（植物学专业论文）高山红景天中的红景天甙、甙元酪醇、香豆素的生产工艺.pdf

摘要 本项研究应用先进的技术，对高山红景天的有效成分红景天甙、甙元酪醇、香豆索 的生产工艺路线进行改革，经过大量的探索和尝试总结出一条经济高效的工艺路线， 不仅提高了生产技术水平和质量控制水平，而且得到高质量、高附加值的高山红景天系 列产物。 研究依据高山红景天中各成分的性质差异，应用超临界c o ：萃取技术、大孔树脂吸 附纯化技术、高效液相色谱分析等先进的提取、纯化及分析技术，分别对各有效成分提 取、纯化、分析的工艺条件进行研究探讨，得出一套完整高效的工艺路线，实现了高山 红景天中有效成分香豆紊、红景天甙、甙元酪醇的有效分离，产物中红景天甙和甙元酪 醇含量达8 0 以上，共收率达0 3 5 ；香豆素含量达2 4 ，收率达8 9 6 。以上三个产物的纯 度和收率均达到产业化的最高水平，该研究成果为高山红景天类药物形成系列产品，开 发新药奠定了基础。 ， 该课题研究所得的高山红景天系列产品的生产工艺，现已经成功通过中试放大，中 试结果进一步证实该生产工艺是确实可行、经济高效的，所得产物附合中药现代化对中 药产品提出的质量要求，该研究成果有很广阔的应用前景7 ， 关键词：高山红景天；超临界二氧化碳萃取；树脂吸附；红景天甙：甙元酪醇；香豆素 高效液相 a b s t r a c t w eu s e dt h ea d v a n c e dt e c h n i q u e st or e f o r mt h ep r o d u c t i o np r o c e s sf o rt h e e f f e e t i v ec o n s t i t u e n t so fz h o 出o l as a c h a l i n e n s i s ：e o u m a r i n s a l i d r o s i d ea n d p - t y r o s 0 1 a f t e rl o t s o ft e s t s ，w ea c q u i r e da ne c o n o m i c a la n dh i g he f f i c i e n t t e c h n o l o g i c a lr o u t et h a tn o to n l yi n c r e a s e dt h et e c h n o l o g i c a ll e v e l t op r o d u c e a n dt h el e v e lt oc o n t r o lt h eq u a l i t yb u ta l s og a i n e ds e r i a lp r o d u c t sw i t hh i g h q u a l i t ya n dh i g ha d d e dv a l u e a c c o r d i n g t o q u a l i t y d i f f e r e n c eo fd i f f e r e n tc o n s t i t u e n t so f 肋。出o l a s a c h a l i n e n s i s , w eu s e d a d v a n c e dt e c h n i q u e s s u c ha se x t r a c t i o nt e c h n i q u eo f s u p e r c r i t i c a lc a r b o nd i o x i d e p u r i f i c a t i o nt e c h n i q u eo fr e s i n o u sa d s o r p t i o na n d a n a l y s i st e e h n i q u eo fh p l ct of i n do u tt e c h n o l o g i c a lt e n d i t i o n so fe x t r a c t i o n ， p u r i f i c a t i o n ，a n da n a l y s i s w e a c q u i r e d a c o m p l e t e a n d h i g h e f f i c i e n t t e c h n o l o g i c a l r o u t ea n d i m p l e m e n t e d e f f e c t i v e s e p a r a t i o n o fe f f e c t i v e c o n s t i t u e n t so fr h o d i o l as a c h a i i n e n m s ：c o u m a r i n s a lt d r o s t d ea n dp t y r o s 0 1 t h e c o n t e n to fs a l i d r o s i d ea n dp t y r o s 0 1i nt h ep r o d u c tc o u l dr e a c