（植物学专业论文）里氏木霉纤维素酶基因的克隆及其在毕赤酵母中表达的研究.pdf

摘要 纤维素占植物干重的3 5 - 5 0 ，它是地球上分布最广、含量最丰富的碳水化合物。对人 类而言，它同时又是自然界中数量最大的可再生性物质，它的降解是自然界碳素循环的中心 环节。纤维素的利用与转化对于解决目前世界能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有十 分重要的意义。 纤维素酶是一类可有效降解纤维素的生物酶，它一方面可将纤维索水解成葡萄糖等有效 成分，另一方面它可以通过提高植物细胞壁的通透性而提高细胞内含物( 蛋自质、脂肪、淀粉) 的提取率，所以纤维素酶可应用于以植物为原料的一切工业中。但天然的微生物生产纤维素 酶还存在许多问题，如：酶产量低，酶活性低、受到葡萄糖等产物的反馈抑制等，这些问题 极大的影响了纤维素酶的应用。而且尽管人们普遍接受纤维素酶分解纤维素的协同作用理论， 但是对于作用机理还有许多问题需要研究。 甲醇酵母表达系统是近十几年发展起来的真核表达体系。巴斯德毕赤酵母作为甲醇酵母 的一种，与传统的大肠杆菌表达系统及第一代酵母表达系统一酿酒酵母相比具有不可比拟的 优势。它具有表达外源基因的能力强、稳定性高、可进行蛋白质的翻译后加工、既可在胞内 表达也可分泌表达，可高密度发酵培养等诸多优点，尤其适合表达真核生物的基因，已成为 一种非常重要的表达系统。 本研究以里氏木霉( t r i c h o d e r m ar e e s e i ) q m 9 4 1 4 菌株为基因供体。克隆纤维素酶多酶 体系中的葡聚糖内切酶( e g ) 、葡聚糖外切酶( c b h ) 和b 葡萄糖苷酶( b g ) 基因。分别 构建其酵母表达载体，并通过电击转化到毕赤酵母中，诱导其表达纤维素酶，筛选出高效表 达纤维素酶基因的工程菌，为迸一步研究纤维素酶的协同作用和分子酶工程奠定基础。 主要研究结果如下： 以羧甲基纤维素钠为诱导剂诱导里氏木霉表达纤维素酶，确定了最佳诱导时间为3 6 , 时。 采用r t - p c r 方法克隆到了纤维素酶多酶体系中的葡聚糖内切酶( e g 、e g i v 、e g v ) 和葡聚糖外切酶( c b h ) ，测序得到c b h h 基因的序列与g e n e b a n k _ l 编号为m 1 6 1 9 0 i 的c b h 基因序列有3 个碱基不同，相似性达虱j 9 9 ，导致其编码的蛋白序列有3 个氨基酸的差异； e g i i 基因的序列与g e n e b a n k 上编号为m 1 9 3 7 3 1 的e g i i 基因序列有5 个碱基不同，相似性达到 9 9 ，导致其编码的蛋白序列有2 个氨基酸的差异；e g v 基因的序列与g e n e b a n k 上编号为 7 _ , 3 3 3 8 1 1 的e g v 基因序列有2 个碱基不同，相似性达到9 9 ，导致其编码的蛋白序列有2 个氨 基酸的差异。 采用外显子拼接法，以里氏木霉d n a 为模板克隆了，葡萄糖苷酶( b g li ) 基因。测序 得到b g li 基因的序列与g e n e b a n k 上编号为u 0 9 5 8 0 i 的b g li 基因序列有4 个碱基不同，相似 性达到9 9 ，导致其编码的蛋白序列有3 个氨基酸的差异。 构建了c b h i i 基因的酵母表达载体p p i c 9 - c b h ，用b g l i i 单酶切使载体线性化。回收后通 过电击转化到毕赤酵母中，得到了3 个转化子，g i 2 p c g 鉴定获得2 个转化c b h i i 基因的重组毕赤 酵母。 v 关键词里氏木霉；纤维素酶；基因克隆；毕赤酵母；表达 v i s t u d yo nc l o n i n g a n d e x p r e s s i o no f t r i c h o d e r m ar e e s e i c e l l u l a s eg e n e si np i c h i a p a s t o r i s a b s t r a c t 3 5 5 0 o ft h et o t a lp l a n td r yw e i g h tw f l bc e l l u l o s e ，i tw i t st h em o s tw i d e l yd i s t r i b u t e d ，t h e m o s ta b u n d a n tc a r b o h y d r a t e so ne a r t h f o rm a n k i n d ，i tw a sa l s ot h el a r g e s ta n dm o s tr e n e w a b l e n a t u r a ls u b s t a n c e s i t sd e g r a d a t i o nw a st h ec e n t r a ll i n ki nn a t u m lc a r b o nc y c l e f o rt h eu s ea n d c o n v e r s i o no fc e l l u l o s et os o l v et