w a v e ，a n w a so v e r6 4 0 m g g ； t h e o p t i m i z e d c o n d i t i o n so f a l k l i n gp r o t e a s eh y d r o l y s i s i s5 s p i t e m p e r a t u r e5 5 。c ，p h 8 5 ，e n z y m eq u a l i t yi se s = 7 o fw e i g h to fs u b s t r a t e ，a f t e r 15m i no fh y d r o l y s i si nm i c r o w a v e ，a nw a so v e r6 2 10m m o l l ； t h eo p t i m i z e dc o n d i t i o n so fn e u t r a l p r o t e a s eh y d r o l y s i s i s5 s p i t e m p e r a t u r e5 0 。c ，p h 7 0 ，e n z y m eq u i l t yi se s = 1 l o f w e i g h to f s u b s t r a t e ，a f t e r 18m i no fh y d r o l y s i si nm i c r o w a v e ，a nw a so v e r3 9 8 9m m o l l ；， t h eo p t i m u mc o n d i t i o n sf o rt h r e ee n z y m e sh y d r o l y s i s a f t e r5 s p ib e i n gp r e - p r e p a r e a l k l i n gp r o t e a s ew a sf i r s tp u ti nw i t hi t s c o n d i t i o n s ：t e m p e r a t u r e5 5 ，p h 8 5 ，e n z y m eq u a l i t yi se s 2 7 ，a f t e rh e a t i n gb y m i c r o w a v ef o r10 m i n ，a d j u s t m e n tp a r a m e t e r ，t h e nn e u t r a lp r o t e a s ew a sp u ti n w i t h5 2 c ，p h 8 ，e n z y m eq u i l t yi se s - - 9 o fw e i g h to fs u b s t r a t e ，a f t e r12 m i no f h y d r o l y s i si nm i c r o w a v e ，a d j u s t m e n tp a r a m e t e r ，t r y p s i nw a sp u ti na tl a s tu n d e r i t sc o n d i t i o n s ：5 5 。c ，p h 8 ，e n z y m eq u i l t yi se s = 1 0 o f w e i 【g h to f s u b s t r a t e ，a f t e r 2 0 m i no fh y d r o l y s i si nm i c r o w a v e ，t h er e a c t i o ns y s t e mw a sq u i c k l yp u ti n t o b o i l i n gw a t e r ( 1 0 0 。c ) f o r1 5m i nt od e n a t u r a l i z et h ee n z y m e ，c e n t r i f u g e ，v a c u u m r e f r i g e r a t i n gd r y i n g ，t h ep o l y p e p t i d e so ft h r e ee n z y m ew e r ep r e p a r e d ，a ni s h i g h e rt h a ns i n g l ee n z y m ea n dd o u b l ee n z y m ef o r12 9 0 5m m o l , l 2 c o n d i t i o no f s e p a r a t i o nw i t hh i g h - p