（分析化学专业论文）有毒含氮化合物的毛细管电泳分析.pdf

摘要 摘要 毛细管电泳( c a p i l l a r ye 1 e c t r o p h o r e s i s ，c e ) 以其样品处理简单、快速、较少的样 品和试剂消耗等优点，被广泛应用于生物、医药、化工、环境等领域。毛细管区带电泳 是毛细管电泳中种重要的分离模式，在本文中主要介绍它在有毒含氮化合物分离和检 测当中的应用。对诸如p h 值、浓度、电压等分离条件进行系统的研究。该方法用于实 际样品分析得到了满意的结果。全文共分3 章，其内容如下： 第1 章：本章主要介绍几种有毒含氮化合物的一些分析方法，其中主要是色谱方法， 而且在一些国标中有很多应用，毛细管电泳是其中一种可供选择的方法，它己被用于一 些有毒含氮化合物分析中。 第2 章：以非水毛细管电泳的方法对中药中的丙烯酰胺进行测定。丙烯酰胺在乙腈 的低p h 环境下质子化而在电泳中发生迁移，所以在未涂层的熔融毛细管中，以3 0 m m o l l 的高氯酸乙腈溶液为背景，2 0l ( v 的条件下分离，1 9 8n m 直接紫外检测。不同 浓度丙烯酰胺校正峰面积的天内和天间的相对标准偏差分别为o 4 一1 7 和1 卜2 4 。 这种方法简单、快速、费用低被用于中药中丙烯酰胺分析。 第3 章：本实验用毛细管定量测定了非吸烟者和吸烟者唾液中亚硝酸盐、硝酸盐和 硫氰酸盐含量，用p h 值等于6 0 的2 0 衄0 1 l 磷酸盐作背景电解质( 离子强度调整为 o 0 8 1 6 哟! k gn a ：s 0 。) 。将等体积的乙腈和唾液混合，然后通过离心和过滤的方法除 去唾液样本中的蛋白质和酶。溴酸盐因为不可能存在于原始的唾液中，并且不干扰所选 择的三种离子的分离，因此被选为内标物。对于皿硝酸盐浓度在o 0 1 到1 0 0 姗o l l 范围内呈校正峰面积与浓度间线性相关系数大于0 9 9 9 ，对于硝酸盐浓度在o 王o 到6 o o 唧0 1 几范围内呈校正峰面积与浓度间线性相关系数大于o 9 9 9 ，对于硫氰酸盐浓度在 o 0 5 到2 o o 咖o l l 范围内呈校正峰面积与浓度间线性相关系数大子0 9 9 9 。整个电泳 分离过程在十分钟内完成。本文的方法因其简单的样品处理过程和相对低的运行费用， 为唾液中这些离子的测定提供了一种可供选择的方法。 关键词毛细管电泳丙烯酰胺硝酸盐亚硝酸盐硫氰酸盐 a b s 仃a c t a b s t r a c t c 印i l l a r ye l e c 仃0 p h o 他s i s ( c e ) h a sb ns u c c e s s 如l l ya p p l i e dt ot l l e 锄a i y s i so f 坞 c o m p l e x m a ：t r i c e si nb i o l o g y c h 啪i s t i xm e d i c i 舱绷de n v i r o n m e n tb c c a u o fi t sa d v a n t a g e s o fe x c c l l e n ts e p a r a t i o ne 伍c i e n c y m p i da i l a l y s i s ，c o n v c n i e n ta n dm i n 蚰a iu s eo ft h es 锄p l e s 锄ds o l v e n t s c 印i l l a 巧z o n ee l e c 仃d p h o r e s i s ( c z e ) i s 锄i m p o r t 锄ts e p a r a t i o nm o d eo fc e 1 1 1 m yd i s 似i o n ，i 妣u s e d i t sa p p l i c a t i o nt 0t h es 印a r a t i o n 锄dd e t e 肿i n a t i o no f 跏e c o m p o u n d sc o n t a i n n i n gn i t r o g e n a t c 粕i nt h e i rc h e m i c a l蝴r e s a f b e rp a r a t i o n c d i t i o n sw e 聆s y s t e m a t i c a l l ys t l j d i c ds uc _ h 髂p h ，c o n c e n t r a t i o 玛a n dt y p e so fb a c k g o u n d s 0 l u t i o 叱叩p l i e dv o l t a g e ，t h eo p t i m u me l e c t r o p h o r e t i c a lc o n d i t i o l l sw