hm o r et h a n8 0 a n dt h et o t a ly i e l de f f i c i e n c yw a s0 3 5 ：t h ec o n t e n to fc o u m a r j ui nt h ep r o d u c t r e a c h e d2 4 a n dt h ey i e l de f f i c i e n c yw a s8 t h ep u t i t ya n dy i e l de f f i c i e n c y r e a c h e dt h eh i g h e s tl e v e lo fm a s s p r o d u c t i o n t h i sr e s e a r c ha c h i e v o m e n to f f e r e d ab a s i sf o rr h o d l o i as a c h a l t n e n s i sm e d i e i n et of o r ms e r i a lp r o d u c t sa n df o rn e w m e d i c i n et ob ed e v e l o p e d t h ep r o d u c t i o np r o c e s so fs e r i a lp r o d u c t so fr h o d i o i a s a e h a 抽e n s l sb a s e do nt h i sr e s e a r c hw o r kh a sb e e ns u c c e s s f u l l ym a g n i f i e db y s i p l a n tt e s t t h es u c c e s so fs e m i p l a n tt e s tf u r t h e rp r o v e dt h a tt h i sp r o d u c t i o n p r o c e s sw a sf e a s i b l e e c o n o m i c a la n dh i g he f f i c i e n t t h ep r o d u c t sc o i n c i d et h e r e q u i r e m e n tf o rq u a l i t yt h a tm o d e r n i z a t i o no fc h i n e s ed r u g sr e q u i r e d k e yw o r d s ：r h o d i o l as a c h a l i n e n s i s ； r e s i n o a sa d s o r p t i o n ；s a l i d r o s i d e c h r o m a t o g r a m ( h p l c ) e x t r a c t i o no fs u p e r c r i t i c a lc a r b o nd i o x i d e p t y r o s o l ；c o u m a r i n ；h i g h p r e s s l i q u i d 高山红景天中的红景天甙、甙元酪醇、香豆素的生产1 艺 1 绪论 1 j 国内外中成药的发展及我国中药现代化的方针 1l 1 中成药在我国的研究及发展现状 人类为r 维护身体的健康和生存繁衍舀：获取食物和与疾病作? l - 争的川时，出发现 j 治疗疾病的植物药草和些动物、矿物。丛l 咖“药食同源”之说已得公认。随着 知识的逐步积累和生产工具的不断改进，医药逐步走上了科学的境界。在历代医药学家 4 ；断总结临床经验的基础上依靠相应的加工方法，根据病情的需要制备成随时可以应 用的剂型。由于沿用传衍继承的成方制各而成适应范围较广。具备一定质量规格成 为可以批量生产供应的药物，所以称为“成药”，为有别于西药，故称为“中成药”“。 中成药起源于我国，经历了夏、商、周、秦、汉、隋、唐、宋、元、金、明、清、 民国时期的发展，在剂型和临床经验上取得了显著成绩，并且建立了严格的药事管理制 度。从新中国成立以来，中成药的发展有了一个新的飞跃，在剂型的开发上二除继承传统 剂型并改进工艺以提高质量外，又研制了新的剂型，提高了疗效且节约了原药材。在 药事管理方面，建立一系列药政和药检机构，组织编写了中药辞海、全国中成药 处方集等著作，全国中成药生产厂家已发展到8 0 0 多家，生产品种达4 0 0 0 多种，剂型 4 0 多个，出口量日渐增多，很多新技术、新设备己在中成药生产中广泛应用，例如分析 技术u v 、i r 、n m r 、m s 、r a c 、x - r c a 、t l c 、g c 、h p l c 、d o t l c s 、i s e 、电子显微镜、同 位素技术等，还有薄膜浓缩、离心薄膜浓缩、反渗透法浓缩、喷雾干燥、离心喷雾干燥、 沸腾干燥、微波干燥、红外线干燥、冷冻干燥、真空干燥、电离辐射干燥、高频电流干 燥等浓缩干燥新技术应用于中成药生产中，大大提高了产品的质量和经济效益“。