（物理化学专业论文）修饰链霉亲和素的核壳型磁性纳米粒子在rna分离中的研究.pdf

上海师范大学硕士擘住论文 论文独创性声明 本论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究成果。论文中除了 特别加以标注和致谢的地方外，不包含其他人或机构已经发表或撰写过的研究成 果。其他同志对本研究的启发和所做的贡献均已在论文中做了明确的声明并表示了 谢意。 作者签名：日期： 论文使用授权声明 本人完全了解上海师范大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留送交论文的复印件，允许论文被查阅和借阅；学校可以公布论文的全部或部分内 容，可以采用影印、缩印或其它手段保存论文。保密的论文在解密后遵守此规定。 作者签名：导师签名：日期： 5 5 上海炜范大学硕士学位论文 摘要 氧化铁磁性纳米粒子可以通过多种方法制备得到，通过表面化学修饰可以得到无机s i o z 包 覆的核壳结构的复合磁性纳米粒子。其壳结构既具有生物适应性，又具有可键合生物分子( 如 细胞、蛋白质、酶和抗体等) 的活性基团，其核具有超强顺磁性。本文通过对氧化铁磁性纳米 粒子的制备，修饰和分离的研究。使磁性纳米粒子分离器有了更好的应片j 。 ( 1 ) 首先采用工沉淀的方法，在碱性条件下共沉淀f e 2 + 和f e “离子混合物，通过调节p h 值 和介质粒子强度防j t 粒子沉聚，并将粒子尺寸控制在一个标准内。 ( 2 ) 采用反相微乳液的方法，利用正硅酸乙酯在碱性条件下水解，在y - f e 2 0 ，的表面包裹一 层s i 0 2 。实验结果表明在磁核y f e 2 0 a 的表面成功地包裹了s i o , 层，形成了核壳型磁性纳米粒 子；而且在合适的条件下，合成的核壳型磁性纳米粒子具有均匀的粒径和良好的单分散性 ( 3 ) 再在包覆s i 0 2 的颗粒上修饰 n - ( 2 一氨基乙基) 一3 一氨基丙基三甲氧基硅烷 ( a e a p s ) ， 再通过链霉亲和素将生物素标记的o l i g o ( d t ) 修饰在纳米颗粒的表面，构建了一种具超顺磁性 的r n a 纳米分离器，此探针可特异性地结合目标r n a ，从而可实现其对互补的r n a 片段的高效 快速分离和富集。 关键词：纳米鞋子；生物分子复合体；纳米生物技术；磁性分离 5 上海师范太学硕士学位论文 a b s t r a c t i r o no x i do x i d em a g n e t i cn a n o p a f l i d e sw i t hb i o c o m p a t i h i l i t ya n df u n c t i o n a lc o a t i n g sv i a a p p r o p r i a t es u r f a c ec h e m i s t r ya p p r o a c h e sh a v eb e e nu s e df o ri m m o b i l i z a t i o n o fc e l l s ，p r o t e i n s ， e n z y m e s ，a n t i b o d i e s ，o l i g o n u c l c o t i d e s a n d d r u g st h r o u g hc o v a l e n tb o n d i n g o r a d s o r p t i o n t h e s u r f a c e m o d i f i e dm a g n e t i cn a n o p a r t i c l e sh a v eb e e nw i d e l yu s e di nb i o l o g i c a la n db i o m e d i c a la r e a s s u c ha si m m o b i l i z a t i o no fb i o m o l e c u l e s ；s e p a r a t i o no fm e t a li o n s , c e l l s ，p r o t e i n s ，d n a ；i m m u n o a s s a y , b i o c h e m i c a la n a l y s sa n dm a g n e t i cr e s o n a n c ei m a g i n g ( m r l ) p r o h e s i nt h i sp a p e r , t h r o u g ht h e p r e p a r a t i o nm e t h o d s , s u r f a c e m o d i f i c a t i o na p p r o a c h e sa n da n a l y t i c a la p p l i c a t i o n so fi r o no x i d e - b a s e d m a g n e t i cn a n o p a r t i c l e s , m a k et h em a