（分析化学专业论文）硫代葡萄糖苷盐类物质的高效液相色谱分析及其结构鉴定研究.pdf

摘要 硫代葡萄糖苷( 简称硫苷) 是存在于十字花科蔬菜中一类重要的次生代谢产 物。此类化合物及其降解产物具有广泛的生物活性，不仪可以抑制细菌和微生物 的生长，还具有很好的抗癌活性。因而，对各种硫苷进行分离提纯及其结构鉴定 在食品科学、化学工业、生物医学等方面有着重要的实践意义。高效液相色谱法 作为2 0 世纪7 0 年代发展最快的分离分析技术，现已成为生化、医学、环保、食 品等领域最常用的分析手段，对硫苷类化合物的分离具有很好的效果。本论文主 要是对硫苷的提取分离和结构鉴定方法进行研究，采用离子交换的方法对油菜籽 提取液中的硫代葡萄糖苷类物质进行粗纯化；再用反相高效液相色谱法对其进行 分离分析，并利用制备色谱分离提纯了其中几种硫代葡萄糖苷，应用红外、质谱、 核磁、紫外等手段对其进行结构鉴定；最后应用量子化学计算的方法对硫昔的液 相色谱保留机理进行探讨。 第章，综述了硫代葡萄糖苷的研究现状，主要包括了硫苷的分布、分类、 形成、降解、生物活性、分析方法等多个方面的内容。 第二章，研究了硫代葡萄糖苷的粗提纯。在硫苷提取液的进一步纯化过程中， 设计了溶剂萃取法、分级析出法和离子交换法等三种方法，结果发现离子交换法 能够将硫苷盐类物质很好地纯化，这主要是因为硫苷主要以硫苷钾盐的形式存在 于油菜籽提取液中，离子交换法对离子型化合物具有很好的选择性。在离子交换 法巾选择三利t 离子交换剂进行比较，发现d 3 1 5 大孔阴离子交换树脂对硫苷具有 最好的吸附效果：同时比较氯化钠、硫酸钾、硫酸铵、碳酸氢钠等不同洗脱剂对 硫苷的洗脱效果，发现n a c l 的洗脱效果最好，低浓度的n a c i 能够将绝大部分 的色素洗脱下来，硫苷则要在高浓度的n a c l 条件下才能被洗脱。选取0 0 2 m o l l 的n a c i 对色素进行洗脱，0 5 m o l l 的n a c i 对硫苷盐进行洗脱，得到的洗脱液 中主要为硫苷类物质，其他杂质很少，可以直接用于对不同硫苷组分的分离和制 备。 第三章，考察了水一甲醇、水一乙腈一甲醇、水一甲醇一三乙胺一醋酸、水 一甲醇一醋酸铵、水一甲醇一氯化钾等5 种流动相分离体系对硫苷分离效果的影 响。其中水一甲醇一三乙胺一醋酸对硫苷盐类物质具有最好的分离效果，并且该 流动相分离体系的溶剂挥发性好，将此流动相分离体系直接用于液相色谱一质谱 联用可以对提取液中的硫苷进行定性分析，解决了在没有标准样品存在条件下硫 苷盐类物质难以定性的问题。水一甲醇一醋酸铵和水一甲醇一氯化钾的分离效果 相似，稍次于水一甲醇一三乙胺一醋酸体系的分离效果，但应用水一甲醇一氯化 钾组成流动相分离体系，以反相制备色谱提纯硫苷，在硫苷收集液中的无机盐容 易除去。应用此方法得到了硫苷盐的提纯物，并应用紫外、红外、核磁、质谱对 其结构进行了鉴定。 第四章，将硫苷与c 1 8 烷烃看作一个超分子体系进行研究，应用量子化学的 a m l 法，对硫苷在反相高效液相色谱上的保留行为进行探讨，发现硫苷在反相 液相色谱的保留能力不仅仅与超分子体系的总能量有关，而且与硫苷分子的偶极 距、氢键作用和分子结构有关，特别是氢键作用的大小对硫苷的保留时间影响较 大。说明硫苷的液相色谱保留机理不仅与固定相有关，而且与流动相和硫苷分子 结构之间有着密切的关系。 a b s t r a c t g l u c o s i n o l a t e sa r es u l f u r - c o n t a i n i n gn a t u r a lc o m p o u n d st h a ta r ep r o d u c e db yt h e s e c o n d a r ym e t a b o l i s mo fc r u c i f e r o u sp l a n t s i t sa n di t s m a j o rb r e a k d o w np r o d u c t s h a v eb e e nf o u n dt od e c r e a s et h eg r o w t ho fy e a s ta n dm i c r o o r g a n i s m sa n dh a v ea l s o b e e nl i n k e dw i t hr e d u c e dr i s ko fc a n c e r t h e r e f o r e ，i tw a sv e r yi m p o r t a n tt os e p a r a t e a n di d e n t i f yg l u c o s i n o l a t e sf r o mc r u c i f e r o u sp l a n t ，w h i c hw o u l db eb e n e f i tt ot h e d e v e l o p m e n to fc h e m i c a li n d u s t r y , f o o ds c i e n c ea n dm e d i c i n es c i e n c e a tp r e s e n t ， h