建国 以来中医药学在我国的发展不s 忽视，但纵观全球，我们还存在着很多不足，我国的 中药研究机构较分散，科研方面缺乏统一的领导和统一标准，阻碍了中药在我国的发展。 目前有相当一部分中药生产厂家的生产设备和设施比较陈旧，产业化工程技术仍较为落 后设备条件还达不到先进工艺的工程化要求，仍处于高消耗、低效益的生产经营状况 应用现代科技尽快改善中药研究和生产的状况，赶超国际水平，是中药工作者面临的艰 巨任务。 随着现代科技的飞速发展，从中草药中分离出众多的有效成分有些有效成分已成 为现代医学治疗疾病的重要工具。为了病人的用药方便和更有效地治疗疾病，应用中药 有效成分治疗疾病成为现代中医药发展的趋向，因此目前中药有效成分的提取分离和 临床应用成为中医药研究发展的重要内容。 i i2 中成药在国外的研究及发展现状 中成药在东方国家的发展也引起西方国家对中医药学的重新评价和重视，开始形 成了中成药的国际市场。国外中成药研究的动向：( 1 ) 成方配伍的研究( 2 ) 成方之中 寻找有效药物( 3 ) 改变配方和刨制新品种( 4 ) 提倡开发中西结合的产品( 5 ) 从中成药 成分分析中开发新药“。 日本是应用中药最早和最普遍的国家，也是中药研究和发展最先进的国家之一，日 本的汉药和中成药虽然不同但没有本质的区别。日本全部药材的8 0 用于生产中成药 尔北林、”大学砸，1 学位f t 仑z r 刚汉方制剂j目前臼雄何2 彩自i 叶z 药f 其q ，成药 一的1 艺比较先进j 一仃c c 势。削按倒际f ， ( 药品生产使赝董管理州范) 柯、准蛭求进i j 生产，小仪好个h jj ：郜n ：毗确圳j e 的责仟者向日从药叫进j 列成品 h f 的争部乍产过程都有严格的挣制折杯 【l 求n 多m 、节，只要其中有个蚪节发生茸锚全部牛一过程就要重新返i 。为j 咚阜 减少和消除生产过程中的差错亿主要生产环节卜较普遍采用电子计算机和电视监视进 行数据分析、处理和控制生产上基本实现了自动化。日本的巾药研究机构遍及全圈， 所有中药企业都是开发型企业犬多数中药研究机构都已根据g l p ( 药品实验规范) 要 求重新装备和改造配备了现代化的仪器、设备和相应的分析、药埋、毒理部门。纵观 日本二十年来天然药物的研究进展有以f 几个特点： r i ) 研究工作有绍织、育部署、 百分工、有协作、注重统一化、标准化、社会化。2 ) 在制剂的研究中，尊重传统理论 以煎剂作对照，在工艺过程中注重工业生药成分的动态研究。( 3 ) 传统医药理论的研究 与现代科学手段相结合，对成方、制剂进行药教学、药理学及临床应用再评价。( 4 ) 不 只顾眼前利益，注重基础研究及科学论文的深度、广度和系统性。( 5 ) 质量的研究不仅 从分析入手，而且从生产的环节就加强g m p 管理，并且注重产品在保存、流通和使用过 程中的信启、反馈“。 朝鲜也是受我国中医药影响最早的国家之一其国内医疗用中药与西药之比达7 0 ： 1 0 0 。泰国约有8 0 0 多家中药厂规模和生产方式同我国以往的前店后场相似，设备简陋， 基本上靠手工操作”“。菲律宾和越南也具有和我国中成药相同的中药厂，苏联和法国早 已开展对中药的研究，目前已具相当规模。 美国是接受中医药最迟的国家，近年来美国医药学界对中医药有所重视。按照美国 f i ) a ( 食品药物管理局) 对“药品”的严格管理要求，我国中成药目前只有少数能达到其 要求的化学、药理、临床等指标，这无疑为中成药争取美国市场提供了新的挑战“。 1 1 3 我国中药现代化的方针 人类生活条件生存环境的变化，使人类身心疾病增加，对医疗模式提出新的要求， 由单纯的疾病治疗变为预防、保健、治疗、康复相结合的模式，在人类“回归自然”的 潮流中天然药物越来越受人们青睐。 目前国际社会对天然药物的需求日益扩大而我国中药生产厂家大多处于规模小， 生产条件简陋技术工艺落后使中药材的有效成分流失严重浪费了我国中药资源， 而且成药质量标准不完善，产品质量不够稳定，与国际化水平差距较大制约了我国中 药产品进入国际市场。据统计，我国年出口中药仅占6 亿美元左右，其中药用植物药材 的比例高达7 0 以上，技术刚加值较高的中成药尚未能占主体，而且出口产品中传统剂 型占主导地位。为了改变中药传统剂型“大、黑、粗”的状态，对中药的制备加工工 艺提出了更高要求，其中中药有效成分的提取分离过程是其重要的关键环节，引进一些 实用的高效新型的提取分离技术已成为新的发展趋势和关注重点，为此国家提出“中药 现代化发展战略”号召广大医药研究者充分开发并利用国内外高新技术，如超临界萃 取技术、树脂吸附技术、膜分离和浓缩技术、喷雾或冷冻干燥技术等等，对中药的提取、 分离、精制等技术进行改造，提高我国中药生产的技术水平和质量控制水平生产出高 质量、高附加值的中成药产品，早日实现中药现代化与国际市场接轨”“。 向山红景凡t o 的兰1 毓天甙、甙兀酪醇、香s 参的乍f o 艺 随肴国阳、问合作日趋频繁中约走向世界足j ! 1 1 剧医药7 t 仃发展的必然趋辨，我的 “叶i 药现代化疗针”告诉j 1 人医药j 作者婪走出传统中药的“人、黑、料i 的：陡念，就 必须充分利刖吲内外的高新技术改造我们的提取分离i 艺，提高中药的质量拧制手段 这足中药现代化、中药走向世界的关键州、竹和必 | j 之路。 