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学位丛1 4 5于l ! l 有关部门或 大学可以将 或扫描等复 本学位论文 学位论文作 日期跏幻年 浙江理工大学硕士学位论文 曲弘理大学 硕士学位论文 r i b o s w i t c hc d n a 文库合成及分析 作者姓名黄艳 学科( 专业)生物化学与分子生物学 指导老师高晓莲教授 所在学院生命科学学院 提交日期 兰1 3 竺兰望! 里 中国杭州 m 浙江理工大学硕士学位论文 z h e j i a n gs c i t e c hu n i v e r s i t y m a s t e rd i ss e r t a 耵o n t h e s y n t h e s i sa n da n a l y s i so f r i b o s w i t c hc d n a l i b r a r yi nv i t r o y a nh u a n g c o l l e g e o fl i f es c i e n c e s ，z h e j i a n gs c i - t e c hu n i v e r s i t y h a n g z h o u ，c h i n a i v 浙江理工大学硕士学位论文 分类号： u dc ： 论文答辩日期知年3 月lc 7 日 密级： 答辩委员会主席 查童苎 论文评阅人 答辩委员会成员 夔磁j - 静谱 姜永厚 v 课题来源 浙江省生物医学工程重中之重学科人才基因项目 v i 浙江理工大学硕士学位论文 摘要 从头合成( d en o v os y n t h e s i s ) 技术随着基因组数据库的日益丰富和d n a 自动化合 成效率的提高而快速发展，未来短期内通过合成基因的方法获得目标序列可能成为普通 实验室的常规实验手段，而且合成技术将会逐步取代现有的重组手段。由传统碱基按序 合成的方法来合成各种预期的基因或者基因组序列既浪费时间又浪费资金，且合成的目 标序列出错率极高；目前虽然已开发芯片技术为大规模平行合成寡核苷酸提供了一种相 对简单便捷的方法，但是，大多受到合成基因种类或实验条件等方面的限制而无法推广 成为一种实验室常规合成方法。与常规利用芯片直接寡核苷酸、p c r 组装基因不同，我 们对寡核苷酸做了特殊的设计和改良，为寡核苷酸两端设计了带有平末端酶切位点的特 异引物区，这不仅使得组装效率大幅度提高，并由常规的一次合成一种基因增加到同时 合成多元基因。从芯片输出合成寡核苷酸后，经过回收和纯化，然后混合成为寡核苷酸 混合物( o l i g o m i x ) ；在o l i g o m i x 扩增及随后的组装中，获得相对保真的组装材料和较 为稳定的体外组装条件，并且以此为基础，最终完成相关文库的建立。 我们以核糖开关d n a 序列( r i b o s w i t c hc d n a ) 为例，分别设计了两套基因，一套长 度小于1 0 0n t 在芯片上直接合成( s r ) ，一套通过寡核苷酸组装合成( l r ) ；并以直接 测序结果作为依据，将每条测序结果与输出序列模板进行比对，统计分析碱基出错率。 两套基因的综合出错率分别为2 5 8 0 ( s r ) 、2 3 7 o ( l r ) ，分析碱基出错可能产生并积 累于芯片原位合成及后续的p c r 过程中，但比传统方法直接合成相应长度的序列出错率 大为降低。再以合成的r i b o s w i t c hc d n a 序列作为模板进行体外转录，从而生产出毫克 水平的f i b o s w i t c hr n a s ，并用r t - p c r 产物验证还原性良好；通过对多元f i b o s w i t c hc d n a 体外转录条件的几个关键因素进行优化调整，获得了优化的体外转录条件，保证了后续 实验( 如配体结合实验，药物等方面开发实验) 足够的实验材料。分析比较m f o l d 软件 对不同r i b o s w i t c h 序列折叠取得的二级结构及测序结果，归纳出各种核糖开关适配体的 关键保守序列，为预测发现新型核糖开关或丰富已发现核糖开关做了铺垫。 从芯片产生的o l i g o m i x n 合成的完整的多元r i b o s w i t c h ，全部过程包括芯片输出设计 寡核苷酸、p c r 扩增富积( u o o mp c r ) 、限制性酶切、组装和组装后扩增( f p c r ) 、 克隆、测序验证以及体外转录，全部过程可在一周内完成。这套合成条件经过优化，原 来用于合成预期长度r i b o s w i t c h 的策略，同样可以被类似地应用合成任意基因序列。 