e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s s e p a r a t i o na n di d e n t i f yt h ep r o t e i np o l y p e p t i d e sa m o n gs o y b e a np r o t e i n d e c o m p o s i t i o np r o d u c tb y n o n g e ls i e v i n gh i g h - p e r f o r m a n c ec a p i l l a r y e l e c t r o p h o r e s i s t h er u n n i n gb u f f e rw a sc o m p o s e do f lo o m m o l lt r i s | h c l ( p h 8 5 1 + 3 5 m m o l ls d s + 0 i p e oa n dt h er u n n i n gv o l t a g ew a s1 8 k v , t i m e i v o fe n t e r i n gs a m p l ei slo s ，b yt h ew a yo fn o n g e l s i e v i n gh i g h p e r f o r m a n c e c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ，s e p e r a t i o n a n de x a m i n a t i o nw a sc a r r i e d u p s u c c e s s f u l l y 3 c o n d i t i o no f s e p e r a t i o nb yg e le x c l u s i o nc h r o m a t o g r a p h y c o m p o n e n t s o fe n z y m et r e a t e d s o yp r o t e i n w e r e s e p a r a t e du s i n g s e p h a d e x g 5 0 ( 2 4 3 0 c m ) g e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h y , t r a c k i n gt h em a x i m u m g r o w t hs t i m u l a t o r ya c t i v i t yo ft h er e s u l t i n gf r a c t i o n so n t h ee l u t i o nw a sc a r r i e d o u tw i t h 。lm o l ln a c l + 5 0m m o l l t r i s ，p h8 ) , t h es p e e dw a s3 0m l 10 m i n ， c o l l e c t i o nq u a n t i t i e s3 0m l | p e rt u b e ，a n dt h ea b s o r b a l i c eo f t h ec o l u m ne f f l u e n t w a sm o n i t o r e da t2 8 0n m ，f o u rg r a d e sw e r ei s o l a t e d 4 c o n d i t i o no fs e p a r a t i o nw i t hr e v e r s e dp h a s eh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y s o y b e a np o l y p e p t i d e sw e r es e p a r a t e di np r e p a r a t i v es c a l ew i t hr e v e r s e dp h a s e h i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y ( r p l c ) w i t ha na n a l y t i c a l t y p er p l c c o l u m n ，t h es a m p l ev o l u m ea n dc h r o m a t o g r a p h i cc o n d i t i o n sw e r es e l e c t e da n d 7 o p t i m i z e d 。