1 2 药j l j 植物高红景天 高山红景灭( r h o d i o l as a c h a l m e n s i sab o r ) ，又名幻景人，库贝红景入足景大科 ( c r a s s u l a c e a e ) 2 l 景天属( r h o d i o l a ) 的多年生草本植物或哑灌术楠物，常具肉质、匍匐 的根状茎，民间多以此药用。 红景天属植物全世界有9o 种，分布于东亚、中亚、两伯利亚及北美地区，我国有7 0 多种，分布于东北、西北、华北及西南，除少数生长于海拔2ooo 米左右的高l i l 草地， 林下灌丛或沟旁岩石附近外，大部分的种生长于海拔3500 5oo0 米左右的石灰岩、 花岗岩、山地冰川、山梁草地或山谷岩石上，常几十平米一片片密集生长，很少零星分 布。红景天植物能在极其恶劣的环境中生长，如低温、干燥、狂风、强紫外线照射、昼 夜温差大等，这就意味着它已经从遗传上适应了高寒多变的恶劣环境或具备了其它植物 所没有的特殊适应性的物质”“。 1 2 1 高山红景天研究进展 1 2 1 1 高山红景天化学成分研究 红景天化学成分很丰富也很复杂，国内外对红景天属植物做过化学成分研究及测试 的有2 0 多种。从这些植物中分离出4 0 多种化合物，主要有9 大类成分：香豆素类、黄 酮类、甙类、生物碱类、无机元素、氨基酸类、纤维索类、淀粉类、维生素类。红景天 甙是研究的最多已知有效成分，也是最明确的。红景天甙、甙元酪醇及二甲苯基六氢吡啶 都是经过药理研究证明有特殊生理功能的有效单体。然而对于非甙类成分研究较少， 作为有重要应用价值和经济价值的高山红景天资源，其基础化学及其生物学特性研究欠 缺，还有相当大的研究和利用潜力有待积极研究开发“。 1 2 1 2 高山红景天药理和药效学研究 根据袁文学、张汝学等l 、程秀娟等“、孙非等等的报导，发现红景天甙元酪 醇具有增强戊巴比妥钠催眠的作用；高山红景天多糖能降低正常小鼠血糖、肝糖元和血 总脂，对四氧嘧啶、肾上腺素和葡萄糖所引起的小鼠高血糖均有抑制作用。 关于红景天甙的药理功能及生理功能已有很多资料报道，总括起来有如下几个方面： 抗缺氧、抗疲劳、抗微波辐射、抗毒等抗性作用；还具有对神经系统、内分泌系统的调 节作用和双向调节作用；延缓机体衰老、防止心血管疾病、抗肿瘤以及多种老年性疾病 的作用1 。 1 2 1 3 高山红景天有效成分提取、分离及含量测定的研究 1 2 13 1 高山红景天有效成分的提取与分离 红景天甙( s a l i d r o s i d e ) 为红景天的主要有效成分，分子量为3 0 0 。卢希贤等”“ 报道了用逐步萃驭，后上a 1 2 0 3 柱，提取和分离红景天甙的方法：葛永潮。1 采用了依次过 聚酰胺、大孔吸附树脂、硅胶、葡萄糖凝胶四种柱进行层析的方法，从红景天提取物里 分离制备红景天甙：杨智蕴等1 用大i l 吸附树脂柱和硅胶柱获得红景天甙：谷会岩“进 东北林、止大学硕 f jj 高山红景天甙提取工艺的初步研究。 l2ix2 音川j 红景天有效成分含量测定的明究蜕状 明海泉。”以岛津( 1 s9 1 0 般波长薄层扫描测定自景大。 j 红景大甙的含最测得久佗 红景尢- r 红景天甙的含量为l2 ：四裂红景天中红景夫甙含量为j 1 。安丰等根据纠 景人甙任2 2 38 n m 波长处具有最大吸收，用薄层层析紫外分光光度法测定了8 种红景天 属植物中的红景天甙的含量，红景天甙的含量随品种、产地、采集时间不同而有所变化， 所测8 种植物红景天甙的含量变化为0 i - 17 3 。周燕等j 用反相高效液相色谱法测定 r 红景天口服液中红景天甙的含量，结果表明该方法回收率高，可信性好。彭江南等”“用 高效液相色谱法测定了红景天中红景天甙的含量，采用h y p e r s y lo d s 柱，水一甲醇乙腈 ( 7 0 ：2 5 ：5 ) 为流动相。实验表明，该法易于操作测定结果可靠。包文芳等”1 采用高 效液相层析法，对四种国产野生红景天根茎中红景天甙的含量进行了定量分析。杨意”“ 也用高效液相色谱法进行了高山红景天中红景天甙含量差异的研究。此外，王曙等0 1 、 邓昌国等“”1 ，分别用h p l c 法、比色法对红景天进行了研究。 1 2 2 高山红景天的应用概况 王中风等。1 报道原苏联将红景天定为“适应原”药物，己制成红景天浸膏、针剂等 多种制品。作为宇航员、飞行员、潜水员、运动员等特殊职业的保健品。 孙世国以红景天为主要原料制成的不含酒精但具有酒类欣快感的饮品，可以提高 工作效率又有益于健康。 盂兆海报道吉林东风制药厂己研制出高山红景天口服液；沈阳飞龙集团的延生护 宝液也是以红景天为原料：辽宁抚顺安怡天然药物厂生产的红景天口服液，其有效成分 主要是红景天甙。 红景天食品的开发刚刚起步，在这方面既可制成袋装泡茶，又可以粉末的形式添加于 糖果或面制品中。由于红景天有抗紫外辐射和延缓衰老的作用，开发研究红景天化妆品 也大有前途。 