h ew o r l de n e r g yc r i s i s f o o ds h o r t a g e s , p o l l u t i o np r o b l e m sw a so f g r e a ts i g n i f i c a n c e c a l l u l a s ew a sak i n do fe n z y m ef a nd e g r a d ec e l l u l o s e o no n eh a n di tc a r lp u th y d r o l y s i so f c e l l u l o s ei n t og l u c o s ea n do t h e ra c t i v ei n g r e d i e n t s t h eo t h e rh a n di tc b ee n h a n c e dt h ee x t r a c t i o n r a t eb yi n c r e a s i n gt h ep e r m e a b i l i t yo fc e l lw a l lo f p l a n tm a t e r a i ( p r o t e i n , f a t , s t a r c h ) , s oc e l l u l a s e c b ea p p l i e dt oa l lp l a n t sa sl a wm a t e r i a l si n d u s t r y h o w e v e r , t h en a t u r a lm i c r o b i a le e l l u l a s e p r o d u c t i o n , t h e r ea r es t i l lm a n yp r o b l e m s ，f o re x a m p l e ：l o w - y i e l d , l o wa c t i v i t y , p r o d u c tf e e d b a c k i n h i b i t i o nb y 舀眦船t h e s ei s s u e sag r e a ti m p a c to i lt h ea p p l i c a t i o no f c a l l u l o s e m o r e o v e r , d e s p i t e t h eg e n e r a l l ya c c e p t e dt h e o r ys y n e r g i e sc e l l u l a s ed e c o m p o s i t i o no fc e l l u l o s e ，b u tt h e r ew e r em a n y p r o b l e m st h a tn e e d t ob es t u d i e dm e c h a n i s m m e t h a n o ly e a s te x p r e s s i o ns y s t e mw a sae u k s r y o t i ce x p r e s s i o ns y s t e md e v e l o p e di nt h ep a s t f e ny e a r s p c h ap a s t o r i sa sam e t h a n o ly e a s t , h a dt h ei n c o m p a r a b l ea d v a n t a g e st h a nt r a d i t i o n a l e e o l ie x p r e s s i o ns y s t e ma n dt h ef i r s tg e n e r a t i o no fy e a s te x p r e s s i o ns y s t e m - $ a c c h a r o m y c e s c e r e v i s i a e i th a dm a n ya d v a n t a g e s ，s u c h 鹤s t r o n ga b i l i t yt oe x p r e s sf o r e i g ng e n e s ，h i g hs t a b i l i t y , a v a i l a b l ef o rt h ep o s t - t m n a l a t i o n a lp r o c e s s i n go fp r o t e i n s , s e c r e t i o ni nt h ei n t m e e l l u l a re x p r e s s i o n c a na l s ob ee x p r e s s e d , a n dc a nb eh i g h - d e n s i t yf e r m e n t a t i o n p a r t i c u l a r l ys u i t a b l ef o re u k a r y o t i c g e n ee x p r e s s i o n , h a db e c