p l ca st h ee f f i c i e n ta n a l y t i c a lt e c h n o l o g yh a sw i d e l ya p p l i e di nt h eb i o c h e m i s t r y , m e d i c i n e ，e n v i r o n m e n t a n df o o df i e l d ，w h i c hc a na l s o e f f i c i e n t l ys e p a r a t e t h e g l u c o s i n o l a t e s m ym a j o rw o r ki s f o c u s e do nt h ea n a l y s i sa n di d e n t i f i c a t i o no f g l u c o s i n o l a t e s ，i n c l u d i n gt h ep u r i f i c a t i o nw i t hi o n e x c h a n g em e t h o d ，s e p a r a t i o no f h p l c ，i d e n t i f i c a t i o n w i t hi r ，h p l c m s ，n m r ，u va n d s t u d y o fr e s e r v a t i o n b e h a v i o rw i t hq u a n t u mc h e m i s t r y i nc h a p t e r1 ，t h er e s e a r c hs t a t u so f g l u c o s i n o l a t e sw a ss u m m a r i z e d ，i n c l u d i n gt h e d i s t r i b u t i o ni n p l a n t s ，t h ec l a s s ，t h ef o r m a t i o n ，t h eh y d r o l y z a t i o n ，t h eb i o l o g i c a l a c t i v i t ya n d t h ea n a l y s i sm e t h o d i n c h a p t e r2 ，t h ee l e m e n t a r yp u r i f i c a t i o no fg l u c o s i n o l a t e sw a ss t u d i e d t h r e e m e t h o di n c l u d i n gs o l v e n te x t r a c t i o n ，s t e p w i s ed e p o s i t i o na n di o n e x c h a n g em e t h o d w a su s e dt o p u r i f y t h eg l u c o s i n o l a t e s t h er e s u l t ss h o w e dt h a tt h ei o n - e x c h a n g e m e t h o dh a dt h eb e s t e f f e c t ，s i n c eg l u c o s i n o l a t e sb a s i c a l l y e x i s t e di n r a p e s e e d e x t r a c t i o na sk a l i u m s a l t s ，t h ei o n e x c h a n g er e a g e n t h a d s e l e c t i v i t y t ot h ei o n c o m p o u n d i nc o m p a r i s o n t h r e ec h o s e nc o l o p h o n ) , , t h ed 3 1 5i o n - e x c h a n g ec o l o p h o n y h a st h eb e s ts e l e c t i v i t yt og l u c o s i n o l a t e s ；a tt h es a m et i m e ，t h ew a s h i n g r e a g e n t ss u c h a sn a c l ，k 2 s 0 4 ，n h 4 s 0 4a n dn a h c o se x h i b i t e dd i f f e r e n t w a s h i n ga b i l i t y t o g l u c o s i n o l a t e so n d 3 1 5 i tw a si n d i c a t e dt h a tn a c lw a sa ne x c e l l e n t r e a g e n t o n d 3 1 5 ， w h i c hc a ne x c h a n g ep i g m e n ta tl o