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山东土学博士学位论文 工作环境中常见气传真菌快速检测鉴别的 d n a 分子标记 摘要 真菌孢子无处不在、无孔不入。越来越多的研究和疾病调查结果显示在办公室、 家庭、工厂、农场等不同的工作环境中存在着大量具有毒性的真菌或者产生变应原的 真菌。真菌能够产生各种过敏性物质、有气味的化学物质以及有毒代谢产物( 真菌毒 素) 。真菌毒素有的附着于真菌孢子表面，有的存在于孢子内部。当真菌生长繁殖并 随着孢子扩散时，大量的真菌可以引起一系列的健康效应，如过敏、哮喘、感染或毒 性反应，影响着从业人员的健康，这已经成为全球社会关注的焦点。因此，快速定性 定量地检测给定环境中的真菌以有利于监测公众受危害的程度，采取有效的防护措 施，保护公众健康是十分必要的。 本论文旨在建立和发展以d n a 分析为基础的分子检测鉴别标记：特异p c r 引物 和特异杂交探针，力求达到在不同的分类水平上快速、准确、灵敏地检测工作环境中 常见气传真菌，为了解工作环境中常见真菌的种系组成及其与公众健康的相关性提供 另一种分析手段。主要技术方法为p c r 特异扩增和探针特异杂交检测。主要工作内 容有以下几方面： 1 特异p c r 引物。我们从文献中摘取了5 3 对各种分类水平上的p c r 特异检测 引物，主要目标是针对工作环境中真菌类群繁多的特点，拓展被检测真菌类群，试验 所选择的5 3 对引物的特异性。选择了3 6 个真菌菌株的纯培养作为研究目标，它们代 表了工作环境中常见气传真菌1 4 个属的2 6 个种。此外实验中还包括了1 6 个细菌菌 株作对照，既有g r a m 菌株又有g f a i n + 菌株。首先建立了一套简便、快速而有效的从 真菌菌丝、孢子中提取d n a 的方法。以纯培养物d n a 为模板，通过大量的p c r 筛 选试验，我们证实5 3 对p c r 引物中只有2 4 对引物在不同的分类水平上具有良好的 特异性。这些引物可分为真菌通用引物( 1 0 维) 、细菌通用引物( 2 组) 、类群或属特异 性引物( 5 组) 以及种特异性引物( 7 组) 。并在本实验室的p c r 系统中优化了这些引物达 到特异检测的p c r 条件。这些结果为下一步以p c r 为基础的分析方法检测鉴别工作 环境中常见气传真菌奠定了良好的基础。 山东大学博士学位论文 2 非放射性探针标记杂交技术。在本实验室建立了一套非放射性探针标记杂交 方法，为p c r 扩增与探针杂交方法相结合，进一步适应检测实际样品中混合状态的 真菌，提高检测的灵敏度奠定技术基础。从文献中摘取了9 个寡核苷酸探针，以常见 气传真菌的2 5 个种作为被试菌种，通过非放射性探针标记杂交技术检测探针的特异 性，并在该杂交系统中优化了每一个探针达到特异检测的杂交温度。结果表明，已有 探针在新建立的杂交检测系统和广泛的被检真菌范围上试验时，其特异性和特异检测 条件会发生改变，有必要重新试验。 3 环境样品中真菌类群的检测。利用血球计数板显微镜下测定真菌孢子总数、 m e a 和d g l 8 平板培养菌落计数( c f u s ) 、p c r 特异扩增和p c r 产物探针杂交检测 4 种方法，对3 个不同工作环境样品中的常见气传真菌类群进行了检测，并将不同检 测方法的结果进行了分析比较。培养结果表明，尽管不同样品中真菌孢予含量差异 明显，但是数量优势真菌或者是p e n i c i l l i u ms p p 或者是a s p e r g i l l u ss p p ，培养得到的 其它常见气传真菌还有c l a d o s p o r i u ms p p 、p a e c i l o m y c e ss p p 、r h i z o p u ss p p 、 c h r y s o n i l i as p p 、t r i c h o d e r m as p p 和w a l l e m i as e b i 。孢子总数计数结果是平板菌落计 数结果的3 8 倍。实验证明环境空气样品中存在着p c r 反应抑制因子，在d n a 提取 过程中抑制因子可进入d n a 样品中，通过稀释d n a 的方式可消除p c r 抑制效应。利 用特异p c r 引物和探针，我们可以确定在空气样品中存在着某类和某种真菌，其中 的一些在培养法中未曾检出。p c r 扩增方法的检测灵敏度为每个p c r 反应9 7 3 孢子、 1 3 1 9 3c f u s 。探针杂交检测方法的检测灵敏度为每个p c r 反应2 - 4 孢子、 0 2 1 2 c f u s 。杂交检测方法比p c r 扩增方法更灵敏、更稳定，样品间的差异更小。 实验证明，p c r 和探针杂交技术可以特异、灵敏、准确地检测鉴别样品中的气传真 菌，是常规孢子总数和菌落数检测方法的良好补充，尤其是p c r 为基础的探针杂交 技术在检测环境样品、进行环境监测方面更具有应用潜力，但是达到特异而系统地检 测环境样品中存在的各个类群，需要建立和发展更多的特异p c r 引物或者特异的杂 交探针。 4 1 8 sr r n a 系列检测探针的建立。我们对常见气传真菌1 5 个属3 1 个种4 9 个 真菌菌株的1 8 sr r n a 进行了序列测定。序列分析表明接合菌类( z y g o m y c o t a ) 与子 囊菌类( a s c o m y c o t a ) 1 8 sr r n a 序列差异明显。在孑囊菌类群中，又归为几个进化 分支，这种归类有助于了解那些研究得较少的真菌的分类位置。从归类结果看， u 山东土学博士学位论文 w a l l e m i as e b i 与子囊菌中其他的种属差异最大。在序列分析的基础上，针对研究中的 各个种属设计了1 0 8 个新的1 8 2 4 个碱基长度的寡核苷酸探针。通过g e n b a n k 序列 同源分析和杂交温度预测后，选择了其中的3 3 个探针进一步实验，其中有的探针为 属特异性的，有的为某些种特异性的。