e 佗o b t a i n e d t h e d c v e l o p e dm e t h o dw 鸽m e nv e r i f i c a t i o nb yt h e 蝴ls 锄p l e sw i t hs a t i s f 犯t 0 叮他鲫l t s t h i s p a p 盯c o n s i s t j so f t t l r c ec l 扭p t c r s ： i i lc i l a p t e rl ：t h i sc h a p t e ri n t r o d u c c ds o m em e t h o d sf o rt l l e 锄a l y s i so fs o m ec o m p o u n d s c o n t a i n i n gn i 打o g e na t 咖i nt h e i rc h e m i c a ls 嘲j c t u r e s 。t h e 辩a n a l y s i sm e t h o d sa r em a i n l y 曲m a t o g r a p h y 锄i ds o m eo ft h e mi 魄v eb e c nw i d e l yi l 辩d 嬲m 【t i 伽a l s t 觚d a r d s t h e a d v 锄t a g e so fc a p i l i a d ，e l e c 仃0 p h o r e s i s 舔锄a l t e m a t i v em c t h o dw e 他踟m m a 血e d ai i lt l l i s s e c t i o i l a n di t st ) ，p i c a la p p l i c a t i o nt 0s o m ec o m p o u n d sc o n t a i n i n gn i t l d g e na t o mi nm e i r c h e m i c a ls t m c t u f e sw 邪p r e s e n 倒 i i lc h a 昨r2 ：an o n a q u e o u sc em e t h o d 、) l ，a sd e v c l o p e df o rt h eq u a n t i t a t i v cd e t e 肌i r l a t i o n o fa c 巧l 锄i d e mt r a d i t i o n a lc h i n e s cm e d i c i n e a c l 锄i d e q u i 佗sap r o t o ni r ia1 0 w - p h e n v i r o m n e n ti i la c n ，a n dm e r c b ym i 舯t e su n d c ri t so w ne l e c t r o p h o r c t i cm o b i l i 妙i nc e t h u s ，n o n a q u e o u ss e p a r a t i o no fa c l a m i d ew a sa c h i e v e db ye m p l o y i n g 3 0m m o l lh c l 0 4i n a c na st h em n n i n ge i c c n d i y t c ，w o r k i n ga t2 0k vi nu n - c o a t e df i l s e ds i l 沁ac a p i l l 撕e s d i r e c t d e t i e c t i o nw 邪c a r r i e do u ta t19 8n m t i h er u n t o m n 锄dd a y - t 0 - d a yp r e c i s i o n sf o rt h e c o r r e c t e dp e a ka r e 笛w e r ec a l c u l a t e d 嬲0 4 一1 7 锄d1 1 2 4 ，佗s p e c t i v e l y n em e t h o di s s i m p l e ，r a p 缸i n e x p e n s i v e ，锄da p p l i c a b l ef o rt h ed e t e n n i n a t i o no fa c 巧l a n l i d ei nc h i n e m e d i c i n e i nc h a p t e r3 ：n i t r i t c ，n i 臼a t e 锄dt h i o c y a n a t e ：h a v eb e e nq u a n t i f i e di nn o n - s m o k e ra n