wc o n c e n t r a t i o na n de x c h a n g eg l u c o s i n o l a t e sa t h i g hc o n c e n t r a t i o n s e t t i n gt h en a c lc o n c e n t r a t i o na to 0 0 2 m l o lt ow a s ho u tt h e t a n n i na n ds e t t i n gt h en a c ic o n c e n t r a t i o na to 5 m o l lt ow a s ho u tt h eg l u c o s i n o l a t e s ， w ec a n g e t t h e p u r i f i e dg l u c o s i n o l a t e st oa p p l y i nt h eh p l c i i i i nc h a p t e r3 ，t h es e p a r a t i o ne f f e c to ff i v ef l o ws y s t e m ss u c ha sh 2 0 c h 3 c h 2 0 h ， h 2 0 c h 3 c n c h 3 c h 2 0 h ，h 2 0 - k c i - c h 3 c h 2 0 h ，h 2 0 一c h 3 c o o h 4 n - c h 3 c h 2 0 h a n dh 2 0 一c h 3 c o o h - n ( c h 2 c h 3 ) 3 - c h 3 c i - 1 2 0 hw a s i n v e s t i g a t e d t h er e s u l t sr e v e a l e d t h a th 2 0 - c h 3 c o o h - n ( c h 2 c h 3 ) 3 c h 3 c h 2 0 hw a st h eb e s ts y s t e mf o rt h es e p a r a t i o n o fg l u c o s i n o l a t e s s i n c et h eu s e dr e a g a a t sw e r ea l lv o l a t i l e , t h eb e s ts y s t e mc a l lb e a p p l i e di nt h eh p l c m sf o rt h es e p a r a t i o na n di d e n t i f i c a t i o no fg l u c o s i n o l a t e s i n a d d i t i o n ，h 2 0 k c i c h 3 c h 2 0 h w h i c hw a sl i t t l ei n f e r i o rt o h 2 0 - c h 3 c o o h - n ( c h 2 c h 3 ) 3 - c h 3 c h 2 0 h a n da ss a m ea s h 2 0 - c h 3 c o o h 4 n c h 3 c h 2 0 hf o rt h es e p a r a t i o no fg l u c o s i n o l a t e sc o u l db ee a s i l y w i p e do f f , w h e ni tw a su s e di nt h ep e r - h p l cf o rt h ep u r i f i c a t i o no fg l u c o s i n o l a t e s s o m ei n t a c tg l u c o s i n o l a t e sw e r eg m n e d u s i n gh 2 0 - k c l - c h 3 c h 2 0 hf l o w i n gs y s t e m ， a n dt h es t r u c t u r eo f w h i c hw e r ci d e n t i f i e db yi r ，h p l c m s ，u vn m r i n c h a p t e r4 ，t h e r e t e n t i o no fg l u c o s i n o l a t e so nr e v - h p l cw a ss t u d i e db y c a l c u l a t i o no f q u a n t u mc h e m i s t r ya m l i n o u rs t u d yt h e g l u c o s i n o l a t e sm o l e c u l e sa n d t h ep h a s ew h i c ha c t e de a c ho t h e rw e r el o o k e da sas u p r a m o l e c u l a rs y s t e m i tw a s f o u n dt h a tt h er e t e n t i