进一步的实验优化确定了3 3 个探针达到特异 杂交检测的适宜杂交温度。这一组新发展的种属特异性探针又为环境质量监测提供了 新的分子鉴别标记。 关键词：气传真菌，检测和鉴别，d n a 分子标记，p c r 技术，非放射性探针杂交 工作环境，序列多样性，种系发生。 i l i 山东大学博士学位论文 m o l e c u l a rd i a g n o s t i cm 噙且k e r sf o rr a p i d d e t e c t i o no fc o m m o na i r b o r n ef u n g ii n w o r n ge n r o n m e n t s a b s t r a c t f u n g a ls p o r e sa r eu b i q u i t o u s ，b e i n gf o u n di na l lt y p e so fi n d o o rs e t t i n g s ，i n c l u d i n g o f f i c e s ，h o m e s ，v a r i o u sf a c t o r i e s ，f a r m s a n do t h e rw o r k i n ge n v i r o n m e n t s ag r o w i n g n u m b e ro fr e s e a r c hs t u d i e sa n dd i s e a s e i n v e s t i g a t i o n s s h o wa l l a l a r m i n g r a t eo fh i g h c o n c e n t r a t i o n so f p o t e n t i a l l yp o i s o n o u so ra l l e r g y - p r o d u c i n gf u n g i ( m o l d ) f o u n di nt h e s e p l a c e s ，s o m em o l d s c a n p r o d u c eav a r i e t yo fa l l e r g e n i cs u b s t a n c e s ，o d o r o u sc h e m i c a l s ，a n d t o x i cm e t a b o l i t e s ( m y c o t o x i n s ) s o m em y c o t o x i n sc l i n gt ot h es u r f a c eo fm o l ds p o r e s ； o t h e r sm a yb ef o u n dw i t h i ns p o r e s w h e ni tm u l t i p l i e sa n ds p r e a d sv i as p o r e s ，h i g hl e v e l s o fm o l dc a nc a n s eas p e c t r u mo fh e a l t he f f e c t ss u c ha sa l l e r g y , a s t h r n a , i n f e c t i o n s ，o rt o x i c r e a c t i o n sa n dh a v et h e p o t e n t i a l t oa f f e c t o c c u p a n t s h e a l t h h e a l t h r i s kc a u s e db y m i c r o b i o l o g i c a la g e n t si sb e c o m i n gaf o c u so fs o c i a l c o n c e r n sw o r l d w i d e t h u s ，r a p i d d e t e c t i o na n d q u a n t i f i c a t i o no f f t m g i i na g i v e ne n v i r o n m e n t a l ee s s e n t i a lf o r m o n i t o r i n g t h e e x p o s u r e r i s ka r l d ，t h u s ，d e v e l o p i n gp r e v e n t i o nm e a s u r e sf o r p u b l i c h e a l t hp u r p o s e t h i st h e s i sd e a l sw i t hd e v e l o p m e n to fm o l e c u l a rd i a g n o s t i cm a r k e r sf o rr a p i d ，a c c u r a t e a n ds e l l s i d v ed e t e c t i o no fc o m m o na i r b o r n e 缸1 9 ii nw o r k i n ge n v i r o n m e n t sa td i f f e r e n t t a x o n o m i cl e v e l s w ee x a m i n e d5 3s e t so fp c rp r i m e r sf o re n v i r o n m e n t a lm o n i t o r i n go fi n d o o ra i r q u a l i t y 3 6f u n g a ls t r a i n sr e p r e s e n t i n g2 6s p e c i e sf r o m1 4g e n e r a o f c o