关键词核糖开关；配体；组装；体外转录 v 浙江理工大学硕士学位论文 a b s t r a c t a st h ei m p r o v e m e n to fg e n o m ed a t a b a s ea n dt h eh i g h e re f f i c i e n c yo ft h ea u t o m a t e dd n a s y n t h e s i st e c h n o l o g y , t h ed ei i o v os y n t h e s i st e c h n o l o g yh a sb e e nd e v e l o p i n gr a p i d l y i nt h e l l e a rf u t u r e ，t h em e a n so fo b t a i n i n gt a r g e ts e q u e n c et h r o u g ht h es y n t h e t i cm e t h o dm a yb e c o m e c o n v e n t i o n a le x p e r i m e n ti nc o m m o nl a b o r a t o r y , a n dw i l lr e p l a c et h ee x i s t i n gr e c o m b i n a t i o n g r a d u a l y t h ea c q u i s i t i o no fp r o s p e c t i v eg e n i eo rg e n o m i es e q u e n c e sw i t ht h ec o n v e n t i o n a l m e t h o do fo n e - b ) 7 - o n eb a s i ss y n t h e s i sw a sat i m ea n df u n dc o n s u m i n gp r o c e s sa n da l w a y sl o n g w i t he r r o r - p r o n eo e e t l l t e n c , e ，h o w e r e r , m i e r o a r r a yt e c h n o l o g yp r o v i d e saf a s ta n de c o n o m i c a l l l l e f l l nf o rm a s s i v ep a r a l l e ls y n t h e s i so fo l i g o s d i f f e r e n tf i o mt h ec o m m o l la s s e m b l i n gm e a n s b ys y n t h e s i z i n go l i g of i r o mc h i pa n dd e t e c tp o l y m e r a s ec h a i l lr e a c t i o no e r ) ，w eh e r e i n s y n t h e s i z et h eo l i g o sw i t hs m a r td e s i g na n di m p r o v e m e n t t h a ti st h es p e c i a lp a r to fp r i m e r s w i t ht h eb h m dr e s t r i c t i o ns i t ee n d sa d d e dt ot h et w oe n d so fo l i g o s t h i sm e t h o dn o to n l y m a k e st h ea s s e m b l ye f f i c i e n c ye n r i c h e dg r e a t l y , b u ta l s oi n e r e a e e st h ek i n d so fs y n t h e t i cg e n e f r o mo n ei nc o n v e n t i o n a le x p e r i m e n tt om u l t i p l eh e r e i nb yat i m e a t t e rs y n t h e s i z i n ga n d p u t t i n go u tt h e s eo l i g o sf r o mm i e r o a r r a y , t h e ya 托r e c o v e r e da n dp u r i f i e d 褐ap a r to fo l i g o m i x t u r e ( o l i g o m i x ) t h eo l i g o m i xw a sa m p l i f i e du s i n gp c ra n dt h ef l a n k i n gp l i m e r s 帐 c l e a v e df o rf o l l o w i n ga s s e m b l ye x p e r i m e