d s m o k e fs a l i v ab yc a p i i i a 叮z o n ee i e c t r o p h o r e s i s ( c z e ) ，u s i n ga2 0m m o l lp h o s p h a t eb u 仃e ra t p h6 o ( i o n i cs 仃e n g t hw 嬲删u s t e dt 0o 0 8 1 6m o l l ( gw | t hn a 2 s 0 4 ) a sam n n i n gb u 仃e r n e p r o t e i n sa n de n z y m e si ns a l i v as a m p l e 、e r er c m o v e db yc e n t r i 如g a t i o n 鲫df i l t r a t i o no f t h e m i x t u r eo fa c e t o n i t r i l ea n ds a l i v as a m p i e b r o m a t ew a ss e l e c t e da s l ei n t e m a l 嘲n d a r d h a b s 仃a c t b e c 硼i tw 嬲i m p o s s i b i yp r e s e n ti l l0 r i g i n a i 鼹l i v a 锄di td i dn o ti n t e r f b r e dw i 廿ln l e l e c t e d t i l p 舳i o n s l i n e a r i 锣o ft h er a l i o0 fp c a l ( a 私f o r 锄a l y t c 锄di n t e m a l 咖d a r da g a i n s t a n a l y t cc o n c e n t l 锨i o n 懈0 b s e n ，e d 矗0 n ao 0 1t 01 o om m o 扎w i t hal i n e 盯c o e f f i c i e n 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论文，是我个人在导师( 鼋殛指导并与导师合作下取得的研究成果，研究工作及取得 的研究成果是在河北大学所提供的研究经费及导师的研究经费资助下完成的。本人完全 了解并严格遵守中华人民共和国为保护知识产权所制定的各项法律、行政法规以及河北 大学的相关规定。 本人声明如下：本论文的成果归河北大学所有，未经征得指导教师和河北大学的书 面同意和授权，本人保证不以任何形式公开和传播科研成果和科研工作内容。如果违反 本声明，本人愿意承担相应法律责任。 声明人：i 童! 兰丝生日期：丝年厶月上日 作者签名：圃i 笪笙 导师签名： 狴坌二匡 日期：二垫l 年厶月卫日 日期：丑年l 月翌日 第1 章绪论 第1 章绪论 有毒的含氮化合物有很多，化肥，农药中不乏这类物质。它们和人们的生产生活密 切相关，其中众所周知的有亚硝酸盐，硫氰酸盐等，另外近几年，关于油炸食品中丙烯 酰胺的研究也成为国内外研究的热点，下面对当前它们的研究作一介绍。 1 1 丙烯酰胺的研究 2 0 0 2 年4 月，瑞典斯德哥尔摩大学首次在油炸及焙烤的马铃薯和谷物类食品中发现 了潜在致癌物一丙烯酰胺( a c r y l 锄i d e ) n 1 ，由此引起各国的高度关注，并展开了广泛深入 的研究。 丙烯酰胺有很多的分析方法，其中气相色谱、高效液相色谱与质谱联用技术满足了 测定中样品成分复杂以及研究中对灵敏性和精确性的进一步要求，是公认的最有效和权 威的方法乜吲。比色法，极谱法等方法，现在报道较少，目前收集到的英文文献8 8 篇， 其中以直接测定丙烯酰胺含量为目的有3 5 篇，还有许多研究它的形成机理、危害、抑 制形成的报道。收集的中文文献有2 9 篇，其中直接测定为目的的有l l 篇。浙江大学的 z h a n gy u 等h 1 对丙烯酰胺测定做过比较详细总结，此处则主要对气相色谱、液相色谱及 与质谱联用测定中的一些要注意的问题和一些实际的应用作一简单介绍，特别是毛细管 电泳方法，目前在测定丙烯酰胺上的报道不是很多，这里把收集到的文献做一简单归纳。 1 1 1 丙烯酰胺的气相色谱分析 丙烯酰胺是一个极性分子，为了适合气相色谱分析，溴化衍生经常用到。它的优点 在于可以降低样品的极性，增加挥发性，使之在气相色谱仪器内更容易气化，同时提高 了选择性和灵敏度。溴化的方法有两种，一种是使用k b r 、h b r 及饱和溴水，另一种是 通过酸性条件加入k b r 和k b r 0 。，用还原产生的溴进行衍生，以避免溴的接触，减少环 境污染。溴化加成技术性较高，具有操作费时，条件不易控制等缺点。