g n e t i cn a n o p a r t i c l e ss e p a r a t i o nh a v ef n o r ea p p l i c a t i o n s ( 1 ) u n d e ra l k a l i n i t yc o n d i t i o n ，u s e sm e t h o dw h i c ht h ec o - p r e c i p i t a t e st op r e p a r e df p a n df e 3 i o nm i x t u r e ，t h e nt h r o u g ha d j u s t st h ep hv a l u ea n di n s u l a t i n gp a r t i c l e si n t e n s i t yt op r e v e n t e dt h e p a r t i c l e s g e tg a t h e r s ，a n dc o n t r o lt h ep a r t i c l e s d i m e n s i o ni nas t a n d a r d ( 2 ) at h i ns i l i c a - c o a t i n gl a y e re n c a p s u l a t i n gt h eb a r et - f e - 2 0 3n a n o p a r t i c l e sw a s f o r m e db ya b a s e c a t a l y z e dh y d r o l y s i sa n dp o l y m e r i z a t i o nr e a c t i o no ft e t r a e t h o x y s i l a n eo e o 勋i nr e v e r s e m i c r o e m u l s i o n t h ee x p e r i m e n t a lr e s u l t ss h o wt h a tt h es t r u c t u r eo fc o r e - s h e t li sa n c e e s s f u l l y s y n t h e s i z e da n dt h es y n t h e s i z e d 小ph a su n i f o r ms i z ei nd i a m e t e ra n dv e r yf i n em o n o d i s p e r s i o ni n s u i t a b l ec o n d i t i o n ( 3 ) al a y e ro fa e a p se n c a p s u l a t i n gt h ep a r t i c l e sw i t hh a v eal a y e ro fs i 0 2 ，t h e nc o n n e c t h e o l i g o ( d t ) w i t hh a v el i n k e db yb i o t i nt ot h ep a r t i c l e sw i t hl i n k e db ys a v , c o n s t r u c tap a r a m a g n e t i s m r n as e p a r a t i o nw i t hc a nl i n kt h et a r g e tr n as p e c i f i c t i l y , s ow ec a ns e p a r a t ea n dg a t h e rr n a e f f e c t i v e l y k e yw o r d sn a n o p a r t i c l e ；h y b r i ds y s t e m s ；n a n o b i o t e c h n o l o g y ；m a g n e t i cs e p a r a t i o n 6 上海师范大学硕士学位论文 1 1 研究意义 第一章文献综述 纳米是个极小的长度单位，1 纳米等于一米的十亿分之一，纳米技术就是在 1 - 1 0 0 纳米尺度空间内，研究原子和分子的运动规律、特征和应用，也就是说在不 改变化学成分的前提下，通过直接操纵和安排原子、分子而创造新的物质。任何物 质的颗粒大小达到纳米级时就会产生表面效应、小尺寸效应和量子效应，这就使纳 米材料具有很多优异的性质。同时许多宏观尺度上的有效规律、定律、方式、方法， 在纳米世界都将不再适用。 随着纳米技术向生命科学领域的不断渗透，利用纳米技术研究和解决生命科 学领域中的重大问题，推动纳米生物技术的发展，正成为当前重要的前沿研究领域 之一。一方面，纳米生物学的重要任务之一是运用纳米材料解决生物学的实际问题。 目前，纳米材料( 主要是纳米粉体) 在生物医药方面的应用主要在如下几个方面： ( 1 ) 利用纳米颗粒作为药物的载体进行靶向给药。