n t s w ec o m p a r e dt h ea s s e m b l yc o n d i t i o n sf o r o b t a i n i n gt h eb e t t e ra s s e m b l ym a t e r i a la n dm e t h o d s w ed e s i g n e dt w os e to fg e n e sf o rs y a t h e s i z i n gi nv i t r o t h es h o r t0 1 1 e ( s h o r tr i b o s w i t e h , s r ) w a ss y n t h e s i z e d0 1 3c h i pd i r e c t l y , t h el e n g t ho fw h i c hl e s st h a n1 0 0n t ，a n dt h eo t h e ro l l e ( 1 0 n gr i b o s w i t c h , l i u 、脚s y n t h e s i z e db ya s s e m b l y i n go l i g o m i x b a s e do nt h er e s u l t sf r o m d i r e c ts e q u e n c i n g ，w ep e r f o r m e dt h es t a t i s t i c a la n a l y s i so ft h eb a s ee l t o l r a t ei ne a c hs e q u e n c e a l o n gw i t ht h es e q u e n c ea l i g n m e n t t h er e s u l t a n te i t o i r a t eo ft h e s et w os e t , w h o s em u t a t i o n c a m ef r o mt h ep r o c e s so fi ns i t uo l i g o m i xs y n t h e s i s0 1 1c h i pa n ds u b s e q u e n e ei c r , w e l et h e n d e t e r m i n e dt ob e2 5 8 ( s r ) a n d2 3 7 o ( l r ) ，s e p e r a t e l l y w i t ht h eh i g h l yf i a e l i t yd n a t e m p l a t e so fa s s e m b l y , w ec a r r i e do u ti nv i t r ot r a n s c r i p t i o nt op r o d u c em i l l i g r a ma m o u n t so f h i g h l ys t r u c t u r e dr n a s o fr i b o s w i t e h e sa n dv e r i f i e db yr t - p c r a st h ec o n v e n t i o n a li nv i t r o t r a n s c r i p t i o n , w eo b t a i n e do p t i m a lr e a c t i v e c o n d i t i o n sb ys e v e r a l d e s i g n e dp r o t o c o l s ， p r o v i d i n ge n o u g hm a t e r i a lf o rt h ef u t u r eg e n eo p e r a t i o na n db i o l o g i c a la p p l i c a t i o n , s u c ha s r i b o s w i t c h e si n v o l v e dr e g u l a t i o no fm e t a b o l i cp a t h w a y sa n dg e n ee x p r e s s i n gr e g u l a t i o n i n v i i i 浙江理工大学硕士学位论文 a d d i t i o nt o ，w ea n a l y z e dt h es e c o n df o l d - s t r u c t u r eb ym f o l ds o f ta n ds e q u e n c i n gr e s u l t s ，t h e n s u m m a r i z e dt h ek e yc o n s e r v e ds e q u e n c eo fd i f f e r e n ta p t a m e r so fr