o nb e h a v i o ro fg l u c o s i n o l a t e so nr e v - h p l cw e r en o to n l y i n t e r r e l a t e dt ot h et o t a le n e r g yo ft h es u p r a m o l e c u l a rs y s t e mb u ta l s oi n t e r r e l a t e dt o t h e d i p o l em o m e n t ，a c c u r a t ec o o r d i n a t e ，h y d r o g e nb o n da n dm o l e c u l es t r u c t u r e ， e s p e c i a l l yt h eh y d r o g e nb o n d b e t w e e nt h ef l o wp h a s ea n dt h eg l u c o s i n o l a t e sw a st h e b e s ti m p o r t a n tf a c t o ri no u rm o d e l i tw a si n d i c a t e dt h a tt h er e t e n t i o nm e c h a n i s mo f g l u c o s i n o l a t e so n r e v h p l cw e r ea f f e c t e db y m a n y f a c m r s 第一章绪论 1 1 硫代葡萄糖苷的研究现状 1 1 1 硫代葡萄糖苷简介 硫代葡萄糖苷( 简称硫苷) 是存在于十字花科植物r f t 的一利t 次生代谢产物，其 一般结构见图1 1 。 r 、c 一 眭 h 、 o s 百 图1 1 硫苷的散结构 f i g 1 1s 自m c h l r eo f g l u c o s i n o l a t e s 1 9 世纪末，g a d a m e r 最早提出了硫苷的结构，认为侧链r 基团直接连在n 原子上，而不是连在n c s 基团的c 原子上，结果这种结构并不能很好地解释硫 苷的许多特性。直到1 9 5 6 年，e t t l i n g e r 和l u n d e e n 2 ”才用x 一射线衍射的方法证 明了硫苷的结构如图1 1 所示。后来e t t l i n g e r 【4 】和m a r s h i s 又对硫苷的结构做了深 入的解释，认为o 原子、n 原子、c 原予( 与n 原子直接相连的c 原子，称零号 碳原子) ，以及s 原子和l 号c 原子( 基团r 中与零号碳原子直接相连的c 原子) 均围绕碳氨双键共同处于一个平面上，硫酸根和基团r 围绕着碳氮双键呈反式 构型，这种解释一直沿用到现在。根据硫苷侧链基团r 的不同，可以把硫苷分 为烷烃类、吲哚类和芳香类硫苷等主要的三大类。1 9 世纪3 0 年代，植物学家最 早从黑芥菜籽和白芥菜籽中提取得到了2 丙稀基硫苷( 图1 2 ) 和4 一羟基苯甲基硫 苷( 图1 3 ) ，后来关于硫苷类物质在植物中的分布又有大量的报道 ，8 ，”。到日前 为止世界上发现的硫苷共有1 2 0 种左右，主要存在于r 字花科植物中，其中含 量较高的主要是芸薹属植物。另外十字花科植物的细胞质和细胞液巾还同时存在 硫代葡萄糖菅酶( 又称内源芥子酶) ，一旦细胞组织被损坏，内源芥子酶就很快导 致硫苷发生水解，形成相应的异硫氰酸酯、硫氰酸酯和腈类等物质。根据硫苷种 类、p h 和离子强度等的不同，水解产物也有所不同。十字花科蔬菜中还含有大 量的植物蛋白可以用作动物食料和人的食物，但众多研究都表明硫苷及其水解产 物具有一定的毒性和抗营养性【1 0 , 1 1 , 1 2 ，因此硫苷的存在限制了这些植物在作为人 和动物食物中的应用。但另方面，随着对硫苷类物质研究的深入，也发现了硫 苷具有很多的生物活性及应用价值。经常食用十字花科蔬菜可以降低癌症的发病 率，这丰要是因为此类膳食可以增强机体1 i 相酶的活性。z h a n g 和t a l a l a y i ”】以 及v e r h o e v e n t l 4 】曾研究了一些硫苷水解产物对肝癌、肺癌和胃癌的抑制作用，一 些实验还表明了3 一吲哚甲基硫苷降解产物( 如吲哚3 甲醇) 能诱导肝、肠酶的 活性 1 5 】。硫苷对人体健康的作用也已经被广泛的研究1 6 , 1 7 , 1 8 。另外由于硫苷具有 广泛的生物活性，可以作为天然的植物杀虫剂1 1 9 】：另有文献还报道【2 0 i 字花科 蔬菜特殊的风味主要是由于硫苷的水解产物所引起的，白菜类蔬菜中的硫瞢如 3 一丁烯基硫苷、4 戊烯基硫苷和苯乙基硫苷相应的异硫氰酸酯水解产物就是形成 白菜风味的来源【2 ”。由于硫苷类物质广泛的生物活性，人们对它的研究已经深入 到各个领域，包括昆虫学、化学、植物学、营养学、食品科学、医学和遗传学。 下面将对硫苷类物质的分布、分类、合成、降解、活性、应用和分析方法等的现 状做详细的介绍。 h o 蚧伊躺h h “。 