1 2 3 高山红景天其它方面的研究概况 1 2 3 1 高山红景天生物学特性的研究 祖元刚等1 、傅立国”。”研究了濒危植物高山红景天种群数量、分布状况、濒危程 度等，并提出应立即采取紧急措施加以保护。 秦佳梅等”、黄德昌等“”对长白山高山冻原带高山红景天的生态环境及分布状况、 植物学特性、红景天生育期对气候条件的要求及自然更新状况进行了调查。 秦佳梅等。1 研究了高山红景天与其它几种红景天的形态特征区别，从根、茎、叶到 花、果实、种子均详细描述，以利于栽培过程中加以区分，提高药材纯度。 王西芳等”1 介绍了几种红景天属植物的形态特征区别。 1 2 3 2 高山红景天引种栽培技术研究 7 0 年代红景天在苏联阿尔泰山区进行人工栽培取得成功( r e v i n o ，1 9 7 5 ) ”1 ：1 9 8 6 年 我国吉林省通化地区、临江林业局和沈阳药学院等地区和单位引种成功，现已在临江、 通化、长白县等地大面积栽植。 孙世国等”1 、秦佳梅等”1 研究了高山红景天驯化栽培中种子处理方法，描述了种子 4 高山红景天中的 f 景天甙、甙元酪醇、香豆素的生产1 艺 一_ _ _ _ + _ _ h - ，h _ m - _ _ - ，_ ，一 形态，种子体h 民类型以及种子休眠力式。 秦任梅等5 1 利用红景夭多年生植楝的根茎为材私 进彳丁r 无肚繁殖试验，提出一 种繁晴，j 法：分株繁殖、根摹繁哨、潜伏芽繁殖，成活率均很高，可广泛应用于t 产， 川州对嫩技扦捅硬原条繁殖也进行r 试验。 此外，张弓等“、姜明兰等“、刘声远等“、张卫东等“分别从组织培养、细 胞培养、酶类、生长等方面对红景天进行了研究。 i23 ： 病害方面的研究 张宝莹“】、蒋文春等“对人工引种栽培的高山红景天根腐病病原菌进行了分离搽 定敛病性测定抑菌试验及田间药剂试验。 i 23 4 高山红景天生态学研究 祖元刚”、唐艳1 、颜廷芬。、王玉杰“7 分别从保护、生殖、遗传、生理生态学方 面进行了研究。 1 3 课题的目的、意义及理论与技术经济价值 高山红景天为多年生草本植物，民间多以根茎入药，有“神草”之称。高山红景天 是近几年发现的具有与人参，刺五加相同的“适应原样”作用的药用植物，现在研究证 明其中含有的有效成分为红景天甙( s a l i d r o s i d e ) 、甙元酪醇( p - t y r o s 0 1 ) 、香豆素 ( c o u m a r i n ) ，此外还有2 0 多种氨基酸和鞣质、蛋白质、黄酮类及微量挥发油和人体所 必需的铁、铝、锌等1 0 余种微量元素。红景天多生长于海拔1 7 0 0 - - 2 5 0 0 m 之问的地区， 纯天然，无污染，又无人参的过度兴奋及刺五加的致便秘的副作用，却具有兴奋智力、 抗疲劳、抗衰老、抗缺氧、抗微波辐射、抑制肿瘤、双向调节等作用，可增强记忆，提 高工作效率，延缓机体衰老，防止老年疾病等，是很有发展前途的环境适应药物，可广 泛用于深海、极地、沙漠、航空、运动等特殊环境作业的保健品，在军事医学、航空医 学、运动医学等领域具有十分重要的应用价值“”“。 我国对于高山红景天的应用已有悠久历史，远在清代，就把高山红景天作为滋补强 壮药。然而，对高山红景天化学成分的研究最早始于5 0 年代的前苏联，6 0 年代前苏联 学者s a r a t i k o v 等人o o “对高山红景天有效成分的提取方法进行了研究。我国从8 0 年代起才对高山红景天给予足够重视，但研究其人工栽培、组织培养、生理生态、分子 遗传、化学成分分析及含量测定的较多：虽然卢希贤等人也对红景天甙的提取进行了研 究但这些研究均属于实验室的，j 、试研究，中间试验尚未展开。当今，各种红景天产品， 如口服液、饮料、药酒、食品等种类繁多；此外，我国西藏地区和美国某公司合作，以 西藏红景天为原料生产了片剂、胶囊、颗粒剂等药物，但都是一些粗提物产品，有效成 分含量极低。为了适应中药现代化发展的要求，顺应国际医药发展的趋势，尤其为使中 药产品打入国际市场，在国际市场上具有较强的竞争能力，开展对其有效成分提纯及中 间试验的研究，以期进行产业化生产，是当今中医药科研工作者的重要而紧迫的任务 直接关系到我国中医药事业的发展前景。我室拟在对高山红景天药用有效成分进行提取、 分离、纯化的基础上，找到最优化的提取工艺参数，并投入中间试验，使高山红景天的 药用价值晟大限度地发挥出来，并能尽早占据国际市场。 在我国即将跨入世界贸易组织大门，逐步与国际经济接轨的今天，传统的中药也越 东北林业大学硕士学位论z 求越面临着严峻的挑战，中药跨出国门走向国际市场已势在必彳亍，我国许多有关专家对 此进行了多方面的研究，取得r 很多成就，但也发现了许多问题如：天然中药资源大 量减少栽培药材存在农药超标的问题；由于环境污染严重，不管是天然还是栽培的药 材均存 重金属超标的问题；此外，我国在中成药提取方法上还是主要以传统方法为手， 提取出来的中成药成分复杂，有效成分不明确而且含量比例较低，很难打入国际市场。 随着近2 ( j 年以超临界流体作为一种分离技术超临界萃取技术( s c f e t ) 的提出和 应用，为我国医药工业存在的以上问题提供了新的思路也为食品工业、化妆品及香料 【业、生物工程、环境治理、材料加工等方面提供了新的方法。 