（法医学专业论文）大鼠脑组织缺血gfap、hsp70的表达与缺血时间推断的研究.pdf

学位论文独创性声明 本人梁新华声明，所呈交的学位论文系在导师王英元、高彩荣教授指导 下本人独立完成的研究成果。文中任何引用他人的成果，均以做出明确标注 或得到许可。论文内容未包含法律意义上已属于他人的任何形式的研究成 果，也不包含本人已用于其他学位申请的论文或成果。与我一同工作的同志 对本研究所做的任何贡献均已在论文中作了明确的说明并表示致谢。 本文如违反上述声明，愿意承担以下责任和后果： l 、交回学校授予的学位证书； 2 、学校可在相关媒体上对作者本人的行为进行通报； 3 、本文按照学校规定的方式，对因不当取得学位给学校造成的名誉 损害，进行公开道歉。 4 、本人负责因论文成果不实产生的法律纠纷。 论文作者签名日期：年月曰 学位论文版权使用授权书 本人完全了解山西医科大学有关保留、使用学位论文的规定，同意 学校保留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论 文被查阅和借阅；本人授权山西医科大学可以将本学位论文的全部或部 分内容编入有关数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段 保存论文和汇编本学位论文。 本人离校后发表或使用学位论文或与该论文直接相关的学术论文或 成果时，署名单位仍然为山西医科大学。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名 指导教师签名 日期：年月一日 日期：年月日 ( 本声明的版权归山两医科大学所有，未经许可，任何单位及个人不得擅自使用) 大鼠脑组织缺血g f a p 、h s p 7 0 的表达 与缺血时间推断的研究 摘要 目的探讨大鼠脑组织缺血后不同时间胶质原纤维酸性蛋白( g l i a l f i b r i l l a r ya c i d i cp r o t e i n ，g f a p ) 和热休克蛋白7 0 ( h e ms h o c kp r o t e i n7 0 ， h s p 7 0 ) 的表达，旨为法医实践中推断脑组织缺血时间提供科学的参考依据。 方法建立w i s t a r 大鼠脑组织缺血模型，应用免疫组化s - p 法与显微 图像分析技术检测脑组织缺血后1 0 m i n 、3 0 m m 、l h 、3 h 、6 h 、1 2 h 、2 4 h 、 4 8 h 和正常组g f a p 、h s p 7 0 的表达，观察是否有统计学意义。 结果( 1 ) 大鼠海马区神经细胞缺血3 h 可见水肿、坏死，锥体细胞 受损；缺血4 8 h 见大量锥体细胞坏死，核膜崩解、核仁消失而仅留细胞碎 屑。( 2 ) 脑组织缺血3 h ，g f a p 在星形胶质细胞的阳性表达与正常组比较 无差异：6 h 与3 h 比较有差异( p 0 0 5 ) ；1 2 - 4 8 h 各组间比较有显著性差异 ( p o 0 1 ) 。( 3 ) h s p 7 0 的表达随着缺血时间的延长而逐渐增高，h s p 7 0 阳 性细胞于脑缺血后1 0 m i n 后开始出现，随着缺血时间的延长开始逐渐增多， 缺血6 h 内各组间比较无差异；6 - 1 2 h 各组间比较有差异( p o 0 5 ) ；2 4 4 8 h 各组间比较有显著性差异( p o 0 1 ) 。 结论大鼠脑组织缺血g f a p 、h s p 7 0 阳性表达呈现一定规律，与缺血 时间明显相关，可作为推断脑缺血时间的参考指标之一，在法医检案中具 有应用价值。 关键词- 脑缺血，时问推断，胶质原纤维酸性蛋白，热休克蛋白7 0 ， 免疫组织化学，图像分析 h 西医科大学硕上学位论文 s t u d yo nt h ee x p r e s s i o no fg l i a lf i b r i l l a r ya c i d i cp r o t e i n a n dh e a ts h o c kp r o t e i n7 0o ft h er a ta f t e rc e r e b r a li s c h e m i a a b s t r a c t o b j e c t i v et os t u d yt h ee x p r e s s i o no fg l i a lf i b r i l l a r ya c i d i cp r o t e i na n d h e a t s h o c kp r o t e i n7 0a f t e rd i f f e r e n tt i m eo fc e r e b r a li s c h e m i a ，a n dt h e yc o a lb e u s e df o re s t i m a t i n gt h et i m eo f c e r e b r a li s c h e m i ai nf o r e n s i cm e d i c i n ea s p e c t m e t h o d sw i s t e rr a t sw e r ek