i b o s w i t c h e s ，a sar e s o u l e f o rp r e d i c t i n ga n df i n d i n gn e wr i b o s w i t c h e so rr i c h i n gt h em o u n to f t h ef o u n d f r o mt h em i c r o a r r a y - d e r i v e do l i g o m i xt os y n t h e s i z e dc o m p l e t er i b o s w i t c h e s ，t h ew h o l e p r o c e s so fc h i pl a y o u to fd e s i g n e do l i g o s ，e n r i c h m e n t , d i g e s t i o n , a s s e m b l ya n da m p l i f i c a t i o n , c l o n i n g , s e q u e n c ev e r i f i c a t i o na n di nv i t r ot r a n s c r i p t i o nw o u l db ea c h i e v e dw i t h i no n ew e e k b e c a u s eo ft h i ss e to fs y n t h e t i cc o n d i t i o n h a sb e e n0 l 炯】飙t h es w a t e g yc a na l s ob e a n a l o g o u s l ya p p l i e di ns y n t h e s i t i n ga n ya r b i t r a r yg e n es e q u e n c e s k e ，w o r d s f i b o s w i t c h e s ；l i g a n d ；a s s e m b l y ；i nv i t r ot r a n s c r i p t i o n 浙江理工大学硕士学位论文 摘要 目录 v 第一章适体、核糖开关及合成生物学研究进展 一l l j 5 呈体( a p t a m c r ) 1 1 1 适体的发现和定义l 1 2 适体的特点1 1 3 适体与靶标分子相互作用简述1 1 4 适体应用进展2 2 核糖开关( r i b o s w i t c h ) 2 1 核糖开关的发现、定义和特点2 2 1 1 核糖开关的发现、定义2 2 1 2 核糖开关一般特征3 2 2 核糖开关分类3 2 2 i 维生素相关核糖开关。 2 2 1 1 焦磷酸硫胺素( t h i a m i n ep y r o p h o s p h a t e ，t p p ) 3 2 2 1 2 黄素单核甘酸( f l a v i nm o n o n u c l e o t i d e ，f m n ) 。3 2 2 1 3 腺苷钴胺素( a d 衄o s y lc o b a l y m i n , a d o c b l ) 4 2 2 2 氨基酸相关核糖开关4 2 2 2 1 硫一腺苷甲硫氨酸( s - a d e n o s y lm e t h i o n i n e , s a m ) 4 2 2 2 2s 一腺苷i 一高半胱氨酸( s - a d 豇1 0 s y l - l - h o m o c y s t e i n e , s a h ) 5 2 2 2 3 赖氨酸( l y s i n e ) 5 2 2 2 4 甘氨酸( g l y c i n e ) 5 2 2 3 嘌呤相关核糖开关6 2 2 3 1i 嘌呤( p m i n e ) 6 2 2 3 2 环鸟苷二磷酸( c y c l i cd i - g u a n o s i n em o n o p h o s p h a t e c y c l i cd i - g m p ) 6 2 2 - 3 3q 核苷前体( p r e q u o s i n e ，p r e q l ) 6 2 2 4 核酶型相关核糖开关( 葡萄糖胺舌磷酸，g l u c o s a m i n e - 6 - p h o s p h a t e g i c n 6 p ) 7 2 2 5 细胞内镁离子相关核糖开关7 2 2 6 新型串联核糖开关7 2 3 核糖开关调节机制7 2 4 核糖开关分布7 3 合成生物学8 3 1 合成生物学定义8 3 2 合成生物学意义。