我实验室以中药产业化为原则以中药产品走出国门，占领国际市场为目标以几 种中药材为主进行了多方面的研究，高山红景天是其中的一种。我们首次把超临界c 0 2 萃取技术应用到高山红景天有效成分的提取、分离，并将从小试到中间试验形成一套完 整的工艺，这在高山红景天有效成分的提取、分离方面将开创国内先例。因为以往的研 究中部在实验室水平或小试阶段，而且也没有把超临界c 0 2 萃取技术应用于此。这套工 艺如果成功将为我国中药产业化、工程化，进而为解决传统中药走出国门难的问题提供 一个新思路、新方法。因此，本研究不仅具有很大的应用价值，而且具有更重要的理论 技术意义。 2 应用二氧化碳超临界萃取技术提取红景天甙、甙元酪醇和香豆素 的研究 红景天甙和甙元酪醇是高山红景天的主要有效成分，近年来倍受科研工作者重视， 也是现今研究最多的高山红景天的次生代谢产物。药理实验表明，红景天甙及甙元酪醇 的作用基本一致，主要表现在以下几个方面：抗缺氧、抗疲劳、抗微波辐射、抗毒等抗 性作用：还有对神经系统、内分泌系统的调节作用和双向调节作用；延缓机体衰老、防 止心血管疾病、抗肿瘤及多种老年性疾病的作用：对物质代谢的影响方面红景天甙及甙 元酪酵可以延长肌肉负荷时间，促进蛋白质分鳃。 很多研究已证明香豆素类物质( 香豆素、7 羟基香豆素、东莨菪亭) 是高山红景天 的有效成分。本类物质如：番豆素( c 扎o d 对人类和动物的生理活性是多种多样的，主 要表现在抗菌消炎作用、平滑肌松弛作甩、抗凝血和止血作甩、对中枢神经系统的作用 以退热作用最强，并有安眠和镇静等抑制作用、同时研究表明香豆紊对动物有一定的毒 性，其中最大的是对肝脏的毒性。同时也是很好的香料。也可作为染料和光学增光剂。 2 1 超临界二氧化碳萃取技术及夹带剂的作用 2 1 1 超临界二氧化碳萃取技术概述 超临界流体萃取技术是近几年发展起来的对环境污染小的新型化工技术，它广泛应 用于食品、化工、制药等行业，该技术的发展符合当前综合利用工艺工程中无污染工艺 6 局i l j 红景天中的细景天甙、甙元酪醇、香显索的q ：产工艺 的发展趋鹌l ，具有明显的生态设益，司使生态环境免受r 扰破坏、保护生物的t 长和】人 类的健康。所谓超临界流体足指一种热力学状态处于临界瓜jp c ，和临界温度t c 以【j 的 流体( m v f r i f i c j li i u id ，简称s r i 、) 。每个纯物质都仃它自己确定的三相点，将纯 物赝沿7l 一液饱和线升温，当达到临界点时，气一液的分界面消失，体系性质均，小 再分7 i 体和液体临界点的温度和压力称为临界温度平临界压力。超临界流体摹取 ( $ u p e t l i i c a “t i i de x t f a o t i o f l 简称s f e ) 是在超临界流体的临界区内进行的单元 操作。由f 超临界液体粘度小，扩散系数大，传质效果比液体好，所以可以迅速渗透到 物体内部溶解目标物质快速达到萃取平衡。溶质在超临界流体中的溶解度是随超临界 液体的密度增大而增大，而流体的临界压力较高，使超临界流体的密度接近于液体，而 日流体的密度随温度和压力的改变发生明显的变化。利用这种性质，可以在较高压力下， 使溶质溶解于超临界液体中，然后，降低超临界流体溶液的压力或升高温度，溶质在超 临界流体中的溶解度随流体的密度的下降而减小，从超临界流体中分离、析出。 可作为超临界流体的物质有c0 。、水、乙烷等，其中c0 。临界温度接近室温( 3 1 3 ) ，临界压力较低( 73 7 m p a ) ，而且无色、无味、无毒、不易燃烧、性质稳定、低廉易 得，故应用最为普遍。与传统的分离技术相比，超临界二氧化碳萃取有如下一些特点： ( 1 ) 超临界二氧化碳萃取结合了传统蒸馏与萃取的特点，既可按挥发度的差异又可按分 子问亲和力的不同进行混合物的分离；( 2 ) 二氧化碳临界温度为3 1 3 c ，因此超临界二 氧化碳萃取分离可以在较低温度下实现，从而有利于低挥发性、热敏性物质的分离：( 3 ) 有较好的过程选择性。超临界二氧化碳的溶解能力一般比液体小，但正是因为这种可接 受的低水平而获得较高的选择性：1 4 ) 操作简单，萃取、分离一步到位，能耗低；( 5 ) 二氧化碳无毒、无害，本身为惰性气体，可以避免活性物质发生氧化等化学反应，产品 无溶剂毒害残留。尽管超临界二氧化碳萃取有它自身的缺点，如高压操作，材料、设备 性能要求高，投资大，其萃取机理研究不够深入等但作为新的萃取技术，仍是人们研 究和开发的热点。 2 1 2 超临界二氧化碳流体萃取中夹带剂的作用 超临界二氧化碳萃取作为一种新的萃取分离技术，在食品工业、化学工业、制药工 业显示了广泛的应用前景。但由于二氧化碳具有很强的非极性特性，对许多低挥发性溶 质、极性较大溶质其溶解量依然很低，这点严重阻碍了该项技术的应用范围。简单靠 改变温度和压力来达到目标化合物的极性，是不可能达到的，而且对设备和操作条件均 提出了更高的要求。目前，提高低挥发性、极性较大的溶质在超临界二氧化碳中的溶解 度以及提高溶质混合物的选择性萃取的主要措施是向萃取体系中加入夹带剂。 