i l l e da t1 0 、3 0 r a i n 、1 、3 、6 、1 2 、2 4 、 4 8 hr e s p e c t i v e l ya f t e rc e r e b r a li s c h e m i a t h ee x p r e s s i o no fg f a pa n dh s p 7 0i n t h ec e r e b r a w a sd e t e c t e db yi m m u n o h i s t o c h e m i c a la n dr e s u l t sw e r ea s s e s s e db y i m a g ea n a l y s i ss y s t e ma n ds t a t i s t i ca n a l y s i s r e s u l t s ( 1 ) t h en e u r o n si nh i p p o c a m p u se d e m a e da n dn e c r o s i s e da f t e r3 h c e r e b r a li s c h e m i a , p y r a m i d a lc e l l sh a di n j u r i e d a tt h et i m eo f4 8 h ，m o s to f p y r a m i d a l c e l l sh a dn e c r o s i s e d ，t h en u c l e o l u sh a d k a r y o l y s i s e d a n d k a r y o r r h e x i s e d ( 2 ) t h ee x p r e s s i o no fg f a pa p p e a r e di nt h en a t u r a lo n e s ，b u t n o te v i d e n c e i ti n c r e a s e dg r a d u a l l yg o i n gw i mt h et i m eo fc e r e b r a li s c h e m i a t h ee x p r e s s i o no fg f a ph a db e c o m ei ne v i d e n c ef r o m6 ht o4 8 h t h ee x p r e s s i o n w a ss t r o n g e ri nt h ee x p e r i m e n t a lg r o u p st h a nt h ep r e v i o u so n e0 0 0 5 ) a t6 h ； b u ts i g n i f i c a n t l ys t r o n g e rt h a n p r e v i o u so nea f t e r6 h ( p 0 0 1 ) ( 3 ) t h e e x p r e s s i o no fh s p 7 0a p p e a r e ds i n c e 10 r a i n ，b u tn o te v i d e n c e i ti n c r e a s e d g r a d u a l l yg o i n gw i t ht h et i m eo fc e r e b r a li s c h e m i a t h ee x p r e s s i o no fh s p 7 0 h a db e c o m ei ne v i d e n c ef r o m 6 ht o4 8 h t h ee x p r e s s i o nw a ss t r o n g e ri nt h e e x p e r i m e n t a lg r o u p st h a nt h ep r e v i o u so n e ( p o 0 5 ) f r o m6t o12h ；b u t s i g n i f i c a n t l ys p o n g e rt h a np r e v i o u so n ea f t e r12 h ( p o 0 1 ) c o n c l u s i o nt h er e g u l a re x p r e s s i o no fg f a pa n dh s p 7 0i sau s e f u lt a r g e t f o re s t i m a t i n gt h et i m eo f c e r e b r a li s c h e m i a k e yw o r d sc e r e b r a li s c h e m i a ，g l i a lf i b r i l l a r ya c i d i cp r o t e i n ，h e a ts h o c k p r o t e i n7 0 ，l m m u n o h i s t o c h e m i c a , i m a g ea n a l y s i s 山西医科大学碗士学位睡文 日l j吾 脑组织缺血损伤是法医实践中比较常见的一种脑损伤，在法医病理学 研究中占有一定的地位。