t h es a m p l ev o l u m ew a s2 0 u l ；c h r o m a t o g r a p h i cc o n d i t i o nw a s 3 0 一6 0 b ，8 0 r a i n ，l i n e ；e x a m i n a t i o nw a v ew a s2 2 0 h m 。u n d e rt h eo p t i m u m 。 s e p a r a t i o nc o n d i t i o n ，s o y b e a np o l y p e p t i d e sw e r ep r e l i m i n a r i l ys e p a r a t e d 5 。t h ep h y s i c a la n dc h e m i s t r yc h a r a c t e r i s t i c so f s o y b e a n p e p t i d e s i tc a nb ek n o w nt h a ti sa ss a m ea st h es o yp r o t e i ni na m i n oa c i d sc o n s t i t u t e d ，一i h a v et h ec h a r a c t e r i s t i c so fe n r i c h i n gi ne f f e c t i v ea m i n oa c i d sa n dc o m p a r i s o n b a l a n c eb ya n a l y s i sa m i n oa c i d so fs o yp e p t i d e s 。 t h r o u g ha n a l y s i sw i t hh i g h - p e r f o r m a n c ec a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i sa n dg e l e x c l u s i o nc h r o m a t o g r a p h y , i tc a l lb ek n o w nt h a tm o l e c u l a rw e i g h td i s t r i b u t eo f s o yp e p t i d e sm a i n l yb e t w e e n2 0 0a n dl1 0 0 d 。 t h e s o y b e a np e p t i d em a d eb yt h ee x p e r i m e n t sh a dg o o ds o l u b i l i t ya n dw a s f r e ef r o mp h i n f l u e n c e ，h a v i n g t h ec h a r a c t e r i s t i c so fh i g hd e n s i t ya n d l o w v i s c i d i t y ；h a v i n gt h ep r o p e r t yo f m o i s t u r ea b s o r p t i o na n dm a i n t e n a n c eo f s o y b e a np e p t i d e s ；s o y b e a np o l y p e p t i d e sh a ss t r o n gf o a mp r o p e r t yb u tt h ef o a m s t a b i l i t yi sb a d k e yw o r d s ：s o yp r o t e i ni s o l a t e ；l o wm o l e c u l ew e i g h ts o y b e a np o l y p e p t i d e s ； e n z y m e sh y d r o l y s i s ；m i c r o w a v e ；c a p i l l a r ye l e c t r o p h o r e s i s ；g e lf i l t r a t i o nc h r o m a t o g r a p h y ，r e v e r s e dp h a s eh i g hp e r f o r m a n c el i q u i dc h r o m a t o g r a p h y