（植物学专业论文）用光镊研究微管系统的分子力学特征.pdf

中图农业大学博士学位论文 摘要 微管是普遮存在于真核细胞中的一种重要的蛋白骨架，它最重要的功能之一是产生机械力 推动细胞的各种形式的运动，对其力学性质的研究有助于理解和阐明其功能及机制。由于光镊 可实现对生物活体样品的非实体接触和无损伤操作。且可涓定生物大分子问纳米量级的微小位 移和皮牛顿量级的作用力，近年来已广泛应用于生物学领域本课题应用双光镊技术研究微管 系统的分子力学特征，包括荧光标记微管断裂力的测量、徽管光敏断裂过程的研究、微管弹性 的研究、微管光敏新裂枫理的研究及微管蛋白与微管相互作用力的研究。 首先建立了适用予光镊擐作的徽臂系统微管蛋白从猪脑中提取，纯化后用荧光染料罗丹 明和生物素标记器记好妁豢瞥蛋白在体外聚合成分散的单根徽管，经紫杉醇稳定后稀释到所 需浓度 在实醵过撼巾发疆获光标记的徽管在激发光下会发生断裂，为了解决这个问题，对微管的 光敏断裂搠囊慧静丁较深入的研究实验结果表明，激发光和染料分子的同时存在是微管断裂 的必要条孵，激发光越强，染料浓度越高，微管断裂越快。激发光与染料相互作用，释放出的 活性氯导蕴警断裂，活性氧中的自由基是主要的破坏因子抗坏血酸可以有效地减缓微管断 裂 建立起连接生物体系与光镊系统的相关实验系统，主要包括样品小池的制作和小球的包被。 我们制作了多种样品池，以适合不同实验条件的需要此外，还制作了流动样品池和温控流动 样品池适合需要更换溶液和准确控制样品温度的实验。经过摸索，确定了以抗生物索包被的 小球作为光镊操作微管的手柄 在用光镊拉伸荧光标记徽管的过程中发现微管平均可以伸长2 0 。在此之后微管“台阶式” 断裂过程中。也观寨到剩余徽营原丝的伸长此实验直接显示了徽管的弹性性质荧光标记微 管的p e r s i s t e n c ef e l l g m 也比正常徽管小3 个数量级。荧光标记徽管的弹性变化与紫杉醇有关， 也与激发光的破坏作用有关通过对拉断微管的力的统计发现，力的大小主要分布在3 口n 左右， 大大小于拉断未经荧光标记的微管的力激发光的破坏使微管蛋白亚基问的作用力大大减弱。 在微管的光敏断裂过程中出现了”台阶式”断裂现象。组成徽管的原丝不是同时断裂而是 相继断裂，最后造成整个微管的断裂说明备徽管原丝受活性氧攻击不是均匀的而是相互独立 的，也说明了此状态下的微管原丝之间的相互作用力很弱 此外，我们还测定了微管结合蛋白a t m a p 6 5 1 与徽管之问的脱结合力。我们在体外聚合的 微管溶液中加入a t m a p 6 5 - 1 使微管成束，用双光镊测定使镀管之间的结合脱离的力结果表明， 使微管之间的结合脱离的力可能为7 5 口n 或1 5p n 通过以上利用光镊技术对荧光标记微譬力学性质的研究及搬管结合蛋白a t m a f 6 5 1 与徽 管之间的脱结合力e 研究，为研究徽管动态和蛋白之阅相互作用力提供了薪的手段和思路，为 更深入系统地研宄细胞骨架分子力学特征及其他生物大分子的分子力学特征奠定了基础。 关键词：微管，光镊，分子力，徽管结合蛋白 u 中国农业大学博士学位论文 a b s t r a c t m i c r o t u b u l e s ( m v s ) ，o n eo f t h em a j o rc o m p o n e n t so f n l ec y t o s k e l e t o ni ne u k a r y o t i cc e l l s p l a yv i t a l r o l e si nm a n yb i o l o g i c a lp r o c e s s e s o n eo ft h em o s ti m p o r t a n tf u n c t i o n so fm 1 bi st og e n e r a t e m e c h a n i c a lf o r c et op o w e rv l t r i o l _ l sm o v e m e n t so fc e l l s s t u d yo ft h em e c h a n i c a lc h a r a c t e r so fm t b e n e f i t so u ru n d e r s t a n d i n gm tf u n c t i o n sa n dt h em e c h a n i s mo ff o r c eg e n e r a t i o n b e c a u s eo ft h e a d v a n t a g e so fn o n - c o n t a c ta n dn o n - i n t r u s i v em a n i p u l a t i o nw i t hl i v i n go b j e c t s ，a n dm e a s u r i n g d i s p l a c e m e n ti nn a n o m e t e rs c a l ea n