（海洋化学专业论文）肠球菌抗生素抗性指纹图谱库的建立及其准确性研究.pdf

中文摘要 摘要 抗生素抗性分析法( a n t i b i o t i cr e s i s t a n c ea n a l y s i s ，a r a ) 作为经济有效的 的粪便污染源示踪工具，在欧美等国已开展并得到了应用。本文在研究肠球菌具 有a l i a 方法示踪因子可行性的基础上，检测了来自人、狗、鸡、牛、猪五个物种 源粪便中5 0 0 株肠球菌的抗生素抗性，并对其应用判别分析法构建了抗生素抗性 指纹图谱库，得出了指纹图谱库的准确性并对其影响因素展开讨论。目的在于合 理有效地构建抗生素抗性指纹图谱库，促进我国利用a r a 法在识别粪便源技术中 的应用。 主要结果如下： ( 1 ) 不同物种源粪便中的肠球菌与肠球菌标准菌株在模拟的自然海水环境下， 存活量随时间逐渐衰减，生存天数为1 8 - 2 0 天，但不同物种来源的肠球菌与肠球 菌标准菌株的存活规律之间略有差异；肠球菌的抗生素抗性在始终未发生变化， 并且与其原始的抗生素抗性保持一致。因此选择肠球菌作为a r a 的示踪因子。 ( 2 ) 对5 0 0 株肠球菌抗生素抗性特征进行耐药率及多重耐药性分析，结果表明五 个物种源之间的抗生素抗性具有差异显著性，可以用于抗生素抗性指纹图谱库的 构建；对五个物种源具有的耐药表型重叠情况统计分析发现人源与其他物种表型 重叠数较多，可能导致指纹图谱库中人源的准确性相对其他物种源低。 ( 3 ) 应用判别分析法构建的抗生素抗性指纹图谱库，在任何一种判别模式下稳 定性良好，在金州湾v s 星海湾、人源v s 非人源判别模式下得到的准确性最高，分 别为7 1 0 与6 9 0 ，应用验证组合得出本数据库最适的判别模式为人源v s 非人 源。 ( 4 ) 随机抽取的样本量8 0 时指纹图谱库的准确性基本一致，a r c c 在 5 7 8 0 0 5 8 2 之间，样本量不是影响本指纹图谱库的主要影响因素；在日后工作过 程中可以考虑增加抗生素种类，并去掉万古霉素，氯霉素与磷霉素可能会提高抗 生素抗性指纹图谱库的准确性。 关键词：粪便污染、肠球菌、抗生素抗性分析、指纹图谱库 英文摘要 a b s t r a c t a sac o s t - e f f e c t i v ef o rf e c a lc o n t a m i n a t i o ns o i e c c st m c l d n gt o o l ，a n t i b i o t i c r e s i s t a n c ea n a l y s i s ) h a sb e e na p p l i e di ne u r o p ea n dt h eu n i t e ds t a t e ss u c c e s s f u l l y t h ep r i n c i p l ei st h a tu s i n gt h es a m et r a c e rw i t hh o s ts p e c i f i c i t yo fa n t i b i o t i cr e s i s t a n c e f r o mt h ef e c e so fd i f f e r e n ts o u r c et oi d e n t i f yf e c a lc o n t a m i n a t i o ns o u r c e s b a s e do nt h e f e a s i b i l i t ys t u d yo fe n t e r o c o c c u sa st r a c i n gf a c t o ro fa r a ，i ti sd e t e c t e d5 0 0s t r a i n so f e n t e r o c o c c ia n t i b i o t i cr e s i s t a n c ef r o mf i v es p e c i e sa sp e o p l e ，d o g s ，c h i c k e n s ，c o w s ，a n d p i g s t h e nw eu s e dd i s c r i m i n a n ta n a l y s i st oc o n s t r u c tf i n g e r p r i n td a t a b a s eo fa n t i b i o t i c r e s i s t a n c e ，a n do b t a i n e df i n g e r p r i n td a t a b a s ea c c u r a c y f i n a l l yi ti sd i s c u s s e dt h ef a c t o r s o ft h ea c c u r a c ya n d p r o m o t e dt h ea p p l i c a t i o no fa r a i nf a e c e ls o u l c et r a c k i n gi n0 1 1 1 c o u n t r y 1 1 1 em a i nr e s u l t sa