由于脑组织缺血后存活时间长短不一，法医尸体 解剖及一般h e 染色结果很难确定具体的缺血时间，难以满足法医检案的要 求，寻找一种准确推断脑组织缺血时间的方法，已成为法医病理学亟待解 决的难题之一。 g f a p 主要存在于脑胶质细胞，是星形胶质细胞的特征性蛋白，在中枢 神经系统中，神经组织受到缺血损伤后，星形胶质细胞将发生改变。由于 g f a p 是星形胶质细胞的特征性蛋白，检测g f a p 的免疫活性能在一定程度 上反映星形胶质细胞在缺血损伤后的改变，用来推断脑组织缺血损伤的时 间。 h s p 在正常脑组织不表达或表达极少，脑组织缺血、缺氧后可引起一 系列分子生物学变化，导致热休克因子( h s f ) 基因的表达，诱导h s f 的产生。 h s f 与热休克元件( h s e ) 结合，诱导h s p 基因的转录，产生大量的 h s p m r n a ，导致快而高水平的热休克蛋白( h s p ) 的产生。h s p 也称应激 蛋白，是细胞对缺血、中毒等应激反应敏感而可靠的标记，对应激细胞起 保护作用。h s p 7 0 是细胞水平检测脑缺血发生的敏感而可靠的指标，在短 时间( 2 1 0 m i n ) 的脑缺血中即可见到表达，尤以海马区最显著，此时神经元 尚未出现可以观察到的病理损害。脑缺血时间不同对脑组织h s p 7 0 合成的 影响还未见文献报道。 观察脑组织缺血后不同时间大鼠脑组织g f a p 、h s p 7 0 的表达，旨为法 医推断脑缺血的时问提供科学依据。 山西医科人学硕士学位论文 第一章材料和方法 1 1 材料 1 1 1 实验动物及动物分组 健康成年w i s t a r 大鼠4 5 只，雄性，体重3 0 0 5 9 ，由山西医科大学实 验动物中心提供。随机分9 组，每组5 只。其中1 组为正常组，不做缺血 模型，其余4 0 只根据脑组织缺血时间分为8 组：a 组( 缺血1 0 m i n ) ，b 组 ( 缺血3 0 m i n ) ，c 组( 缺血l h ) ，d 组( 缺血3 h ) ，e 组( 缺血6 h ) ，f 组 ( 缺血1 2 h ) ，g 组( 缺血2 4 h ) ，h 组( 缺血4 8 h ) 。 1 1 2 主要仪器设备 自动磨刀机( m d j 一4 b )天津航空机电公司 e 胁似切片机 e m r ao p t i c a lw 0 r k s l t d 电热恒温水浴锅天津航空机电公司 电热恒温干燥箱天津泰斯特仪器有限公司 b i 2 0 0 0 显微图像分析系统 成都泰盟科技有限公司 1 1 3 免疫组织化学试剂 枸橼酸盐缓冲液武汉b o s t e r 生物工程公司 g f a p 抗体s - p 试剂盒福卅迈新生物技术开发公司 p b s 磷酸盐缓冲液北京中山生物技术有限公司 h s p 7 0 抗体武汉b o s t e r 生物工程公司 抗体稀释液武汉b o s t e r 生物工程公司 内源性生物素阻断试剂盒福州迈新生物技术开发公司 1 2 方法 1 2 1 脑组织缺血模型建立 脑组织缺血模型( 采用四动脉阻断法，阻断双侧颈总动脉和双侧椎动 脉) 的建立参照文献 1 _ 4 1 ，并加以改进。实验组动物分别使用1 戊巴比妥 钠腹腔麻醉( o 3 m l 1 0 0 9 ) ，待四肢瘫软后将大鼠腹卧位固定，使鼠头与躯 干屈曲3 0 。，颈后正中切口，暴露第一颈椎两侧横突翼小孔，用i m l 注射 器针头顺其自然走向方向捣入翼小孑l 约1 0 m m ，左右轻轻旋转针体，见有 少量鲜红色血液自针头和翼小孔涌出，说明已经损毁椎动脉，此时不急于 拔出针头，维持3 m i n ，待翼小孔内血液自然凝固后再拔出。若仍有较多血 液渗出，用小棉球压堵翼小孔，使其止血即可。2 4 h 后再次麻醉，仰卧位固 定在自制的手术台上，颈正中切口2 - 3 c m ，颈动脉三角处牵开胸锁乳突肌， 分离、暴露两侧颈总动脉，用丝线结扎即可。 1 2 2 取材与固定 分别把相应组的动物在相应缺血时间后取出大脑组织，用水轻轻冲洗 掉脑组织表面的血液后置入1 0 的中性福尔马林液中固定4 8 小时，在视交 叉处后2 r n m 取材进行常规石蜡切片连续冠状切片厚6 k m ，分别进行h e 染 色和g f a p 、h s p 7 0 免疫组化染色。 1 2 3 h e 染色和s - p 免疫组化染色 免疫组化s p 法按照试剂盒说明书操作完成，用二氨基联苯胺( d a b ) 显色，以胞质或胞核内出现棕黄色染色为阳性细胞。以p b s 代替一抗作为 阴性对照。应用b l 一2 0 0 0 图像分析仪，每张切片随机取5 个高倍视野，测 一定面积内阳性信号的面积和阳性信号平均灰度值，计算阳性指数( p i ) ， p i = 阳性信号面积阳性信号平均灰度值测定面积。 1 2 4 统计学处理 应用显微图像分析系统分别对g f a p 和h s p 7 0 的s - p 免疫组化结果进 行分析。数据处理采用s p s s l 0 0 统计软件进行方差分析，以均数标准差 表示，并进行各组间两两比较。 