df o r c ei n # c o - n e w t o ns c a l e ，o p 6 c a lt w e e z e r sh a v eb e e nn o w w i d e l ya p p l i e di nb i o l o g i c a ls t u d i e s i nt h i sd i s s e r t a t i o n ，ad u a l o p t i c a lt w e e z e r ss y s t e mw a su s e dt o s t u d yt h em o l e c u l a rm e c h a n i c a lc h a r a c t e r so fm i c r o t u b u l es y s t e m ，i n c l u d i n gt h eb r e a k i n gf o r c eo f f u o r e s c e n tl a b e l e dm i c r o t u b u l e ，t h ep r o c e s so f t h ep h o t o s e n s i t i v eb r e a k a g e ，t h ee l a s t i c i t yo fm t , t h e m e c h a n i s m so ft h ep h o t o s e n s i t i v eb r e a k a g e , a n dt h eu n b i n d i n gf o r c eb e t w e e nm i c r o t u b u l ea s s o c i a t e p r o t e i n s ( m a p s ) a n dm r s t h eb i o l o g i c a ls y s t e mp r a c t i c a b l ef o ro p t i c a lt w e e z e r ss t u d i e sw a sf i r s ts e tu p t u b u l i nw a s p u r i f i e df r o mp o r c i n eb r a i na n dl a b e l e db yr h o d a m i n ea n db i o t i n m t s w e r ea s s e m b l e di nv i t r oa n d s t a b i l i z e db yt a x 0 1 d u r i n ge x p e r i m e n t s ，w ef o u n df u o r e s c a n c el a b e l e dm r sb r o k eu n d e re x c i t a t i o nl i g h t t or e s o l v e t h i sp r o b l e m ，w ei n v e s t i g a t e dt h em e c h a n i s mo fh d 丌c l e a v a g ei nd e t a i l t h er e s u l t ss h o w e dt h a t f l u o r e s c e n td y ea n de x c i t a t i o nl i g h tw e r eb e t hn e c e s s a r yt ot h ep h o t o s e n s i t i v eb r e a k a g e t h e s t r o n g e rt h el i g h ti n t e n s i t ya n dt h eh i g h e rt h ed y ec o n c e n t r a t i o n ，t h ef a s t e rb r o k eu pt h en i t s i ti s t h er e a c t i v eo x y g e ns p e c i e s ( r o s ) p r o d u c e db yt h ei n t e r a c t i o nb e t w e e nt h ed y e sa n dt h e i re x c i t a t i o n l i g h tl e dt ot h em tb r e a k a g e f r e er a d i c a l s , o n ek i n do f r o s ，w e r et h em a i nd e s t r o y e r s a s c o r b i c a c i dr e s t r a i n e dt h ef l u o r e s c e n tm tb r e a k a g ee f f e c t i v e l y t h eo p e r a t i o ns y s t e mw a st h e ns e tu p , i n c