sf o l l o w e d ： ( 1 ) e n t e r o c o c c io fd i f f e r e n ts o u r c e sf e c a la n ds t r a i n so fe n t e r o c o c c is t a n d a r di n s i m u l a t e dn a t u r a lw a t e re n v i r o n m e n ts u r v i v a ld e c r e a s e sw i t ht i m eg r a d u a l l y , s u r v i v a l t i m ew a sf r o m18t o2 0d a y s ，b u tt h e r ew a sl i a l ed i f f e r e n c ei nt h es u r v i v a lo fl a w ； e n t e r o c o c c ia n t i b i o t i cr e s i s t a n c eh a dn oc h a n g ea n dc o n s i s t e dw i t ht h eo r i g i n a l c o n d i t i o n t h e r e f o r ee n t e r o c o c c u si sc h o s e na st h ea r at r a c i n gf a c t o r ( 2 ) a n a l y z i n gt h er e s i s t a n c er a t ea n dt h em u l t i - r e s i s t a n c ec h a r a c t e r i s t i c so f5 0 0 s t r a i n so fe n t e r o c o c c i , i ti ss h o w e dt h a ta n t i b i o t i cr e s i s t a n c eh a ds i g n i f i c a n td i f f e r e n c e s a m o n gt h ef i v es p e c i e s ，a n dt h ea n t i b i o t i cr e s i s t a n c ec a l lb eu s e df o rc o n s t r u c t i n gt h e f i n g e r p r i n td a t a b a s e a c c o r d i n gt o t h er e s i s t a n c ep h e n o t y p e so ff i v es p e c i e ss o u l c e 晰t ho v e r l a p p i n gs t a t i s t i c a l ，i ti sf o u n dt h a th u m a nh a v em o r ec h a n c et o g e t o v e r l a p p e dp h e n o t y p i ct h a nt h eo t h e rs p e c i e s ，a n dt h i sm a yc a u s el o w e ra c c u r a c yo f h u m a ns o u r c e si nf i n g e r p r i n td a t a b a s e ( 3 ) f i n g e r p r i n t d a t a b a s eo fa n t i b i o t i cr e s i s t a n c ew a ss t a b l ei n a n yk i n do f d i s c r i m i n a t i o nm o d e 、析t i ld i s c r i m i n a n ta n a l y s i s u n d e rd i s c r i m i n a t i o nm o d eo fj i n z h o u b a yv sx i n g h a lb a ya n dh u m a nv sn o n h u m a n , w eg o th i g h e s ta c c u r a c y , r e s p e c t i v e l yt h e a r c cw a s71 0 a n d6 9 0 v a l i d a t e d s e t sc a m et od e t e r m i n et h eo p t i m a lm o d eo ft h e d a t a b a s ew a ss o u r c ev sn o n - h u m a ns o u r c e so fm a n ( 4 ) t h ea c c u r a c yo ff i n g e r p r i n td a t a b a s er e m a i n st h es a m ew h e nt h er a n d o m s a m p l i n gi sl a r g et h a n8 0 ，谢ma r c cb e t w e e n5 7 8 a n d5 8 2 ，s a m p l es i z ew i l l 英文摘要 n o ta f f e c tt h i sf i n g e r p r i n td a t a b a s e i nt h ef u t u r e ，w ew i l lc o n s i d e rt ou s em o r et h et y p e s o fa n t i b i o t i c s ，a n dr e m o v ev a n c o m y c i n , c h l o r a m p h e n i c o la n df o s f o m y c i n , i tw i l l i n c r e a s et h ea c c u r a c yo ft h ef i n g e r p r i n td a t a b a s e k e yw o r d ：f a e c a lc o n t a m i n a t i o n ) e n t e r o c o c c u s ；a n t i b i o t i cr e s i s t a n c ea n a l y s i s ； f i n) r i n td a t ab ：t m g e r p r m td a t a b a s e 大连海事大学学位论文原创性声明和使用授权说明 原创性声明 本人郑重声明：本论文是在导师的指导下，独立进行研究工作所取得的成果， 撰写成硕士学位论文：肠堡菌抗生塞抗挂指纹图谱廑的建立厘基准确性研 究2 。除论文中已经注明引用的内容外，对论文的研究做出重要贡献的个人和集 体，均已在文中以明确方式标明。本论文中不包含任何未加明确注明的其他个人 或集体已经公开发表或未公开发表的成果。本声明的法律责任由本人承担。 学位论文作者签名： 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者及指导教师完全了解大连海事大学有关保留、使用研究生学 位论文的规定，即：大连海事大学有权保留并向国家有关部门或机构送交学位论 文的复印件和电子版，允许论文被查阅和借阅。本人授权大连海事大学可以将本 学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，也可采用影印、缩印或扫 描等复制手段保存和汇编学位论文。同意将本学位论文收录到中国优秀博硕士 学位论文全文数据库( 中国学术期刊( 光盘版) 电子杂志社) 、中国学位论文全 文数据库( 中国科学技术信息研究所) 等数据库中，并以电子出版物形式出版发 行和提供信息服务。保密的论文在解密后遵守此规定。 本学位论文属于：保密口在年解密后适用本授权书。 不保密( 请在以上方框内打“ ) 一：神衫名：万唯 日期：矽( o 年多月乡p 日 肠球菌抗生素抗性指纹图谱库的建立及其准确性研究 引言 改革开放以来，国民经济迅猛发展，人民生活水平不断提高，但由于污染管 理措施的不同步，海洋生态环境遭到了空前的污染，逐渐变成了人类的“纳污池” 和“垃圾场”，承受着各种环境污染的重负。伴随着沿海人口的递增和养殖业的发展， 人类和动物的排泄物在生活污水总量中所占比重日益增加，使粪便污染成为近岸 海域污染的一个重要污染源。尽管我国投入了大量的人力物力解决粪便污染问题， 然而由于对其认识及防治不到位，使得粪便污染久治无效，也使得水体污染事件 和灾害频频发生。由于粪便污染物多以非点源方式进入环境，具有发生区域随机、 排放途径、排放污染物不确定及污染负荷空间分布差异大等特点，给管理和控制 造成了困难，其治理难点是粪便污染源种类的确定【1 埘。 我国传统的粪便污染监测方法仅能用指示细菌的数量表明水体受粪便污染的 程度，却不能确定其真正污染来源。为弥补传统粪便污染监测方法上的不足，欧 美等国兴起的粪便污染源示踪技术成为解决非点源粪便污染的有效措施。其中， 抗生素抗性分析法( a n t i b i o t i cr e s i s t a n c ea n a l y s i s ，a r a ) 作为一种经济有效的粪 便污染源示踪工具，在美国、加拿大、欧盟的等地区的粪便污染治理中得到了成 功的应用【3 1 。a r a 是利用微生物在环境中的生化特性、遗传多样性及其特异性代 谢产物确定细菌宿主来源的一种技术。凭借对不同动物粪便源中相同示踪因子特 异性抗生素抗性的检测，可以达到识别粪便污染源的目的。由于其操作简单、经 济快速的优势，这一方法作为粪便污染源示踪工具受到了高度重视并得到了广泛 的应用。因而，本论文以国家8 6 3 海洋环境监测技术专题“典型近岸海域粪便污染 源的m s t 监测技术研究”为支撑，采用a r a 方法对不同物种源粪便中分离的示踪因 子肠球菌的抗生素抗性进行差异性分析，并构建a r a 指纹图谱库讨论其准确 性，最终为国家管理部门识别、控制粪便污染源提供科学的理论基础。 第1 章绪论 第1 章绪论 1 1 粪便的非点源污染 粪便作为人类和动物的代谢产物广泛存在于自然界中，当其进入水体后严重 污染地表水和地下水，产生的恶臭气体中氨等有害成分严重污染空气，滋生的病 菌严重影响群众和畜禽健康。