m m o n l y f o u n df u n g i a n d1 6d i f f e r e n tb a c t e r i as t r a i n so f b o t hg r a m - n e g a t i v ea n dg r a m - p o s i t i v ew e r ei n c l u d e di n t h ee x p e r i m e n t a m o n gt h e5 3s e t so fp r i m e r s ，w ev e r i f i e dt h es p e c i f i c i t yo f2 4p r i m e r s e t s t l l e ya r ec a t e g o r i z e da su n i v e r s a lf u n g a l ，u n i v e r s a lb a c t e r i a ，g r o u p a n ds p e c i e s - s p e c i f i c , t h ep c r c o n d i t i o n st oa c h i e v et h eo p t i m a ls p e c i f i c i t yw e r ep r e s e n t e d t h e s e r e s u l t s 蝴s e r v ea s g u i d ef o rs t e p w i s e p c r - b a s e dd e t e c t i o na n di d e n t i f i c a t i o no ft h e c o m m o na i r b o r n ef u n g ii ni n d o o re n v i r o n m e n t s w 山东土学博士学位论文 an o n - r a d i o a c t i v e h y b r i d i z a t i o np r o c e d u r e w a se s t a b l i s h e di no u rl a ba n dt h e s p e c i f i c i t yo f 9p u b l i s h e do l i g o n u c l e o t i d ep r o b e sw a st e s t e da m o n g2 5s p e c i e so fc o m m o n a i r b o r n ef u n g i t h eh y b r i d i z a t i o nt e m p e r a t u r ef o rs p e c i f i cd e t e c t i o no fe a c hp r o b ei no n r h y b r i d i z a t i o ns y s t e m w a s o p t i m i z e d i t w a sd e m o n s t r a t e dt h a ti tw a s n e c e s s a r y t o r e e v a l u a t et h e s p e c i f i c i t yo ft h ep u b l i s h e dp r o b eb e c a u s et h es p e c i f i c i t ya n dd e t e c t c o n d i t i o nm i g h tb e c h a n g e d i nan e wd e t e c t i o n s y s t e m f o u r m e t h o d s ，m i c r o s c o p i cc o u n t i n g o f t o t a lf u n g a ls p o r e ，c o l o n yf o r m i n gu n i t s ( c f u s ) c o u n t i n go nm e a a n dd 0 18m e d i a , p c ra n d p r o b eh y b r i d i z a t i o no f p c r p r o d u c t s ，w e r e a p p l i e dt oa n a l y z et h ec o n l l l l o na i r b o r n ef o n g a lc o m m u n i c a t i o no f a i rs a m p l e sf r o mt h r e e d i f f e r e n tw o r k i n gp l a c e sa n dt h er e s u l t sw e r ec o m p a r e d t h ec u l t u r em e t h o ds h o w e dt h e d o m i n a n tf u n g ii nt h r e ew o r k i n gp l a c e sw e r ep e n i c i l l i u ms p p o ra s p e r g i l l u ss p p e v e n t h o u g h t h e r ew a sm u c hd i f f e r e n c ei ns p o r ed e n s i t ya m o n g s a m p l i n gp l a c e s o t h e rc o m m o n a i r b o r n ef u n g is u c ha sc l a d o s p o r i u ms p p ，p a e c 打o m y c e ss p p ，r h i z o p u ss p p ，c h r y s o n i b a s p p ，t r i c h o d e r m as p p a n d w a l l