l u d i n gt h e s a m p l ec e l l sa n dm i c m s p h e r ef o r t h e m a n i p u l a t i o n v a r i o u ss a m p l ec e l l sw e l em a d ea c c o r d i n gt od i f f e r e n te x p e r i m e n t s f l o wc e l la n d t e m p e r a t u r e - c o n t r o l f l o wc e l lw e r ea l s om a d ef o rr e p l a c e m e n to ft h eb u f f e ra n dc o n t r o l l i n g t e m p e r a t u r e o p t i c a lt w e e z e r s c a u g h t s i n g l en i tt h r o u g hm i c r o s h p e r e sw h i c hw e r ec o a t e dw i t h s t r e p a v i d i nt ob i n dt ot h em t a n d t h em e c h a n i c a lf o r c ew a sm e a s u r e db yt h eo p t i c a lt w e e z e r s f l u o r e s c e n c el a b e l e dm t sw e r ee l o n g a t e da b o u t2 0 抽a v e r a g ew h e ns t r e t c h e db yo p t i c a lt w e e z e r s w h e ns o m ep r o t o f i l a m e n t so f t h em tb r o k eu p , t h er e s i d u a lp r o t o f i l a m e n t sw a ss t r e t c h e de v e nl o n g e r t h i sr e s u l ti n d i c a t e dt h ee l a s t i cp r o p e r t yo ff l u o r e s c e n c el a b e l e dm l tt h ep e r s i s t e n c el e n g t ho f f l u o r e s c e n c el a b e l e dm tw a s3o “l e r so fm a g n i t u d es h o r t e rt h a nt h a to f m r sw i t h o u tn u o r s c 钉l c e l a b e l e d ，i tw a sa f f e c t e db yt a x o la n de x c i t a t i o nl i g h t t h eb r e a k i n gf o r c eo b t a i n e db yt h eo p t i c a l t w e e z e r se x p e r i m e n t sw a sm a j o r l ya r o u n d3 p n , w h i c hw a sm u c hs m a l l e r t h a nt h a tw i t h o u t f l u o r e s c e n c el a b e lm r s t h ei n t e r a c t i o nf o r c eb e t w e e nt u b u l i u sw i t sw e a k e n e db yt h ee x c i t a t i o n l i g h t 1 1 1 中国农业大学博士学位论文 s t a i r s - l i k es t e p so c c u r r e dd u r i n gt h er e c o r d i n go f t h eb r e a k a g ep r o c e s s i ts h o w e dt h a tt h eb r o k e n o fp r o t o f i l a m e n t so ft h em tw a sn o ts i m u l t a n e o u sb u ts t e pb ys t e p ，s u g g e s t i n gp r o t o f i l a m e n t sw e r e n o ta t t a c k e db yf r e er a d i c a l sc o r r e l a t i v e l ya n du n i f o r m l y , b u ti n d e p e n d e m l y i ta l s oi n f e r r e dt h a tt h e i n t e r a c t i o n sb e t w e e np r o t o f i l a m e n t sa r ev e r yw e a k ， i na d d i t i o n ，w em e a s u r e dt h eu n b i n d i n gf o r c eb e t w e e na t m a p 6 5 - 1 ，am a pf r o mp l a n t ，a n dm t m t sw e r eb u n d l e db ya t m a p 6 5 1 。