尽管我国在解决粪便污染问题上投入了大量的人力 物力，然而现状却是：污染源依在，污染物照排，水质严重超标，污染事件和灾害频 频发生，与环境污染相关的案例更是屡见不鲜 6 - 9 1 。事实警示我们，以往对污染源的 控制管理上仍存在问题，从污染源头上治理才是解决粪便污染问题的关键所在 【l o 1 6 】 o 1 1 1 我国粪便污染的现状 在我国，自新中国成立后畜牧业发展迅猛，随之而来的是禽畜粪便产生量的 增加。1 9 8 8 年我国畜禽粪便发生量为1 8 8 亿吨，是当年工业固体废弃物量的3 4 倍； 1 9 9 5 年达2 4 9 亿吨，约为当年工业固体废弃物量的3 9 倍；2 0 0 0 年达3 6 4 亿吨，相当 于同期工业固体废弃物发生量( 9 5 亿吨) 的3 8 t 音d 7 , 1 5 】。据专家预测，至u 2 0 1 0 年畜禽 粪便产生量将达到4 5 亿吨【1 9 】。不仅如此，国家环保总局在全国2 3 个省市进行调查 发现，9 0 的规模化畜禽养殖场未经过环境影响评价，6 0 的养殖场缺乏必要的污 染防治措施。随着中国养殖业的进一步发展，畜禽粪便排放量还会进一步增大， 由此可见，畜禽粪便污染已成为生态环境保护所面临的严重问题2 0 1 。 1 1 2 粪便污染对水体的污染与危害 粪便和其他污染物质一样，需要在一定的条件下才能对水体产生污染。当排 入水体中的粪便总量，超过水体能够自然净化的能力时，就会改变水体的物理性 质、化学性质和生物群落组成，使水质变坏，并使原有的用途受到影响。首先， 造成污染区水质恶化不能饮用，甚至水源污染不能使用，引起供水困难。第二， 水体富营养化结果造成水生动植物死亡、腐烂、沉淀，并导致污泥增多，给水的 净化处理增加困难。自来水厂的工作效率降低，供水能力降低，净化成本显著升 高。第三，富营养化水体的表面水污秽发黑，散发难闻的气味，影响周围居民的 身心健康。第四，用富营养化水源灌溉可致农作物烂秧倒苗，生育期出现倒伏和 肠球菌抗生素抗性指纹图谱库的建立及其准确性研究 成熟不良等后果。第五，加速湖泊的衰退和经济价值降低。第六，粪便中病原微 生物和寄生虫以水为媒介造成传染病和寄生虫病的传播【2 m 3 1 。 1 1 3 控制粪便污染关键 粪便污染通常以非点源的形式对水体进行污染，非点源污染是指溶解性污染 物或固体污染物在大面积降水和径流冲刷作用下汇入地表水体而引起的污染。与 点源污染相比，非点源污染的时空范围更广，不确定性更大，过程更复杂，污染 更严重，因而加大了相应的研究、治理及管理的难度。随着点源污染控制能力的 提高，欧美一些发达国家的水污染控制实践表明，即使点源达到零排放，水体的 粪便污染仍然是一个严重的环境问题。因此，控制流域非点源粪便污染物的输出， 对水域环境的保护至关重要，其控制主要途径有：( 1 ) 源控制，即污染物被控制在 产生的源头；( 2 ) 迁移控制，即利用传输廊道对污染物进行截留、转化，降低其输 出量：( 3 ) 对受纳水体的治理，即通过人为干预帮助水体自净。后者属于末端治理， 花费巨大，恢复周期长，且效果不明显。因而，控制水体粪便污染的关键即在源 头上控制非点源性污染。 1 1 4 我国非点源污染识别研究现状 刘枫等【2 4 】介绍了非点源污染的因子量化识别方法，即根据降雨、土壤、地貌、 植被、土壤表层总氮总磷或其他污染物含量等诸因子的特性加以综合估计的方法， 这不失为一种识别非点源污染的好方法，但仍涉及大量的监测调查工作，而且对 非点源污染物的迁移转化很难客观地加以描述，尽管n o v o t n y 这方面等有较详尽的 研究1 2 5 】。王凯雄等人口6 】对非点源污染的元素示踪技术展开研究，这一技术利用各 种非点源污染物的固有特征，在水中选择若干元素进行跟踪分析，通过数学方法 对元素间含量的比例进行处理，获取非点源污染的信息以及各非点源对某污染物 的分配。这一方法能直接反映水体受某些非点源污染物的污染状况，并能确定某 些非点源污染物来自各不同非点源的贡献。近年来在我国研究较多的是利用粪醇 追踪和鉴别非点源污染的来源。香港城市大学将粪甾醇作为主要的被动示水标记， 来追踪香港近岸海洋环境中的污水污染，主要用于污水排放的环境风险评价，对 管理和保护香港的近岸环境非常重要。崔崇威等人综述了粪醇的分析方法及其示 踪作用2 7 1 ，比较了粪醇与现存的粪便污染指标的优势与限制，指出粪醇可作为粪 第1 章绪论 便污染的一个度量指标，并为识别粪便污染源提供了一个新的工具。王雪艳【2 8 】则 是以我国近岸典型重点排污口作为研究对象，将粪甾醇作为近岸典型海域中生活 污水的指示物，建立近岸典型海域生活污水中粪甾醇鉴别的模式识别方法，获取 近岸典型海域生活污水来源的鉴别指标体系，优化出近岸典型海域生活污水来源 的指示物，旨在为提高近岸排污口污染监测数据的可比性提供佐证。 近几年微生物源示踪技术识别非点源粪便污染在我国初步发展，本实验室至 2 0 0 5 年开展了相关研究并取得了一定成绩。苏洁对大肠杆菌在海水中生存规律及 其r e p p c r 指纹图谱稳定性进行研究，结果表明在模拟夏季的自然海水环境中，大 肠杆菌存活时间与存活量呈负相关性，利用r e p p c r 获得特异性指纹图谱共具有1 4 条特异普带，并且在不同的环境因素影响下条带都未曾缺失，说明大肠杆菌的 r e p - p c r 指纹稳定性良好。