e m i as e b iw e r ea l s of o u n di nt h es a m p l e s t h ec f u s c o u n t i n gw a s3 - 8t i m e sl o w e r t h a nt h et o t a ls p o r ec o u n t i n g i tw a sd e m o n s t r a t e dt h a tp c r i n h i b i t o r so f t e ne x i s t e di nt h es a m p l e sa n dc o u l db ec o e x t r a c t e dt o g e t h e rw i t hd n a f r o m a i rs a m p l e s t h ee f f e c to fp c ri n h i b i t o r sc a nb ee l i m i n a t e db yd n ad i l u t i o ni no u rs t u d y u s i n gs p e c i f i cp c rp r i m e r sa n dp r o b e sw e i d e n t i f i e dt h ep r e s e n c eo fs e v e r a lg r o u p sa n d s p e c i e so ff u n g ii nt h ea i rs a m p l e s t h e d e t e c t i o ns e n s i t i v i t y - f o rp e r a m p l i f i c a t i o n sw a s9 t o7 3s p o r e sa n d1 3t o1 9 3c f u s p e rp e r r e a c t i o n t h eh y b r i d i z a t i o nd e t e c t i o nl i m i tw a s 2t o4s p o r e sa n d0 2t o1 2c f u s h y b r i d i z a t i o nm e t h o dw a sm o r es e n s i t i v et h a np e r a m p l i f i c a t i o na n ds h o w e dl e s s v a r i a t i o na m o n gs a m p l e s - p c ra n dp r o b eh y b r i d i z a t i o n t e c h n i q u e sw e r ep r o v e d t ob es p e c i f i c ，a c c u r a t ea n ds e n s i t i v ef o rd e t e c t i o no f a i r b o r n ef u n g i i nt h e s ea i rs a m p l e sa n dp r o v i d e dac o m p l e m e n t a r ym e t h o dt ot o t a ls p o r ec o u n t i n ga n d c f u s c o u n t i n g at w o s t e pp c r - b a s e d d e t e c t i o ns t r a t e g yt h r o u g hf i r s ts e l e c t i v e l ya m p l i f ya g r o u p o f t h et a r g e td n a sf o l l o w e db ym o r es p e c i f i ce x a m i n a t i o nv i ap r o b eh y b r i d i z a t i o n t o a s p e c i f i ct a r g e ti nt h ep c rp r o d u c t sh a sp r o m i s i n ga p p l i c a t i o n si nt h ee x a m i n a t i o n o fa i r s a m p l e sf o re n v i r o n m e n t a lm o n i t o r i n g f o rs p e c i f i c d e t e c t i o no fa l lf u n g ii nt h es a m p l e s m o r e s p e c i f i cp c rp r i m e r s o ro l i g o n u c l e o t i d ep r o b e ss h o u l db ed e v e l o p e da n de v a l u a t e d v 山东太学博士学位论文 f u r t h e rm o r ew e s e q u e n c e d18 sr r n a f r o m4 9 f u n g a ls w a i n sr e p r e s e n t i n g3 1 s p e c i e s f r o m15g e n e r a m o s to f t h e s es p e c i e sa r ec o n i i n o na i r b o r n ef u n g ia n dp a t h o g e n st h a tm a y c a u s ev a r i o u s p u b l i c h e a l t h c o n c e r n s s e q u e n c ea n a l y s i s r e v e a l e dd i s t i n c t d i v e r g e n c e b e t w e