山西医科大学硕士学位论文 第二章结果 2 1h e 染色结果 光镜观察显示：正常组海马区神经细胞排列整齐，细胞呈多角形，核 圆形，核仁清晰；3 h 组可见细胞层次变少，部分神经元呈皱缩，胞核深染， 呈杆状或三角形外观的急性型改变，部分神经元胞浆肿胀，胞核增大，但 核膜边界清晰，细胞周围间隙增大，部分区域出现点状坏死；6 - 2 4 h 组可见 海马区细胞排列紊乱，可见较多梭形和三角形的缺血神经元，嗜酸性变锥 体细胞逐渐减少，细胞周围间隙增大更加明显，并出现许多坏死细胞遗留 的空隙：4 8 h 组可见大量锥体细胞坏死，核膜崩解、核仁消失而仅留细胞碎 届( 附图l 一6 ) 。 2 2s - p 免疫组化结果 g f a p 的阳性表达定位于星形胶质细胞胞浆，呈黄棕色。在正常组虽可 见阳性表达，但其胞体较小、纤维纤细、阳性表达数量较少。而在实验组， 均可见到阳性细胞表达增多，部分细胞胞体增大、纤维增粗、阳性细胞数 目明显增多；脑组织缺血6 h 内，g f a p 在星形胶质细胞的阳性表达与正常 组相比，几乎没有变化，6 - 4 8 h ，g f a p 阳性表达明显增多，纤维变得粗大 ( 附图7 1 2 ) 。 h s p 7 0 的阳性表达于大脑皮层的神经细胞内，h s p 7 0 的表达随着缺血 时间的延长而逐渐增多。h s p 7 0 阳性细胞于脑缺血后1 0 m i n 后开始出现， 以后随着缺血时间的延长开始逐渐增多，6 - 4 8 h 明显。缺血2 4 h 后，阳性表 达不仅出现在神经细胞的胞浆内，而且细胞核内也出现了大量表达( 附图 1 3 - - 2 0 ) 。 2 3 图像分析和统计学分析 应用b i 一2 0 0 0 显微图像分析系统分别对g f a p 和h s p 7 0 免疫组化s - p 法的结果进行分析，用p i 值均数标准差表示。以上各组t 匕较均有统计学 意义( 实验原始数据见附表1 1 4 ) 。 山西医科大学硕士学位论文 注：+ 表示与上一组比较有差别( p o 0 5 ) ；+ + 表示与上一组比较有显著差别( p 00 1 ) 。 表2h s p 7 0 免疫组化统计结果分析 p i 值 7 09 3 0 3 土2 00 5 4 77 14 1 9 8 2 96 3 8 08 6 3 6 2 1 1 8 2 2 6 0 9 8 0 9 5 4 4 - _ 1 35 9 4 5 p i 值 1 2 2 9 6 9 2 _ + 1 2 2 3 9 1 + 1 4 2 3 7 7 5 + 2 7 2 9 5 9 +1 6 5 2 4 0 3 + 2 9 1 2 8 6 ” 1 9 0 4 2 9 3 _ - + 3 4 4 7 5 1 + + 注：+ 表示与上一组比较有差别( p o0 5 ) ；表示与上一组比较有显著差别( p 0 0 1 ) 。 3 0 0 2 5 0 2 0 0 p i 值 1 5 0 l o o 5 0 图1g f a p 、h s p 7 0 的p l 值均数随时间变化的折线图 f 镕w mo i 日 3 0 = i1 mah m6 1 1 n 组别 1 卜- g f a pp i 均值+ h s p 7 0p i 均值 7 第三章讨论 3 1 四动脉阻断法制作脑组织缺血模型的优越性 选用大鼠制作脑缺血模型，因大鼠脑血管解剖特点比较接近人类，大 鼠的生理、生化、形态及药理等方面的实验资料比较丰富，有利于进行研 究和比较且价格低廉，可进行较大量重复实验，纯种鼠属近亲交配，品种 相对一致。脑血管解剖和生理机能变异较小，大脑体积小，有利于进行固 定染色及病理组织学观察，具有较强的抗感染能力，成为最广泛应用动物 之一。 应用四动脉阻断法制作大鼠脑缺血模型。手术分两步进行：闭塞双 侧椎动脉，2 4 h 后再闭塞双侧颈总动脉。缺血程度通过神经功能缺损程度 来判断，缺血达到以下标准，即夹闭双侧颈总动脉l o s 左右，大鼠出现意 识丧失、角膜反射和翻正反射消失，在缺血期内，意识和上述反射均未恢 复者，才可作为实验组动物进行实验。在缺血期死亡或仅出现昏睡以及在 整个实验过程中出现抽搐的大鼠均被废弃。在四动脉阻断的脑缺血模型制 作过程中，损毁椎动脉一步最为关键，p u l s i n e l l i l 2 j 创立的四动脉阻断法需要 手术显微镜和单极电灼器，应用广泛性受到影响，电灼器电流不易控制， 过高会损伤脊髓造成老鼠瘫痪，过低则不能灼闭椎动脉，造成出血，对动 物损伤大，还可能电伤操作者。改为直接用l m l 注射器针头捣毁椎动脉， 方法简便，效果可靠，无需特殊仪器，便于观察，捣毁时少量鲜红色动脉 血凭借压力从针头处涌出，即可初步判断已破坏椎动脉。体重在2 5 0 3 0 0 9 的大鼠，其翼小孔的直径较适用于使用l m l 注射器针头插入，针头过大则 出血太多，过小则插不进去。另外，针头插入不可太深，以防损伤低位脑 于。需要注意的是分离颈总动脉时一定要充分暴露动脉主干，于颈内、颈 外动脉分叉的近心端夹闭，否则误把颈外动脉认为是颈总动脉而忽视了向 深部走行的颈内动脉则不能完全阻断血流【3 ，4 】。 温度及空气湿度：在模型制作过程中，要保持室温恒定，室温过高或 过低都可导致模型的失败。