杨滴检测了了猪源7 5 株、牛源7 8 株、鸡源6 9 株、人源6 8 株的大肠杆菌r e p p c r 的指纹，结果表明其同源相似率高达9 9 ，并对r e p p c r 扩增 体系进行了摸索确定了p c r 扩增方法，为后续研究提供参考。 我国的非点源污染研究开始于8 0 年代初，尽管研究工作在其污染危害、污染 影响因素、污染物迁移模型化等方面取得了较大进展，然而到目前为止仍没有行 之有效的措施去解决非点源污染问题【2 9 1 。因此，确立适合我国国情的非点源粪便 污染源控制技术与政策迫在眉睫。当务之急是借鉴国外的先进理论和方法，确立 我国非点源粪便污染源控制的最佳管理方案。 1 2a r a 方法识别粪便污染源概述 1 2 1a r a 识别粪便污染源应用原理 生活在不同宿主环境中的同一种微生物为了适应所处的特异性生态环境，产 生一系列环境适应性，并将这些特性遗传给予孙后代，进而形成一个区别于其他 环境的同种微生物群。这些微生物都带有标志其宿主或生存环境的特异性指纹图 谱( 如：特殊代谢产物、遗传学特征等) ，通过分析这些指纹图谱，就能够达到识 别微生物污染( 如粪便污染) 源的目的1 3 w 3 4 。a r a 便是基于这种微生物源示踪理 论发展出来的一种粪便污染源示踪方法。 a r a 通常选择人或动物肠道微生物做示踪因子，由于人与动物之间使用的药 品种类不同，人体肠道内的抗生素环境也会与家禽、宠物、野生动物间形成差异 一4 一 肠球菌抗生素抗性指纹图谱库的建立及其准确性研究 ( 如野生动物，它们基本处于无抗生素直接作用的环境中，因而对绝大多数的野 生动物肠道微生物都不具耐药性) 。示踪因子则因寄主肠道内抗生素环境的差异 产生了具有寄主特异性的抗生素耐药特征。从受污水体中分离出该示踪因子进行 抗生素抗性检测，针对不同种抗生素( 品种、浓度) ，被检测的示踪因子会产生 不同的表现形态，即抗生素抗性指纹。将这种抗生素抗性指纹与已建的潜在污染 源抗生素指纹图谱库进行对比后便可达到污染源示踪的目的【”】。 a r a 识别粪便污染源的技术路线( 图1 1 ) 是在常规水质监测的基础上确定受 到粪便污染区域，调查了该区域的潜在粪便污染源后进行粪便样本的采集与示踪 因子的分离并构建a r a 指纹图谱库，同时采集受污区域的样品分离示踪因子，检 测示踪因子的抗生素抗性，最终与以建立的指纹图谱库进行对比溯源。 图1 1a r a 识别粪便污染源技术路线图 f i g 1 1t h et e c h n i c a ls k e t c ho f a r ai d e n t i f yf e c a lc o n t a m i n a t i o ns o u r c e s - 5 - n 第1 章绪论 1 2 2a r a 的技术关键示踪因子 示踪因子是指取代检测水中的病原体，并能够起到预测与致病菌相关的潜在 危险性的作用。理想的示踪因子还需满足：污染源中大量存在，具有标识特异性， 反映其在特定环境或宿主的生存特征，并且在环境中较为稳定州。以微生物为因 子，即“示踪微生物”除上述要求外还必须是非病原体、可快速检测、易计数， 并和病原微生物存在有较强相关性。针对a l i a 的应用，示踪微生物的选择仍然是 争论的焦点，较多使用的是肠球菌或大肠埃希氏杆菌。然而研究表明，在温带大肠 埃希氏杆菌在水体中不能长时间存活；而在热带地区，气温、光照和营养等有利 条件可使大肠埃希氏杆菌在水体中增生扩散、在受污染的土壤中繁殖，并成为水生 微生物群落的一部分，使检测结果不能反映原始的污染状况，因此研究选择肠球 菌作为a r a 的示踪因子。 1 2 2 1 肠球菌的生理生化特性 4 2 - 4 6 1 肠球菌属革兰氏阳性细菌，外形呈圃形或卵圆形，单个或短链状排列。大小 为0 5 - 1 0 u m ，无鞭毛，无芽孢，少数有荚膜。为需氧或兼性厌氧、化能异养、 发酵代谢，触酶试验阳性。最适生长温度约3 7 ，在1 0 和4 5 c 均可以生长，在 1 0 和p h 9 6 时能生长。在胆汁七叶甙和含6 5 的n a c i 培养基中生长良好。葡萄 糖发酵主要最终产物是乳酸，营养需要的最低限度比较复杂，可发酵乳糖。肠球 菌是人类肠道中的正常菌群，但当进入血液或其他部位，可引起败血症，尿路感 染、心内膜炎、脑膜炎和伤口感染等。肠球菌属在人类粪便中的数量仅次于大肠 菌群，由于此污染指示菌较大肠杆菌对外界环境温度适应性强、抵抗力强及耐受 性强，甚至可以与多种抗生素相抵抗且生长营养要求不高，因此在自然界分布广 存活力强。 1 2 2 2 肠球菌在环境监测中的应用【4 7 铷】 目前肠球菌已经成功地用作粪便污染的指示菌，多作为生活饮用水、管道水 等的水质指示菌，特别是可靠地用于监测海洋环境和娱乐水体的健康风险。卫生 学家认为，肠球菌类似于大肠菌群的生态活动，但其对恶劣的外环境和冷冻条件 具有较强的抵抗力，肠球菌比沙门氏菌，大肠杆菌抵抗性及存活率均高。水体中 肠球菌的存在容易引发多种疾病，随着近年来肠球菌所致感染不断增多，美国监 视系统州i s s ) 已将其列为医院感染的第二大病原菌，占所有医院感染原因的1 2 。 