a n dt h ef o r c et os e p a r a t eam t f r o mt h eb u n d l ew a sm e a s u r e db y o p t i c a l t w e e z e r s a c c o r d i n g t o t h er e s u l t s ，t h e f o r c e m i g h t b e 7 5 p n o r1 5p n t h er e s e a r c h e so f f e rn e wa p p r o a c ha n di d e af o rs t u d y i n gm e c h a n i c a lc h a r a c t e r so f t h ee y t o s k a l e t o n a n do t h e rb i o l o g i c a lm a e r o m o l u l e s k e y w o r d s ：m i c r o t u b u l e ，叩n c a lt w e e z e r s , m o l e c u l a r m e c h a n i c a lf o r c e , m i e r o t u b u l ea s s o c i a t e d p r o t e i n 中国农业大学博士学位论文 图l 。l 匿1 2 基1 3 圉l 鼻 图1 5 图1 6 图1 7 圈1 ，8 銎1 9 匿1 1 0 图1 ，1 l 图2 1 图2 2 图2 3 罄3 。l 銎3 2 图3 3 图3 , 4 图3 5 图3 6 圈3 7 嚣4 。l 圈4 。2 图4 。3 图4 , 4 图5 1 图5 - 2 盈5 3 垂5 4 露5 s 图5 6 图5 ，7 图5 8 图5 9 墅5 。l o 垂5 t l 图6 。t 图6 2 图6 3 圈6 4 图表目录 光镊形成的示意图4 双必矮溅重擞丝与歇球囊白终爰力与运动莎耩暴意蓬5 锾丝与虢臻蛋鑫稳簸镶羯静示意图6 厢光镊测量动蛋白的步距7 用光镊涮定打结徽熊挝断的力9 用光镊研究微管的抗挠剐度。l o 用多光镊测定徽管聚台的力 愆s f m 切压璇管 豢蓉在渡流孛静弯熬获态 l ： l ： 在l s 度体蠹弯藕徽管。1 4 用原子力显微镜测定微管的弯曲模量一1 4 纯化微营蛋白的s d s m p a g e 分析2 l 微管在细胞核、拨颓粒上的聚合2 2 体外聚合的徽管呈分数的单根状态2 2 簌激发先照射下，擞繁发生秘显貔酝裂现象 嚣激发光照蔓圣莠不产嫩荧宠据谴疆管鹃薮裂2 7 微营断裂时简与激发光强度的关系。2 7 微管断裂时间与微管搬自标记率的关系2 8 短时间照射后荧光标记徽管在黑暗中仍发毙断裂2 9 溉氧水和r o s 抑制j f l l 对徽管断裂的加速或然迟作用2 9 激发光照下溶液中活栋袋耜对量豹变亿慵溅，3 0 涎静流动撵晶拖 溢控流动样晶涎。3 不同条件下相互缩套的小球数占小球总数的话分比3 6 包被荧光抗体的小球3 7 双光镊系统装置图3 9 双光镊系统光路结构承意图加 小球成露及其光强度分辑 箱毙镊控 争壤管爨捧建程示意銎 粥光镊测定徽营断栽进程 4 3 拉伸微管过程中电艨随时间的关系图- ”4 5 4 s 次测量中断裂力的统计分布图4 5 作用在徽管上的力与徽管的伸长之阍的燕篆及其指数拟合4 6 微管应力与应交触荚蘸， 激发光对徽营弹挂麴影璃 耀q o 探灏豹a 球瓣靛咎藏辩霹交纯懿关豢灏 + 。，。4 7 4 8 a t m a p 6 5 1 使徽营藏艨的电镜结掏图5 l q d 输出信号与b 球挝穆的关系- - 5 2 两次移动球干扰信号的测量结果”- 5 3 两球同时存在时和仪商移动球时，移动球邂潮移出q d 测量范围的过程中q d 的 中国农业大学博士学位论文 i i 图6 5 图6 6 图6 7 图6 。