v 小分子大豆多肽的制各和分离纯化研究 附录f ：原创性声明及关于学位论文使用授权的声明 原创- | 生声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进行 研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何其他 个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究做出重要贡献的个 人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的法律责任 由本人承担。 论文作者签名：童l 盔 日 期：2 q qz 生妇 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解陕西科技大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学 校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被 查阅和借阅；本人授权陕西科技大学可以将本学位论文的全部或部分内容 编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文 和汇编本学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：韭导师签名：径趁垃日期：2 q q2 生 旦 小分子大豆多肽的制备和分离纯化研究 1 文献综述 1 1 大豆肽概述 我国是世界大豆的生产国之一，栽培历史悠久，分布广，种植面积大，大豆年产约 6 4 0 万吨，约占世界总产量的1 0 ，位居第三。我国大豆品种蛋白质含量高，籽粒中蛋白 质含量可高达4 8 - 5 0 。大豆作为一种重要的农作物，价格低廉，氨基酸含量平衡，是 一种重要的优质植物蛋白资源，具有诸多的生理功能。但由于它的低溶解性、不易消 化吸收，高浓度状态下粘度大等缺点限制了其应用于食品及医药等行业。近代研究表明， 人类摄入的蛋白质经消化酶作用后，不是象以前认为的那样仅以氨基酸的形式吸收，更 多的是以小肽的形式吸收1 。小分子肽具有良好的溶解性，人体消化时不被水解，而且 可以直接被小肠绒毛上皮细胞快速吸收，并具有各种生理活性，人们称这类肽为生物活 性肽。 大豆多肽是指大豆蛋白质经酶水解、分离精制等过程而获得的通常由3 6 个氨基 酸组成的相对分子量低的低肽混合物，其水溶性很高( 可溶性氮n s i 约为9 9 ) ，可作 为新的治疗药剂、功能食品添加剂或饲料添加剂来使用。大豆蛋白经酶水解分离精制等 过程得到大豆多肽，含有组成与大豆蛋白完全一致的必需氨基酸，含量平衡且丰富，具 有优于它的加工特性，如高溶解性，高稳定性，高吸湿保湿性，抗凝胶性，尤其是小分 子肽吸收速度快，蛋白质利用率高等，同时还具有防病治病，调节人体生理功能叫】，如 具有易吸收和低过敏性、降低血脂和胆固醇、降低血压、促进矿物质吸收和脂肪代谢、 增强运动员体能，帮助恢复疲劳、促进钙磷和其他微量元素的吸收、促进大脑发育、提 高记忆力增强免疫功能、保护表皮细胞、防止黑色素细胞沉淀等多种生物功能。 大豆肽由于具有良好的溶解性和稳定性，可用于大多数的普通食品中；由于其具有 各种生理活性，安全实用，无副作用，还可专用于营养疗效食品、功能保健食品和运动 员食品等多类特种食品中。因此，大豆肽是一种十分有前途的功能性食品原料，应用范 围广，市场开发潜力大，它以其独特的功能和特，性广泛应用在食品工业、医药、化妆 品等领域，成为目前众多学者关注的课题m 。 但由于大豆蛋白酶水解产物是多肽混合物、a a 等，不同肽段的生理功能是不同的， 例如：5 0 0 0 d 以上大豆肽有降低胆固醇作用；2 0 0 0 3 0 0 0 d 左右大豆肽具有减肥作用； 1 0 0 0 d 以下大豆肽具有一定生物活性和生理功能：且杂质与目标多肽在结构和性质上十 分相似，必须选用适当方法，从这些混合物中分离纯化出某些具有生物活性的大豆肽， 以满足人们的需要。因此探寻小分子大豆肽分离纯化方法具有十分重要意义。 1 2 大豆肽的理化性质和生物活性m i 1 2 1 大豆肽的理化性质 陕两科技大学硕士学位论文 大豆肽的理化性质直接影响其营养特性、加工特性、应用范围和生物活性。大豆肽 是大豆蛋白质的水解产物，其具体理化性质与分子大小或水解度、所用蛋白酶的作用特 性、水解条件及终产物的其它组成成分有密切关系j 。 1 2 i i 高溶解性 大豆蛋白的应用范围因其溶解性受到很大的限制。而大豆多肽具有良好的溶解性， 也是其最重要的理化性质之一。