两种溴化衍生方 法在有关丙烯酰胺国家标准中都有运用，情况见表1 1 。 由所列的标准方法中发现，多采用气相色谱一电子捕获检测器( e c d ) ，这是因为e c d 本身是一种灵敏度高，选择性强的检测器，它只对具有电负性的物质，如含s 、p 、卤 河北大学理学硕十学位论文 表1 1 丙烯酰胺国家标准有关气相色谱方法比较 t a b l e1 1 c o m p a r i s o no fn a t i o n a ls t a n d a r d so fa c r y l 锄i d eb yg a sc h r o m a t o g r a p h ym e t h o d s 标准样品方法衍生进样检测限 素的化合物、金属有机物及含羰基、硝基、共轭双键的化合物有输出信号，而对电负性 很小的化合物基本无输出信号。丙烯酰胺经溴化后生成的2 ，3 一二溴丙酰胺含有2 个溴 原子和一个羰基，电负性极强，很适合e c d 检测。 另外一种衍生方法是五氟苯基异硫氰酸酯衍生法m 1 ，该方法是利用l 一颉氨酸、五氟 苯基异硫氰酸酯参与反应，用g c m s m s 进行测定，其检测限可达0 0 0 3 烬几，灵敏度 比较高，但是与溴化的方法相比，该方法操作过于复杂，比较费时，测定成本大，有干 扰问题等，主要还是以溴化衍生为主。 不衍生的方法也有报道，这样可以节省时间，但是有报道称可能使测定结果偏高哺。7 1 。 1 1 2 丙烯酰胺的液相色谱分析 液相色谱大量用于丙烯酰胺分析，样品提取常用水哺1 、乙腈等，提取过程常有加热、 摇床、超声波等促进提取，但是也要注意对固相萃取可能的影响，有无产生额外的丙烯 酰胺等。经过油炸的食物样品常利用丙烯酰胺在烷烃化合物中的低溶解性，以正己烷、 戊烷、庚烷或石油醚m 、环己胺等进行脱脂净化。 在液相色谱分离当中，反相色谱相对应用较多，正相色谱较少。p a l e o l o g o sek ， 第l 犟绪论 k o n t 伽i n a smg 把正相色谱u 们用于丙烯酰胺和甲基丙烯酰胺的分析，a i i n e xh p x 一8 7 h ( 3 0 0 咖7 8 衄n ) 柱子，o 0 l 啪1 l 的硫酸作洗脱液，在这种条件下分析物被转换成它 们的阳离子，然后发生质子化，再转化成铵化产物，近一步得到了满意的结果。 对于色谱分离之后的检测，串联质谱是最常用的方法，其它的有单质谱以及紫外检 测n ，二极管阵列检测n 1 1 ，电化学检测n 羽等，现对收集到的检测方法比较见表1 2 。 表1 2 丙烯酰胺高效液相色谱分析中的不同检测器 ! 堑! 皇! ：兰兰2 里曼垒呈塑里垡2 里望兰! 垒2 空! 垒! 兰竺：! 箜鲤塑皇! z ! i 12 1 竺翌! 垒翌! 垒! 样品柱子l c 参数检测检测限 液相色谱已经作为某些权威机构测定丙烯酰胺的方法( 表1 3 ) 。美国职业安全与 卫生管理局( o s h a ) 提出有关空气中丙烯酰胺的取样和检测方法，由特制的o s h a 取样 器0 v s 一7 取样，o v s 一7 由一个玻璃棉过滤器和两部分x a d 一7 吸附剂组成。取样器用水+ 甲醇 ( 5 + 9 5 ) 解吸附，洗提液经z o r b a x0 d s 柱分离、液相色谱紫外检测；1 9 9 4 年美国环境保护 组织( e p a ) 建立的高效液相色谱法测定饮水中丙烯酰胺n4 1 ，水样只要经过o 4 5 岬滤膜 3 - 河北大学理学硕士学位论文 过滤即可直接进样检测。 表1 3 有关高效液相色谱法国家标准方法比较 t a b l e1 3c o m p a r i s o n0 f n a t i o n a ls t a n d a r d so f a c 叫l a m i d eb yl cm e t h o d s 样品取样方法 柱子 检测限 单位 特制的o s 姒取样 用z o r b 觚0 d s 柱分o 0 0 1 2 5 空气器0 v s 一7 取样，水+ l c u 、f ( 2 0 0 珊)0 s i i a 离m g r 甲醇( 5 + 9 5 ) 解吸附 饮水 过滤即可直接 竺：! ：誓萎薹裟相，。眦叭 ( 1 9 5n m ) 高效液相色谱柱 一 以上有关气相或液相色谱的分析方法，测定样品主要针对水和空气，对于食品中丙 烯酰胺的检测，国际上尚无统一的标准方法。 1 。1 。3 丙烯酰胺的毛细管电泳分析 虽然目前对丙烯酰胺的检测多采用气相色谱或液相色谱与质谱联用方法，但是随着 研究的深入，毛细管电泳也因为诸多优点，被成功用在丙烯酰胺分析上。目前有关的文 献报道不是很多，掌握的文献情况如表1 4 。 西班牙b e r 叫d oe 所在的研究小组对以毛细管电泳测定丙稀酰胺进行了大量研究工 作，先后在色谱a 发表了多篇文章。首先以毛细管区带电泳对食品中的丙稀酰胺进行分 析n 町，以2 一巯基苯甲酸为衍生试剂，衍生时间较长，要放置3 小时。 