一般以2 5 3 0 为佳，动物体温维持在( 3 7 5 o 5 ) 。 3 2 6 f a p 胶质细胞是脑组织中的重要间质成分，对神经元起支持、营养、修复 和吞噬坏死产物的作用，胶质细胞尤其是星形胶质细胞( a s t r o c y t e s ，a s t ) 受损害因子的刺激后，可以发生增殖反应。g f a p 是a s t 特异蛋白和骨架 成分之一，是a s t 的特征性结构，分子量5 0 k d ，属细胞质内中间丝的一 种成分。g f a p 作为a s t 特有的细胞骨架蛋白，被公认为a s t 的成熟标志 5 1 ，也是应用广泛、可靠的一种特异性标记物1 6 ”。a s t 在脑缺血早期出 现反应性增生和肥大( 称为a s t 的反应性变化) ，增强了a s t 摄取和转化神 经元释放的兴奋性递质谷氨酸的能力，后者在谷氨酰胺合成酶的作用下转 化为无毒的谷氨酰胺，从而解除兴奋性递质的继发性神经毒作用口 。 g f a p 主要存在于脑胶质细胞，缺血损伤后的反应性胶质细胞尤为明 显，因此不论体内还是体外，g f a p 常作为分化和反应性胶质细胞的标记物 】。国内外已分别应用该抗体研究了a s t 在一过性脑缺血动物模型【9 】和局 灶性脑缺血模型1 的变化规律，发现一过性脑缺血动物的海马和局灶性脑 缺血动物的脑缺血边缘区2 4 h 后才出现a s t 的反应性变化。y a m a s h i t a 等研 究了g f a p 的m r n a 在局灶性脑缺血模型的变化规律，发现缺血6 h 后扣 带回g f a p 的m r n a 开始增加，1 2 h 一3 d 内逐渐扩展到同侧皮质的外侧部和 纹状体，有关脑组织脑缺血g f a p 变化规律的报道较少。 g f a p 表达受多种生理、病理条件影响，中枢神经系统( c n s ) 受损时发 生g f a p 水平上调，是c n s 的a t s 最常见的特征性反应之一，g f a p 已成 为正常及病理情况下应用最广泛的a s t 标记物。脑缺血时一些及早基因如 c l o s 、c - j u n 的表达上调，其表达产物结合于g f a p 启动子a p o l ，从而增强 g f a p 的转录 7 , 1 1 。 g f a p 的生理作用，可能对脑损伤有保护作用。脑组织缺血损伤早期， g f a p m r n a 和蛋白的表达减少或消失，这一过程先于神经元m r n a 表达 的减少和神经元的坏死，而梗死邻区和对侧大脑半球相应区域g f a p m r n a 和蛋白表达迅速增加 1 ”。在缺血后6 小时广泛区域g f a p m r n a 表达增加， 其机制可能与血脑屏障破坏后血管源性促细胞分裂素的释放有关，9 6 1 2 0 小时到达高峰，而g f a p 蛋白质在伤后2 4 4 8 小时显著增加l l 。通过脑缺 血引起a s t 广泛的病理改变，探讨脑组织缺血不同时间下g f a p 在缺血脑 组织的阳性表达为法医学上推断脑缺血时间的实验性研究领域具有较好的 应用前景。 3 3h s p 7 0 热休克蛋白7 0 是机体在遭受各种应激刺激后诱导产生的一种应激蛋 白，具有保护机体不受损害或少受损害的功能，与缺血性脑损伤等多种神 经系统疾患关系密切。已经发现高热、癫痫、脑缺血缺氧、脑卒中以及脑 损伤均会导致中枢神经系统h s p 大量表达，认为h s p 对机体和脑都有明显 的保护作用【1 。目前已将h s p 作为中枢神经系统损伤、特别是脑损伤的标 志物，用于判断脑损伤的部位和损伤的程度。 h s p 7 0 为细胞受到缺血损害的一个敏感指标，又与缺血耐受有关【15 1 。 h s p 7 0 作为脑组织缺血所诱导的一种神经元保护性物质可阻止蛋白质在压 力下发生聚集或错误折叠而目益受到医学界的广泛关注，被认为与缺血性 脑损伤的修复密切相关。 据n o r t h e r n 分析并经r t - p c r 法证实，正常大鼠脑含少量h s p m r n a ， 在发生局灶性缺血、损伤时，h s p 7 0 基因表达明显增u 。正常脑组织中检 测不到h s p 7 0 的存在【1 7 1 。而缺血早期，脑中蛋白质合成普遍受到抑制，由 于应激反可诱导多种基因表达。其中h s p 7 0 m r n a 对缺血反应极敏感，沙 土鼠缺血5 m i n 后，h s p 7 0 m r n a 在脑组织中有阳性表达。 正常情况下，h s p 7 0 位于细胞浆内，当细胞受到热休克刺激时，细胞 核内h s p 7 0 迅速增加，细胞浆内只有少量存在，细胞处于恢复阶段时，细 胞核内的h s p 7 0 消失，细胞浆内仍有低水平h s p 7 0 表达1 1 ”。h s p 7 0 家族 成员在细胞内的脑组织缺血、缺氧后可导致热休克因子( h s f ) 基因的表达， 诱导h s f 的产生。h s f 与热休克元件( h s e ) 结合，诱导h s p 基因的转录， 产生大量的h s p m r n a ，导致快而高水平的h s p 的产生【l 。b r o w n 等研究 报道，大脑局灶性缺血后2 小时，缺血区域及其周围脑组织内h s p 7 0 m r n a 显著表达，1 2 小时后开始减少，至2 4 小时仅有少量h s p 7 0 m r n a 表达。 