8 图6 9 图6 1 0 信号变化5 4 移动球逐渐移出q d 测量范围的过程中q d 输出信号的理论和实验曲线5 4 测量微管蛋白与微管结合蛋白之间作用力的示意图5 5 用双光镊操作微管束的过程”5 5 使锻管问连接脱离的力的测量5 6 测量过程中出现双峰5 7 使微管之阊脱离结合的力的统计 v m 中国农业大学博士学位论文 i l l 缩写符号和试剂 p i ：p r o p i d i u ml o d i d e i v i e s ：2 f n m o r p h o l i n o e t h a n b n l f o n i ca c i d ，s i g m a e d a c ：n 一( 3 - d i m e t h y l a m i n o p r o p 叫) - n - e t h y l c a r b o d i i m i d eh y d r o c h l o r i d e e d c ：i - e t h y l - 3 ( 3 - d i m e t h y l a m i n o 卜p r o p y lc a r b o d i i m i d e e g t a ：e t h y l e n eg l y c o l - h i s ( 2 - a m i n o - e t h y l e t h e r ) - n n n ，n ，- t e t r a - a c e t i ca c i d i v i e s ：2 k n - m o r p h o l i n o ) e t h a n e - s u l f o n i ca d d d m s o ：d i m c t h y ls u f o x i d e n h s r h o d a m i n e ：5 ( a n d - 6 ) c a r b o x y t e t r a - m e t h y l - r h o d a m i n es u c c i n i m i d y ie s t e r p i p e s ：1 , 4 - p i p e r a z i n e d i e t h a n e s u l f o n i ca c i d d 1 v r d i t h i o e r y t h r e i t o l b s a ：b o v i n e 煳a l b u m i n e d t a ：e t h y l e n e d i a m i n e t e 打a a c e t l ca c i d p m s f ：p h e n y l m e t h ls u l f o n y lf l u o r i d e g t p ：g u a n o s i n et r i p h o s p h a t e a t p ：a d e n o s i n e 喇d h o s p h a t e d h r ：d i h y d r o r h o d a m i n e1 2 3 像o l ：p a c l i 协, x e l m t ：m i c r o t u b u l e m a p ：m i c r o t u b u l ea s s o c i a t e dp m t e i n i x 独创性声明 本人声明所呈交的论文是我个人在导师指导下进行的研究工作及取得的研究 成果。尽我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其他人已 经发表或撰写过的研究成果，也不包含为获得中国农业大学或其它教育机构的学位 或证书而使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所傲的任何贡献均已在论文 中作了明确的说明并表示了谢意。 研究生签名： 斛绎 i 时问：沙咕年, e l2 , o 日 关于论文使用授权的说明 本人完全了解中国农业大学有关保留、使用学位论文的规定，即：学校有权保 留送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅，可以采用影印、缩印或扫描 等复制手段保存、汇编学位论文。同意中国农业大学可以用不同方式在不同媒体上 发表、传播学位论文的全部或部分内容。 ( 保密的学位论文在解密后应遵守此协议) 研究生 导师签名 签名：i 余秦绛 身 ：糨 v 时间：伽 年6 月e t 时间： 年月 日 中国农业大学博士学位论文 第一章5 l 言 1 1 细胞骨架与生命运动 第一章引言 无论生命活动是如何的复杂和神奇，从本质上来说，依然要遵循物理的和化学的基本规律。 运动是生命活动的最基本特征之一细胞是构成生命的最基本单位，“活”细胞的最直接的可察 觉的现象就是“动”。事实上，细胞的各种生理过程都离不开细胞中各种亚细胞结构和太分子物 质的运动，如生物分子的合成、分选、储存、转移；遗传信息的表达；信号的识别和传导；分子 马达的运动等等细胞还能将能量从一种形式转化为另一种形式，并随外界环境而改变自身的结 构( c h e ne a ，1 9 9 7 ) 例如，血管内壁的内皮细胞会改变“压力敏感”基因的表达从而适应血 液的剪切力( m c c o r m i c ke t a l ，2 0 0 1 ) ：生物的发育过程中普遍存在的细胞迁移现象需要细胞产 生收缩力( s t o s s e l ，1 9 9 3 ) ；肌肉细胞的收缩；细胞受外力时产生的形变，等等。