特别是利用磁性纳米颗粒作为 主要的药物载体，在外磁场作用下将抗癌药物定位于肿瘤靶区的药物浓度，并使药 物以受控的方式从载体中释放，从而达到有效化疗癌肿并降低药物对全身的毒副作 用的研究受到了高度重视 1 ；( 2 ) 磁性纳米颗粒用于核酸细胞蛋白质等生物大分 子的分离和纯化【2 ，3 ；( 3 ) 将磁性纳米颗粒应用于临床磁共振成像 4 ；( 4 ) 利 用纳米粒子提高物质检测的灵敏度和最低检测限 5 。另一方面，纳米生物学的另 一个重要任务是利用生物分子和纳米粒子独有的特性对其进行单分子操纵，从而实 现以。自下而上”的纳米制造。其中，由于核酸( 如d n a ) 本身的尺寸可控和沃 森一克里克互补识别能力，在组装d n a 纳米粒子的纳米结构方面的研究也成为当前 研究的热点之- - 1 6 1 0 。由于磁性纳米粒子( m n p ) 具有很好的磁性，在靶向药物 载体和生物分子分离方面有着巨大的应用前景，因此研究生物分子在m n p 表面的 键合以及以此为结构单元组装的纳米结构，不仅具有重要的理论意义，而且还具有 7 上海师范大学工蠢士擘往论文 重要的实用价值。 ， 分子克隆( m o l e c u l a rc l o n i n g ) 、d n a 测序( d n as e q u e n c i n g ) 和聚合酶链反应 ( p o l y m e r s ec h a n i nr e a c t i o n ，p c r ) 是分子生物学的三大主流技术。在这三种技术 中，p c r 技术在实践中的应用日益广泛，并随着分子生物学实验技术的成熟丽不 断创新和拓展 1 1 ，1 2 。聚合酶链反应( p c r ) 是一种选择性体外扩增d n a 或r n a 片断的方法，即通过试管中进行的d n a 复制反应使极少量的基因组d n a 或r n a 样品中的特定基因片段在短短几小时内扩增上百万倍，p c r 反应体系主要包括d n a 靶序列、与d n a 靶序列单链3 末端互补的合成引物、4 种d n t p 、耐热d n a 聚合 酶以及合适的缓冲液体系。p c r 反应是一个重复地进行d n a 模板解链，引物与模 板d n a 杂交、d n a 聚合酶催化形成新的d n a 链的过程，这些过程都是通过控制 反应体系的温度来实现的。p c r 的第一个特点，即它能够指导特定d n a 序列的合 成。当p c r 反应体系中存在分别与两条链互补的一对引物时，两条单链d n a 都可 作为模板合成新的互补链。并且每一条新生链的合成都是从引物的退火结合位点开 始，并沿着相反链延伸，这样在每一条新合成的d n a 链上都有新的引物结合位点。 然而反应混合物经再次加热使新、旧两条链分开，并加入下轮的反应循环，即引物 退火、d n a 延伸和双链的变性分离。p c r 技术的第二个特点，即能使特定的d n a 片段得到迅速大量的扩增。p c r 扩增能力是十分惊人的，理论上讲经过3 0 次的循 环反应，便可使靶d n a 得到1 0 9 倍的扩增。随着耐热d n a 聚合酶的发现和应用， 大大地提高了p c r 的效率并推动了其向p c r 自动化技术的发展。目前，p c r 技术 已成为生物科学研究的一种重要方法，为医学、遗传学和考古学等学科的研究提供 了新的技术手段 1 3 1 5 。 此外，细胞生物学中一个十分重要的技术是细胞分离，它关系到研究所用的 细胞标本能不能快速获得的关键问题。以往的细胞分离技术主要采用离心法，利用 密度梯度原理，时间长、效果差。8 0 年代，人们开始利用纳米微粒进行细胞分离。 随着分子生物学研究的不断深入，利用生物大分子进行物质的组装已经成为生物 8 上海师范大学硕士擘住论文 大分子各级结构与功能研究的基础和最活跃的领域。d n a 或蛋白质的特性为纳米物 质的制造提供了新思路，同时纳米物质的研究也拓宽了该领域向更为快速、精确的 方向发展。纳米尺寸的胶体粒子因其物理学、光学、光化学特性而被广泛应用于化 学传感器、色谱激发器等物理学领域；d n a 纳米技术是以d n a 的特性为原理设计的 纳米技术，主要应用于分子的组装。d n a 复制过程中所体现出来的单纯性、互补法 则的恒定性和专一性、遗传信息的多样性以及构象上的特殊性和靶向性都是纳米技 术所需要的设计原理。 1 6 纳米磁性微球是由纳米雌性颗粒与各种活性功能基团的材料复合而成的具有 一定磁性及特殊表面结构的粒子。磁性微球的研究始于2 0 世纪7 0 年代，国内在2 0 世纪8 0 年代以来日渐活跃1 1 7 】，通过共聚和表面改性，磁性微球表面可被赋予多种 活性功能基团，如c o o h 、- c o h 、- n h 2 等，也可以共价结合酶、细胞、抗体等生 物活性物质。因为具有磁性，雌性微球可在外加磁场的作用下方便的被定位、导向 和分离，有学者因此将其形象的称为动力粒子。作为新型功能材料，雌性微球在生 物、医学( 生物大分子分离、靶向药物等) 、细胞学( 细胞标记、细胞分离等) 等 领域有着广阔的应用前景 1 8 一e 2 。 随着纳米科学技术向生命科学领域里不断地发展，纳米材料在生命科学中的运 用将会越来越广泛，也必将越来越多地渗透到各种各样的生物科学技术里，这将有 助于推动纳米生物技术的发展。