大豆蛋白在微生物酶的作用下，大分子蛋白断裂成小分 子肽，随着肽键的断裂，一c o o h 、一n h ：的增加，其亲水性增加，故水解后，蛋白溶解度显著 上升，大豆肽在广泛的p h 值、温度、离子强度、氮浓度范围内都是可溶的，有高p h 值 适应性0 2 1 ；而大豆蛋白在酸性条件下。特别是在p h 4 2 - 4 5 等电点附近时，大豆蛋白便会 因酸沉淀而无法继续溶解。 这就极大地扩大了大豆肽的应用范围。尤其是大豆肽在大豆蛋白的等电点p h 4 3 附 近保持溶解状态，这一酸溶特性为开发酸性大豆饮料和食品提供了条件。 1 2 i 2 低粘度性 大豆蛋白质的粘度随着浓度的增高而急剧升高，这是因为大豆蛋白溶液在浓度为 1 0 以上时经高温处理易于产生疏水键结合和二硫键结合形成网状聚合物，使得大豆蛋 白溶液的粘度高。而大豆肽的溶解度高达9 9 以上，其溶液的粘度在其浓度高达6 5 以上 仍具有良好的流动性。而且肽溶液的粘度通常不受热处理的影响，加热也不会胶凝，具 有明显抑制蛋白质形成凝胶的性质，可用于改善蛋白食品品质和口感m j 。 1 2 i 3 高吸湿性 大豆蛋白经酶法水解后，球状分子结构遭到破坏，大量亲水基团暴露，导致大豆多肽 具有强吸湿性。由于p h 的改变影响了大豆蛋白净电荷数，从而改变了蛋白质蛋白质 和蛋白质水的相互作用力，而大豆多肽则受影响较少，大豆蛋白吸湿性随p h 的增加 而增大。 1 2 i 4 乳化性 适度的水解可以提高蛋白水解物的乳化性。这是由于水解使包埋于蛋白质内部的疏 水性残基暴露出来，提高了其在界面的吸附，形成了内聚性膜，同时疏水性残基与油相 互作用，而亲水性残基与水相互作用所致；但过度的水解也会导致水解产物乳化性的急 剧下降。这是因为尽管小肽能迅速扩散，并在界面吸附，但它们不能折叠并在界面如同蛋 白质一般取向，因此不能有效地降低界面张力l 。 1 2 2 大豆肽的生物活性 大豆肽除具有良好的营养特性、加工特性和广泛的应用范围外，还具有多种生物活 性q 1 2 2 i 易吸收性 小分子大豆多肽的制各和分离纯化研究 生物代谢实验证明，大部分蛋白质并非完全水解成氨基酸才被吸收，而是在多肽形 式时就能直接被人体吸收。而且二肽和三肽的吸收速度比相同组成的氨基酸还要快。大 豆肽不仅具有与大豆蛋白相同的必需氨基酸组成，而且与大豆蛋白相比，更易、更快被 消化吸收。因此，大豆肽可以用于维持和改善蛋白质营养状态，以达到维护改善人们对 蛋白质营养的目的：一方面可以提供给康复期病人、消化功能衰退的老年人以及消化功 能未成熟的婴幼儿等胃肠功能较弱的人群；另一方面可以作为过度疲劳后蛋白质的高效 补充剂，尤其是可用于运动员剧烈运动后体能的迅速恢复。 1 2 2 2 降低胆固醇的作用 由于大豆多肽刺激甲状腺分泌量的增加，从而促进了胆固醇胆汁酸化而无法再吸 收，因而大豆多肽具有降低血清胆固醇含量的功效，而且效果更显著u t j 。对胆固醇值正 常的人，不降低其胆固醇。它不降低对人体有益的高密度脂蛋白的数值，在食用高胆固 醇含量食品时，对血清胆固醇值升高也有防止作用。 1 2 2 3 降低血压的作用 血管中含有血管紧张素和血管紧张素转换酶，大豆多肽混合物中降压肽可将两者转， 换，同时降解激肽，使之失活，防止血管收缩，因而起到降低血压的作用；对心血管疾 病也有显著疗效，具有预防动脉硬化、延缓人体衰老等功效。但大豆多肽仅对高血压患 者有降压作用，而对正常人无降压作用，因此其应用安全可靠，长期食用具有很好降血： 压作用。 1 2 2 4 促进脂肪代谢的作用 过度肥胖会引起许多疾病，但低能膳食方式的减肥又会导致减肥者体质下降。大豆多 肽有阻止脂肪吸收的作用，在保证足够肽摄入的基础上，将其余能量组分降至最低，则 既可达到减肥的目的，又能保证减肥者的体质。实验结果表明，添加大豆肽的食品产热 量最高，说明大豆肽比其它蛋白质具有更大的促进能量代谢的效果。摄食蛋白质比摄食 脂肪和糖类更能促进能量代谢，高长城等( 2 0 0 1 ) 报道，大豆肽比其它蛋白质具有更大的 促进能量代谢的效果 js - i q 。 1 2 2 5 抗氧化作用 大豆蛋白经酶水解后的产物具有一定的抗氧化能力。大豆水解物的主要组成为多肽 和氨基酸的混合物。己发现有抗氧化活性的氨基酸有：色氨酸、胱氨酸、组氨酸、赖氨 酸、精氨酸、亮氨酸、缬氨酸。一些氨基酸的衍生物，特别是色氨酸的衍生物：5 一羟基 色氨酸具有很强的抗氧化能力。将大豆蛋白水解产物与酚类抗氧化剂协同作用可显示出 一定的增效作用。c h e n 等( 1 9 9 5 ) 从大豆蛋白质的酶解液中分离得到6 种具有抗氧化性 的多肽，鉴定了它们的氨基酸序列，并推测它们的抗氧化性主要是由于组氨酸和酪氨酸 能消除自由基或整合金属离子的缘故。 