s 町 图1 22 - 丙稀基硫苷 f i g1 2 2 - p r o p e n y lg l u c , o s i n o l a t e 1 1 2 硫代葡萄糖苷在植物中的分布 o h h 图1 34 - 羟基苯甲基硫苷 f i g1 3 4 - h y d r o x y b e n z y lg l u c o s i n o l a t e 硫代葡萄糖苷作为植物中种重要的次生代谢产物，广泛地分布于各种植物 中，其中十字花科植物中就有超过1 2 0 种的硫苷。k j 砖产2 1 曾对几百种十字花科植 物进行研究，发现这些植物大都能合成硫苷类化合物，此类化合物在十字植物中 的分布已经成为众多学者研究的目标2 3 2 4 2 ”。除了十字花科植物能合成硫苷外， 至少还有5 0 0 种非十字花科的双子叶植物中含有已发现的1 2 0 利，硫苷中的一种或 几种。r o d m a n 2 6 1 曾列出了各种类型硫苷在备含硫苷植物属中的分布，见表1 1 表1 1 各类含硫苷植物和所含硫苷的类型 植物属硫苷类型植物属硫苷类型 t 硫苷类型根据r 基团分类：a ，r = c h a s ( c h 2 ) n 、c h 3 s o ( c h 2 ) n 、c h 3 s 0 2 ( c h 2 ) n ；b ，r = 直 链饱和烷烃类；c ，r = 支链饱和烷烃类；d ，r = 末端双键烷烃类或末端双键醇类；e ，r = 直 链或支链饱和醇类；f ，r = 直链酮类；g ，r j 芳香类；h ，r = 苯甲酸酯类；i ，r = 吲哚类；j ， r j 多葡萄糖苷类或其他。 从表1 1 可以看到芸苔属( b r a s s i c a c e a e ) 植物是含有硫苷种类最多的植物属，其 他属植物中则只含有少量的一种或多种硫苷。v e l a s c o 2 1 等也利用近红外漫反射 光谱法对芸苔属中的2 0 类植物的1 7 0 8 个标本进行了研究，结果发现甘蓝型和芥 菜型蔬菜中含有较多种类的硫苷。我国大面积种植的含硫苷植物主要是各种芸苔 属蔬菜，其中油菜作为中国重要的食用油料作物，不仅给农民带来了可观的经济 效益，同时优质的菜油也受到了国内外消费者的欢迎。但油菜籽中除了含有大量 的脂肪和植物蛋白以外，还含有单宁、植酸和硫苷等有害物质，这给油菜籽的开 发利用带来了很大的困难。目前已经开展了很多菜籽的开发工作 2 8 , 2 9 ，其中油菜 籽的脱毒工作曾被列为我国“八五”计划的攻关项目，双低油菜( 低硫苷、低芥 酸) 种植的普及，使油菜籽从单的油料作物成为集油料和饲料为一体的高效益 经济作物。近年来，随着国内外对硫苷生物活性和抗癌作用的深入研究，油菜籽 中硫苷对人体和动物的有益作用也逐渐体现出来，文碧玲【3 0 】等对油菜吲哚硫苷降 解物对s 1 8 0 小鼠抗肿瘤作用进行了研究，结果发现吲哚硫苷降解产物可以通过增 强机体免疫功能来抑制移植性肿瘤的生长，起到抗肿瘤的作用。我国的科学工作 者 3 1 , 3 2 , 3 3 1 己从油菜籽中提取分离了多种硫苷，这对硫苷生物活性和抗癌活性的研 究将起到很好的先导作用，同时还可以指导植物学家培育含某种高活性硫苷的油 菜品种。 1 1 3 硫代葡萄糖苷的分类 硫代葡萄糖苷的结构主要包括三部分：一个硫代葡萄糖苷键、一。个磺酸根和 个侧链r 基团。在所有发现的硫苷中，可以根据侧链r 基团的不同详细地把 硫苷分为1 0 种( 见图1 4 ) 。 a ：r 基团为c h 3 s ( c n 2 ) n 、c h 3 s o ( c h 2 ) n 、c h 3 s 0 2 ( c h 2 ) n oo | | i i a 办。o i v x ，、j 、o h 。一工一。、l 一工一。 s 八人小。t 人一“百w 。 0 8 人八。 b ：r 基团为直链烷烃 x c ：r 基团为支链烷烃 0o0o h 义八儿。a 八人八。 人x 人x 丫一x d ：r 基团为含不饱和双键的烷烃或醇 x l x 八l x 图1 4 硫代葡萄糖苷的分类 f i g 1 , 4c l a s s i f i c a t i o no f g l u c o s i n o l a t e sa c c o r d i n g t oc h e m i c a ls t r u c t u r e s e ：r 基团为饱和醇 h o x h 。 f ：r 基团为支链酮 x g ：r 基团为芳香基团 。：h 。胪x h ：r 基团为苯甲酸酯类 r 基团为吲哚类 x ：妒x l x 图1 4 ( 续) f i g u r e1 4 ( c o n t i n u e d ) x x x 5 k何 剪_ x l o c h 3 j ：r 基团为另一葡萄糖苷的结构 x l 0 s 0 3 。 x o c h 3 图1 4 ( 续) f i g u r e1 4 ( c o n t i n u e d ) 在所有硫苷种类中，r 基团为直链或者支链烷烃结构的硫苷占了绝大多数( 其 中包括了含有双键、羟基、硫氧基和亚硫氧基等官能团的硫苷) ，另一部分是含 有苯环结构和吲哚基团的硫苷，这一部分硫苷大都含有较高的生物活性。