肠球菌抗生素抗性指纹图谱库的建立及其准确性研究 我国肠球菌耐药菌株引起的医院感染也逐年上升。有些国家已经制定了针对肠球 菌污染限量标准，例如美国环境卫生委员会在2 0 0 4 年4 月要求各州开始以肠球菌 的浓度监测娱乐业水质。因而肠球菌作为监测水质及环境卫生质量的示踪因子更 具有卫生学意义。在大量研究结果的分析和讨论的基础上，肠球菌被提倡作为粪 便污染的指示因子，其原因是： ( 1 ) 肠球菌普遍存在于各种动物的肠道，并随粪便排出； ( 2 ) 肠球菌环境适应性较强，随粪便排入环境后可以较长时间存活，并相对稳 定； ( 3 ) 能在极端环境下生长，适用于海水检测； ( 4 ) 较粪便中的其它微生物而言，肠球菌在微生物学和体外抗生素敏感性检测 方面的研究较为透彻； ( 5 ) 肠球菌的同致病菌与病原菌对自然条件和污染处理过程的抗性相似，作为 粪便污染源的示踪因子，肠球菌具有卫生学意义。 1 2 3a r a 应用方法学研究 a r a 是一种数据库依赖型的识别污染源方法。所谓数据库依赖，即选择一种 能够指示粪便污染程度的微生物做示踪因子，从已知的潜在污染源中分离出该种 微生物，检测其特异性并构建指纹图谱库。将受污水体中微生物的指纹图谱与已 建的指纹图谱库进行比对，判定其同源识别率以达到溯源的目的【5 1 1 。因而根据a r a 的应用过程可将其应用方法学分为三部分：a r a 指纹图谱库建立、a r a 指纹图谱 库分析及应用a r a 指纹图谱库溯源。 1 2 3 1a r a 指纹图谱库建立 a r a 指纹图谱库包含了污染区域潜在污染源的抗生素抗性特征，因此a l i a 指纹图谱库建立包括确定应用范围及潜在污染源、选择能够体现特异性的抗生素 种类及浓度、选择抗生素检测方法这三个方面。 ( 1 ) 应用范围及潜在污染源的确定 根据多个案例的研究结果显示，依赖数据库型方法在小型水域内研究取得较 为明显的成功，选取越小的水域区域进行研究，其粪便污染源示踪的同源相似率 就越耐5 2 1 。此外，还需对选取的水域区域周围的主要物种数量及分布进行调查， 第1 章绪论 以确定具有代表性的动物粪便源。成功选择选定研究区域及其周围主要粪便污染 源，是后续实验的科学实施的基础，是研究最基础和最重要的部分，此结果的准 确性和权威性直接影响到最终的试验成果的实际应用，因此具有重要意义。 ( 2 ) 抗生素种类与浓度的选择 在选择抗生素种类及浓度上，通常选取多重抗生素，每种抗生素又选择不同 浓度来检测指示菌的抗生素抗性。构建每株菌落特定抗生素抗性的数据大概在3 0 个左右。例如，在v a l e r i ej h a r w o o d 5 1 】等人利用抗生素抗性分析法对粪便污染源 示踪的研究中，共选择了9 种抗生素，每种抗生素4 个浓度，检测了肠球菌对这 3 6 种不同药物浓度的抗生素抗性指纹。但选择过多的抗生素种类或浓度，会不利 于各物种指纹图谱特异性的获得。由于抗生素种类或浓度的增加，使得指纹图谱 的指标更加复杂，某些物种间出现相似指纹表型的可能性增加，导致各物种源错 误识别率增加。总之，如何选择抗生素要根据所研究区域的抗生素环境而定，如 果数据库中的指示菌对某一种特定抗生素全部耐药或全部敏感，则该种抗生素不 能很好的说明各个物种间的抗生素抗性差异，故可以放弃，选择足以说明各物种 源间差异的抗生素种类、浓度即可。 ( 3 ) 抗生素抗性检测方法的优化 微生物体外药敏试验可对细菌进行耐药性分析，根据美国临床和实验室标准 协会( c l s i ) 的推荐，主要有以下四种方法：k i r b y b a u e r 药敏纸片扩散法( 简称 k b 法) 、定量测定稀释法( d i l u t i o nt e s t ) 包括微量肉汤稀释法和琼脂稀释法、抗 生素浓度梯度法( e t e s t 法) 和自动化仪器等。 k b 法是国际卫生组织推荐的全球统一的标准方法。其原理：含有定量抗菌药 物的纸片帖在已接种测试菌的琼脂平板上，纸片中所含有的药物吸取穷之中的水 分溶解后便不断地向纸片周围区域扩散，行程递减的梯度浓度。在纸片周围抑菌 浓度范围内的细菌的生长被一直，形成透明的抑菌圈。影响抑菌圈大小的因素有： 使用的培养基；培养条件；抗生素的扩散程度；抗生素使用的浓度【7 4 1 。 抑菌圈的大小反应了测试菌对测定药物的敏感程度，并与该药物对测试菌的最低 抑菌浓度( m i c ) 成负相关。 定量测定稀释法( d i l u t i o nt e s t ) ，主要是测定细菌对某药物的最低抑菌浓度。 琼脂稀释法的原理是：将不同计量的抗茵药物加入融化并冷致5 0 0 c 左右的定量 肠球菌抗生索抗性指纹图谱库的建立及其准确性研究 m h 琼脂中，制成含有不同递减浓度药物的平板。接种待测菌( 可在一个平板上做 多株测定) ，3 5 0 c 培养1 6 2 4 h ，无细菌生长的最低药物浓度为测试菌的m i c 。微 量肉汤稀释法的原理同琼脂稀释法相同，不同的是待测菌接种的培养基为营养肉 汤。 抗生素浓度梯度法( e t e s t 法) 是结合了扩散法和稀释法各自的有点，操作简 便同扩散法，又可以像稀释法一样直接定量测出抗菌药物对测试菌的最低m i c ， 结果准确，重复性好，但是价格昂贵。 