有运动就需要 有推动运动的力。长期以来，由于缺少对大分子间作用力的研究手段，生物学家们对生物学过程 中分子力学现象的了解极为有限。然而，对生物大分子的力学特征的研究，倒如细胞运动中的力 的产生机制及其调控、大分予问结合力和力学作用过程等等对阐明许多基本的生物学过程，如细 胞分裂、细胞生长、分化和发育等都可能提供重要的理论。 微丝( m i e r o f i l a m e n t ) 和微管( m i e r o t u b u l e ) 是真核生物中普遍存在的由蛋白质亚单位聚合 而成的纤维状的结构，它们与居间纤维( i n t e r m e d i a t ef i l a m e n t ) 共同构成细胞内相互联系、动态 的三维网络体系细胞骨架。大多数微丝和微管都是动态的，能够快速地进行聚合或解聚它 们在空间上以特定的方式排布并且随时进行重捧以适应不断变化的外界环境和细胞生理活动的 需求( m i t e h i s o na n d k i r s c h n e r ，1 9 8 4 a ，b ；m o o r ee t a l ，1 9 9 7 ：y u a ne t a l ，1 9 9 4 ：v a l i r o ne t a l ， 2 0 0 1 ) 。 有运动就需要有推动运动的力。机械力在生物的各个水平上都起着重要作用细胞骨架最重 要的功能之一是产生机械力推动细胞的各种形式的运动虽然生物体可以通过不同的机制产生运 动，但细胞中大多数的运动是依赖于细胞骨架体系的。一般来说，细胞骨架以两种机制推动细胞 的各种运动首先，徽丝和微管可以与其马达蛋白组成特定的运动体系马达蛋白是能够将化学 能转变为机械能的特殊蛋白质马达蛋白可以分为微丝马达( 例如m y o s i n ) 和徽管马达( 例如 d y n e i n 和k l n e s i n ) 。它们通过永解a t p 沿徽丝或徽管“轨道”运动，推动细胞自身或细胞内亚细 胞结构的运动，以及物质的运输等等( w a n l 妇，2 0 0 3 ) 最常见的肌肉收缩就是由徽丝系统中的肌 动蛋白丝与肌球蛋白丝产生相对滑动所致两种蛋白纤维问产生相对滑动的力正是由徽丝马达肌 球蛋白( m y o s i n ) 水解a t p 而提供的细胞鞭毛的摆动也是由于微管马达和微管之间产生相对滑 动而造成的( i n a b a ，1 9 9 3 ) 再比如动蛋白( k i n i n ) 可以利用水解a t p 释放的能量向微管的正 极运输囊泡而力蛋白( d y n e i n ) 则驱动囊泡向徽管的负端运输。在细胞有丝分裂过程中，高尔 基体和内质隔都经过解体和重建过程其中高尔基俸髓徽管的解聚而裂解成若干小囊泡分散在细 胞质中，当子细胞中微管再形成时，囊泡沿徽管移向徽管组织中心( m t o c ) ，重新形成高尔基 体；内质网也有类似的再形成过程但其形成的方向与高尔基体相反( p a l m e r ，2 0 0 5 ) 推测这种 运动方式也是由于高尔基体和内质同的囊泡上结合有类似动蛋白和力蛋白的蛋白质，推动其运动 中国农业大学博士学位论文 第一章引言 并维持极性再者，微丝和徽管都可以通过其聚合和解聚来产生机械力，形成细胞运动的动力来 源。微丝和礅管都是由其蛋白质亚单位聚合而成的结构蛋白质亚单位在微丝或微管两端的加入 ( 聚合) 或脱离( 螭聚) 可以产生推动或拉动的机械力( d o 和o me t a l ，2 0 0 5 ) 。这种运动机制 的典型例子存在于细胞的有丝分裂过程中在有丝分裂后期，对于染色体平均分向两极的运动， 一种解释就是随着结合于动粒端的微管去组装，动粒倾向于向极滑行以恢复“袖筒”壁与微管的 结合，从而拉动染色体向极运动( c o u ee t a ，1 9 9 1 ：l o m b i l l oe t a l ，1 9 9 5 ) 。同时，在有丝分裂 后期，除了染色体分向两极以外，两极之间也互相远离两极的分离伴随着微管的延长，这就同 微管聚合产生的力密切相关另外，一种名为李斯特( l l s t e r i u m ) 的细菌，当其侵入细胞后会形 成很长的微丝组成的尾部，并且徽丝处于快速的聚合解聚循环之中，由于其尾部微丝在正端快速 聚合并在负端快速解聚，从而推动整个细菌的向# 口运动。 虽然早已知道微丝和微管在细胞运动中的重要作用，但是长期以来由于缺少对细胞骨架的力 学特性的研究方法，特别是对分子闻力学特性的研究技术，对微丝和微管的力学特性的了解通常 是定性的，而非是定量的，因此无法深入阐明其分子基础或机制。 1 2 光镊 1 2 1 光镊的产生及其意义 早在1 7 世纪初期，德国天文学家开普勒在解释彗尾之所以背向太阳的原因时，就提出是受 到太阳光的辐射作用所致到1 8 7 3 年，麦克斯韦根据他的电磁学理论从理论上说明了光本身可 产生作用力，或者说是光辐压1 9 0 9 年德拜给出了线偏振平面电磁波作用于均匀球形粒子所产生 的辐射压力的理论。