9 4 研究目的及内容9 4 1 研究目的及意义9 4 2 研究内容9 第二章寡核苷酸与引物设计 x 1 0 浙江理工大学硕士学位论文 l 材料与方法1 0 1 1 材料与处理工具l o 1 2r i b o s w i t c h 寡核苷酸设计方法举例lo 2 结果ll 2 1 核糖开关序列获得l l 2 2 核糖开关寡核苷酸引物设计1 4 第三章体外获取多元r i b o s w i t c he d n a 与r n a 1 材料与试剂 1 1 实验材料 1 2 1 3 1 6 处理工具16 酶和试剂1 6 2 方法1 6 2 1l ro l i g o m i x sp c r 扩增1 6 2 1 1l r - o mp c r 扩增寡核苷酸丰度。1 6 2 1 2m l yi 限制性酶切接头引物1 7 2 1 - 3m l yi 酶切后o i i g o m i x 组装1 7 2 1 3 1 缓慢降温法l8 2 1 3 2 热循环法1 8 2 1 4 组装后片段p c r 扩增( f - p c r ) 。1 8 2 2s r 全基因扩增( s r f - p c r ) 1 8 2 3 组装产物克隆与测序1 9 2 3 1 纯化组装产物接a 处理19 2 3 2 连接19 2 3 31 障化2 0 2 4 质粒鉴定2 0 2 4 1 碱裂解法提取质粒。2 0 2 4 2 质粒p c r 鉴定2 1 2 5 序列测定与保真性分析。2 l 2 5 1 测序2 1 2 5 2 测序结果分析方法2 l 2 6 体外转录2 1 2 6 1 体外转录d n a 模板准备2 1 2 6 1 1l r - d n a 体外转录模板准备2 1 2 6 1 2s r - d n a 体外转录模板准备2 2 2 6 2 体外转录及条件优化2 2 2 6 2 1 体外转录模板量条件优化2 3 2 6 2 2 体外转录r n t p 量条件优化2 3 2 6 2 3 体外转录m g + 条件优化2 4 2 6 3 转录后r i b o s w i t c hr t - p c r 验证2 4 2 7r i b o s w i t c h 适体保守序列一2 4 2 7 1 文献提供结构2 4 2 7 2p r e q l - r i b o s w i t c h 适体保守序列与结构模式预测2 5 2 7 2 1p r e q l - d b o s w i t c h 适体保守序列2 5 x i 浙江理工大学硕士学位论文 2 7 2 2p r 蛔1 - r i b o s w i t c h 适体结构模式。2 5 3 结果2 5 3 1l ro l i g o m i x sp c r 扩增：2 5 3 2l r - o mp c r 纯化产物m l yi 限制性酶切鉴定。2 6 3 3 体外组装2 6 3 4f p c r 扩增组装产物切胶回收2 7 3 5 组装产物克隆及序列分析 2 8 3 5 1s r 克隆与序列分析2 8 3 5 2l r 克隆与序列分析 3 5 3 克隆与序列分析说明3 0 3 5 - 3 1 克隆结果相关说明3 0 3 5 3 2 序列分析说明。3 l 3 6 体外转录d n a 模板准备3 3 3 7 体外转录条件优化3 3 3 8p r e q l - r i b o s w i t c h 适体保守序列3 4 3 9p r e q l - r i b o s w i t c h 适体结构模式3 5 3 1 0r i b o s w i t c h 适体保守序列汇总3 5 4 小结与讨论。3 6 4 1 体外组装核糖开关3 6 4 2 体外转录。3 6 4 3 序列比对分析3 7 第四章核糖开关相关文库构毫。一。一3 3 1 材料与处理工具。3 8 2 方法。 2 1 寡核苷酸信息汇总。3 8 2 2 测序分析信息汇总3 8 2 3 测序序列二级结构及相关序列信息汇总3 8 2 4 测序样品储存信息汇总3 8 2 5 排除序列相关信息汇总3 8 3 结果。 3 1 寡核苷酸信息表。3 8 3 2 测序分析信息表3 9 3 3 测序序列二级结构及相关序列信息表。3 9 3 4 测序样品储存信息表3 9 3 5 排除序列相关信息表。4 0 4 小结与讨论。 总讨论 参考文献 4 5 4 6 x 浙江理工大学硕士学位论文 第一章适体、核糖开关及合成生物学研究进展 适体是一种由人工体外合成的核酸分子，可以特异结合小分子；而受到适体的启发， 人们继而发现一种天然存在的适体结构，就是核糖开关。核糖开关大量存在于原核细菌 中，并具有适体的基本特征，扩充了适体的范围。 1 适体( a p t a m e r ) 1 1 适体的发现和定义 早在1 9 9 0 年，t u e r k 和s z o s t a k 首次报道了一种由体外筛选得到与靶标分子特异性结 合的r n a 分子的方法，通过这种方法得到的核酸分子就是适体( a p t a m e r ) 【埘，a p t a m e r 一词源于拉丁文a p t u s ，意即配合、适合，故暂译为“适体 【1 1 ；该方法现取名为s e l e x ( s y s t e m a t i ce v o l u t i o no f l i g a n d sb ye x p e r i e n t i a le n r i c h m e n t ) ，中文译为指数富集配体系统 进化【3 4 】；用抗体模拟与适体结合的靶标分子叫“a p a t o p e s 一，学术上通常命名为“抗原决 定簇( e p i t o p e ) 或“靶标分子、配体( t a r g e t ) 一【5 】。