e nz y g o m y c o t aa n da s c o m y e o t a w i t h i na s c o m y c o t a ，s e v e r a ls t r o n g l ys u p p o a e d c l a d e sw e r ei d e n t i f i e dw h i c hf a c i l i t i e st h et a x o n o m i cp l a c e m e n to fs e v e r a l1 i t t l e s t u d i e d f u n g i w a l l e m i as e b ia p p e a r e d 髂t h e m o s td i v e r g e dg r o u pf r o ma l lt h eo t h e ra s c o m y c o t a s p e c i e s b a s e do n t h es e q u e n c ed a t a ，1 0 8p r o b e sw e r ed e s i g n e df o re a c hg e n u sa n ds p e c i e s i n c l u d e di nt h i s s t u d y a f t e rh o m o l o g ys e a r c ha n dh y b r i d i z a t i o ne v a l u a t i o n s ，3 3p r o b e s w e r ev e r i f i e da sg e n u s - o rs p e c i e s s p e c i f i cf o rt h ed e t e c t i o no f c o m m o n a i r b o m ef i m g i t h e o p t i m a lh y b r i d i z a t i o nt e m p e r a t u r e s t oa c h i e v et h eb e s ts p e c i f i c i t yf o rt h e s e3 3p r o b e sw e r e d e t e r m i n e d t h e s en e wp r o b e sc o n t r i b u t e t ot h em o l e c u l a r d i a g n o s t i c r e s e a r c hf o r e n v i r o n m e n t a lm o n i t o d n g k e y w o r d s ：a i r b o m ef u n g i ，d e t e c t i o na n di d e n t i f i c a t i o n , m o l e c u l a rd i a g n o s t i cm a r k e r , p c r ， n o n r a d i o a c t i v e p r o b eh y b r i d i z a t i o n ，w o r k i n g e n v i r o n m e n t s ，s e q u e n c ed i v e r g e n c e ， p h y l o g e n y 原创性声明 本人郑重声明：所呈交的学位论文，是本人在导师的指导下，独立进 行研究所取得的成果。除文中已经注明引用的内容外，本论文不包含任何 其他个人或集体已经发表或撰写过的科研成果。对本文的研究作出重要贡 献的个人和集体，均已在文中以明确方式标明。本人完全意识到本声明的 法律责任由本人承担。 论文作者签名：鬈杰! 纽日 关于学位论文使用授权的声明 本人完全了解山东大学有关保留、使用学位论文的规定，同意学校保 留或向国家有关部门或机构送交论文的复印件和电子版，允许论文被查阅 和借阅；本人授权山东大学可以将本学位论文的全部或部分内容编入有关 数据库进行检索，可以采用影印、缩印或其他复制手段保存论文和汇编本 学位论文。 ( 保密论文在解密后应遵守此规定) 论文作者签名：墓塞! 色导师签名：访燃日期：丝兰车塑咖论文作者签名：筮盔! 睦导师签名：谨丝弪互丛日期：丝兰罕塑却 山东土学博士学位论文 p c r c f u s r d n a s b s v o c m v o c u m v o c s 符号说明 p o l y m e r a s ec h a i n r e a c t i o n 聚合酶链反应 c o l o n yf o r m i n g u n i t s 菌落形成单位 r i b o s o m a ld n a核糖体d n a s i c kb u i l d i n gs y n d r o m e“s i c kb u i l d i n g ”综合症 v o l a t i l eo r g a n i cc o m p o u n d s挥发性有机化合物 m i c r o b i a lv o l a t i l eo r g a n i cc o m p o u n d s微生物挥发性有机化合物 u n i q u e m i c r o b i a lv o l a t i l eo r g a n i cc o m p o u n d s 微生物独特挥发性有机化合物 e n z y m e l i n k e di m m u n o s o r b e n ta s s a y酶联免疫吸附测定 r e s t r i c t i o nf r a g m e n t l e n g t hp o l y m o r p h i s m 限制酶切片段长度多态性 n u c l e a rs m a l lr d n a细胞核核糖体小亚基d n a m l t o c h o n d 削s m a l lr d n a线粒体核糖体小亚基d