自动化仪器检测药物敏感性，工作流程顺畅，准确性高，并且具有很强大的数 据处理功能。可鉴定的细菌种类高达3 0 0 多种，在几小时内便能完成药敏实验， 药敏实验可选择的抗生素种类有近百种，但是价格昂贵。 表1 1 抗生素抗性主要检测的方法比较 t a b 1 1c o m p a r i s o no ft h ed i f f e r e n ta n t i b i o t i cr e s i s t a n c ed e t e c t i n gm e t h o d s 注：能抑制待测菌肉眼可见生长的最低抗生素浓度称为最小抑菌浓度( m i c ) 1 2 3 2a r a 指纹图谱库分析 5 4 - 6 2 1 在检测指示因子特异性后，需要对所构建的指纹图谱库进行分析评价其代表 性，才能确定该指纹图谱库能否应用于粪便污染源的示踪。 ( 1 ) 数据库的分析方法 针对a r a 方法所建立的指纹图谱库，常用的数据库分析方法有：判别分析法 ( d i s c r i m i n a n ta n a l y s i s ) 及聚类分析法( c l u s t e ra n a l y s i s ) 。判别式分析是一种多 元数据分析法，目的是对已知分类的数据建立由数值指标构成的分类规则，并在 第1 章绪论 此规则指导下，对类别未知的样本进行归类判别。聚类分析则是按“物以类聚 的原则将特性相近的变量或观察单位进行归类。 ( 2 ) 数据库的评价指标 同源识别率( r a t eo fc o r r e c tc l a s s i f i c a t i o n ，r c c ) ，即每个物种源的正确判别 率。 平均同源识别率( a v e r a g er a t eo fc o r r e c tc l a s s i f i c a t i o n ，a r c c ) ，数据库的平均 正确判别率； 随机判别率( r a n d o mc l a s s i f i c a t i o nr a t e ，r c r ) ，每株菌株被随机判别成某一 物种源的概率； 错误判别率( t 1 1 em i s c l a s s i f i c a t i o nr a t e ，m c r ) ，即其他物种被错判成某个物 种的判别率： 最小检出率( m i n i m u md e t e c t a b l ep e r c e n t a g e ，m d p ) ，即指纹图谱库在实际验证 中所要求的阈值，当某未知源的r c c 小于m d p 时，该未知源的污染可以忽略不 计。 ( 3 ) 数据库的判别模式 大部分研究表明，由于某些种类的抗生素在不同物种身体摄入上的普遍性， 不同物种的某些抗生素抗性表型存在明显的重叠现象。从统计分析上讲，这种重 叠会导致数据库分析过程中错误判别率的增加。因此可以将表型重叠率高的两个 或多个物种合并为同一污染源，改变类别较多的单物种判别模式，选择类别有所 减少的物种合并判别模式。在物种合并的判别模式下构建的指纹图谱库普遍比单 物种判别模式下的准确性高。在实际应用过程中，确定最适的判别模式，根据不 同的污染情况达到不同的溯源目的，使得构建的指纹图谱库准确性及解决实际问 题的能力均达到最优。 ( 4 ) 数据库准确性分析 数据库的准确性，即准确评价受污水样中污染物来源的能力。首先利用重新 带入分析法( r e s u b s t i t u t i o na n a l y s i s ) ，将建库中的每一个样品当做未知源按所建立 的判别式重新判别溯源。由于该数据库中已经包含了这个样品本身的指纹表型， 因此这种判别方式通常会过高估计数据库的平均同源识别率。为了避免这个问题， 交叉验证法( c r o s sv a l i d a t i o na n a l y s e s ) 也常应用于验证数据库的平均同源识别率 肠球菌抗生紊抗性指纹图谱库的建立及其准确性研究 上。从已建立的a r a 数据库中抽取一部分样品，将这部分样品与剩余样品所构成 的子数据库按判别式进行比对分析，得到平均同源识别率。两种验证方法所得到 的a r c c 之差小于5 ，则说明数据库的准确性良好。 ( 5 ) 数据库时空稳定性分析 数据库的可用性是受时间与空间制约的。通常情况下，在利用数据库进行粪 便污染源示踪过程中，所使用的数据库建立时间不超过一年时，时间稳定性可忽 略不做讨论。为了验证数据库的空间稳定性，在建库以外地区对相同的已知源进 行采样，根据所建的数据库按判别模式进行分析得出同源识别率，评价数据库的 空间稳定性。研究表明，a r a 分析法所建立的数据库只能应用于小范围地域，但 在同一地区的不同水域，当其生态环境相近时，可用同一数据库进行粪便污染源 的示踪【5 3 】。 总之，指纹图谱库的分析就是在某种即定的判别模式下，分析该数据库的代 表性与时空稳定性，而良好的代表性与时空稳定性又再次确定该判别模式的可行 性，为粪便污染源的示踪提供先行条件。 1 2 3 3a r a 指纹图谱库溯源 粪便污染源示踪需要根据该示踪技术运用目的的不同，确定合理的样品采集 方案。