o m eav e r yi m p o r t a n te x p r e s s i o ns y s t e m i nt h i ss t u d y , t r i c h o d e r m ar e e a e iq m 9 4 1 4a st h eg e n ed o n o rt oc l o n i n gc e l l u l a s ee r i z y m e s y s t e me n d o - i 争d , g l u c a n a s e ( e g ) e x o - 1 , 4 毋d g j u c m a s e ( c b h ) e n d 户l , 4 - 酉u c a n a ( b g ) g e n e , i t sy e a s te x p r e s s i o nv e c t o r sw e r ee o m 们c t e dr e s p e c t i v e l y , a n dt r a n s f o r m a t i o ni n t op i c h i a p a s t o r i sb ye l e c t r o p o l a t i o n , i n d u c et h ee x p r e s s i o no fc e l l u l o s e ，s e l e c tw o r k sb a c t e r i af o rh i g h l y c e l l u l a s eg e n ee x p r e s s i o nl e v e l l a yt h ef o u n d a t i o nf o rt h ef u r t h e rs t u d yo nt h es y n e r g i e so f c e l l u l o s ee n dm o l e c u l a re n z y m ee n g i n e e r i n g t h em a i nf i n d i n g sa r e ： i n d u c e de x p r e s s i o no f c e l l u l a s eb ys o d i u mc a r b o x y m e t h y lc e l l u l o s e ，t h eb e s ti n d u c e dt i m ew a s i n d u c e d3 6h o u r s v c l o n i n g e g i i ，e g i v ，e g va n dc b h i i g o n eo f m u l t i - g l u e a n a s ee n z y m e ss y s t e mb yr 1 ：p c r c b h i ig o n eh a db e e ns e q u e n c e d 。t h es e q u e n c e sh a ds i m i l a r i t yo f9 9 w i t hn o m 1 6 1 9 0 1i n g o n e b a n k , o n l yt h r e ed i f f e r e n tb a s e sa n d t h r e ed i f f e r e n c e si np r o t e i ns e q u e n c e e g s e q u e n c e sh a d s i m i l a r i t yo f 9 9 w i t hn o m 1 9 3 7 3 1i ng c n c s a n k , o n l y f i v ed i f f e r e n tb a s e sa n dt w od i f f c r o n c e si n p r o t e i ns e q u a n c e e g v s e q u e n c e sh a ds i m i l a r i t yo f9 9 w i t hn o z 3 3 3 8 1 1i ng o n e b a n k , o n l y t w od i f f e r e n tb a s e sa n dt w od i f f e r e n c e si np r o t e i ns e q u e n c e t r t c h o d e r m ar e e s e $ d n a 鹪t h et e m p l a t et oc l o n i n gb g lig o n eb yu s i n ge x e r ts p l i c i n g b g lig o n eh a db e e ns e q u e n e c d ，m es e q u o n e a sh a ds i m i l a r i t yo f9 9 w i t hn o u 0 9 5 8 0 1i n g e n e b a n k , o n l vf o u rd i f f e r e n tb a s e sa n dt h r e ed i f f e r e n c e si np r o t e i ns e q u e n c