陕西科技大学硕十学位论文 1 2 2 6 促进矿物质吸收的作用 有些肽有促进矿物质吸收的作用，研究最多的为酶解酪蛋白所获得的肽，后来发现 矿物质结合肽不仅来源于乳蛋白，还产生于其它食物，如鱼、大豆和谷蛋白。肽促进矿 物质吸收主要是通过螯合矿物质阳离子，使其保持在肠道中的溶解状态而实现的。 1 2 2 7 其它活性功能 经研究表明：大豆多肽还具有镇静安神、刺激胰岛素的分泌、对糖尿病患者有治疗 和康复作用。另外还有一些多肽能够抗毒、解毒、保护表皮细胞、防止黑色素沉淀、促 进大脑和神经发育。 1 3 大豆肽的制备 目前制备大豆肽常用的方法就是将蛋白质进行酸水解、碱水解或酶水解，它们各有利 弊 2 0 1 。 1 3 1 碱法水解 水解完全，色氨酸不被破坏，工艺简单、对设备腐蚀性小。但缺点是碱水解时，丝 氨酸、苏氨酸、精氨酸等大部分被破坏，且大部分氨基酸都会发生消旋作用，营养成分 损失大。由于人体只能吸收l 型氨基酸( 蛋氨酸除外) ，因此很少采用此法来制取供人类 食用的水解蛋白2 2 】。 1 3 2 酸法水解 人们最早采用的水解蛋白质的方法之一，其最大优点是水解完全彻底，不会引起氨 基酸的消旋作用，几乎能使全部的蛋白变为l a a 。缺点是色氨酸全被破坏，丝氨酸和 酪氨酸部分被破坏，腐蚀设备，劳动条件差，而且与含醛基化合物作用，生成黑色的物 质使水解液过滤困难刮。 1 3 3 酶法水解 和酸、碱水解法相比较，酶法水解植物蛋白具有许多优点【2 5 2 6 ，用适宜的蛋白酶， 控制反应条件在其酶活力适宜的p h 和温度范围内，经过一定时间使蛋白质水解。酶法 水解植物蛋白较酸、碱水解法具有许多无可比拟的优点鲫，如反应条件温和，产品纯度 高，不产生消旋作用，也不破坏氨基酸，对环境友好，是一种不彻底的水解，其主要产 物是肽而不是氨基酸。特别是经过分离精制得到的多肽，含有组成与蛋白完全一致的必 需氨基酸，具有高溶解性，高稳定性，高吸湿保湿性，抗凝胶性等特点。1 ，尤其是小 分子肽，人体吸收速度快，利用率高，同时还具许多生物活性。酶法水解可以在不降 低营养价值的前提下改善蛋白质的理化性质和功能性质，扩展在食品加工中的应用范 围，酶法生产大豆肽安全性极高，价格低廉、易于推广。 酶的专一性不同：酶对蛋白分子肽链的作用点不同，相应水解的程度和水解液中 小分子大豆多肚的制备和分离纯化研究 多肽的组成有很大不同。例如用胰蛋白酶水解蛋白质仅限于水解蛋白质分子中由精氨酸 残基和赖氨酸残基构成的肽键，而肽键两侧都连接着芳香族氨基酸时，将有利于胃蛋白 酶的作用。 酶作为具有生物活性的特殊蛋白质，对反应条件要求苛刻。因此，酶促反应大都 要求在一定范围的温度、p h 值下进行，且酶水解效果与底物浓度、酶用量、反应时间、 预处理、溶液中有无金属离子等因素有关。同时在水解过程中，酶常常会逐渐变性失活， 致使酶活力随时间而降低，特别是蛋白水解酶会发生自溶( 自身水解) 现象，导致生产 效率下降。因此，酶法水解蛋白质的水解度不高。 1 4 大豆多肽研究进展 1 4 1 国外研究概况 关于对蛋白质的改性研究历史，可追溯到上个世纪4 0 年代，当时西方学者用酶法 改性蛋白质以弥补鸡蛋紧缺。6 0 年代以来，随着生物进步和生命科学发展，大豆多肽 生理功能逐渐被人们所认识，一些活性肽结构和功能逐渐明确，也进一步推动活性肽研 究，大豆蛋白酶法改进也成为众多学者关注的课题1 。美国和日本都处于在发展大豆肽 生产和利用的前列。美国在7 4 年成立a d l e - n i s s e n 领导专门研究水解蛋白课题机构，取 得研究成果，d e l t o w ns p e c i a t i e s 公司建成了年产5 0 0 0 t 食用蛋白肽的工厂。m u t i l a n g i ， w e r w 等一直致力于研究酶解对蛋白质的改性作用c 3 。3 3 而n a o m i 则将酶与化学结合起 来，对蛋白质进行改性l 。日本也于8 0 年代开始开展该方面的研究，日本不二制油公 司致力于大豆肽的研究，从酶菌选育、水解工艺确定、水解产物脱苦技术及产品分离纯 化等均取得较大进展，生产出3 种大豆肽；日本k o d e r at o m o h i r o 等】不添加任何脱苦 吸附剂或遮盖剂，直接利用一种内切酶的作用，来切除疏水性末端氨基酸以除去苦味。 雪印和森永等乳业公司均己成功地将大豆肽应用于食品工业d 一* 4 2 1 m c n e i lm a r c e l ”】采用 a l c a l a s e 酶和n e u t r a s e 酶双酶分步水解，h e t