前面提到的s e l e x 技术随后不断 简化，现已发展为一种自动的体外程序，并开辟了一条从大量分子中高通量筛选所需某 一特定靶标分子的道路 3 5 , 6 1 。 1 2 适体的特点 适体是从大容量寡核苷酸随机文库中经s e l e x 技术多轮筛选富集产生的，故具有高 特异性和靶分子的广泛性陵刀；适体是由人工合成的，意味着适体可根据反应条件加以修 饰( 分子骨架修饰和分子外修饰) 【7 8 】；以上几点同时促成了适体在诊断上具有一定的普 遍性 2 , 7 1 。 虽然表观上核酸适体发挥着与单抗相似的功能，但又具有许多优势【l 】o 首先，适体 由体外筛选而得，生产效率高，在时间、质量、数量上都具有选择弹性，且不涉及动物 或细胞，不受毒性或免疫原性差等不利因素的限制【1 & 7 1 ；人工合成的适体重复性好、稳 定性高，便于保存、运输等【7 9 1 ；最后，小分子量的适体与靶分子结合空间位阻小，有利 于高密度阵列生物传感器的构建【姗。 1 3 适体与靶标分子相互作用简述 近年来，通过借助靶分子同源家族一致序列对照、核磁共振波谱分析及计算机模拟 等生物化学、分子生物学、计算机技术，获得了大量用来揭示分子间相互作用规律的实 验数据，为研究适体与其靶分子作用位点和作用机制提供了可能【i l 】。 大多数靶分子通过与适体碱基边缘相互作用而被识别，这种识别过程可区别靶分子 与其类似物，使适体具有特异性【1 2 1 。h e r m a n n 和d i n s h a w 发现，非w a s t o n - c r i c k 碱基对 浙江理工大学硕士学位论文 形成的特异氢键和堆积作用普遍存在于不同适配体复合物之间的相互作用中；前者提高 适配体之间的亲和力及适体的选择性，后者有助于稳定复合结构1 3 】。此外，非w a s t o n c r i c k 碱基对包括腺嘌呤单磷酸一g 碱基对( a m p g ，a m p 适体复合物) 、g - g 碱基对、 嘌呤嘌呤和碱基三体( 形成碱基大平台，肽适体复合物) 1 l , 1 2 , 1 3 1 。对于带有电荷的氨基 酸或低聚糖类配体，大多数是嵌入到适体的深沟中，并由两者间的静电作用稳定复合结 构1 3 】。而当适体与蛋白结合时，适体改变构象嵌进蛋白质表面的裂缝中，分子间作用使 之稳定【1 2 】。 综上所述，核酸适体与靶分子间的相互作用主要有：堆积作用、氢键作用、静电作 用和结构互补作用【l l 】。 1 4 适体应用进展 适体是一种小分子核苷酸，它在生物传感器和临床治疗及药物设计方面的应用研究发 展迅速，其应用前景已经引起了人们极大的兴趣。 生物传感器方面：鉴于适体在不同温度、离子浓度、金属螯合剂等条件下的重复使用 性及可修饰性等特征优势【l , s , 1 4 ，近年以适体为传感识别分子的光学传感器和电化学传感 器得到了飞速发展队1 0 1 4 1 ，并几乎可以胜任抗体进行的诊断技术【n 。适体作为理想的识别 元件，在蛋白质组学、病毒检测、疾病监测、环境检测方面发挥了重要作用 3 , 9 , 1 0 , 1 5 ；目 前，寻找提高适体传感器的灵敏度和适用性的高特异性新适体，以加速检测过程的自动 化要求已成为适体传感器主要研究方向【9 】。 药物设计和临床治疗方面：由于折叠成一定三维结构的核酸适体与病理学相关蛋白 特异性结合后往往能抑制蛋白的功能，改变细胞或有机体的生理学特性，因此是一种很 有发展前途的药物分子，可直接用于干扰疾病的发生发展过程 3 , 1 1 , 1 2 】；目前已被广泛运用 于病毒感染( 人类免疫缺陷病毒，h w ：丙肝病毒，h c v ) 、自身免疫病( 重症肌无力， m g ) 、肿瘤、血管性疾病( 心血管疾病) 等临床治疗研究口，1 2 1 5 1 。适体作为临床治疗药 物的开发刚刚起步，还面临许多问题【3 】。 2 核糖开关( r i b o s w i t c h ) 2 1 核糖开关的发现、定义和特点 2 1 1 核糖开关的发现、定义 耶鲁大学的b r e a k e r 等受到适体的启发，通过一系列实验证明了自然界存在某种天然 的r n a 适体，并命为“r i b o s w i t c h 【1 6 1 。“r i b o 指“m r n a s ，而 s w i t c h 指能够控制 基因表达的“分子开关一；中文暂将“r i b o s w i t c h 一译作“核糖开关乃或“核开关疗 1 6 , 1 7 , 1 研。 2 浙江理工大学硕士学位论文 人们发现的首例核糖开关是早在1 9 9 1 年，以腺苷基钴胺素为配体，并调节编码维生素 b 1 2 的胞外转运蛋白基因的核糖开关【1 6 ，1 9 , 2 0 1 。 