e ay e a s te x p r e s s i o nv e c t o rp p i c 9 - c b hw e r ec o n s t r u c t e d s i n g l e 、i n e a rv e c t o rd i g e s t e dw i t hb g t 1 1 t r a n s f o r m e di n t op i e h i ap a s t o r i sb ye l e c t r o p o r a t i o na r e rr e c o v e r e d ，g o tt h r e et r a n s f o r m a n t sa n d b yp c ra m p l i f i c a t i o no f w h i c ht w ow o r ef o rt i l ec o n v e r s i o no f c b h 1 1g o n ei np i c h i a p a s t o r i s k e yw o r d st r i c h o d e r m ar e e s e i ，e e l l u l a s e ，学l c l o n i n g p i c h i a p a s t o r i s ，e x p r e s s i o n i c a n d i d a t e ：x ut i a n p e n g s p e c i a l i t y ：b o t a n y s u p e r v i s o r ：v i c e - p r o f l ij i e 研究生学位论文独创声明和使用授权书 独创声明 本人声明所呈交的学位论文是本人在导师指导下进行的研究工作及取得的 研究成果。据我所知，除了文中特别加以标注和致谢的地方外，论文中不包含其 他人已经发表或撰写过的研究成果，也不包含未获得 ( 洼! 翅遗直基地置墨挂型座明丝：查拦亘窒2 或其他教育机构的学位或证 书使用过的材料。与我一同工作的同志对本研究所做的任何贡献均已在论文中作 了明确的说明并表示谢意。 学位论文作者签名： e t 舅! 1 1 ：殄7 年g 只如日 学位论文版权使用授权书 本学位论文作者完全了解学校有关保留、使用学位论文的规定，学校有权保 留并向国家有关部门或机构送交论文的复印件和磁盘，允许论文被查阅和借阅。 本人授权学校可以将学位论文的全部或部分内容编入有关数据库进行检索，可以 采用影印、缩印或扫描等复制手段保存、汇编学位论文。( 保密的学位论文在解 密后适用本授权书) 学位论文作者签名： 导师签名 殄 殄 月 月 、b 6 年 年 7 砷 期 期 1 引言 1 1 研究目的及意义 纤维素占植物干重的3 5 9 铀5 0 它是地球上分布最广，含量最丰富的碳水化合物。对人 类而言，它同时又是自然界中数量最大的可再生性物质，它的降解是自然界碳索循环的中心环 节。纤维素的利用与转化对于解决目前世界能源危机、粮食短缺、环境污染等问题具有十分重 要的意义。纤维素的降解有两条途径，即化学法和生物酶法，但化学法特异性差、纯度低、污 染环境，而用生物酶法可克服这些缺点。目前常用的生物酶是纤维素酶。纤维素酶一方面可将 纤维素水解成葡萄糖等有效成分，另一方面它可以通过提高植物细胞壁的通透性而提高细胞内 含物偿 白质、脂肪、淀粉) 的提取率，所以纤维素酶可应用于以植物为原料的一切工业中。因 此。纤维素酶一经发现就受到了世界各国科学界的重视。但天然的微生物生产纤维素酶还存在 许多问题，如：酶产量低、酶活性低、受到葡萄糖等产物的反馈抑制等，这些问题极大的影响 了纤维素酶的应用。甲醇酵母表达系统是近十几年发展起来的真核表达体系。巴斯德毕赤酵母 作为甲醇酵母的种，迄今为止，已有4 0 0 多种外源蛋白在此体系中成功表达。与传统的大肠 杆菌表达系统及第一代酵母表达系统酿酒酵母相比，具有不可比拟的优势。近年来已经有 学者将纤维索酶基因转化入甲醇酵母中进行表达。用甲酵酵母表达系统表达纤维素酶基因并研 究纤维素酶基因的功能，己成为目前纤维索酶研究的热点之一。 本研究计划从里氏木霉( t r i c h o d e r m a r e e s e i ) q m 9 4 1 4 菌株中克隆纤维素酶多酶体系中的 葡聚糖内切酶( e g ) 、葡聚糖外切酶( c b h ) 和芦葡萄糖营酶( b g ) 基因，分别构建其酵母 表达载体，并通过电击转化到毕赤酵母中，诱导其表达纤维索酶，筛选出高效表达纤维素酶基 因的工程菌。既可以应用于生产，又可以为进一步研究纤维索酶的协同作用和分子酶工程奠定 基础，具有重要的研究价值和广阔的应用前景。 1 2 国内外研究进展 1 2 1 纤维素酶的研究进展 1 2 1 1 纤维索酶的作用机理 纤维素( c e l l u l o s e ) 是地球上最丰富的有机物质，分子本身组分单一，化学结构并不复杂 但天然纤维素材料都有复杂的超分子结构。许多纤维素分子链之间通过次级键的作用组成结构 严密的原纤维，其内可分为相对松散的无定形区和排列整齐而规则的结晶区。在细胞壁中微纤 维形成网状结构，纤维之间结合大量的木质素、半纤维素、果胶、树胶、丹宁等间隙物质，共 同组成结构复杂的天然纤维和其它细胞壁结构。