夹带剂是种挥发度介于超临界流体和被萃取的溶质之间，作为亚临界组分，以液 体的形式和相对少的量加入到超临界流体之中的少量溶剂。它的加入能明显提高超临界 流体中溶解度i l l i , 的难挥发溶质的溶解度，降低超瞄界萃取中的费用，对该技术实现工 业化起着关键作用。经验表明好的溶剂往往也是好的夹带剂，如乙醇、甲醇、丙酮等。 目前已有些学者对夹带剂的“夹带”机理进行了较为系统的研究，尽管众多国内 外学者说法各一，但结论都是：夹带剂的作用是由于夹带剂与溶质分子之间能够形成氢 键或形成一种特殊的化学作用力，从而影响物质的溶解度。到目前为止尚未见有精确可 身、北林业- 人学顾 学位论文 疆的r g 预测央带剂对溶解度增强作用的数学模型。 2 2 实验试剂与设备 2 2 1 试剂药品 9 5 乙醇分析纯哈尔滨市化工试剂厂 尼水乙醇分析纯哈尔滨市化 _ ：试剂厂 红景天甙标准品9 5 北京市生物药品研究所 甙元酪醇标准品 9 8 北京市生物药品研究所 香豆素标准品9 9 和光纯药工业株式会社 c o = 气体9 9 5 哈尔滨黎明气体公司 乙腈色谱纯t e d l ac o m p a n yi l l c u s a 2 2 2 设备 超临界二氧化碳萃取装置江苏南通华安超临界萃取有限公司 超声波清洗器 b r o a d s o n c l e a n i n g c o m p a n y ，u s a w k 8 9 1 型烘干箱重庆四达实验仪器厂 a b l 0 4 型电子天平瑞士 t g 3 2 8 a 型分析天上海天平仪器厂 恒温水浴锅河北黄骅 2 2 r 型高速冷冻台式生物离心机德国h e r a e u s s e p a t e e h 9 8 0 型j a s c o 高效液相色谱仪日本j a s n o 公司 9 7 5 型紫外检测器日本j a s c o 公司 色谱柱：o b s 柱( 4 6 2 5 )英国h p l c 公司 2 3 实验方法 2 3 1 超临界萃取实验工艺参数 原料：购于吉林省安图县二道白河镇的高山红景天根茎 原料预处理方法：将高山红景天根茎洗净，于8 0 恒温干燥箱中烘干，经粉碎机粉碎 过4 0 目筛，根茎粉贮藏于塑料袋中供试验用 萃取压力温度：2 5 m pa 5 5 分离压力温度：5 5 m pa 5 5 投料量：2 0 0g c0 z 流量：2 0k g h 夹带剂添加量：高山红景天根茎粉( g ) 8 0 乙醇( e 1 ) = l o g 9 m l 时间：1 2 0 m i n 本研究除为了考察参数的影响而说明变更参数外，其余的参数均与上述参数相同 2 3 2 红景天甙、甙元酪醇和香豆素标准曲线的制作 高效液相色谱条件如下： 紫外检测波长红景天甙和甙元酪醇 2 8 0 n m 流动相红景天甙和甙元酪醇乙腈水( v v ) = l 9 紫外检测波长香豆素： 2 7 3 n m 8 高山钉景天中的红景天甙、甙元醅醇、香豆素的生产1 艺 流动相香亚索： 札温： 流速： 进样量： 232l 约景大甙杯推曲线的建0 ： 红景大甙标准嗣z 的高效液相色谱图见圈2 t i 00 0 0 t e o 洲3 d k 乙n 水( v v ) = 4 6 2 5 1 m 1 n , 1 1 1 1 0ui 图2 i红景天甙标准品高效液相色谱图 从红景天甙标准品的商效液相色谱图可见，在该实验方法的条件下，红景天甙的保 留时间在6 6 8 m i n 左右，峰形良好，虽然适当提高乙腈浓度可使红景天甙保留时间相应 缩短，为了使提取样品中红景天甙的能更好的分离，经过大量的预实验筛选，最终确定 用该色谱条件来分析红景天甙的含量。 标准溶液的配制：精密称取红景天甙标准品5 m g ，置于是l o m l 容量瓶，用9 5 乙 醇定容，摇匀，备用。 用2 0ul 移液器分别配制不同浓度梯度的标准液，按照上述高效液相色谱条件进行 测试，重复测定三次，取平均值，结果经回归处理得回归方程 y = 2 1 0 9 8 4 5 1 1 8 3 x 一8 4 0 9 7 9 1 7 ，回归方程的r 2 = o 9 9 9 9 ，可见红景天甙标准溶液浓度在 0 0 3 1 2 5 0 5 m g m l 范围内与峰面积成很好的线性关系。红景天甙标准曲线见图2 2 。 根据红景天甙标准曲线所得的回归方程可以得出计算红景天甙提取得率的公式如 下： 东北林业大学硕士学位论文 红景大批s ，= 蒜瓣黔m z 7 式中：y ：峰面积 m ：原荆_ 蓖f 1 1 1 9 ) 月：稀释倍数 矿：提取液体积( m ” 1 2 0 e 十0 6 1 0 0 e 旧6 8 0 0 e + 0 5 淞 恒6 o o e + 0 5 蚶 4 0 0 e - 5 00 10 2o 30 40 50 6 红景天甙浓度( m g m 1 ) 图2 2 红景天甙乙醇溶液标准曲线 23 2 2 甙元酪醇标准曲线的建立 甙元酪醇标准品的高效液相色谱图见图2 3 从甙元酩醇标准品的高效液相色谱图可见，在该实验方法的条件下，甙元酪醇的保留时 间在1 0 3 0 0 m i n 左右，峰形良好，虽然适当提高乙腈浓度可使甙元酪醇保留时间相应缩短， 为了使提取样品中甙元酪醇能更好的分离，经过大量的预实验筛选，最终确定用该色谱条件 来分析甙元酪醇的含量。 