n a m i t o c h o n d r i a ll a r g er d n a线粒体核糖体大亚基d n a i n t e r g e n i c t r a n s c r i b e ds p a c e r基因间转录间隔区 a l k a l i n ep r o t e a s e碱性蛋白水解酶 m a l te x 廿a c ta g a r麦芽浸出物琼脂 t r y p t o n eg l u c o s e e x t r a c t a g a r 胰胨浸出物葡萄糖琼脂 d i c h l o r a ng l y c e r o la g a r m e l t i n gt e m p e r a t u r e 解链温度 a d e n o s i n e腺嘌呤核苷 t h y m i d i n e 胸腺嘧啶脱氧核苷 c y t i d i n e 胞嘧啶核苷 g u a n o s i n e乌嘌呤核苷 一 一 m m 撇 眦 一 一 蔓 a t c g 山东土学博士学位论文 第一部分绪论 空气中微生物的种类和数量是影响空气质量的重要因素之一。空气中存在有细 菌、放线菌、真菌、病毒、花粉等生物颗粒。其中，大多数真菌的营养要求较为简单， 很容易在土壤或者其他各类基质上生长繁殖，产生大量的孢子。体积小、质量轻的孢 子可随空气流动在空气中传播，称之为“气传真菌”( a i r b o r n ef u n g i ) ，( 现代空 气微生物学及采检鉴技术，于玺华，车风翔主编，1 9 9 8 ，军事医学科学出版社) 。 不仅仅是真菌孢予，有报道表明真菌的菌丝碎片也可以象孢子一样漂浮，成为气溶胶 的稳定成分“。量大易扩散的特点使得真菌在空气中的存在相当广泛而普遍。某些真 菌遇到合适的条件，通过生长繁殖，在一定区域内积聚成“灾”，在工作和生活环境、 医学领域、食品业、农林业以及工业领域产生不同的危害效应，最终危害到人类的健 康。 1 1 工作环境常见气传真菌及其危害性 l _ 1 1 工作环境常见气传真菌 真菌的孢子随空气流动而传播，无处不在，无孔不入。越来越多的环境调查和流 行病学研究表明在各种类型的室内外工作环境中，包括家庭、办公室、工厂和农场， 都存在着不同种类和数量的真菌类群。”。工作环境中常见的气传真菌种类和数量随着 地域、季节、气候和工作环境温度、湿度及性质的不同而有所变化。通常地， a s p e r g i l l u ss p p ( 曲霉属类群) 和p e n i c i l l i u ms p p ( 青霉属类群) 既是工作环境中 的常见类群，又常是其中的数量优势菌群”“。由于这两个类群菌种繁多，致使在环 境检测中往往仅能鉴定到属的水平。其他各类群则常常出现在不同的环境样品中，如， c j a d o s p o r j u m s p p ( 枝孢菌属) 在室外环境中常见且为优势菌之一；s t a c h y b o t r y ss p p 多生长在潮湿的木质环境中；在牛，马棚等处理干草的农场环境中w a l l e m i a s e b i 及 其他的耐旱真菌则是优势类群。数量少但较为常见的还有l t e r n a r j as p p ( 链格孢 属) ，p a e c i l o m y c e ss p p ( 拟青霉属) ，f u s a r i u m s p p ( 镰刀菌属) ，t r l c h o d e r m a s p p ( 本霉属) ，r h i z o p u ss p p ( 根霉属) ，e u c o rs p p ( 毛霉属) ，e l o c l a d j u ms p p ， 6 r e m m e 口i e l l as p p 等等。环境中气传真菌孢子的种类和数量还取决于不同真菌自身 的生理特性。有些菌如a s p e r g j l l u ss p p ，p e n i c i l l i u ms p p 和c a d o s p o r j u m s p p 等形成的孢子个体微小，数量多，并形成脆弱易散的孢子链或者孢子柱，较容易飘散 山东上学博士学位论文 在空气中，这也是该三大类菌群常在不同的环境中被检测到并且占有数量上的优势的 原因之一。a l t e r n a r i as p p 。所形成的孢子较大，因而不易在空气样品中检测到。一 些f u s a r i u ms p p 孢子着生在气生菌丝上并形成黏液滴，因而释放到空气中的数量大 减。表1 1 中列举了在室内外工作环境中发现报道的气传真菌，对有些属中常出现 的种也一并列入。 表1 1 工作环境中常见的气传真菌 t a b l e1 1c o m m o na f t b o r n ef u n g ii nw o r k i n ge n v i r o n m e n t s ( “2 2 ) g e n u s s p e c i e sg e n u s s p e c i e sg e n u s s p e c i e s a i t e r n a r i as p p c f e r m e n t a n s pc o m m u n e a a l t e r n a t ach e r b a r u mp e x p a n s u m a c h a m y d o s p o r a c s p h a e r o s p e r m u m p f r e q u e n t a n s a s p e r g i l l u ss p p c r y p t p c o e c u ss p p p h i a l o p h o r as p p a f l a t u se p i c o c c u ms p p p f a s t i g i a t a a f u m i g a t u s e u r o t i u m s p p p h o m a s p p ag