这些超分子结构直接影响纤维素材料的理化特 性，并且增加了微生物及其酶系降解纤维索的难度。纤维物质的复杂结构，使得任何单一的酶 都难以高效水解它( 盂雷等，2 0 0 2 ) 。 能水解天然纤维素的纤维素酶都是复杂的多酶体系，主要来自于真菌和细菌。根据功能的 不同，分为三大类：葡聚糖内切酶( e n d o - l , 4 - 卢d , g l u c a n a s e ，e c3 2 1 4 ，来自真菌简称e g ，来 自细菌简称l e n ) 、葡聚糖外切酶( e x o - 1 ，4 b - d , g l u c a n a s e ，e c3 2 1 9 1 ) 和b 一葡萄糖苷酶( ，1 。4 g l u e a n a s e ，e c3 2 1 2 1 ，简称8 g ) 。葡聚糖内切酶作用于纤维素内部的非结晶区，随机水解b 1 , 4 塘苷键，将长链纤维素分子截短，产生大量带非还原性末端的小分子纤维素。葡聚糖外切 酶作用于纤维素线状分子末端，水解1 , 4 1 3 。d 糖苷键，每次切下1 个纤维二糖分子，故又称为 纤维二糖水解酶( c e l l o b i o h y d r o l a s e 简称c b h ) 。而卢葡萄糖苷酶一般将纤维二糖水解成葡萄 糖分子。纤维素降解过程首先被外切纤维素酶的纤维素吸附结构域吸附到不溶性纤维索表面， 使结晶结构的纤维素长分子链开裂，聚集结构解聚，长链分子末端部分发生游离从而为纤维素 水解酶类的作用提高了可及性和反应性，从而使纤维素易于水化；之后内切酶作用于经外切活 化的纤维素，分解其卢一1 ，4 键，产生纤维二糖、三糖等短链低聚糖。在内切葡聚糖酶、外切葡 聚糖酶和，葡萄糖苷酶的协同作用下，纤维素的，一1 ，4 糖苷键逐步水解，形成纤维寡糖和葡萄 糖。其催化机理与溶菌酶相似，糖苷配基的脱去涉及2 个保守羧基氨基酸分别作为质子供体和 亲核试剂执行酸碱催化的双置换反应( 农向等，2 0 0 5 ) 。协同作用其作用顺序不是绝对按各酶的 功能也不是简单固定的。c b h 和e g 都能引起纤维素的分散和脱纤化，因此纤维素的结晶结构 被打乱导致变形，使纤维素酶能深入纤维素分子界面之间，从而使纤维素孔壁、腔壁和微裂隙 壁的压力增大，水分子的介入又使纤维素分子之间的氢键被破坏。产生部分可溶性的纤维的微 结晶，利于进一步降解( 高培基，2 0 0 3 ) 。 1 2 1 2 纤维素酶分子结构与功能 ( 1 ) 纤维索酶结构域的拆分 t i l b e u r g ( 1 9 8 6 ) 用木瓜蛋白酶有限酶切里氏木霉( t r i e h o d e r m a r e e s e i ) 的c b h l 分子 得到具有独立活性的两个结构域：一个是具有催化功能的催化域( c d ) ，只能水解可溶性纤 维素和微弱吸附，但不能水解不溶性纤维素，分子量为5 6 k d 。另一个是具有结合纤维素功 能但无水解活力的纤维素结合，吸附域( c b d ) c b d 在纤维素酶中位于氨基端或羧基端的1 0 k d 的小片段，它通过一段高度糖基化的连接肽( 1 i n k e r ) 与催化区相连。细菌纤维素酶有两 个酶切位点可将c b d 与l i n k e r 分别切去。真菌纤维素酶一般只有一个酶切位点可将c b d 与 l i n k e r 一同切去( 杨永彬等，2 0 0 4 ) 。 ( 2 ) 催化域结构和功能的研究 利用x 光衍射的方法r o u v i n e n ( 1 9 9 0 ) 对t r e e s e i 的c b h i i 的催化域、j a y ( 1 9 9 2 ) 对 c t h e r m o e e l l w n 的c e l l ) 的催化域、s p e z i o ( 1 9 9 3 ) 对t f u s e a 的e g 2 的催化域、d i v n e ( 1 9 9 4 ) 对z r e e s e i 的c b hi 的催化域进行了结晶和解析，三维结构的研究为内切酶和外切酶底物的 特异性作出了合理的解释：内切酶的活性位点位于一个开放的c l e f t 中，它可与纤维素链的任 何部位结合并切断纤维素链；外切酶的活性位点位于一个长l o o p 所形成的t u n n e l 里面，它 只能从纤维素链的非还原性末端切下纤维二糖。 s i n n o t ( 1 9 9 0 ) 从化学机制的角度出发论述了酶催化糖基转移的机制，他认为糖苷配基的 2 离去是涉及到两个氨基酸残基的酸碱催化的双置换反应，这实际与溶菌酶的作用机制是相似 的s i r m o t ( 1 9 9 4 ) 采用定点突变技术和酶专一性抑制剂做了大量研究，终于证明g l u 位于细 菌、真菌的内切酶、, v j 酶和葡萄糖苷酶的活性位点；在异头碳原子位通过构型的保留或构 型的转化完成催化反应，其中两个保守的羧基氨基酸分别作为质子供体和亲核试剂。 ( 3 ) 结合( 吸附) 域结构和功能的研究 t o m m e ( 1 9 9 5 ) 根据c b d 分子大小及氨基酸的相似性将已知的c b d 分成了l o 个家族， 大部分的c b d 位于i 、i i 、i 家族。