一方面由于纳米材料具有独特的光学或磁学等性 质，因而可以利用纳米材料对生物大分子( 如d n a 分子等) 进行分离和纯化；另一 方面由于生物大分子具有良好的识别能力和尺寸易于控制，因而可以利用生物大分 子作为模板对纳米材料进行组装。所以，对纳米材料生物大分子复合体的研究具 有重要的意义。此外，传统的d n a r n a 分离耗时、有毒性，因此，利用磁性纳米粒 子复合体分离d n a r n a 具有非常重要的理论意义和应用价值。 1 2 研究进展 9 上海师范大学项士学位论之 1 2 1 磁性纳米粒子的合成 生化及医学等领域对磁性纳米粒子的物理、化学及药理学性质如化学组成、粒 度大小、晶体结构、磁功能、表面形状、吸附性、溶解性及低毒性都有严格要求。 研究高分散、粒度分布均匀，并能方便地进行表面化学修饰的氧化铁磁性纳米粒子 的合成方法具有更重要的意义。 溶液中合成氧化铁磁性纳米粒子有两种方法 2 3 - 2 5 】：一是在碱和氧化剂存在 下，使f e ”氧化得到f e 。0 4 ；二是在碱性条件下共沉淀f e ”和f e ”离子混合物，f e 和 f e ”的摩尔比为1 ：2 。磁性纳米粒子的大小、形状和成分可通过所用的铁盐类别( 盐 酸盐、硫酸盐、硝酸盐或磷酸盐) 来控制；另外，通过调节批p h 值和介质离子强 度能够防止粒子沉淀，并将粒子尺寸控制在一个数量级上( 2 - 1 5 n m ) ( 2 6 。其中第 二种方法是目前最常用的制备方法，被广泛应用在生物化学及生物医学领域。 微乳液是两种不相混溶的液体通过表面活性剂分子作为界面膜，形成热力学稳 定、各向异性的分散体系。微乳液分为水分散在油中( w o ) 和油分散在水中( o w ) 两种体系 2 7 ，其中w o 体系被广泛用于纳米粒子的制各。分散性好、大小均一的 氧化铁磁性纳米粒子可通过形成胶束的铁前体 2 8 和, d o 乳液反应 2 9 - 3 2 得到。 微乳液合成也能得到两亲嵌段共聚保护的磁性纳米粒子 3 3 。微乳液合成的优点是 纳米李子的大小可通过乳液液滴的大小来控制。但是微乳液合成氧化铁磁性纳米粒 子只溶于有机溶剂，在医学领域的应用受到限制，通常需要在氧化铁磁性纳米粒子 的表面修饰上亲水分子，使氧化铁磁性纳米粒子溶于水，从而能应用于生物、医学 领域。 此外，通过非水解过程制备氧化铁磁性纳米粒子的方法中，最典型的方法是在 热的表面活性剂中，分解合适的铁化合物前体 3 4 】。例如氧化铁磁性纳米粒子可以 通过铁一- - 7 酰丙酮酸酯配合物( f e r r i c t r a c e t y l a c e t o n a t e ，f e ( a c a c ) 3 ) 热分解得 到 3 5 ，3 6 。高温热分解制备氧化铁磁性纳米粒子分散性好，通常只溶于有机溶剂。 1 0 上海师范大学硕士擘住论文 但g a o 等 3 6 ，3 7 以f e ( a c a c ) ，和无机铁盐f e c l ，6 h 。0 为前体，2 一吡咯酮为溶剂， 用高温热解法制备了适宜生物体系、水溶性好的f e ，o 磁性纳米粒子，作为核磁共振 成像( m a g n e t i cr e s o n a n c ei m a g i n g 。m r i ) 造影剂。氧化铁纳米粒子也可以通过 电化学途径制得，产物纳米粒子可控制在3 - 8 n m 3 8 。 通过生物合成的方法也可以得到氧化铁磁性纳米粒予。例如，铁蛋白是种存 储铁的蛋白质，它在制备氧化铁及其他纳米粒子时提供模板。天然铁蛋白形成一个 6 n m 的y f e o o h 纳米粒子核。移出天然y f e o o h 纳米粒子核后形成空壳，称之为脱 铁铁蛋白。在a r 或n ：、6 0 6 5 1 3 、p h = 8 5 下，将f e 2 冰溶液逐滴加到脱铁铁蛋白溶 液中，然后部分氧化，可得到包含在铁蛋白壳内的直径为7 3 n m 的f e 舢纳米粒子或 f e 。o j y f e ：0 3 3 9 ，4 0 。像铁蛋白一样，李斯特细菌也能提供5 r i m 的内空穴合成氢 氧化亚铁磁性纳米粒子 4 l ，4 2 。f e ，0 。磁性纳米粒子也可以通过趋磁细菌合成 4 3 4 5 ，其中氧化铁磁性纳米粒子被包埋在磷脂双层胶囊中，称为“磁原体” 4 6 ， 将细胞壁破坏后，可以用于磁性分离。 1 2 2 核壳型磁性纳米粒子的合成及分类 铁的氧化物有着多种组成形式，不同的组成形式有着不同的磁性，y f e 籼和 f e 。仉是最常见的具有良好磁性的铁氧体，它们都是表现为亚铁磁性( 4 0 。它们不仅 在工业上具有重要的用途( 如磁性记录材料等) ，而且在生物医疗等方面也具有重 要的应用前景( 如核酸和蛋白质的分离、磁共振成像造影剂等) 。然而，虽然它们 具有优良的磁性，但是由于裸露的y f e 2 0 。和f e 籼的磁性容易受到环境的影响( 尤 其在生物体系中) 并且个体容易团聚等，这使得它们的应用受到限制。因此，对磁 性纳米粒子进行表面修饰使其具有更好的分散性和生物相容性的研究具有重要的 意义。 氧化铁磁性纳米粒子的保护层可以通过原位反应，即在反应过程中直接引入保 护分子，如在合成氧化铁磁性纳米粒子的同时生成聚合物。