其次为了增强c e 测定的灵敏度，研究小组把场放大样品进样( f a s i ) 、样品堆积移 除( l v s s ) n 们两种富集技术用于丙稀酰胺的检测。该实验在样品提取上和前一实验基本 相同，继续进行衍生，但是对过量衍生试剂加入醋酸铅( i i ) 进行移除，实验更加复杂， 且不易控制。 然后为了进一步提高方法的选择性和灵敏度，2 0 0 7 年b e r m u d oe 等n 刀又对2 一巯基 苯甲酸衍生物进行质谱分析，结合场放大进样分析了食品中的丙烯酰胺含量。 依 止要 嘲懈 刊燃 。” 。o目。-】【州-p时目一a骞二p州事ii叫lqp 一 口。州pu1ii州。一q目时口。州铀州_【a蜀勺一刊-一h匕 1 m t l 量oon凸司q 【g 0目t i i o t l 岭o o o 咭t f 卜o o 0 ，iti h o o o 国i t t 卜o o 萎o【n 磐峰甾哥 冒_ohn凸司q昌oh譬 攥辫鹜z譬甾联担1ho昌o 妻n_0o|【毛幂铤鹾郴 琪十窨1ho基。寸会藩1ho看。崎 o 【i i a 疑臻*豚袋镒蛊1【o邑 甓是群辐甾鼙1【o重。呻 矮是螺翊镒鼙1ho看导 急。目。呻 限 田n棼戏 貅r基臻窿。曲h 球姐s a l涨姐h v d 誉镒踺 醢醐壬 限 止叫叫 甾 将 疃扯 粥媾，n 甾吁将 墒媾i n 舫昔晷 巾签 艇硼皇rf吣卜 u p口【叫 茸un荨魁惘目t1卜 堪硼目t l o 半。o a3宝ooon匕iv 口星u山茸日lo宙 搿徊目j卜 8 昌u o 田o 口口苫u山ij日lumlq 甾 将 中蕊率 搿硼昌tt田卜 8 搁壤l 代 $ 糕铝 暑是o崎 o。吣2d ub里。a 嗟露辑 露辑 棼撩锻隶 卖 封 霉肇e l | 州浆 疃妻 瓤弱婶 稚警 opi善一j2 uoo暑og衄u oo岛o一磊qgou寸i q 一口时一 铎丑趟恹嚣1串驰最岬s簪蛋瑷腔鼍【琳 嵇躲册一缺 河北大学理学硕士学位论文 该研究小组虽然先后都采用了衍生的方法，但是分别采用了贝克曼的5 5 0 0 和p a c e 舳q 两种不同型号的仪器，毛细管的长短、粗细也不同，缓冲液的组成和最后的检测也 存在差异。实验中采用的富集技术，是提高灵敏度的好方法，由于不需要特别的设备而 得到广泛的应用。其中f a s i 非常流行，是提高灵敏度的好方法。 为了简化实验操作，2 0 0 6 年，周殉、曹成喜等n 阳首次以胶束电动毛细管色谱对土豆 中低水平的丙烯酰胺进行了分离和检测，得到满意的结果。样品以甲醇提取3 次，经过 振荡，离心，蒸发溶剂，以水溶解，己烷脱脂等一系列处理。虽然实验操作过程得到了 很大的简化，但是仪器运行一次还需要3 0m i n 左右。另外涉及十二烷基硫酸钠( s d s ) 的使用，溶液容易产生泡沫，不便操作。 总结了几种方法的不足，那么有没有一种更简单使用的方法呢? 2 0 0 6 年p o r r a ss p 提出的在非水条件下测定几种弱碱的报道给丙烯酰胺的测定带来新的希望。他从毛细管 区带电泳的原理出发，通过以有机溶剂代替水，在非水条件下解决了水体系中不易质子 化的难题，成功的以含高氯酸的溶液作背景溶液，测定了几种弱碱。鉴于这一报道，s e l d a bn 们以非水毛细管电泳对食品中的丙烯酰胺进行了分析。他们以3 0 珊0 1 几高氯酸的乙 腈溶液作运行电解质，使丙烯酰胺在低p h 条件下发生质子化，而在电泳中发生迁移。 样品以乙腈提取，振荡，加己烷脱脂3 次，离心，过滤，就可以直接进样。方法突出的 优点是样品处理步骤相对简单，并且不需要衍生，分析时间较短，在3 4m i n 之间， 避免了许多干扰，灵敏度也比较高。 从以上的报道中发现测定样品多为土豆片，咖啡类的食品，而对我国的传统中药报 道较少。要对复杂成分中的目标物质提出有效的分析方法，就对研究提出了很大的挑战。 通过文献研究，希望在非水条件下选择合适的实验参数，对中药中的丙烯酰胺分离检测。 1 2 硝酸盐、亚硝酸盐及硫氰酸盐的研究 硝酸盐、亚硝酸盐、硫氰酸盐也是常见的含氮化合物，它们和某些癌症的发生有着 密切的关系陋甜1 。在当前开展戒烟的背景下，通过唾液中硫氰酸盐含量测定还能评价戒 烟效果。 为避免硝酸盐与亚硝酸盐的危害，除了要科学合理地施行环保措施和注重生活、饮 食夕 ，研究人员提出抑制，降解的方法。江瀚，马正驰恤1 发明了一种微生物亚硝酸盐降 解剂，应用于各种水体水质的净化处理。王鹏，李楠乜3 3 发明了微波辅助处理高浓度亚硝 第l 章绪论 酸盐废水的方法，它属于工业废水处理领域，亚硝酸盐的去除达9 0 以上。姚贵安等泓1 发明一种消除饮用水中硝酸盐和亚硝酸盐的方法，经处理的饮用水完全达到国家标准。 硝酸盐，亚硝酸盐检测有很重要现实意义。在水质监测，植物和土壤的营养状况评 价，刑事侦查上发挥了重要作用。