用核磁共振和分子本身的几何动力形成杂化物的方法研 究了c b h i 酶c b d 蛋白的三维结构，c b h i 酶的c b d 是一个1 3 折叠片形成的契形结构，一 面疏水、一面亲水，疏水面与底物表面接触：t o r m o ( 1 9 9 6 ) 用x 光衍射的方法对不同纤维 索酶c b d 的三维结构进行了研究。比较发现：尽管它们在分子大小和折叠构型上不同，但 它们的吸附面是相似的，都比较平坦，暴露出几个芳香族氨基酸及一些潜在的氢键形成的残 基。 c b d 的主要功能是将酶分子连接到纤维素上。研究表明c b d 的这种一面亲水。一面疏 水的楔形结构，便它能插入和分开纤维索的结晶区。在其吸附于纤维素分子链表面后，具有 疏解纤维素链的作用。研究还表明芳香族氨基酸在与结晶纤维索的吸附中发挥重要作用，它 们的突变会导致c b d 对结晶纤维素的吸附能力极剧下降。目前人们推测，c b d 可能通过芳 香环与葡萄糖环的堆积力吸附到纤维素上，由c b d 上其余的氢键形成残基与相邻葡萄糖链 形成氢键将单个葡萄糖链从纤维索表面疏解下来，以利于催化区的水解作用( 汪天虹，2 0 0 0 ) ( 4 ) 连接肽结构和功能的研究 催化结构域和结合结构域是通过连接肽( 1 i n k e r ) 连接而成的。这一段肽链易暴露于水相， 对蛋白酶非常敏感，所以为防止被蛋白酶水解，常被o - g l y c o s i l a t e d 糖基化。细菌纤维素酶的 l i n k e r 富含p h o 、t h r ，约由1 0 0 个氨基酸残基组成：而真菌纤维素酶的l i n k e r 富含g l y 、s e r 、 t h r ，大概只有3 0 4 0 个氨基酸残基组成；细菌纤维素酶的c b d 与c d 夹角为1 3 5 。，而真 菌为1 8 0 4 。l i n k e r 的作用可能是保持催化结构域和结合结构域之间的距离，有助于不同酶分 子问形成较为稳定的聚集体( c a v a e op a u l o a 。1 9 9 9 ) ( 5 ) 纤维素酶的分子折叠 在纤维素酶的研究中，人们又根据同源性将它们分成九个族( a j ) 。a 族是九个族中 最大的一族，其c t h e r m o e e l l u m 的内切酶c e l e 催化域的结构已得至b 解析。这个分子折叠成一 个( a 1 3 ) s 的桶状结构，g l u - 2 8 0 ，g l u 1 4 0 分别作亲核试剂和质子供体，a r g - 4 6 ，a s h - 1 3 9 ， h i s 9 0 ，h i s - 1 9 8 ，t y r - 2 0 0 和t r p 3 1 3 参与底物结合。已知结构的几个酶分子中。同族的分 子具有相似的折叠模型，不同族之间也可以有相似的折叠。但它们都遵循双置换机制。这表 明了它们的活性位点具有相似的拓扑结构性质。鉴于蛋白质折叠比其氨基酸序列更具保守性， 则几族糖基水解酶完全有可能具有相似的折叠( 陈燕勤等，2 0 0 4 ) 。 ( 6 ) 纤维素酶的分子多样性 产纤维素酶微生物一般不会只有一类纤维索酶组分，即使只产生一类纤维素酶组分，也 往往有多种不同的形式，这已经有很多报道，纤维索酶的分子多样性是指许多纤维素酶具有 “多功能一多域”( m u l t if u n c t i o n a l - - m u l t id o m a i n ) 的特征，因而有着多种催化活性功能，这 种多样性在细菌中更为常见，此外在其他降解复杂碳水化合物的酶类中如木聚糖酶也发现具 有这种多催化活性的功能，认为这可能是葡聚糖酶类的共性 ( 7 ) 纤维素酶多样性的分子起源 普遍认为，水解葡聚糖酶类的进化是通过对原有的始祖基因( a n c e s t r a lg e n e ) 进行结构域 改组( d o m a i ns h u m i n g ) 的机制实现分子多样性的，即连接催化结构域和c b d 的接头起到类似 铰链的作用，而重复编码接头的d n a 则类似内含子，以至在d n a 复制过程中编码不同结构 域的碱基序列被重新剪切和融合，这样的结果是原先编码一些“域”的序列被保留继而保留 它的催化活性，而另一些“域”的序列则通过融合也就是说“结构域改组”的改变，而产生 了新的催化功能，因而导致新基因的产生进而产生了“杂合酶”。 1 2 1 3 纤维素酶基因工程研究进展 纤维素酶的大规模工业化应用在很大程度上受纤维素酶活性较低以及成本较高的限制。纤 维素酶的基因克隆为研究纤维素酶的生物合成和作用机制，以及了解纤维素酶遗传特性进而构 建高效纤维素分解菌开辟了新途径。国内外在这方面开展了大量的研究，研究领域不断扩大， 取得了许多进展。 纤维素酶基因克隆研究起始于7 0 年代，发展非常迅速。人们已从四十多种细菌和数种真菌 中克隆到了纤维素酶基因，同时构建了这些酶的基因文库，其中一些酶的基因己在大肠杆菌和 酵母中得到了表达( 李燕红，2 0 0 5 ) 。 真菌主要产酸性纤维素酶，由于丝状真菌木霉属能产生大量的胞外纤维素酶，酶系较完全， 并且对结晶纤维素有较好的酶解活性，近十几年来对真菌木霉属纤维素酶基因做了大量的研 究，其中对里氏木霉( t r i c h o d e r m a r e e s e i ) 纤维素酶基因研究比较透彻，克隆了c b hi 、e b hi i 、 c b h l i i 、c b hi v 、e gi 、曙i i i 、e g v 和坛等基因。