另一种方法是在合成氧 1 1 上海师范大学硕士擘位论文 化铁磁性纳米粒子后，加入保护分子，其保护层分子也能与其他分子发生交换反应， 得到不同分子功能基团为壳、氧化铁磁性纳米粒子为核的复合纳米粒子体系。磁性 纳米粒子保护层可以是无机材料、有机分子或聚合物。 氧化铁磁性纳米粒子表面的羟基很容易与硅烷试剂反应，生成包覆二氧化硅 4 7 5 5 的复合纳米粒子表面二氧化硅层具有生物相容性，不仅在非水溶液中稳定， 而且表面存在的硅烷醇基团很容易再与硅烷试剂发生耦合反应，得到表面含有 _ n h 2 、一c l i o 、一s h 等集团，能与酶、核酸、蛋白质等多种生物分子结合。另外，o 反向微乳液聚合法也被用于制备包覆硅的氧化铁纳米粒子 5 6 ，在反向微乳液液滴 中沉淀铁盐，也可制备包覆硅的氧化铁纳米粒子 5 7 、5 8 。 为了得到分散性好的氧化铁磁性纳米粒子，非聚合物的有机分子也常被用作稳 定剂，包括乙醇，有机羟酸( 链烷磺酸、链烷磷酸、油酸) 、硫醇和硅烷等 2 4 、2 5 。 油酸和月桂酸是具有相似功能的表面活性剂，以它们为稳定剂的铁磁流体可以稳定 分散在十六烷溶剂中 5 9 。些表面活性剂如油酸钠，十二烷基胺等常被用来提高 氧化铁磁性纳米粒子在水相中的分散性。利用单分子层交换反应，可以得到表面含 不同功能分子的氧化铁磁性纳米粒子 6 0 、6 1 。为了在生物医学上使用氧化铁磁性 纳米粒子，需要氧化铁磁性纳米粒子溶于水，通过表面分子的交换可以得到亲水功 能修饰、在水相中具有高度分散性的磁性纳米粒子例如水溶性的环糊精分子与铁 流体表面的油酸交换，可以将分散在有机相中f e n 的转移到水相 6 2 】。 此外，聚合物也被广泛用作纳米粒子的稳定剂，一种方法是在聚合物存在下， 用沉淀方法合成磁性纳米粒子；另外是在氧化铁磁性纳米粒子表面形成聚合物保护 层。磁性纳米粒子通常在沉淀后进行修饰，以获得更好的分散效果。通过反向微乳 液聚合过程，可以得到聚合物壳的亲水磁性纳米粒子。作为保护剂的聚合物分为天 然聚合物和合成聚合物两大类。典型的合成聚合物包括聚乙烯基吡咯烷酮 6 3 、聚 乙烯醇 6 4 、聚炳烯酸 6 5 、共聚乳酸一甘醇酸 6 6 、聚乙二醇( p e g ) 6 7 - 7 0 】、 1 2 上海师范大学硕士学位论文 枝状聚合物 7 l ，7 2 、聚甲基丙烯 7 3 等。天然聚合物包括明胶、支链淀粉、葡萄 糖、脱乙酰壳多糖和磷酸胆碱 8 4 7 9 ，生物活性分子多巴胺也常被用于包覆在氧 化铁纳米粒子表面 8 0 。 1 2 3 核壳型磁性纳米粒子在分离中的应用 磁性纳米粒子作为载体包覆酶、蛋白质、多肽、抗体和抗原等生物分子被广泛 应用于生物医学和免疫分析领域 8 1 ，8 2 3 ，但是由于磁性微球的大小( 7 5 - 1 0 0 um ) 限制了其在细胞生物过程和微流芯片中的一些应用 8 3 ，8 4 。磁性纳米粒子作为生 物分子的载体具有：( a ) 高的表面积，能吸附或键合大量生物分子；( b ) 较少的质 量传递阻力和较少的污染；( c ) 利用外加磁场，很容易从混合物中分离包被的生物 分子。含有有机功能基团的有机分子和聚合物被引入到磁性纳米粒子的表面，然后 通过多种方法将生物分子键合在磁性纳米粒子的表面，得到生物活性的磁性纳米粒 子。许多生物分子也可以通过酰胺或醚键连接在磁性纳米粒子的表面 2 5 ，连接的 蛋白质有铁转递蛋白、自蛋白、胰岛素、转化生长因子、神经生长因子、激素、核 酸和抗体等生物分子 2 5 ，8 5 9 0 。 将具有识别功能的超分子主体分子杯芳烃衍生物生物连接到磁性纳米粒子上， 结合杯芳烃的识别功能和磁往纳米粒子磁性分离的特点，可以有效地进行金属分子 的分离 9 1 - 9 5 。另外，在蛋白质的分离上，基于电荷作用的粒子交换一直是很有 效的途径，其工作p h 值在待分离的两种蛋白质等电点之间。s o u s a 等 9 6 将磁性纳 米粒子应用于氨基酸天冬氨酸和谷氨酸的吸附。蛋白质与磁性纳米粒子的结合和解 离通过蛋白质与磁性纳米粒子表面的负电荷来控制 9 7 ，在低p h 值( p h p i ) ，带负电的蛋白质将被排斥离开磁性纳米粒子表面。b u c a k 等 9 8 做出了磷酸包覆的、粒径8 n m 的f e 3 0 4 胶体纳米粒子用于从蛋白质混合物中进行单一 蛋白质的回收和分离。使用磁性纳米粒子分离蛋白质的一个显著优点是：即使在悬 上海师范大学硕士学位论文 浮固体或其他肉眼可见污染存在下，吸附蛋白质的过程也可以进行。另外，使用高 梯度磁性过滤的方法，可实现环境污染物分离 9 9 。 将特异性配体键合在磁性纳米粒子的表面可用于细胞的分离和检测。g u 等 1 0 0 报道了万古霉素修饰的磁性纳米粒子用于选择性的吸附革兰氏阳性细菌细胞，其作 用基于万古霉素与细胞表面末端肽d 一丙氨酸一d 丙氨酸的分子识别作用。多聚糖包 覆的5 0 h m 的氧化铁磁性纳米粒子和右旋糖苷包覆的超顺磁性纳米粒子已在细胞分 离体系中采用，并实现了商业化。由于磁性纳米粒子的超顺磁性和在高梯度磁性分 离中的应用，需要特定设计的磁性柱以保证在细胞分离中的高磁场强度 1 0 1 ，1 0 2 。 细胞分离被成功应用在许多生物医药和生物研究领域，如在血液中选择裸肿瘤细胞 的灵敏度很高，因此尤其适合分离少量靶标细胞 1 0 3 。