t a g l i a r of ， b o r t 0 1 0 t t if 等瞵1 提出了毛细管电泳 方法用于枪炮开火后的残留物，成功的测定了受害人头发和皮肤样品中的亚硝酸盐和硝 酸盐，为刑侦提供依据。 1 2 1 硝酸盐、亚硝酸盐的测定方法 测定硝酸盐和亚硝酸盐的方法有很多，其中离子色谱法1 是首选方法，应用也较多。 光谱分析法测定有很高的灵敏度。动力学光度法，荧光猝灭法汹，化学发光法在 测定硝酸根和亚硝酸根离子中都有应用。这些方法往往需要先测定一种，然后再测定另 一种，不能达到同时测定，而且对于复杂的样品，干扰也较大。化学法测定需要的仪器 较简单，易于推广，有利于条件一般的实验场所的测定，但是灵敏度不高。对于极谱法， 样品对测定影响比较大，方法受的干扰因素较多，这方面的报道较少。李建平等咖1 研究 了甲基橙亚硝化产物的极谱波行为，提出了亚硝化极谱法测定亚硝酸根的灵敏极谱波新 体系。 另外为了适应复杂的测定环境，实现快速测定，出现了一些半定量方法，例如张山 泉，陈川等m 1 发明了一种快速测定蔬菜中硝酸盐的速测盒和检测试剂，微量取样针。它 们主要利用硝酸盐和亚硝酸盐与试剂发生颜色反应，通过颜色的变化，与标准的颜色图 对照，从而确定样品中硝酸盐和亚硝酸盐含量的大致范围。目前这些方法测定精度还不 高，有的操作仍很复杂，有的试条本身百元左右，也并不经济。有关硝酸盐或亚硝酸盐 测定专利见表1 5 。 1 2 2 毛细管方面的研究 毛细管电泳技术能够实现多种离子的快速同时检测，是另一种测定硝酸盐和亚硝酸 盐的方法。在1 9 9 3 2 0 0 6 年问，它在阴离子测定方面的报道很多，有关硝酸盐和亚硝酸 盐测定的英文文献情况如图1 1 ： 河北大学理学硕士学位论文 l 3 一l 51 9 一1 9 驰1 9 9 9 2 0 0 l2 2 2 0 0 42 0 0 5 2 0 0 6 时间段年 图1 1 毛细管电泳测定硝酸盐和亚硝酸盐的英文文献 f i g 1 1c 印i l l a d ，e l e c 仃0 p h o r c s i sd e t e 舶i n a t i o no fn i t r a t e 锄dn i t r i t ei ne n 蛐s hl r a t u r e 在硝酸盐和亚硝酸盐的毛细管电泳分析中，区带电泳汹最常用，毛细管离子电泳啪1 等也有报道。在某些情况下，由于样品中的目标物质含量较低，用常规的毛细管电泳方 法很难测定，为了满足痕量分析的要求，除了改进仪器结构和检测方法之外，往往要用 到在线富集技术，主要有样品堆积、扫集、等速电泳、动态p h 连接、固相萃取等。k a n i a n s k y d ，z e l e n s k yi 等1 用在线毛细管等速电泳一毛细管区带电泳，电导检测联用，对氯化 物，硝酸盐，硫酸盐，亚硝酸盐，氟化物和磷酸盐进行检测。对于仪器改进方面，y a 0w 和x usk 采用流动注射与毛细管电泳联用( f i - c e ) 接口进行自动连续采样，以流动注射 一毛细管电泳h 直接测定环境水中的硝酸根和亚硝酸根。 毛细管的长短，粗细也对分离产生较大的影响，合理的分析时间和分离效果一直是 分析实验所期盼的。通常毛细管长度在1 0 0 肛m 以下，长的常见为7 5c m ，短的有3 0c m 左右，显然长而细的毛细管使分析的时间延长。毛细管也有涂层毛细管h 2 1 和未涂层之分， 未涂层毛细管的制作相对较复杂。 在毛细管电泳测定硝酸盐和亚硝酸盐的有关研究当中，通常是用直接紫外检测，检 测波长选择2 0 0n m 左右争惦1 ，这和测定对象和样品的基质有关，对于干扰的排除很重要。 也有用间接紫外检测6 1 的，原因是大多数无机离子在紫外区没有吸收或吸收很弱， 6 4 2 o 8 6 4 2 o 壤棚箍议 跟搿曝 聚甾擦缒将畦舔皿链鹾艇 锚髯靶寮毒|器链鳝 姻甾缮甾餐将醐腻灰篷耆肇 幂恹骅豁站缝鼙鲞；笔 繁蛙艇锸融 镒锯兹鳝熊口锚餐将郴腻靛 长霹樵 铋悼鼯缝壹肇a镒罄将粥胍茛 锄)l叫目oo呻oo一 警n状相甾器茸 sl奢o【穴捌锱器 棚习轺肇嚼 均)i3目h状钮链驾 永oooo宁内oooo 越矮卿峰 嘲议掣议 箱盛普导株措 矧箭酱爿辐程鼍 g 岳眯* 株糯 籍甾器g廿绦徭 辐斑翟爿七b隧 珩i|f遴碟暑岽 龌扑藻爿瓤娜痞 蓬状 拳株褥篮料藻爿长l 抖怔裂 静l | f 鹾 【ic一本世埘删帮冥 谣箱露轺琼锢幕 垛r 1 1 装 锻嘲如矧瀣翟株缮 暮燃 稚$h恹露轺弑嗡镅幂蛞 浆蜊斟删钿绷淄器爿冥相镒普账长球糟燕掣 静 爵恤h i - 燃恹坡嚣 g矧镫翟磔椿熏l 舔翅丹犯罐 吾】樊磊 辑甚州翊甾鬻爿噬 蕊妖奄貅 帮 锢甾器斟船长呕钲 凼螺、丘扑烈爿遮扑德貅肼髓巡幽静叶肼疆齄呶匝手躯怕恒 一奢一 燃恹雄器辣隧嫌鳝嚣辎翊斑器高嚣1 藤蛞旺篷 晤强披露 聪灰披露 、r 磐蚤 、r 器越 棰婶蜜越 芑。藿co毛daui q专jo尝皇li勺磊q藿巷j0皇。