高山红景夫t ，的缸景灭甙、甙几酪醇、香1 2 素的生产i 艺 t 眦n 0 0 0 m 协72 t 。0 5q o h t * 图2 3 甙元酪醇标准品高效液相色谱图 标准溶液的配制：精密称取甙元酩醇标准品l o m g ，置于是l o m l 容量瓶，用9 5 乙 醇定容，摇匀，备用。 用2 0u1 移液器分别配制不同浓度梯度的标准液，按照上述高效液相色谱条件进行 测试，重复测定三次，取平均值，结果经回归处理得回归方程 y 2 6 2 2 4 8 7 4 6 0 2 2 x 一5 5 7 9 0 7 0 8 3 ，回归方程的r 2 = o 9 9 9 9 ，可见甙元酪醇标准溶液浓度在 0 0 6 2 5 一l m g m l 范围内与峰面积成很好的线性关系。甙元酪醇标准曲线见图2 4 。 根据甙元酪酵标准曲线所得的回归方程可以得出计算提取甙元酪醇得率的公式如 下： 甙元酪醇( r a g ) ：兰! ! ! 塑：! ! 墅。爿。v 6 2 2 4 8 7 46 0 2 2 m 式中： ，：峰面积 m ：原料干重( m g ) a i 稀释倍数 v ：提取液体积( m 1 ) 东北林、儿，大学硕十学位沦业 一l + _ l i l 1 i - j ) h 川t 一 4o f ) t ：+ 0 6 一 窖0 叭- ，0 b 2i i o e 0 5 1o o e 。o b 0o o e + 0 0 02040 60 8 甙元酪酵浓度( r a g m 1 ) 图2 4 甙元酪醇乙醇溶液标准曲线 2323 香豆素标准曲线的建立 香豆素标准品的商效液相色谱图见图2 5 h m 5 圈2 5香豆素标准品高效液相色谱图 从香豆索标准品的高效液相色谱图可见，在该实验方法的条件下，香豆索的保留时 间在6 5 0 0 r a i n 左右，峰形良好，虽然适当提高乙腈浓度可使香豆素保留时间相应缩短， 高山妇景天中的红景天甙、甙几酪醇、香h 素的生产j _ 艺 为，使提取样。铺q 香孛素的能更好的分离，经过尺鞋的预实验筛选，最终确定用该色谱 条件来分析香 j 素的含嚣。 标准溶液的配制：精密称取香豆素标准品， 9 9 8 4 i 【i g 胃于是l o m l 容量瓶用9 5 乙醑定容，摇匀，备用。 j i 】2 0u 】移液器分别配制不同浓度梯艘的 ，：准液，按照 ：述高效液相色谱条件进行 测试重复测定三次，取平均值结果经回归处理得回归方程 、一4 2 8 17 4 0 03 9 6 8 x + 7 4 7 5 2 5 6 3 4 9 ，回归方程的r 一09 9 5 5 ，可见香豆素标准溶液浓度在 0 0 3 9 0 4 703 9 9 8 4 m g m l 范围内与峰面积成很好的线性关系。香豆素标准曲线见图2 6 。 根据香豆素标准曲线所得的回归方程可以得出计算香豆素提取得率的公式如下： 香豆素c m 萨高焉篇础矿 式中：，：峰面积 肘：原料干重( m g ) 爿：稀释倍数 v ：提取液体积( m 1 ) 00l0 2030 4 香豆索溶液浓度lm g m 1 ) 图2 6 香豆索乙醇溶液标准曲线 2 3 3 红景天甙、甙元酪醇、香豆素的提取方法 ( 1 ) 超临界二氧化碳夹带剂萃取红景天甙、甙元酪醇、香豆素 本文在超临界二氧化碳萃取设备上进行红景天甙、甙元酪醇、香豆素萃取的实验研 究，将烘干( 8 0 0 c ) 恒重的红景天根茎粗粉各1 8 份每份2 0 0 9 ，分别用浓度为4 0 、5 0 、 6 0 、7 0 、8 0 、9 0 的乙醇1 8 0 m 浸润、搅拌均匀，预浸过夜，装入萃取罐，来自钢瓶 的二氧化碳气体，先经一过滤器，进入制冷机内的贮罐，在此处降温，待萃取罐、各分 离器的温度达到各自设定温度后，打开阀门让二氧化碳气体进入萃取罐并慢慢排空萃取 罐内空气，密封。当贮罐内的二氧化碳气体温度降至o c 5 ，变为液体时，开启高压 7 7 7 7 7 7 6 6 6 6 o 0 0 0 0 o o o o 0 o 0 + + + + 十+ + + + + e e e e e e e e e e e 0 o 0 0 0 0 0 0 0 o o 0 8 6 4 2 0 o o 0 o o 2 l l 1 l l 8 6 4 2 0 群旧攀 东北林业人学坝f j 学位论文 ，| = j 塞裂。高j f 、的液体氧化碳经泵进入热交换器诎加热汽化，处t 超帕，界状态并被继续 泵入苹取罐，与苹敬罐的压力达剑预定压力厉，打开流耸调1 i 阀爿凋祭高压桂塞泵的 转动频率，将流域调 7 至预定值进行萃取。溶解有萃取物的超临界氧化碳流体夹 带哜u 通过1 ，流阀减压，并进入分离器中，析出萃取的物质。二氧化碳通过流量计计量，l 厅 重新进行循环。收集提取产物，在相同条件r ( 转速6 0 0 0 r m i n 、温度2 06 c 、离心时间 1 5 m ir 1 ) 进? f l a l 液分离，称取固体膏状物质量，并量取上清液体积，用气液质谱联用仪 测定其中红景大甙和酪醇的含量。先后重复三次依据结