万古霉素修饰的磁性纳米 粒子作为亲核探针选择性吸附包覆革兰氏阳性病原体，用基质辅助激光解吸电解质 谱( m a t r i xa s s i s t e dl a s e rd e s o r p t i o ni o n i z a t i o nm 2 l s ss p e c t r o m e t r y 。m a l d i m s ) 法检测葡萄球菌和金黄色葡萄球菌 1 0 4 】。同样，将i g g 键合到f e n 表面，选择性 富集溶液中的目标细胞细菌，用m a l d i m s 可检测水样和尿样中较低浓度的葡萄球 菌和金黄色葡萄球菌 1 0 5 。 传统的d n a 分离方法不仅需接触有毒试剂，而且步骤繁杂难以自动化。磁性纳 米粒子最近广泛作为有机固相合成和生物分子固化的载体，通过共聚、表面改性， 磁性纳米粒子可连接各种基团或d n a 片段以达到分离的目的 1 0 6 - 1 0 8 。m a t s u n a g a 等 1 0 9 报道了一种将d n a 从埃希氏蕴属大肠杆菌细胞分离出来的方法，在中性p h 值和低盐度条件下，利用硅烷接枝在磁性纳米粒子上得以实现z h a o 1 1 0 等设计了 磁性纳米粒子捕获器从混合物和肿瘤细胞中分离和富集微量d n a m r n a 。磁性纳米捕 获器以磁性纳米粒子为载体，功能化分子钳作为d n a 探针用于基因识别和富集。d n a 与通过静电吸附在d n a 骨架上的f e 2 + 和f e 3 + 作用，产生的f e 。也与d n a 结合。根 据标记的d n a 与其碱基互补的d n a 链杂交，连接f e ，嘎的d n a 分子可将标记的d n a 1 4 上海师范大学硕士擘住论文 与非标记的d n a 分离 1 1 1 。 1 2 4 核壳型磁性纳米粒子在分析检测中的应用 f a n g 等 1 1 2 用f e 舢磁性纳米粒子修饰电极测定多巴胺。l i e b e r m a n 等 1 1 3 将金纳 米粒子连接到表面含有氨基的磁性纳米粒子上，由于金纳米粒子具有表面拉曼增强 效应，可用表面拉曼增强测定五氯噻吩。磁性纳米粒子键合上抗原或者抗体可用于 免疫分析 1 1 4 - 1 1 6 ，其中功能化的磁性纳米粒子主要用于磁性分离和浓缩分析物 以及每次分析的敏感界面的交换。例如应用外加磁场将抗体或抗原修饰的磁性纳米 粒子吸附在石英晶体微天平上，进行免疫分析 1 1 4 ，这种方法可以通过简单交换 表面磁性纳米粒子，很方便再生敏感曾。m a t s u n g a 等 1 1 7 3 用单克隆抗体键合细菌 磁性粒子自动免疫体系分析了内分泌干扰化学物。 磁性纳米粒子表面修饰上d n a 单链探针，d n a 杂交后磁性分离d n a 标记物，可 用电化学方法测定d n a 1 1 8 ，1 1 9 。磁性纳米粒子表面修饰上不同的o d s 、p b s 、z n s 、 c d s 标记的d n a 片段构建多重化学密码探针，根据p b 2 + 、z n 2 + 、c d 2 + 溶出电位不同， 可以用电化学法同时测定多个d n a 片段 1 2 0 n a m 等 1 2 1 1 利用磁性粒子探针发展了一种新的超灵敏检测蛋白质分析物的方 法。该检测系统基于在氨基磁性纳米粒予表面修饰上键合特定目标分析物前列腺特 异性抗原( p r o s t a t e s p e c f i ca n t i g e n ，p s a ) 的单克隆抗体，纳米探针d n a 编码 专一于目标蛋白质和抗体，并可与修饰的磁性微粒形成夹心结构。当利用磁性分离 复合探针和目标物后，纳米探针表面的d n a 去杂交化，然后分析纳米粒子探针所释 放的核苷酸系列，从而实现目标蛋白质的检测。由于每个蛋白质分子含有大量的d n a 片段结合在纳米粒子上，检测信号从而得到放大。其中，p s a 的检测浓度为 1 0 一 m o l l 。此外，用类似的方法也可以检测浓度为1 0 。m o l l 的d n a 1 2 2 】。s t o e v a 等 1 2 3 建立了s i 晚纳米粒子为核、表面为a u 、内部为f e 。仉的三层复合磁性纳米粒 子探针分析d n a 。三层复合磁性纳米粒子通过氨基修饰的s i 也纳米粒子静电吸附 1 5 上海师范大擘硕士擘住论文 1 5 r i m 带负电的f e ，n ，然后再吸附卜3 n m a u 纳米粒子，加入h a u c i 。还原得到。 基于磁性纳米粒子自聚时独特的磁性质，即在自聚集过程中，磁性探针和目标 形成稳定的纳米结构，磁性纳米粒子作为磁性弛豫开关，延长周围水分子的自旋一 自旋弛豫时闯。w e i s s l e d e r 小组设计了纳米磁传感器，通过核磁共振或磁共振成像 测量技术，应用于d n a 、蛋白质、酶活性和病毒等生物分子检测中 1 2 4 - 1 2 8 。这种 检测技术可用于研究d n a d n a 、d n a 一蛋白质、蛋白质一蛋白质、蛋白质一小分子间互 相作用和酶反应。由于磁信号不受被分析物介质的混浊度影响，该种基于磁性的检 测手段适用于在活有机体中进行。 