2 1 2 核糖开关一般特征 实际上，现已发现的r i b o s w i t c h 大部分位于代谢相关基因m r n a 的5 非翻译区( u i r ) ， 有两个结构域组成，分别是适体结构域( a p t a m e rd o m a i n ，a d ) 和表达结构域( e x p r e s s i o n d o m a i n ，e p d ) ，a d 实质上就是前文介绍的可以结合小分子的适体部分，具有与适体 相同的一般特征，高度保守性、高度选择性和高度敏感性【1 6 1 。在各生物体内，核糖开关 a d 部分与代谢小分子( 即配体，l i g a n d ) 结合后，a d 发生构象变化并将信息传递至e p d ， 后者通过形成选择性茎一环结构改变基因的表达【1 6 2 1 捌。不同核糖开关的e p d 可能利用不 同的机制调节基因表达【16 1 8 捌。 2 2 核糖开关分类 到目前为止，已经鉴定多种核糖开关配体，分别属于维生素，氨基酸，核苷酸，核 酶【1 6 1 ，及目前新发现的细胞金属离子有关核糖开关和两种适配体核糖开关。 2 2 1 维生素相关核糖开关 。 一 2 2 1 1 焦磷酸硫胺素( t h i a m i n ep y r o p h o s p h a t e , t p p ) h o 一 细菌维生素b l 是糖代谢辅酶t p p 的前体，编码维生素b l 生物合成及转运酶类的珐f 操纵子存在保守的非翻译前导序列，该段被称为“t h i - b o x 瞄】。系统发育状态比对分析 表明，来源不同的各t h i - b o x 序列具有形似的发夹折叠结构刚。对足e t l it h c o g e i 操纵子 前导r n a 的功能分析显示，硫胺素抑制了砌基因翻译起始过程，进一步研究发现t p p 直接与t h i - b o x 作用改变r n a 构象，其结果是控制了& e t l i 的s d 序列；该过程对t p p 具有高特异性，并与转录水平无关1 2 5 1 。t p p - f i b o s w i t c h 通过t h i - b o x 诱导革兰氏阳性菌的 转录终止或抑制革兰氏阴性菌的翻译起始来控制相应r n a 的表达闭。 2 2 1 2 黄素单核甘酸( f l a v i nm o n o n u c l e o t i d e , f m n ) 核黄素( b 2 ) 是辅酶黄素单核苷酸( n 烈) 和黄素腺嘌呤二核苷酸( 山) 的一个 前体。在杆菌中，核黄素操纵子( 厂f 6 锄么胛) 由五个编码合成酶的基因组成，其中第一 个基因前段的非翻译前导域中存在一个称为“咖- b o x 的保守调控元件；该元件在对哟 操纵子的负调控中其主要作用【2 7 】。咖- b o x 折叠成典型的五发夹结构，对其突变将导致 核黄素的过表达 2 9 l 。r b 前导域拥有内在终止子、抗终止子和抗抗终止子( 二者位于咖 - b o x 内) 。各实验室研究结果中没有发现相应蛋白的存在，所以推出f m n 直接与咖b o x 结合的假说，并已在体外得到证实。在体外，痕量的f m n 足以引起转录终止子的形成： 3 浙江理工大学硕士学位论文 另外，完整的r f n - b o x 序列结构对发挥核糖开关作用是必需的，各种定点突变都会使其失 效网。经证实，f m n 会改变哟前导r n a 自我剪切模式，以使构象发生改变，但核黄 素没有该功能圆；f m n 分子内荧光在r n a 形成时淬火进一步证明f m n 与咖的直接作 用阳。 大多数r i b 基因在革兰氏阳性菌中集中于一个操纵子内，却分散在革兰氏阴性菌染色 体周围，这种情况下，核糖开关操纵子不再局限于受到转录水平的调控。例如，在大肠 杆菌中，f m n 达到两个数量级，翻译就会受阻，而只有到达五倍的f m n 量才能使转录 水平受到影响 2 5 ；2 s 。 2 2 1 3 腺苷钴胺素( a d e n o s y lc o b a l y m i n , a d o c b l ) b 1 2 是一种受到核糖开关调控的维生素。在沙门氏茵( s a l m o n e l l a ) 和大肠杆菌( e c o l i ) 中，b t u b 编码b 1 2 外膜转运蛋白，c o b 操纵子编码b 1 2 合成酶；这两个基因都含有保守的 “b ，2 - b o x 一，调节机制与珐f 和m 两基因极其相似 2 6 ，2 9 9 1 。b j 2 - b o x 在效应分子a d o c b l 作用下负调控b t u b 基因；在翻译起始阶段，发夹结构隔离了s d 序列3 0 】。研究表明， 是a d o c b l 而不是b 1 2 抑制b t u br a n3 0 s 核糖亚基，并完全依赖于b 1 2 - b o x 的完整性， 结合时构象发生变化 3 0 3 1 】；位于b t u b 编码序列5 ，端的转录弱化子可