都在_ e c o l i 中得到了表达，并测定了这些基因 的核苷酸序列。王建荣、张曼夫( 1 9 9 5 ) 利用里氏木霉的基因序列同源片段做探针，构建了绿 色木霉基因文库，从中克隆了c b hi 、c b h i i 基因，并对其基因结构进行了研究。目前对一些纤 维素酶的基本结构和活性部位已基本弄清，且已有百余个纤维素酶的基因组分得到了克隆和表 达，并不断地有新的组分得到分离、纯化。 细菌主要产中性纤维素酶和碱性纤维素酶。由于酶的耐热性在生产中具有实用意义，所以 耐热细菌是研究的热点。k i m 等( 2 0 0 0 ) 克隆t a q u i f e x a e o l i e u sv f 5 编码e g 的c e l s y 基因，在点，f x l l b l u e 中表达成功。酶c e l s y 有很好的耐热性，最适作用温度和p h 分别为为8 0 和p h 7 0 。 而碱性纤维素酶由于在洗涤剂工业中有很好的应用价值，所以对其的研究也是热点之一，其产 生菌主要集中在芽孢杆菌属。 由于纤维素酶在e c o l i 中的分泌表达水平很低，而且提取困难大，所以人们将目光转向了 真核表达系统。酵母因其不产生毒素。用来表达纤维素酶基因，产物高度糖基化。表达水平高， 而且产物直接分泌至胞外，所以酵母表达系统的应用研究较多。为了适应工业化生产的需要， 4 纤维素酶的研究除了趋向于高产、耐受性强的菌种，高效酵母表达的系统外，纤维素酶基因还 用于构建高效纤维素分解工程菌。随着木霉分子生物学研究的深入，对于木霉转化系统的构建 e 1 趋成熟。木霉作为外源基因的表达系统将会引起广泛的关注。特别是里氏木霉，因其产量高， 将成为新的基因工程受体菌。另外，对于瘤胃微生态区系中的纤维素分解菌群的遗传改造也将 是纤维素酶分子生物学研究的一个重要领域。 1 2 1 4 纤维素酶研究中存在的问题 尽管人们普遍接受纤维素酶分解纤维素的协同作用理论，但是对于作用机理还有许多问题 需要研究：如当以磷酸或碱溶液处理后的纤维素作基质时，协同作用为何消失；最初测定的纤 维素酶活性和最终分解率是否有相关性；纤维素酶多是同功酶。其作用机理又有何不同。虽然 已基本阐明了纤维素酶的底物特异性和水解机制，但关于c b d 如何吸附到纤维素表面、吸附 后c b d 如何与c d 相互作用降解纤维素的问题。目前尚未作出合理解释。 另外，纤维素酶活力都是在底物不饱和的情况下测定的，这样势必造成酶活力的不可比较 性。事实上影响纤维素酶研究的瓶颈，是没有统一的测定纤维素酶的方法。在酶活的定义方面 不同研究者甚至同一研究者在不同的研究中存在明显的分歧，难以进行横向比较，急需要统一 规范，包括规定标准菌株、标准测活方法、标准底物等。 1 2 1 5 纤维素酶的研究展望 纤维索物质是年产量巨大的可再生资源，如何成功的开发这一资源，对人类的可持续发 展具有非常重要的意义。随着人们对纤维素酶研究工作的深入，纤维索酶必将在食品、饲料、 环境保护、能源和资源开发等各个领域中发挥越来越大的作用。目前，对纤维素酶和半纤维 素酶的催化降解机制的主要框架已有所了解，怎样利用这种机制去指导应用，可能是今后的 主要研究方向。 由于e c o l i 不能外分泌蛋白质，所以将纤维素酶基因克隆到大肠杆菌中并予以表达仅限 于实验室。目前，大家更多地将目光投向真核表达系统。毕赤酵母作为一种非常优秀的真核 表达系统已经被越来越多的学者所使用。采用毕赤酵母表达系统单独表达纤维素酶系的各种 组分，然后按照不同的应用目的将纤维素酶的各种组分以一定的比例混合，可更有效的和更 为广泛的适应不同应用过程对纤维素酶各组分比例的不同要求，从而显著提高纤维素酶的使 用效果。而将不同组分单独表达对研究各组分间的协同作用机理也有着巨大的好处。 另一方面木霉本身也是优良的外源基因表达系统之一，而且木霉具有十分成熟的批量发 酵技术，还具有较强的蛋自质胞外分泌能力，所以将高效的纤维素酶基因克隆到木霉中也将 是十分具有商业诱惑力的课题之一。 1 2 2 毕赤酵母表达系统研究进展 1 2 2 1 毕赤酵母表达系统的优点 大肠杆菌是用得最多、研究最成熟的基因工程表达系统，当前已商业化的基因工程产品大 5 多是通过大肠杆菌表达的，其主要优点是成本低、产量高、易于操作。但大肠杆菌是原核生物， 不具有真核生物的基因表达调控机制和蛋白质的加工修饰能力，其产物往住形成没有活性的包 涵体，需要经过变性、复性等处理，才能应用。近年来，以酵母作为工程菌表达外源蛋白日益 引起重视，主要是因为酵母是单细胞真核生物，不但具有大肠杆菌易操作、繁殖快、易于工业 化生产的特点，还具有真核生物表达系统基因表达调控和蛋白修饰功能，避免了产物活性低， 包涵体变性、复性等等问题，非常有利于真核基因的表达，能有效克服大肠杆菌系统缺乏蛋白 翻译后加工、修饰的不足。因此酵母表达系统受到越来越多的重视和利用。 与大肠杆菌相比，酵母是单细胞真核生物，具有比较完备的基因表达调控机制和对表达产 物的加工修饰能力，人们对酿酒酵母( s a c c h a r o m y c e sc e r e v i s i a e ) 分子遗传学方面的认识最早， 酿酒酵母也是最先作为外源基因表达的酵母宿主。