一藿一番里占=q一丑昌 熏秘霉越g波嚣翊瀣翟爿罢辎甾翟水忙旧【僻 嵇躲褂一躲 锢程钼甾心砉肇 签舔 黏镫fz念誉器睾靡举爿*降枢稍 *疆撼镒悼鼹 斑捌镒悼熙甾餐 哪议 目。呻n矧程翟黼 目 oooo荨矧谣器 钼程 罄茸冥钼甾篷亡b呕啦 捌毹 鼹斟稍锚篷株褥呕啦 裙对醛忙枣整 匾球爿林熏$忸糕k 辎时卅鞋椒卷 扑k 目嶷 靼牲骧黾革餐趔畎 【上一v 燃恹嚣掣删披譬钼铤鬻冥矧甾普茸导喏缸雾。暖翅林越螺箔披嚣 制$捌斑鼍斟捌锚眢 幂爆旺蓬 匝挺披嚣 搽莨披磊 轰 e b 9 8 5 ) ；高氯酸( 优级纯，天津市华东试剂厂，含 量7 卜7 2 ) ；冰醋酸( 分析纯，天津华东试剂厂) ；d m f ( 分析纯，天津鼎盛化工材料 厂) ，含量9 9 5 ；丙烯酰胺( 分析纯，s o l o no h i ou s a ) ；甲基丙烯酰胺( 分析纯， w e s tc h e s t i e r ) 。 2 2 3 实验方法 2 2 3 1 储备液的配制 2 0m o l l 高氯酸的冰醋酸储备液：在5 0m l 的容量瓶中加入适量的冰醋酸，再移 取加入高氯酸，然后加入乙酸酐，冷却室温，最后冰醋酸定容。由此过程用冰浴( 放热) ， 并且要缓慢加入。注意不得将高氯酸与乙酸酐直接混合，且须放置2 4 小时后使用。 配制丙烯酰胺、甲基丙烯酰胺5 0 0 熠：m l 的乙腈储备液，用时逐级稀释。d 肝的乙 腈储备液lm g m l 。 2 2 3 2 样品处理 天冬样品购自当地药店，买来后除去杂质，然后剪成小块，放在烘箱中烘烤2 0 分 1 3 河北大学理学硕士学位论文 钟，取出放置冷却，粉碎，放在干燥器备用。 准确称取5 0 0g 天冬样品，加入1 0n i l 的甲醇涡旋混匀，超声5 分钟，提取液转移到 一小烧杯中，然后用空气吹干溶剂，再在固体残留物中加入3 皿l 的乙腈，搅拌，充分的 溶解，溶液用0 4 5 呻微孔滤膜过滤，滤液转移到盛样品的小瓶，进样分析。 2 2 3 3 电泳条件 新的毛细管柱直接用背景电解质溶液冲洗，而不采用1 1 几的氢氧化钠和水冲洗， 可以避免实验过程中出现的电流不稳定的问题。每次仪器运行期间用背景电解质溶液， 1 0p s i 压力冲洗2m i n 。注意乙腈的易挥发性，高氯酸的冰醋酸溶液储备液体积受温度 的影响等条件对结果的影响。 实验条件：以高氯酸的乙腈溶液为背景电解质，分离在2 0k v ，温度2 0 ，o 3p s i 压力下进样3s ，检测波长1 9 8n m 。 2 3 结果与讨论 2 3 1 分离条件的选择 2 3 1 1 背景和溶剂的选择 在冰乙酸中高氯酸为最强的酸，在乙腈中高氯酸也比氢溴酸，盐酸，硫酸，硝酸强。 这样就尽可能在较低的浓度值时使被测物质丙烯酰胺完全的质子化，而溶液的电导率 又不是很高，使其适合非水体系中毛细管区带电泳分析。 2 3 1 2 分离电压的影响 在非水毛细管电泳( n a c e ) 中，分离电压也是影响电渗的个重要参数。一方面， 非水介质中的电流值和焦耳热均较水相介质中小得多，因而在非水介质中可以使用比较 高的分离电压。电压升高，分析时间缩短，但毛细管中焦耳热增大，基线稳定性降低。 灵敏度降低；电压太低，分析时间延长，峰形变宽，导致分离效率降低。本实验采用2 0 l 。 2 3 1 。3 背景电解质浓度对分离的影响 实验了在1 0 5 0m m o l l 的不同浓度b g e 条件下，三种标准物质的分离情况见图 2 1 ： 第2 章非水体系一中药中丙烯酰胺含量c z e 分析 图2 1 背景电解质浓度对分离的影响 f i g 2 1e f j 眈t0 f b u 虢rc o n c e 肭眦i o n p a m t i a _ _ e 分别为l o 、2 0 、3 0 、4 0 、5 0 咖0 1 l 的背景电解质； 1 ，2 ，3 分别为d 岍，丙烯酰胺，甲基丙烯酰胺各1 2 5l ig m l ； 电泳条件：分离电压2 0k v ，温度2 0 ，在0 3p s i 压力进样3s ，检测波长1 9 8 姗。 由图可见随着背景电解质浓度的增加，对三种物质的分离度几乎无影响，不利于复 杂样品中内标物的加入；另一方面，浓度越高，电流值大，当背景电解质浓度为5 0 咖1 几 时，电流值在1 0 0 衅以上，功率在1 7 0 0w 左右，这意味着产生的较多焦耳热，不利于 实验。本实验最终选择3 0i 硼0 l l 的背景电解质。 2 3 1 4 水的影响 实验尝试了在2 5m l ，3 0i i i 1 0 1 l 的背景电解质中分别加入o 1 2 5 、0 2 5 0 、0 3 7 5 、 o 5 0 0n l l 的水，测量发现由于水的加入，分离度更高，所以可以用加水多少来改善样品 分离，同时可以在体系中添加内标。另一方面它也会使迁移时间延长，最长达9m i n ， 但是可以接受。