但由于光辐珏极其徽弱，同时也因缺少足够强的光，毫瓦级功率的光仅可产 生皮牛顿级( 1p n = l o “2 n ) 的作用力( s v o b o d aa n db l o c k ，1 9 9 4 )所以当时无法进行实验研 究。直到2 0 世纪6 0 年代，激光的发明给辐射压力的研究提供了高强度、商准赢度的光源，从实 验上验证光辐射压的存在才成为可能 贝尔实验室的a r t h u ra s h k i n 是对此进行研究的先驱1 9 7 0 年，a r t h u ra s h k i n 等人首先提出 利用光压操纵微小粒子的概念他们首先用一束i w 的连续氩离子激光会聚成窄的光束，成功地 观察到在垂直光传播的方向上激光对水中乳胶颗粒的束缚以及沿光的传播方向上由于辐射压引 起的小球的加速运动，实现了不同直径的球形颗粒的二维囚禁为了实现三维囚禁他们又将两 道相向的激光加以聚焦，利用其相反方向的光压构成一个稳定的能量阱，建立了第一套利用光压 操纵微小粒子的工具( a s h k i n 。1 9 7 0 ) 之后的几年中a s h k i n 等人逐步拓展其应用领域。如将 粒子、液滴等提起以对抗熏力等方面的应用研究( a s h k i n ，1 9 7 1 ，1 9 7 4 ，1 9 7 5 ，1 9 7 6 ) 这套方 法后来发展成激光制冷技术，使得其不仅可以使用在徽米级的粒子上，还可以推广到原子分子的 尺度( a s h k m ，1 9 7 8 ，1 9 8 6 ；c h u ，1 9 9 1 ) 激光制冷技术也帮助朱棣文( s t e v e nc h u ) 获得1 9 9 7 年的诺贝尔物理奖一直到1 9 8 7 年a s h k i n 等人才发现单独一柬高度聚焦的激光就足以形成三 维稳定的能量阱，可；c 吸引电介质粒子并束缚在光鏖中央，于是第一部光镊子( o p t i c a lt w e e z e r s ) 诞生。也因此光镊的正式名称为单光隶梯度力阱( s i n g l e - b e a mf a d i e mo p t i c a lt r a p ) 它可以用 来捕获并移动从数十纳米到教十微米的微小粒子( a s h k i n ，1 9 8 7 ) 2 中国农业大学博士学位论文 第一章引言 光镊一个由光学梯度力形成的光学势阱，如同把无形的镊子可以捕获微小的生命体。 光镊用于微米范围内操纵微粒的特点正好符合细脆、亚细胞层次的研究，实现了对活体细胞、细 胞器无损伤地操纵，并且光镊产生的皮牛顿量级的力也正好适合于生物分子水平的力学研究。在 2 0 世纪束各种薪技术争奇斗艳的角逐中，光镊以它能动态地研究活细胞的独特的功能，显示出耀 人眼目的灿烂之光 光镊的发明对纳米生物学领域深入研究活体细胞和生物大分子个体行为、探索生命运动规律 具有极其重要的意义。由于光镊具有精确定位、选择个体、可实现对生物活体样品非接触无损伤 操纵，以及光镊产生的皮牛顿量级的力正适合于细胞、亚细胞层次的力学研究，再配以高精度的 皮牛顿量级的力和纳米量级的位移测量系统后光镊的应用便不仅仅停留在徽操纵上，如对微米 量级的活细胞、细胞器的固定、悬浮、分选、操级，对染色体的捕捉，徽胶囊的定位等，其应用 已拓展到精确测定细胞及分子水平的微小作用力及运动步幅，如测定马达蛋白作用力及运动步 幅、克服分子马达力引起的细菌的旋转动力以及对膜体系进行定量研究等。光镊技术是微米量级 ( 亚微米到数十微米) 微粒微操作微加工不可或缺的独立技术，是从生物大分子层次上研究生命 过程的重要工具，将在细胞生物学、分子遗传学、免疫学、基因工程等领域中发挥重要作用在 其它涉及微小粒子的各种研究和应用领域，诸如在大气物理、空间科学、材料科学、医药科学、 精密颡8 量、工艺技术等方面的研究和应用也有广阔前景 1 2 2 光镊的原理 光是电磁波，电磁波不仅携带能量，而且也携带动量。光与物质的相互作用包含着能量与动 量的传递在以往许多激光应用中都是利用物质对光的吸收，这种能量传递形式改变其化学、物 理等性质达到对组织的切割焊接、钻孔等目的在此过程中光的热学、化学等效应远远大于光对 物体的力学作用。而光镊的工作原理则是利用物体对光的折射而不是吸收，即光与物体间动量传 递引起的光的力学效应。当然，无论是以哪一种效应为主的相互作用都伴随着箕它的弱相互作用。 这对光镊来讲是应当尽可能避免的我们说光镊是一种无损伤操作工具，不仅是与机械镊子相比 其不存在局部面积受到很大的压力，不产生明显的机械掼伤，而且可选用适当波长的光使它对 物质的热学或化学等效应也非常弱。 光镊是利用光与物质问动量传递的力学效应形成的三维梯度光学势阱其最基本的组成单元 是：一束经过扩束的平行激光柬和一高数值孔径的物镜( n a1 o ) 。当强会聚的g a u s s 光场作用 于一透明物体时，如果粒子的折射率n t 大于周围介质的折射率n 。，无论是在光的传播方向z 轴， 还是在垂直予z 轴的x - y 平面内，梯废力将把粒子推向光场的摄强处，即激光焦点处附近，如图 1 】所示 因此对于单光束梯度力光阱。