g r a h a m 等 1 2 9 设计基于磁性电阻的传感器用于高灵敏分析识别检测和生物芯 片测定d n a 1 3 0 。一种基于磁性光弛豫的液相免疫技术用于单克隆和多克隆抗体的 测定 1 3 1 。在荧光染料或放射性核索标记的磁性载体表面偶联上抗体或抗原，制 成一种磁性探针，用超导量子干涉仪和磁诱导双折射，可以方便快速的对标本中的 抗原或抗体进行定性、定量测定 1 3 2 ，1 3 3 。 1 2 5 核壳型磁性纳米粒子在生物医学中的应用 在生物医学领域，氧化铁磁性纳米粒子作为m r i 造影剂、细胞标记和示踪剂的 到广泛应用 2 5 ，1 3 4 ，1 3 5 。最常用的氧化铁磁性纳米粒子造影剂大小为8 0 1 5 0 n m 。 为了增加特异性，许多生物分子像单克隆抗体、蛋白质、小分子多肽等键合在磁性 纳米粒子表面与细胞或细胞表面的受体特异性结合。氧化铁磁性纳米粒子作为m r i 的造影剂可以区分健康的和病变的组织。例如肝肿瘤的诊断，正常肝细胞吸收氧化 铁磁性纳米粒子后使影像变黑，肿瘤细胞排斥氧化铁磁性纳米粒子从而在组织中产 生亮点。 磁性纳米粒子在医学成像上的一个成功应用是特异性细胞示踪。氧化铁磁性纳 米粒子标记体系已用于监控干细胞迁移 1 3 6 - 1 4 0 和追踪淋巴细胞 1 4 1 ，1 4 2 ，对于 细胞移植提供有效的手段。 】6 上海师范大学硕士擘位论文 生物分子修饰的磁性纳米粒子促进了特定的m r i 探针靶标应用于脑瘤诊断 1 4 3 ，实现了基因表达 1 4 4 1 和t 细胞 1 4 5 及源细胞迁移的实时监测。n i t i n 等 7 3 设计了多功能磁性纳米粒子探针体系，荧光染料得克萨斯红和能渗入细胞的多肽链 结到超顺磁性纳米粒子表面的磷脂上，探针被释放到细胞中，得到荧光显微镜图和 m r i 。这种集体内释放、目标物监测、信号转移、信号传输等多功能的磁性纳米粒 子探针将在疾病的诊断上更准确，磁性纳米粒子探针将在医学成像中扮演主要角 色。 1 3 实验方法和表征手段 随着纳米技术不断地向生命科学中的渗透，纳米材料在生命科学中的应用越来 越引起人们广泛的兴趣，越来越多材料和生物的研究方法和技术结合起来。例如： 表面增强拉曼光谱在核酸分析中应用，凝胶电泳法对纳米粒子d n a 复合物的分析 等。这里将本论文所涉及到的部分实验方法和表征手段简要综述如下： 1 3 1 反相微乳液法 微乳液法是利用两种互不相溶的溶剂在表面活性剂的作用下形成一个均匀的乳 液，从乳液中析出固体，这样可使成核、成长、聚结和团聚等过程局限在一个微小 的球形液滴内，从而形成球形颗粒。微乳液通常由表面活性剂、助表面活性剂( 通 常为醇类) 、油( 通常为碳氢化合物) 和水( 或电解质的水溶液) 组成透明的各向 同性的热力学稳定性体系。其中反相微乳液是指油包水( w o ) 型乳液，即水相分 散在油相而形成微小的不连续的“水池”，其大小可控制在几十到几百个埃之间。 纳米粒子的微乳液制备方法正是利用微乳液的“水池”作为“微反应器”，从而达 到控制纳米粒子的粒径和形状 1 4 6 。 1 3 2 穆斯堡尔谱 穆斯堡尔效应是一种共振吸收，其基本原理是，固体物质的激发态原子核发射 的y 射线有一定的几率会被固体中的同种核的基态共振吸收，并使基态核跃迁到激 1 7 上海师范大学硕士擘位论炙 发态，且共振吸收线宽接近于核激发态平均寿命所决定的自然线宽。这种原子核y 射线的无反冲发射及共振吸收效应，也可以称为y 射线零声子发射及共振效应或y 射线的共振荧光现象，叫做穆斯堡尔效应。由于该共振线非常窄，对y 射线能量的 细微变化十分敏感，因此可以利用这一效应来探测由于共振吸收原子核附近的物理 和化学环境变化而引起的共振y 射线能量的细微变化。目前，穆斯堡尔效应已发展 成为自然科学中非常有效的实验方法之一。 1 3 3 表面增强拉曼光谱( s e r s ) 光散射是物体除吸收和反射外的又一类重要的光学现象，分为表面散射和体内 散射。其中表面散射在本质上与反射相同，是由于物体表面的不平整所引起的；而 体内散射是由于物质内部的颗粒( 包括分子或原子等) 所引起的，因此与材料的物 性有密切关系。体内散射分为弹性散射和非弹性散射两类。其中弹性散射的散射光 频率与入射光频率相等，根据引起散射颗粒的大小可分为延得尔散射和瑞利散射； 而非弹性散射的散射光频率与入射光频率不相等，这一现象是印度物理学家拉曼于 1 9 2 8 年发现的。但是一般拉曼光谱的强度较弱，很难得到理想的生物分子的拉曼光 谱图。1 9 7 4 年f l a i s c h m s n n 等人在研究吸附在氧化还原循环方法( o r c ) 粗糙化的 银电极表面上物质时，首次观察到拉曼光谱的强度增加了1 0 5 1 0 6 倍，这种现象称 为表面增强拉曼散射( s e r s ) 自首次报道s e r s 以后，人们发现在很多其它金属 ( 如金、铜以及铂等) 的粗糙表面也具有s e r s 。这样，s e r s 为表面分析提供了一 种极为有效的研究手段。同时人们对表面增强的机理也进行了大量的研究，目前一 般认为主要存在两种形式的增强机制：电磁增强和化学增强。不过因为s e l l s 的增 强机制非常复杂，这两种机理都只能解释部分实验事实，迄今为止，还役有种能 被普遍接受的可以解释所有实验现象的理论。