但另 小部分苯基上接有葡萄糖苷基团的硫苷，其生物活性和应用未曾了解，有报道认 为这类硫苷的由来可能与苯基类硫苷的水解相关 3 4 , 3 5 。 1 。1 4 硫代葡萄糖苷的合成 硫代葡萄糖苷的来源主要有两种：一是化学合成，二是生物合成。早在四十 多年以前就有报道 3 6 , 3 7 , 3 8 , 3 9 , 4 0 , 4 1 1 提出了硫苷的多种化学台成方法，但这些合成路 线都相当复杂，条件也不易于控制。2 0 世纪9 0 年代，关于硫苷类物质的合成化 学又提出了一种新的合成方法m , 4 3 , 4 4 ，除此以外，还有报道 4 5 , 4 6 4 7 1 自然植物r r i 存 在的吲哚类硫苷的化学合成方法。c o t t a z 4 s , 4 9 等还合成了2 一羟基苯甲基硫苷的两 种衍生物r 去羟基的苯甲基硫苷和羟基被氟乙酰铵取代的苯甲基硫苷) ，用以研究 葡萄糖苷酶在催化硫苷合成反应时，2 号c 原子位上取代的羟基对催化反应的重 要性，同时他们还研究了这一反应的机理。l a z a r 和r o l l i o n 5 0 】更进一步地合成了 硫代葡萄糖苷的一种衍生物，他们将硫代葡萄糖苷中的0 s 0 3 基团用o p 0 3 基团 代替，以研究硫代葡萄糖苷中的0 s 0 3 慕团被o p 0 3 取代以后对酶水解反应动力 学的影响。最近几年，a u c a g n e 5 1 1 又报道另一种硫代葡萄糖苷衍生物( c 一苯甲基硫 代葡萄糖苷) 的合成，即是将硫代葡萄糖苷分子中葡萄糖苷键上的s 原子t h jc 原 子取代掉。到目前为止，所报道的人工合成的硫苷种类已经有很多，但还有许多 自然植物中存在的硫苷尚未找到合成的方法，比如甲基硫氧基4 ，丁基硫苷，从 营养学和抗癌活性的角度来讲具有很好的应用价值，但目前还没有找到合理的化 学合成方法。因此从目前研究的现状来说，硫昔在植物中的生物合成才是硫苷的 主要来源。 n , h 2o r 一是z 一6 一c 。h 一r g ：一! ! 一c 。h + 晡一c 。h c o o hc o o h i 卜r 9 2 一g i c h 2 一c o o h i hr 9 2 c i c h c o o h l h i o h o h ，r 一字一字一8 0 c 。h 一r g ：一是：一竖c 。h 图1 5 氨基酸延伸的生物过程 f i g1 5b i o l o g i co u t s p r e a dp r o c e s so f a m i n oa c i d 关于硫苷生物合成的观点首先来源于u n d e r h i l l 和同事5 2 1 的最初研究以及后 来m i t h e n 和同事 5 3 , 5 4 , 5 5 , 5 6 , 5 7 , 5 8 1 在遗传学方面的研究。这些研究为氨基酸延伸为硫 苷的侧链r 基团提供了强有力的证据m 一氨基酸的延伸主要将醋酸加到a 位上， 然后通过去羰基作用而得) ，在硫苷形成以后再通过侧链r 基团的修正( 去饱和羟 基化作用) 而得到众多非氨基酸直接延伸的硫苷。到目前为止，普遍能接受的硫 苷的生物合成过程主要包括了三个阶段：1 氨基酸的延伸，2 氨基酸和葡萄糖台 成硫苷，3 侧链r 基团的修正。早在四十多年以前，放射性研究就为脂肪类硫 昔的侧链延伸提供了证据。后来又有研究将1 4 c 同位素标识的醋酸和氨基酸加 到植物r l 、1 5 9 , 6 0 1 用以分析所合成的硫苷，结果发现氨基酸的延伸过程与缬氨酸和醋 酸合成亮氨酸的过程很相似。氨基酸首先被转化成a 一酮酸，然后与1 4 c 同位素 标识的醋酸反应，接着经过羟基的异构作用，最后氧化成为延伸的酮酸，d 酮酸再转变为延伸的啦氨基酸，这样氨基酸的延伸过程就完成了，见图1 5 。被 延伸的氨基酸在醋酸的作用下可以进一一步延伸成为更长链的氨基酸。因此，从植 物中存在的硫苷中，我们司以观察到大量由各种氨基酸亘援代谢过来的硫百种类 ( 比如由丙氨酸、蛋氨酸、缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸代谢而来的脂肪类硫苷； 由苯氨酸和酪氨酸代谢而来的芳香类硫苷；由色氨酸代谢而来的吲哚类硫苷) 或 经氨基酸延伸以后代谢过来的硫苷种类 6 1 , 6 1 ( 比如大量脂肪类硫苷的侧链r 基团 的前体就是延伸后的氨基酸) r f h c o o l 旦生，r 一：2 一g n o hj l - r 9 2 一c h i h 。 厅” 洲2 o + 。 一cyst。ine r h 2 c 心s - - 一i _ 一r 一字一3 “ 一u d p - g i c 鞯璐 | ( hr h ) ( r 一字一c 5 占f 百 竺! ， 一一扎 n o s 0 3 h 图1 , 6 硫代葡萄糖苷的生物合成过程 f i g 1 6b i o s y n t h e s i sp r o c e s so f g l u c o s i n o l a t e s 在植物体内氨基酸延伸完成以后，硫苷的生物合成接着就进入第二阶段氨 基酸和葡萄糖合成硫苷。在第二阶段中，氨基酸首先转化成相应肟的形式( 见图 1 6 1 。众多研究表明，不同的生物酶催化不同的氨基酸反应，其中最具特征性的 酶是p 4 5 0 氧化酶【6 3 刚，它催化酪氨酸和苯基氨酸转化成为相应的肟。