处于焦点以内或以外的粒子，都将受到一个趋向焦点附近的力 梯度力阱中任何横向( x - y 平面) 偏离都会导致因横向上的梯度力而产生的回复力。而任何纵向 ( z 方向) 的偏离都会导致因纵向上的橼度力而产生的回复力。所以，在焦点附近的粒子将会受 到三维空间的回复力而穗定地被柬缚于光阱中 光阱施加在小球上的力与光源的强度以及光束的性质有关，也与被作用的小球形状、大小和 折射率等物理性质有关目前，可用于光作用力计算的方法主要有射线光学r o ( r a y - o l 谢c s ) 模 3 型和电磁e m ( e l e c 仃o m a g n e t i c ) 模型当粒子在光阱作用范围内，偏离光阱中心越远，受到的光 阱回复力就越太。总的说来，光阱力的大小可根据光阱刚度和粒子偏离光阱中心的位移来计算 b 图l ，l 光镊形成的示意图 h s u r c1 1t h e s k 酞c hm a po f t h ef o r m i n go f o p t i c a lt c m c z c r $ 一般来说，光镊的成功使用必须借助于相应的观察手段。人们通常将激光束耦合到显微镜中， 实现光阱捕获与观察的同时进行激光在显微镜物镜的焦点处汇聚起来，形成光阱，微小物体受 光压的作用而被束缚在光阱处，当移动光束时物体将随光阱而移动。 通过选择适当的波长和激光功率，被光阱捕获的物体的大小可从几个纳米到几十个微米可 以是有生命的或非生命的。比如病毒、酵母、细菌、原生动物、细胞、d n a 或r n a 分子、玻璃 小球、树脂小球等等如果光镊所捕获的微粒受到其他作用力，当该作用力小于光阱力时微粒将 被柬缚在光阱而无法脱离，外力、光阱力和重力相平衡；而当该外力大于光学力时微粒就会脱离 光阱的束缚利用光镊可以对微小位移和微小力进行定量的测定。事实上，光镊应用于生物学研 究的过程中，一般是将微米级的介质球体( 如二氧化硅或聚苯乙烯球体) 粘接在生物样品上，将 球体作为“手柄”( h a n d l e ) 来完成对生物样品的操纵同时也可以通过测量小球的位移来了解生 物体的运动和受力情况等 1 3 光镊技术的应用 光镊自诞生以后在生物学上已经得到了广泛应用，至今，生物学领域仍是光镊技术应用研究 的热点a s k i n a 首先将光镊技术引用到了生物学领域，实现了对活体细胞的无损伤操纵随后， 人们逐渐将这一技术广泛地运用到了生物学的研究 a s h k i n d z c i d z i c ( 1 9 8 9 ) 用光镊将细胞质拉出j 目质丝，以测定细胞质在各种状态下的黏弹 性。g r e u l i c b ( 1 9 9 2 ) 用激光刀切害毒染色体，然后用光镊收集切下来的片断用于测序他们还用 中国农业大学博士学位论文 第一章引言 光镊把杀伤t _ 细胞和靶细胞放在一起。以观察免疫反应( s c o g e re ta l ，1 9 9 1 ) 。还有用光镊测定精 子游动的力，然后尝试用光学的方法促进体外受精( 咖i re ta l ，1 9 9 0 ：c o l o ne la l ，1 9 9 2 ) 光镊 还可用于从混合培养物中分离单个的细胞，如细菌( a s h k i ne ta 1 ，1 9 8 ) 或酵母( g r i m b e r g e ne l 口j ， 1 9 9 3 ) 。 用光镊抓住一个玻璃小球或树脂小球作为手柄是另外一类特殊而有效的方法。手柄比生物材 料更容易操作，而且它规则的形状和均一的大小也更方便数据的测量。c h u ( 1 9 9 1 ) 把d n a 分子 标记上荧光，并用树脂小球与它的末端相连，然后再用光镊去抓住小球，可以测定在拉力作用下 d n a 分子的性质。s h e p h e r d 等人( 1 9 9 0 ) 把肌球蛋白与树脂小球共价交联，然后用光镊把小球 从悬浮液中抓出来，直接放在体外的微丝束上，加入a t p 后，可以直接观察到肌球蛋白分子拉动 小球在微丝柬上单方向运动。光镊技术还被用于证明在噬菌体d n a 包装过程中的p o r t a lm o t o r 可以产生 5 0 p n 的力，是目前所知的产生力最大的分子马达( s m i t he t a l ，2 0 0 1 ) 。 1 3 1 用光镊研究细胞骨架马达蛋白及其作用机制 由于光镊在测定生物大分子间微小位移和作用力方面的独特作用，细胞骨架力学特性方面的 研究获得突破性的进展。九十年代以来，细胞骨架系统的分子力学的测定和研究成为细胞骨架研 究领域的新的前沿。 圈1 2双光镊测量散丝与肌球蛋白作用力与运动步幅示意田 f i g u r e1 2 t h es k e t c hm a po f h o wt om c u f et h ef o r c ea n ds t e po f m y o s i nb yo p t i c a lt w e e z e r s ( f i n e r 甜a 1 ，1 9 9 4 ) 肌肉收缩所产生的力的来源是通过水解a