但这并不妨碍s e r s 技术的广泛应用。 s e r s 技术因其具有灵敏度高、不易受水干扰、结构信息量大、测量速度快并且能 够实施现场检测等一系列的优点而广泛应用于各个领域 1 4 7 ，1 4 s 1 。 1 8 上海师范大学硕士掌住论文 自从1 9 7 9 年，k o g l i n 和s e q u a r i s 1 4 9 - 1 5 1 最早研究了核酸碱基和d n a 在银表 面和银溶胶中的拉曼光谱，至今已对核酸组分进行过一系列的报道。熊键和盛蓉生 【1 5 2 ，1 5 3 1 等在银基体上获得了5 一氟尿嘧啶、5 氯尿嘧啶和5 溴尿嘧啶等腺苷衍生物 的s e r s 谱，并与尿嘧啶的s e r s 谱作了比较；龙耀庭 1 5 4 ，1 5 5 等报导了吸附在化 学沉积银膜上d n a 碱基的增强拉曼光谱；o t t o 1 5 5 研究小组测定了单链d n a 的增 强拉曼光谱，但不够理想；l e e 1 5 6 1 等则用银溶胶研究了胞嘧啶及其1 ，5 二甲基 衍生物在银表面的吸附状态。方晔1 1 5 7 等研究了双螺旋d n a ( d ( a g ) 8 d ( c t ) 8 ) 在 银和金电极表面上的增强拉曼光谱及其s e r s 信号的强度和位置随电极电势的变化 规律。g e a r h e a r t 等人用s e r s 研究了寡聚脱氧核苷酸在金电极上的吸附性质 1 5 8 ， p e r e z m e n d e z 研究小组用s e r s 研究了吸附在银纳米粒子上的聚乙烯亚胺与d n a 的作用【1 5 9 1 ，b x e u z a r d 则用s e r s 研究了溴非乙啶与d n a 的相互作用 t 6 0 l ，g r a h a m 等人用s e r s 对d n a 进行了定量的研究 1 6 1 ，我们实验室1 1 6 2 1 6 5 也对a m p 、 d n a 的银溶胶拉曼光谱以及核酸在银电极上的增强拉曼光谱和电位的关系进行了 研究。 1 3 4 凝胶电泳法 1 9 3 7 年，瑞典的t i s e l i u s 最早建立并使用电泳技术，他成功她将血清蛋白分 成五个主要成份。目前，随着电泳技术的不断进步，它已成为生物化学、分子生物 学和化学生物学研究工作中不可缺少的工具，被广泛应用于生物大分子如蛋白质、 酶、核酸的分离和性质的研究。它的基本原理是荷电分子在电场的作用下，向着与 其电荷相反的电极移动。常用泳动度( m ) 表示带电颗粒在单位电场中泳动的速度： m ，! 。盟。些 ev lv t 式中v 为荷电分子的移动速度( t ；t l l s ) ：e 为电场强度( v c m ) ；d 为荷电分子的泳动 距离( c m ) ；l 为支持物的有效长度( c m ) ；t 为通电时间( s ) ；v 为加在支持物两端的 1 9 上海师范大学硕士雩住论文 实际电压( v ) 。 影响泳动度的因素有两个方面，一方面是待分离物质本身的结构和性质，如待 分离物质的荷电性质、质量以及颗粒形状；另一方面是电泳条件，即外部因素，包 括支持介质，溶液介质和电场强度等三个方面。 应用较为广泛的有琼脂糖凝胶电泳和聚丙烯酰胺凝胶电泳【1 6 7 】，本实验采用琼 脂糖凝胶电泳。琼脂糖凝胶具有较大的孔径，因而适宜于较大分子的电泳分离。电 泳时，不同类型的琼脂糖凝胶具有不同的分辨能力。琼脂糖浓度一般在0 3 - 6 的 范围内，较低浓度的琼脂糖凝胶适合于较大分子的电泳分离，较高浓度的则有利于 较小分子的分离琼脂糖凝胶除能分辩不同分子量大小的d n a 外，还能分辩分子 量相同但构型不同的d n a 1 6 8 1 7 1 。例如电泳实验表明，在t a e ( 三羟甲基氮基甲 烷t r i s ，醋酸，e d t a ) 缓冲体系中，电泳速度次序如下：超螺旋d n a ( s u p e r c o i l e d d n a ) 线型d n a ( l i n e a rd n a b 开环的双链d n a ( n i c k e dd n a ) ；而在t b e ( t r i s ，硼 酸，e d t a ) 缓冲液中，其电泳速度次序为：超嫘旋d n a 开环的双链d n a 线型 d n a 。 1 3 5 聚合酶链式反应( p c r ) p c r 是目前分子生物学实验室中常用的技术，也广泛应用于医学中的i 临床诊断。 p c r 技术有助于鉴定某一特定d n a 片断，它能按照某一特定0 n a 片断的序列在短时 间内精确地复制成千上万的d n a 片断，使非常稀有的实验所需的遗传物质变得非常 丰富。 p c r 技术的原理与细胞内发生的d n a 复制过程十分类似。首先是双链d n a 分子在 高温下加热变性成两条单链d n a 分子，然后d n a 聚合酶以单链d n a 为模板并利用反 应混合物中的4 种不同的脱氧核苷三磷酸( d n t p s ) 合成新的与单链模板d n a 互补 的单链d n a 。显然，d n a 聚合酶需要有- d , 段双链d n a 来启动引导新链的合成。因 此，新合成的d n a 链的起点，是由反应混合物中的一对寡聚核菅