氨基酸转 化成相应肟以后，可能进一步氧化形成不稳定的酸性硝基化合物的形式，此化合 物再与巯基给体半胱氨酸在s 转移酶的催化作用下发生反应【6 q 形成硫代亚胺酸 酯，所形成的硫代亚胺酸酯进一步水解成为硫代亚胺酸。最后一步硫代亚胺酸与 葡萄糖苷的键合是目前研究最深透的一步，硫代亚胺酸在尿苷二磷酸葡萄糖半乳 糖基羟赖氨酸一胶原转葡萄糖基酶邮d p g l c ) 的作用下与吡喃葡萄糖苷反应，生 成去硫磺化的硫苷，去硫磺化的硫苷在高能量的3 一磷酸腺苷一5 一磷酰硫酸( p a p s l 的作j 玎下最后形成硫苷盐类化合物 6 6 , 6 7 , 6 8 , 6 9 , 7 0 。到f t 前为止，从肟到硫代亚胺酸的 不稳定中问产物酸性硝基化合物即没有提纯得到，也没有生物化学的证明，只是 研究者的一些猜测。但催化硫代亚胺酸转化成为去硫磺化硫苷的尿昔二磷酸葡萄 糖半乳糖基羟赖氨酸一胶原转葡萄糖基酶( u o p g i u ) 和3 一磷酸腺苷一5 磷酰硫酸 ( 队p s ) 已经从含硫苷植物中提取得到【7 “7 2 7 “，其中u d p g l c 对硫代亚胺酸与葡萄 糖营的反应具有专一性，但对侧链r 基团不具有专一性。 氨基酸和葡萄糖作用形成硫苷以后，特别是脂肪类硫营，侧链r 基团可以 经过修正得到更多种类的硫苷。修正的过程我们以蛋氨酸延伸而得到的硫昔 ( c h 3 s ( c h 2 ) i 1 g s l ) 为例加以说明。末端的甲硫基首先被氧化成甲基硫酰基或甲 基亚硫酰基，然后在甲基亚硫酰基转移酶或甲基硫酰基转移酶的作用下去除甲基 硫酰基或甲基皿硫酰基，再通过去饱和作用得到侧链r 为链烯基的硫苷，链烯 基通过羟基化作用进一步得到侧链r 为羟烷基的硫苷 7 4 , 7 5 。但在整个修正路线的 某一过程中还有可能出现多种变化，比如4 甲基亚硫酰基丁烯基硫苛的形成直接 由相应4 一甲基亚硫酰基丁基硫苷的去饱和作用而得到，这一过程则不需要甲基亚 硫酰基转移酶的参与。除了脂肪类硫苷r 基团的修正以外，其他类型的硫苷可 以对r 基团进行修正，比如由色氨酸代谢而来的吲哚甲基硫营可以在吲哚基团 的1 号n 上和4 号c 上发生甲氧基化和羟基化作用，形成含取代基的吲哚类硫 苷。但从硫苷完整的合成过程来看，r 基团的修正这一阶段研究的较少，主要是 因为对催化这一反应过程的生物酶了解的太少。 1 1 5 硫代葡萄糖苷的降解 组织化学和免疫学研究表明催化硫苷水解的芥子酶可能分布在芥子硫苷酸细 胞的细胞质中，也可能分布在其他细胞的细胞质中口”，硫代葡萄糖苷则可能分 布在液泡中【_ ”】。一旦植物被研碎或蒸炒，细胞组织遭到破坏时，芥子酶的催化活 性就会使葡萄糖苷发生水解，糖苷基从硫苷中脱去，形成不稳定的中间化合物， 糖苷配基则通过各种重排得到多种降解产物( 见图1 7 a ) 。大多数情况下，中间化 合物重排得到相应的异硫氰酸酯，如果得到的异硫氰酸酯中含有b 一羟基( 如2 一羟 基3 丁烯基硫苷相应的异硫氰酸酯) ，在环硫蛋白酶的作用下将进一步重排得到 环硫腈类的化合物嗍( 见图1 7 b ) 。在p h 值较低的条件下，中间产物则容易直接通 过脱硫作用得到腈类降解物，s e r r a 8 0 】等的研究表明硫苷水解转化成腈类物质的 机会还与亚铁离子浓度成正比。相对于其他类型的硫苷，吲哚类硫苷降解得到的 异硫氰酸酯更不稳定，容易转化成醇类化合物，甚至转化成二吲哚甲烷f 见图 1 7 c ) ；在更低的p h 值条件下，也容易转化成相应的腈类化合物。除此以外，在 没有芥子酶存在的条件下，也可能发生降解作用，钱和等 8 l 】研究了加压条件下油 菜籽中硫苷非酶解规律及其机理。结果发现，硫苷非酶解时温度越高，降解反应 速度越快，生成腈的趋势越大；硫苷降解反应速度与体系含水量有关，硫苷降解 速度与体系含水量成正比；碱性试剂的存在和过渡金属盐的存在都可以加快硫苷 降解反应的速度，硫苷降解产物的结构对其生物活性有着重要的影响，结构上的 微小变化就会使其生物活性发生很大的变化。比如，甲基亚硫酰基烷基硫苷产生 的异硫氰酸酯具有很好的挥发性和辛辣昧，但甲基硫酰基烷基硫苷产生的异硫 r l s - - - g l u c o s ek c s h 了e k = r - - s 三- - c 一- - - - - - n n o s o 。 【 n o s 0 3 j 、 呲一c c h c h z c 8 6 i “8 。 一s 一广一c | 一 。h n 。s 。3 - ：2 一一吲“。：e k o s o i 一【 g h 2 l n h l | s h 2 一c 兰n 。_ 一一8 一叼字二叼2 印 h c i o c h ch 吖 q 氰酸酯不具有挥发性；如果将甲基硫酰基烷基硫苷中的甲基硫酰基去除，再引入 不饱和双键，则产生的异硫氰酸酯又具有很好的挥发性。异硫氰酸酯挥发性的变 化也正好说明了侧链r 的微小差别在硫苷生物活性巾的作用。 1 1 。6 硫代葡萄糖苷的生物活性和作用 硫代葡萄糖苷作为十字花科蔬菜中主要的含硫化合物，其牛物活性很早就引 起了人们的兴趣。