在远离缺血区的脑组织中未见h s p 7 0 m r n a 表达【2 。研究表明缺血时间越 长，h s p 表达越高1 2 “。 脑组织缺血时h s p 7 0 的表达，依其缺血程度而在各细胞间的转录和翻 译水平有较大差异。轻度脑缺血可诱导h s p 7 0 在神经元中转录和翻译，中 度脑缺血可诱导转录，但不翻译，而严重脑缺血时，其梗死区内神经元和 山西医科大学硕士学位论文 胶质细胞无h s p 7 0 转录【2 “。而且，在致死性脑损伤鼠脑中发现，即使在损 伤至死亡的极短时间内，h s p 7 0 m r n a 也能出现明显的升高，说明 h s p 7 0 m r n a 对损伤反应迅速，如此时出现了m r n a 蛋白分离，脑细胞将 失去h s p s 的保护作用而坏死，证明了h s p 7 0 应激保护对维护脑功能活动 的重要作用【i 。 k i n o u c h i 等对脑缺血区h s p 7 0 m r n a 的诱导及h s p 7 0 蛋白质的表达进 行对比观察发现：短暂脑缺血3 0 m i n 后h s p 7 0 在缺血区神经元表达，缺血 9 0 m i n 后，h s p 7 0 在缺血坏死区的血管内皮细胞和缺血半影区的神经元表 达，h s p 7 0 m r n a 在缺血区的表达时间较长。w e l s h 也发现缺血中央区 h s p 7 0 m r n a 的诱导时程比周边区长，一般认为缺血后只有h s p 7 0 m r n a 诱导而无h s p 蛋白合成是神经元严重受损的标志幽j 。 山西医科大学硕士学位论文 第四章小结 光镜观察显示：正常组海马区神经细胞排列整齐，细胞呈多角形，核 圆形，核仁清晰；3 h 组细胞层次变少，部分神经元呈皱缩，胞核深染，呈 杆状或三角形外观的急性型改变，部分神经元胞浆肿胀，胞核增大，但核 膜边界清晰，细胞周围间隙增大，部分区域出现点状坏死；6 2 4 h 组海马区 细胞排列紊乱，见较多梭形和三角形的缺血神经元，嗜酸性变锥体细胞逐 渐减少，细胞周围间隙增大更加明显，并出现许多坏死细胞遗留的空隙； 4 8 h 组见大量锥体细胞坏死，核膜崩解、核仁消失而仅留细胞碎屑。 g f a p 的阳性表达定位于星形胶质细胞胞浆，呈黄棕色。本实验正常组 虽可见阳性表达，但其胞体较小、纤维纤细、阳性表达数量较少。而实验 组，均可见到g f a p 阳性细胞表达，部分细胞胞体增大、纤维增粗、阳性 细胞数目明显增多。脑组织缺血6 h 内，g f a p 在星形胶质细胞的阳性表达 与正常组相比，几乎没有变化；6 - 4 8 h ，g f a p 阳性表达明显增多，且纤维 变得粗大。统计分析：脑组织缺血3 h ，g f a p 的阳性表达与正常组比较无 差异；6 h 与3 h 比较有差异( p o 0 5 ) ；1 2 4 8 h 各组间比较有显著性差异0 o 0 1 1 。 h s p 7 0 的阳性表达于大脑皮层的神经细胞内，h s p 7 0 的表达随着缺血 时间的延长而逐渐增高。h s p 7 0 阳性细胞于脑缺血后1 0 m i n 后开始出现， 以后随着缺血时间的延长开始逐渐增多，6 - 4 8 h 明显。在2 4 h 后，阳性表达 不仅出现在神经细胞的胞浆内，而且细胞核内也出现了大量表达。统计分 析：缺血6 h 内各组间比较无差异；6 - 1 2 h 各组间比较有差异( p o 0 5 ) ；2 4 4 8 h 各组间比较有显著性差异( p 0 o d 。 g f a p 、h s p 7 0 阳性表达呈现一定规律，与缺血时间明显相关，可作为 推断脑缺血时间的参考指标之一，在法医检案中具有一定的应用价值。 一一 当堕垦型查堂堡主兰竺笙兰 参考文献 1 】王军等大鼠脑缺血模型研究进展冲医研究2 0 0 2 ，1 5 ( 5 ) ：6 0 6 2 ， 2 】p u l s i n e u i w a ，s a r o k i n a ，b u c h a n a ，a n t a g o n i s mo f t h e n m d a a n d n o n n m d ar e c e p t o r si n g l o b a lv e r s u sf o c a lb r a i ni s c h e m i a p r ob r a i n r e s ，1 9 9 3 ，9 6 ：1 2 5 【3 陈玲，陈海滨等建立大鼠全脑缺血模型的方法与体会汕头大学医 学院学报，2 0 0 0 ，1 3 ( 1 ) ：5 9 6 0 4 傅震，赵君等大鼠全脑缺血再灌注模型方法的改进及其在热休克蛋 白7 0 方面的应用中华实验外科杂志，2 0 0 4 ，2 1 ( 1 ) ：1 0 8 1 0 9 5 】g a b r y e lb ，t r z e c i a kh i r o l eo fa s t r o c y t e si np a t h o g e n e s i so fi s c h e m i c b r a i ni n j u r y n e u r o t o xr e s 2 0 0 1 ，3 ( 2 ) ：2 0 5 2 1 6 】汪枫脑损伤时间推断的分子生物学研究进展皖南医学院学报 2 0 0 3 ，2 2 ( 3 ) ：2 3 2 2 3 4 7 】胡晓松，g f a p 与局灶性脑缺血f f c i ) 再灌四川解剖学杂 志2 0 0 3 1 1 ( 4 ) ：2 8 3 0 8 】a v o l ar ，d it u l l i o v i a ，e ta 1 g l i a lf i b r i l l a r ya c i d i cp r o t e i na n d v i m e n t i ne x p r e s s i o ni sr e g u l a t e db yg l u c o c o r t i c o i d sa n dn e u r o t r o p h i cf a c t o r si n p r i m a r yr a ta s t r o g l i a lc u l t u r e s c l i ne x ph y p e r t e n s 2 0 0 4 ，2 6 ( 4 ) ：3 2 3 3 3 3 9 k i r ay ，t m e t t n e rj ，z h a ow ，e ta 1 t h ei n f l u e n c eo fd e l a y e dp o s ti s c h e m i c h y p e rt h er m i af o l l o w i n gt r a n s i e n tf o c a li s c h e n f i a ：a l t e r a t i o n so fg e n e e x p r e s s i o n n e u r o ls c i 1 9 9 8 ，1 5 ；1 5 9 ( 1 ) ：1 - 1 0 10 c h a np h m i t o c h o n d r i aa n dn e u r o n a ld e a t h s u r v i v a ls i g n a l i n g p a t h w a y si nc e r e b r a li s c h e m j a n e u r o c h e mr e s 2 0 0 4 ，2 9 ( 1 i ) ：1 9 4 3 1 9 4 9 1l 】h i l b i ga ，b a b bt l ，n a j mi ，e ta 1 f o c a lc o r t i o a la y s p l s i ai nc h i l d r e n d e vn e u r os c i ，1 9 9 9 ，2 1 ：2 7 1 2 8 0 12 l i ud ，s m i t hc l ，b a r o n ef c ，e ta 1 a s t r o c y t i cd e mi s ep r e c e d e s d e l a y e dn e u r o n a ld e a t hi nf o c a li sc h e m i cr a tb r a i n j 】b r a i nr e sm o lb r a i n r e s ，1 9 9 9 ，6 8 ：2 9 - 4 1 13 p a s q u a la c ，e ta 1 e x p r e s s i o no fm r n af o rg l i a lf i b r i l l o r ya c i d i c 山西医科大学颁上学位论文 p r o t e i na f t e re x p e r i m e n t a lc e r e b r a li n j u r y j jn e u r o p a t h o le x pn e u r o l ， 2 0 0 3 ，51 ：5 6 0 5 6 5 1 4 】t s u c h i y ad ，h o n gs ，m a t s u m o r iy ，e ta 1 o v e r e x p r e s s i o no fr a th e a t s h o c kp r o t e i n7 0r e d u c e sn e u r o n a li n j u r ya f t e rt r a n s i e n tf o c a li s c h e m i a ，t r a n s i e n t g l o b a li s c h e m i a ，o rk a i n i ca c i d i n d u c e ds e i z u r e s n e u r o s u r g e r y 2 0 0 3 ，5 3 ( 5 ) ： 1 1 7 9 一1 1 8 8 ， 【1 5 谷文萍，谢光法，杨期东热休克蛋白研究进展【j 国外医学 中经病 学神经外科学分册，1 9 9 9 ，2 6 ( 2 ) ：5 7 5 9 【1 6 y a k u b o ve ，g o t t l i e bm ，g i ls ，e ta 1 o v e r e x p r e s s i o no fg e n e si nt h e c a lh i