1 9 8 1 年酿酒酵母表达了第一个外源基因一千 扰素基因，随后又有系列外源基因在该系统得到表达。虽然干扰素和胰岛素已大量生产并在 人群中广泛应用，但很大部分表达由实验室扩展到工业规模时。培养基中维持质粒高拷贝数的 选择压力消失，质粒变得不稳定，拷贝数下降，而大多数外源基因的高效表达需要高拷贝数的 维持，因此引起产量下降。同时，实验室用培养基复杂而昂贵，采用工业规模能够接受的培养 基时，往往导致产量的下降。为克服酿酒酵母的局限，人们发展了以甲醇营养型酵母 ( m e t h y l o t r o p h i c y e a s t ) 为代表的第二代酵母表达系统。 以甲醇营养型酵母巴斯德毕赤酵母( p i e h i a p a s t o r i s ) 为宿主的外源基因表达系统近年来 发展最为迅速。毕赤酵母是是甲醇营养型酵母中的一类能够利用甲醇作为唯一碳源和能量来源 的酵母菌，1 9 6 9 年c g a t a 等首次发现它可以在甲醇为唯一碳源的条件下生长。1 9 8 7 年，g r e g g 等名e p i c h i a 菌中表达了乙型肝炎表面抗原( 髓s a g ) ，之后利用毕赤酵母表达系统表达了许多生 物活性蛋白。 毕赤酵母表达系统作为第二代酵母表达系统与酿酒酵母表达系统相比具有不可比拟的优 点： ( 1 ) 具有强有力的乙醇氧化 酶( a o x t ) 基因或磷酸甘油酸脱氢酶( g a p ) 基因启动子作为外源 基因启动子，可严格调控外源蛋白的表达。 ( 2 ) 高稳定性，该系统的载体能和酵母本身的核基因组进行整合，所以构建的菌株稳定， 一般不会出现外源基因随生长繁殖而丢失现象。 ( 3 ) 在分泌过程中，可进行蛋白质的翻译后加工，包括前体蛋白的成熟，二硫键的重建， 蛋白构象的正确折叠，适度的糖基化修饰，这些翻译后加工可使所表达的外源蛋白结构与构象 更接近于天然蛋白。此外，如果表达的是糖蛋白，还可经高尔基复合体对蛋白糖链剪切，使表 达蛋白的外链不含a - l , 3 甘露糖，避免了像& c e r e v i s i a e - - 样的免疫原性问题，使表达的糖蛋白 更适于治疗用途。 ( 4 ) 在毕赤酵母中表达的蛋白既可存在胞内，又可分泌到胞外，毕赤酵母自身分泌的蛋白 ( 背景蛋白) 非常少，十分有利于纯化如表达人白介素1 1 时，经过离子交换层析疏水层析凝胶 过滤等纯化后，产品纯度大于9 7 ( 5 ) 表达量高，如在毕赤酵母中表达的牛胰蛋白酶原，通过改变前导肽序列后，摇瓶产量 为l o m g , q , ，用6 l 发酵可达到4 0 m g l 。破伤风毒素c 片段表达量高达1 2 9 r l 。 ( 6 ) 可高密度发酵培养，并且能够耐受较高的流体净压，在发酵罐中的细胞干重甚至可达 6 1 2 0 9 r l 1 2 2 2 毕赤酵母表达系统的组成 完整的毕赤酵母表达系统由宿主菌和表达载体组成。 ( 1 ) 宿主菌 只p a s t o r i s j 屠子囊菌类，为单倍体，可以作为d n a 转化的宿主菌。这个体系以营养缺陷突 变株( 缺乏组氨酸脱氢酶) 为基础，表达株均来源于n r r l - y 1 1 4 3 0 。现在使用较多的是g s i l 5 ， 另有x 3 3 和k m 7 1 也发展成为d n a 转化的宿主菌。它们多数具有一个或多个营养缺陷型突变。 以利于表达载体的转化筛选。 巴斯德毕赤酵母以甲醇作为唯一的能源和碳源，甲醇能够迅速诱导其合成大量的醇氧化酶 ( a l c o h o lo x i d a s e ，a o x ) 。在巴氏毕赤酵母中有两个基因编码a o x ，约占全部可溶性蛋白质 的3 0 以上。a o x l 基因严格受甲醇的诱导和调控a o x 2 基因- 与a o x l 基因序列有9 2 的相似性； 其编码蛋白质有9 7 的相似性。根据对甲酵利用的情况，巴斯德毕赤酵母可划分为3 种表型。 多数菌株含有爿o x l n a o x 2 基因，在含甲醇的培养基中生长速率与野生型类似，称为甲醇利用 正表型( m u t + ) ，如g s i1 5 ( m s 4 ) ；n a o x l 被其它基因取代，则需依赖4 d i 2 ，尽管o x 2 - 与a o x l 有9 7 的相似性，但其甲醇代谢速度慢，故被称为甲醇利用慢表型( m u p ) ，如k m 7 1 ：当a o x 基因全部缺失，则不能利用甲醇，被称为甲醇利用负表型( m u t ) ，如m c l 0 0 - 3 。后两者表达外 源蛋白有时优于野生株，且需甲醇较少。这三种菌株在a o x l 启动子调控下均可诱导异源蛋白 的表达。对这三种菌株的进一步改造，g f 4 n 其它衍生的宿主菌，目前不同基因型己达十几种。 另外研究发现，蛋白酶缺陷型毕赤酵母如s m d l l 6 3 、s m d l l 6 5 和s m d l l 6 8 可有效降低外 源目的蛋白的酶解。因此在大规模发酵培养时，使用此类蛋白酶缺陷型菌株有利于获得功能性 外源目的蛋白。但是此类蛋白酶缺陷型菌株的活力较差，转化率低且生长缓慢，所获外源目的 蛋白产量较低。因此，只有在其他降低蛋白酶解方法均不理