硫代葡萄糖苷在内源芥子酶的作用下容易发生降解，其降解产 物( 如腈类、硫氢酸酯类和异硫氢酸酯类) 很多都具有毒性，对脊椎动物的成长有 害雌”】，最典型的是由2 羟基一3 一丁烯基硫苷衍生而 ：导的氧氮杂环戊烷，其主要 存在于油菜籽中，它的存在严重影响了油菜籽中植物蛋白的应用价值，因此，油 菜籽的脱毒t 作已经成为了国内外研究的重大课题。由于硫苷及其降解产物的毒 性，其在植物中的存在与植物免疫系统的抗细菌和真菌作用密切相关，另外已有 文献报道其对病虫害的防治具有很好的效果，是很好的植物杀虫剂【8 4 】。除此以外， 硫苷的生物活性主要表现在其抗癌活性上。在过去二十年的研究中已经发现，经 常食用蔬菜和水果f 特别是十字花科蔬桨) 可大大降低各种癌症的发病率 8 5 , 8 6 , 9 8 7 】， 进一步调查的结果表明【8 8 】在一些地区每天食用十字花科蔬菜可以将癌症发病率 减少到5 0 。部分硫苷( 如苯甲基硫苷、对羟基苯甲基硫苷、吲哚硫苷等) 本身能 够诱导哺乳动物中相酶的活性 8 9 , 9 0 ；另外存在于植物组织或人体消化系统中的 内源芥子酶容易将硫苷转化成一系列的降解产物( 如腈类、硫氢酸酯类、界硫氢 酸酯类等) ，这些降解产物中有些既有诱导相酶的活性的作用，又具有抗类风 湿性关节炎和诱导氧化还原i 相酶的作用1 9 1 , 9 2 , 9 3 。从目前硫代葡萄糖苷抗癌活性 的各例子分析，主要包括以下几类：( 1 ) 一些研究表明，含硫酸的盐可以通过提 高抗氧化响应网子( a r e ) q ，间体的转录滞后活性使机体相酶保持较高的水平 p 4 9 5 】；含硫酸的盐作为间接的抗氧化剂可以减少氯杀鼠灵在老鼠乳腺体中的含量 p 6 j ，同时它对人体癌细胞可以发挥选择性的抑制细胞生长和细胞毒素增长的作用 【9 ，1 ，甚至它还可以抑制细胞色素p 4 5 0 ( 特别是c y p 2 e 1 ) 的增长p ”，从而可以延缓 细胞代谢周期和阿朴奎胺碱在癌细胞中的含量【”】。( 2 ) 一些对硫苷降解产物抗肿 瘤实验的研究发现，由苯乙基硫苷降解而得的苯乙基异硫氢酸酯可以防止老鼠和 耗子食道癌和肺癌的产生 1 0 0 , 1 0 1 】。这些作用的产生主要是与苯乙基异硫氢酸酯对 良性肿瘤一d n a 加合物以及细胞色素p 4 5 0 的抑制作用有关。另一个对吸烟者的 实验还发现，食用一种含苯乙基硫苷的食物将对n n k 的新陈代谢起到抑制的作 用，但对烟碱的代谢却没有有明显的增加效果 】。a d e s i d a t l 0 如等还报道了苯乙 基异硫氢酸酯的新陈代谢在人体巾的抗类风湿性关节炎的作用。( 3 ) 还有研究发 现，甲基硫氧基烷基硫苷以及吲哚类硫苷可以提高苯醌还原酶的水平，而且对于 诱导机体相酶的活性也有很好的作用，特别值得注意的是4 一甲基硫氧丁基硫 苷的降解产物是迄今为止发现的最强烈的机体i i 相酶诱导剂，它能使致癌基因 失去作用”0 4 。到日前为止，硫苷及其代谢产物在抗癌方面的作用已经得到了很 多专家的证实，其机理丰要是通过提高机体i i 相酶的活性，从而抑制人体细胞 的变病和抑制癌细胞的生长。 1 1 7 硫代葡萄糖苷的分析方法 硫代葡萄糖苷类化合物主要存在于各双子叶植物中，由于其广泛的生物活性， 因此从各植物中提取、分离、鉴定各种硫代葡萄糖苷显得非常重要。从日前的研 究状况来看，硫代葡萄糖苷的分析方法主要有以下几类。 1 1 7 1 硫代葡萄糖苷总量的测定 早在1 9 8 0 年m c g r e g o r ”5 】就对硫苷总量的测定提出了六种不同的方法：( 1 ) 将含硫苷植物用水蒸气进行提取，再用e d t a 容量法进行滴定，测定提取液叶1 异 硫氢酸酯水解产物的总量，从而确定硫苷的总量。( 2 ) 利用紫外分光光度法测定 提取液中硫苷代谢产物( 烷基取代的氮氧杂环戊烷) 的含量。( 3 ) 气相色谱法测 定提取液中易挥发的硫苷水解产物异硫氢酸酯的含量。( 4 ) 气相色谱一紫外光谱 联用测定硫苷的水解产物含量。( 5 ) 紫外光谱法测定由硫苷水解产物异硫氢酸酯 衍生而来的硫脲含量。( 6 ) 气相色谱测定硫苷的三甲基硅烷化衍生产物含量。前 五种方法都是直接测定硫苷的水解产物或是水解产物的衍生物，但水解的程度和 副产物的含量与水解酶的活性、水解的时间、p h 值的大小等都有直接的关系， 但水解的条件很难控制，因此所测定的结果往往不是很准确；第六种方法通过三 甲基硅烷化衍生得到的衍生物在气相色谱条件下大都能够测定，而且衍生反应也 较完全，因此测定结果较为准确。国内也报道了不少硫苷总量的测定方法。戈兰 英 1 0 印报道了用麝香草酚分光光度法测定油菜籽中硫苷的含量，葡萄糖在7 7 的 硫酸溶液。i j 脱水形成5 一羟基甲基糠醛，它进一步与麝香草酚反应生成有颜色( 红 色) 的物质，且生成颜色的深度与葡萄糖浓度成正比。硫苷分子的结构为：一分 子硫苷含有一分子的硫酸根和葡萄糖，在硫酸溶液中水解形成葡萄糖，它同样与 草酚反应生成有颜色( 红色) 的物，以各种浓度的葡萄糖做工作曲线，在5 0 5 n m 处 进行比色，可以求得硫苷水解产物中葡萄糖的总量，从而得到硫苷的总量。该方 法测定过程中麝香草酚与硫酸溶液巾的碳水化合物也起显色反应，因此测定过程 对玻璃器皿的清洁度要求特别严格