例如：为了评估水体每日最大污染负荷量( t o t a lm a x i m u md a i l y l o a d ，t m d l ) ，可通过分析各潜在污染源的污染贡献率按季节采集样品；为了解决 娱乐区域因粪便污染被迫关闭的问题，可通过分析娱乐季节期间潜在污染源的污 染贡献率，制定采集样品方案；为了判断降水量与潜在污染源污染贡献率之间的 关系，可以按照丰水期与枯水期采集样品。 从受污水体中分离出示踪因子，按建立数据库的方法检测其抗生素抗性后与所 建立的数据库做判别分析，得出确定判别模式下各物种源识别率，评价不同物种 源的污染贡献率以达到示踪目的。 1 2 4a r a 与其他粪便污染源示踪方法比较 近年来，微生物源示踪方法已经作为种有效的工具被应用到识别水环境中 的非点源污染中，根据是否需要事先建立已知单一污染源数据库，分为非依赖数 据库法( l i b r a r y i n d e p e n d e n t ) 和依赖数据库法( l i b r a r y d e p e n d e n t ) 3 2 删。 非依赖数据库方法主要原理为检测一些特殊的指示微生物基因型或表现型来判定 第1 章绪论 污染源种类的一种方法，不用构建庞大的数据库是其最主要的优点，但是检测率 很低并且要求指示微生物具有专属性，使这种方法具有很大的局限性。所谓数据 库依赖，是通过未知污染源指纹图谱与已知源的指纹图谱数据库进行对比，进而 分析出污染源种类的一种方法。依赖数据库的主要优点是可以对污染源进行定量 分析，因此可根据定量结果进行污染贡献率分析，因此成为粪便污染源示踪技术 中的主要方法类型。 依赖数据库型粪便污染源识别的方法中，根据特异性指纹图谱的类型，可以 将其进一步细化为表型示踪法( p h e n o t y p i cm e t h o d s ) 和基因型示踪法( g e n o t y p i c m e t h o d s ) 【6 3 ，6 4 1 。表型法是通过比较不同的环境因素诱发下细菌所产生的特殊生化 物质来判断其所在宿主的来源。现有的方法有：抗菌素抗性法( a n t i b i o t i cr e s i s t a n c e a n a l y s i s ，a r a ) 、碳源利用法( c a r b o ns o u r c eu t i l i z a t i o n ，c s u ) 和血清型法 ( s e r o t y p i n g ) 等。基因型示踪法是利用在不同宿主环境内存在的同一种微生物具 有相似但有差异的基因指纹，利用其差异，反向追踪其所在宿主。现今主要应用 的方法有：重复序列扩增法( p c ro f r e p e t i t i v es e q u e n c e s ，r e p p c r ) 、核酸印迹法 ( r i b o t y p i n g ) 、脉冲场凝胶电泳法( p u l s e f i e l dg e le l e c t r o p h o r e s i s ，p f g e ) 、限制性 片断长度多态性分析( r e s t r i c t i o nf r a g m e n tl e n g t hp o l y m o r p h i s m ，r f l p ) 等。以核 酸探针技术、聚合酶链式反应( p c r ) 等技术为基础的基因型示踪法以其灵敏、特异、 简便、快速和可靠性等优势，越来越广泛的应用于源指示微生物的检测。但是技 术难度大，费用高是目前影响分子生物学方法在m s t 应用的主要因素6 5 , 6 6 。 在依赖数据库粪便污染源识别方法中，抗生素抗性分析法( a r a ) 、重复序列 扩增法( r e p p c 鼬、脉冲场凝胶电泳法( p f g e ) 应用的较为广泛。但实际上各种方法 都有其各自的优缺点，迄今为止，还没有单独一种方法能保证任意环境中粪便污 染源示踪结果的完全可靠性。各种新技术也在持续的研究中不断改进与发展，在 粪便污染源示踪应用过程中只有充分了解每种方法学各自特点，才能取长补短制 定出最合理的技术方案。 肠球菌抗生素抗性指纹图谱库的建立及其准确性研究 表1 2 数据库依赖型的不同粪便污染源识别方法比较 t a b 1 2 c o m p a r i s o no fl i b r a r yd e p e n d e n tm e t h o d so ff e c a ls o u r c ei d e n t i f i c a t i o n 1 3a r a 识别粪便污染源研究现状 a r a 利用不同物种源的同种示踪因子对不同种类和浓度抗生素的抗性特征来 查找污染来源，在欧美等国家已被普遍应用。该方法多次应用的结果也表明，这 种方法适用于来自于动物和人肠道的微生物的鉴别，并且已成功地解决了美国多 条河流和近海的粪便污染问题，近几年国内针对刖队的应用仅有少量报道，尚未 第1 章绪论 应用于实际解决粪便污染源问题中。 1 3 1a r a 识别粪便污染源理论研究 示踪因子的抗生素抗性具有寄主特异性是a r a 能够成功应用于粪便污染源示 踪的前提，因此研究能够作为示踪因子的微生物的生存环境、分布规律及抗生素 抗性特征等，有助于a r a 识别粪便污染源的实现。 d e v r i e s e 等人研究发现在家禽、牛及其他动物的粪便中肠球菌的分布数量各不 相刚6 7 】；与此同时，s j o