p p o c a m p u sr e g i o no fa d u l tr a tf o l l o w i n gs o d e so fg l o b a li s e h e m i a j b r a i nr e sm o lb r a i nr e s 2 0 0 4 ，1 2 7 ( 1 - 2 ) ：1 0 2 6 【1 7 o h t s u k ak ，s u z u k it ，r o l e so fm o l e c u l a rc h a p e r o n e si nt h en e r v o u s s y s t e m j b r a i nr e sb u l l ，2 0 0 0 ，5 3 ( 2 ) ：1 4 1 1 4 6 【18 】g r a d ym s ，c h a r l e s t o nj s ，e ta 1 n e u r o n a la n dg l i a lc e l ln u m b e ri nt h e h i p p o c a m p u sa f t e re x p e r i m e n t a lt r a u m a t i cb r a i ni n j u r y ：a n a l y s i sb ys t e r e o l o g i c a l e s t i m a t i o n jn e u r o t r a u m a 2 0 0 3 ，2 0 ( 1 0 ) ：9 2 9 9 4 1 19 范德义脑缺血大鼠脑组织热休克蛋白7 0 的表达心血管病防 治2 0 0 3 3 ( 6 ) ：2 0 2 1 2 0 b r o w ni r i n d u c t i o no f ah e a r ts h o c kg e n ea tt h es i t eo f t i s s u r ei n j u r y i n t h er a t b r a i n j n e u r o n ，1 9 9 9 ，2 ：1 5 5 9 2 1 】v a r g a s - a l a r c o ngl o n d o n oj d ，e ta 1 h e a ts h o c kp r o t e i n7 0g e n e p o l y m o r p h i s m si nm e x i c a np a t i e n t sw i t hs p o n d y l o a r t h r o p a t h i e s a n nr h e u m d i s 2 0 0 2 ，6 1 ( 1 ) ：4 8 - 5 1 2 2 h a s e g a w ak ，e ta 1 b r m n19 9 7 ，7 5 0 ：1 2 3 g i f f a r dr gy e n a r im a m a n ym e c h a n i s m sf o rh s p 7 0p r o t e c t i o nf r o m c e r e b r a li s c h e m i a jn e u r o s u r g a n e s t h e s i 0 1 2 0 0 4 1 6 ( 1 ) ：5 3 6 1 2 4 蒋祁桂热休克蛋白7 0 与脑缺血广西中医学院学报2 0 0 3 ， 6 ( 4 ) ：5 9 61 山西医科大学硕士学位论文 图1 正常组( x 4 0 0 ) 海马区细胞排列整齐，细胞呈多角形， 核圆形，核仁清晰。 图36 h 组( x 4 0 0 ) 附图 图23 h 组( x 4 0 0 ) 可见细胞层次变少，部分神经元皱缩，胞核 深染，但核膜边界清晰，锥体细胞核减少。 图41 2 h 组( x 4 0 0 ) 山西医科大学硬士学位论文 圈52 4 h 组( 4 0 0 ) 6 - 2 4 h 组可见较多梭形和三角形的缺血 抻经元，嗜酸性变锥体细胞逐渐减少。 图7 正常组( 4 0 0 ) 可见阳性表达，但其胞体较小纤维纤细、 阳性表达数量较少。 图64 8 h 组( x 4 0 0 ) 可见大量锥体细胞坏死，核膜崩解、核 仁消失而仅留细胞碎屑。 图83 h 组( x 4 0 0 ) 6 f a p 在墨形胶质细胞阳性表达与正常 组相比，几乎没有变化。 山西医科丈学硕士学位论文 图96 h 组( x 4 0 0 ) 图1 12 4 h 组( 4 0 0 ) 图1 01 2 h 组( 4 0 0 ) 图1 24 8 h 组( 4 0 0 ) 在h 8 h ，g f 舻阳性表达明显增多，且纤维变得粗大随着时间的延长阳性表达逐渐增 加。 1 7 山西医科大学硕士学位论文 图1 3 正常组( x 4 0 0 )图1 4 1 响i n 组( 4 0 0 ) h s p 7 0 阳性细胞开始出现。 图1 53 0 m i n 组( x 4 0 0 ) 图1 63 h 组( x 4 0 0 ) 3 0 m i n 和3 h 组t l s p 7 0 阳性细胞随着缺血时间的延长开始逐渐增多，但不明显。 山西医科大学碗士学位论文 图1 76 h 组( x 4 0 0 ) 图1 92 4 h 组( x