l a u c sg r o u p 点r e p e n s 户h e r b a r u m an i g e rf u s a r i u m s p p r h i z o p u ss p p ao e h r a c e u sfc u l m o r u mr h o d o t o r u l a a r e s t r i c t u sg r o u pe m o n o l i f o r m es t a c h y b o f r y ss p p av e r s 记0 l o t g e o m y c e s p a n n o r u m 丘a t r a b o t r y t i sc i n a r e a g e o t r i c h u m s p p c h a r t a r u m c a n d i d a f a m a t am u c o r p l u m b e u s t r i c h o d e r m a s p p c h a e t o m i u n g l o b o s u mp a e c i l o m y c e s v a r i o t i izv i r i d e c h r y s o s p o r i u ms p p p e n i e i l l i u ms p p u l o c l a d i u m s p p c h r y s o n i l i as i t o p h i l a户a u r a n t i o g r i s e u m uc h a r t a r u m c l a d o s p o r i u ms p p p b m v i c o m p a c t u m u b o t r y t i s e c l a d o s p o r i o i d e s旦e h r y s o g e n u m 耽! l e m 洫s e b i 通常室内空气中还有细菌存在。如有s t a p h y l o c o c c u s 、m i c 五o c o c c u s 、 a n t i n o m y c e s 、s t r e p t o m y c e s 等属的种类，有包括如c j 坩在内的生孢类群，有 2 山乐土学博士学位论文 c o r y n e b a c t e r i u m - b r e v i b a e t e r i u m 组的成员“。此外在室内加湿器易发现 f j a v o b a c t e r i u m 、l e g y o n e l a 、p s e u d o m o n a s 和s e r r a t i am a r c e s c e n 且 对于工作环境中气传真菌的种类和数量并没有一个明确的标准来表明其存在是 否有危害、危害的程度如何。在有些工作环境中丝状真菌和酵母的含量可能高达1 矿 个一。”。在农业工作环境中，不同的工作种类和工作时期，所接触的可培养真菌孢 子量达1 0 2 到1 0 “c f u m 3 ，在奶牛饲养场含量较高，尤其是喂食与其他的干草处理过 程中，空气中真菌含量达到峰值。”。对于室内空气中气传真菌的含量，k l a n o v a 。6 在 其文章中指出，室内空气中真菌的浓度在2 ，0 0 0c f u m 3 以上就可以视为严重影响从 业人员健康的危险因素。通常认为，正常情况下真菌的含量室内环境应低于室外环境， 室内外环境中真菌的类群应当相似。室外气溶胶中腐生真菌孢子的含量通常都超 过1 0 3c f u m 3 ，在夏季可能平均在1 0 4c f u m 3 以上。在特殊的情况下，如免疫系统机 能存在障碍的人，其生活环境中的真菌孢子的含量一般不能超过1 0 0c f u 疗。所以通 常是以人们的申诉和症状来判断是否存在危害及危害程度如何。 1 1 2 工作环境中气传真菌的潜在危害性 尽管在室内空气中真正的病原性真菌相对而言并不常见，但是许多常见的真菌以 及它们的产物的确是影响健康的潜在危险因素。这种影响主要表现在以下几个方面： ( 1 ) 感染性疾病。只有很少的几种气传真菌能够侵袭活细胞引起感染性疾病。“。常 见的由a f u m i g a t u s 以及其他a s p e r g i l l u ss p p 引起的侵袭性曲霉病( i n v a s i v e a s p e r g i l l o s i s ，i a ) ，可发生在肺部或其他深层组织部位。随着医疗技术的发展， 恶性肿瘤、血液病、骨髓移植、组织器官移植以及爱滋病患者的生存期得以延长， 但由于免疫抑制剂、细胞毒药物、广谱抗菌药及各种微侵袭手段的广泛应用，医 院真菌感染日益增多。”，尤其是侵袭性曲霉病在免疫系统机能有障碍的病人中不 仅发病率高，而且死亡率极高。资料表明，1 9 8 1 到1 9 9 3 年间，在德国侵袭性曲霉 病发病率上升了1 4 倍；在9 0 年代，美国上升了1 5 8 。同时，许多常见真菌因 此成为机会致病菌，导致真菌感染率的不断上升。 ( 2 ) 真菌可作为变应原，导致各种过敏和哮喘等症状。真菌性抗原是空气中常见的变 应原，所有气传真菌的孢子都可能引起过敏性哮喘、鼻炎及肺炎等。”。如已确 定a l t e r n a r i a 和a s p e r g i l l u s 类群是面包师哮喘的起因“”。与农作物有关的真菌， 如c a d o s p o r i u ms p p 和a l t e r n a r i as p p ，常常引起收获季节哮喘“”。木工、造 山暑土曩博士学位论文 纸厂和锯木厂的工人处理树皮中污染有a t e r n a v i as p p 和p e n i c i l l i u ms p p 的 木材时，会引起超敏性肺炎。c h r y s o n i h as i t o p h i l a 可引起伐木工人的职业哮 喘。还有其他特殊从业人员的农