本实验最终选择2 5n l l 背景溶液加0 5 0 0 l l 的水。图2 2 是d 肝，丙烯 酰胺，甲基丙烯酰胺三者分离情况( 各1 2 5 鹇m l ) 。 河北大学理学硕士学位论文 3571 0 1 t i m ，m m 图2 2 水对物质分离的影响 f i g 2 2e 腧c t o f 啪l e r v 0 i 啪e o n p a r a t i o n 电泳条件：分离电压2 0k v ，温度2 0 ，0 3p s i 进样3s ，检测波长1 9 8 姗。 背景电解质溶液3 0 咖0 1 l ，再加不同体积的水 l ，2 ，3 分别为d 肝，丙烯酰胺，甲基丙烯酰胺各1 2 5i lg m l ； a - d 分别为2 5m l 背景溶液加入o 1 2 5 ，0 2 5 0 、0 3 7 5 、0 5 0 0m l 水 在以上最佳的实验条件下，对系列浓度为0 5 ，l ，5 ，1 0 ，2 0 ，3 0 ，4 0 ，5 0 ，6 0 ， 7 0 熠肺l 的丙烯酰胺标准溶液( 甲基丙烯酰胺浓度1 0 嵋肺l ) 进行测定，然后以丙烯 酰胺浓度为横坐标，以与内标物峰面积的比值为纵坐标作图2 3 ，其线型方程为y = 0 0 5 0 0 l + 0 1 4 4 5 3 x ( 相关系数r 2 = o 9 9 9 5 ，n _ 1 0 ) ，线性关系良好。 。 ! 。 l l 4 2 o o1 0 3 0o 5 0e o7 0l o c o n c e n t r ti o n ug - l 图2 3 丙烯酰胺的工作曲线 第2 章非水体系一中药中丙烯酰胺含量c z e 分析 f ig 2 3c a l i b m t i o nc u r v eo fa c q i a m i d e 电泳条件：分离电压2 0k v ，温度2 0 ，在o 3p s i 进样3s ，检测波长1 9 8 衄。 3 0 嘲i l 背景电解质溶液，加体积5 0 ；i 的水 2 3 2 精密度 方法的重现性，在一天内分别对5 ，2 0 ，6 0 峙i l l l 的丙烯酰胺标准溶液连续测定五 次( 甲基丙烯酰胺浓度l o 增肺l ) ，连续做三天，计算天内和天间的相对标准偏差，结 果如下表2 1 ： 表2 1 仪器定量参数 t a b l e2 1i n s t r u m e n t a lq u a n lit yp a r a m e t e r s 参数数值 运行天内r s d 9 6 ( n ：5 ) 丙烯酰胺内标( 面积比) 5 舭 2 0p g m l 6 0 舭 天闯的r s 蹒( n = 3 ) 丙烯酰胺内标( 面积比) 5 舭 2 0 舭 6 0 陷，m l o 4 o 9 1 7 1 1 2 0 2 4 2 3 3 样品的测定 经高温烘烤的天冬样品，丙烯酰胺含量会有所上升，温度越高，生成丙烯酰胺的量 越多。在最佳实验条件下，对经过1 6 0 ，1 8 0 烘烤的天冬样品进行分析。下图即为 1 8 0 的样品电泳图( 图2 4 ) ，可见样品能实现很好分离。 河北大学理学硕士学位论文 o26e1 0 21 4 1 1 m e f m 矾 图2 41 8 0 的样品电泳图 f i g 2 4e l e c t r o p h e r o g r a m so f1 8 0 s 锄p l e 丙烯酰胺，甲基丙烯酰胺添加水平各l o 烬m l ，条件同图2 3 ；a 一加标后，b - 加标前。 测定结果为：1 6 0 、1 8 0 的天冬样品丙烯酰胺含量分别为0 1 1m g k g 、2 0 5 m g k g ，与权威的f d a 所公布的0 6 9 3 2 5 l om g k g 范围接近哺，证明该分析方法是切 实可行、准确可靠。 2 3 4 准确度 在经处理后的空白基体中加入丙烯酰胺和甲基丙烯酰胺标准溶液，得到终浓度为1 0 i lg i n l 的样品溶液，经回收检测，计算出目标样品与内标的峰比值，并与未经处理的样 品溶液的峰比值相比，计算出回收率。数据如表2 2 所示，均符合定量分析对回收率的 的要求。 表2 2 不同温度样品加标回收率( r = 2 ，n = 2 ) t a b l e2 2r e s u l t so fr e c o v e r yt e x t ( r = 2 ，n = 2 ) 他 住 协 位 ” n n n n n n n n 量至雳 第2 章非水体系中药中丙烯酰胺含量c z e 分析 2 4 结论 本文打破一般在水条件下进行区带电泳分析的模式，而以乙腈代替水，把高氯酸的 冰醋酸乙腈溶液作为背景，在这种非水体系中利用区带电泳测定丙烯酰胺，实验操作简 单，省时，比有关报道节省时间至少一半以上，通过实验条件的探讨，成功测定中药中 丙烯酰胺含量。 河北大学理学硕士学位论文 第3 章毛细管电泳法分离分析唾液中